Αφηρημένο

Ιστορικό

καρκίνο του στομάχου είναι μια από τις πιο συχνές μορφές καρκίνου στον κόσμο. Η «οικονομικά ανεπτυγμένες χώρες» στυλ ζωής, συμπεριλαμβανομένης της διατροφής, αποτελεί παράγοντα κινδύνου που ευνοούν αυτή τη μορφή καρκίνου. διαφοροποίηση διατροφή μπορεί να μειώσει την επίπτωση του καρκίνου του πεπτικού. Μεταξύ των πολλά υποσχόμενων συστατικά των τροφίμων, γαλακτοκομικά propionibacteria δείχθηκε για να προκαλέσει την απόπτωση των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, μέσω της απελευθέρωσης του βραχείας αλύσου λιπαρά οξέα οξικό και προπιονικό.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Α γάλα που έχει υποστεί ζύμωση , που έχουν υποστεί ζύμωση αποκλειστικά από

P. freudenreichii

, πρόσφατα σχεδιασμένο. Στην εργασία αυτή, η προ-αποπτωτική δυνατότητες αυτής της νέας ζυμωμένου γάλακτος αποδείχθηκε στις HGT-1 ανθρώπινου γαστρικού καρκινικά κύτταρα. Ζύμωση υπερκείμενο γάλα που προκαλείται τυπικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης περιλαμβάνουν συμπύκνωση χρωματίνης, σχηματισμός αποπτωτικών σωμάτων, κλιμάκωσης ϋΝΑ, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και εμφάνιση ενός πληθυσμού subG1, έκθεση φωσφατιδυλσερίνης στην εξωτερική φυλλάδιο μεμβράνη του πλάσματος, αντιδραστική συσσώρευση είδη οξυγόνου, μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό διαταραχής, κασπάσης την ενεργοποίηση και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c. Αξίζει να σημειωθεί ότι, αυτή η νέα ζυμωμένο γάλα που περιέχει

P. freudenreichii

ενισχυμένη την κυτταροτοξικότητα της καμπτοθεκίνης, ένα φάρμακο που χρησιμοποιείται σε γαστρικό χημειοθεραπεία του καρκίνου.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Η νέα ζυμωμένο γάλα προβιοτικά μπορεί έτσι να είναι χρήσιμη ως μέρος μιας προληπτικής δίαιτα σχεδιαστεί για να πρόληψη καρκίνου του στομάχου και /ή ως συμπλήρωμα διατροφής για να ενισχύσει τον καρκίνο θεραπευτικές αγωγές

Παράθεση:. Ξάδελφος FJ, Jouan-Lanhouet S, Dimanche-Boitrel MT, Corcos L, Jan G (2012) Γάλα που έχει υποστεί ζύμωση με

Propionibacterium freudenreichii

επάγει την απόπτωση των HGT-1 κύτταρα ανθρώπινου γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 7 (3): e31892. doi: 10.1371 /journal.pone.0031892

Επιμέλεια: Abbes Belkhiri, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Νοέμβρη 2011? Αποδεκτές: 19 του Ιανουαρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 19 Μαρτίου 2012

Copyright: © 2012 Ξάδελφος et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Conseil Regional de Bretagne μέσω της πρόσκλησης Développement CBB για τα έργα και από το Εθνικό Κέντρο Interprofessionnel de l’Économie laitière (CNIEL) μέσω της παρούσας πρόσκλησης επιστημονική Επιτροπή της Syndifrais για τα έργα. Έρευνα στην ομάδα IRSET υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από την Ligue Nationale Contre le Καρκίνο (Κυανή Armor, Ille et Vilaine, Morbihan, Βαντέ και Sarthe Επιτροπές), INSERM, University of Rennes 1 και της Περιφέρειας της Βρετάνης. FJC έλαβε επιχορήγηση από CNIEL (διδακτορική υποτροφία). SJL υποστηρίχθηκε από την Ένωση pour la Recherche sur le Καρκίνο (διδακτορική υποτροφία). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

διατροφή διαμορφώνει τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του στομάχου

ο καρκίνος είναι η κύρια αιτία θανάτου στις οικονομικά ανεπτυγμένες χώρες που προκύπτουν από τις επιλογές του τρόπου ζωής σχετίζονται με τον καρκίνο όπως το κάπνισμα, η έλλειψη σωματικής άσκησης, και «δυτικού» διατροφή [ ,,,0],1]. Πράγματι, ο ρόλος της διατροφής στην ανάπτυξη καρκίνου υποστηρίζεται σθεναρά από επιδημιολογικές μελέτες, ιδίως όσον αφορά τους καρκίνους του πεπτικού σωλήνα. Γαστρικού καρκίνου (GC) αποτελεί το τρίτο είδος των θανατηφόρων καρκίνων για τους άνδρες στον κόσμο. Το 2008, 640.600 περιπτώσεις GC υπολογίστηκαν, προκαλώντας 464.400 θανάτους παγκοσμίως [1]. Αυτή η ασθένεια είναι ιδιαίτερα συχνή στην ανατολική Ασία, και στην Κεντρική και Ανατολική Ευρώπη. Οι πιο σημαντικοί αιτιολογικοί παράγοντες που εμπλέκονται στη γαστρική καρκινογένεση είναι η διατροφή και η

Helicobacter pylori

μόλυνση. Σημαντικά στοιχεία, κυρίως από μελέτες ασθενών-μαρτύρων, υποδεικνύει ότι ο κίνδυνος της αναθέτουσας GC αυξάνεται από την υψηλή πρόσληψη παστά, τουρσί ή καπνιστά παραδοσιακά τρόφιμα, καθώς και αποξηραμένα ψάρια και κρέας. Αντιθέτως, οι ίνες, τα φρέσκα λαχανικά και φρούτα, ίσως λόγω της περιεκτικότητας τους σε βιταμίνη C, βρέθηκαν να σχετίζονται αντίστροφα με τον κίνδυνο GC [2], [3]. Η επίδραση των συστατικών των φυσικών /διατροφής στην καρκινογένεση του στομάχου έχει έτσι διερευνηθεί κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών [4] – [6]. Μεταξύ αυτών, τα προβιοτικά και την ικανότητά τους να αναστέλλουν την ανάπτυξη του καρκίνου προσέλκυσε επιστημονικού ενδιαφέροντος [7], [8]. Ένα προβιοτικό ορίζεται γενικά ως «ένα ζωντανό μικροοργανισμό ο οποίος, όταν χορηγείται σε επαρκείς ποσότητες, παρέχει όφελος για την υγεία του ξενιστή» [9]. Ενώ ορισμένες μικροοργανισμούς, όπως

H. pylori

μπορεί να ευνοήσει GC, άλλοι μπορεί να έχουν ευεργετικό αποτέλεσμα, με την πρόληψη του πεπτικού καρκίνου. Ειδικότερα, επιλεγμένα στελέχη προβιοτικών βακτηρίων μπορεί να περιορίσει την ανάπτυξη καρκίνου σε ζωικά μοντέλα καρκινογένεσης [10]. Αυτό ήταν ιδιαίτερα εμφανές για καρκίνο του παχέος εντέρου, ενώ λιγότερα είναι γνωστά σχετικά με τις πιθανές επιδράσεις των προβιοτικών στο GC. Μια πιθανή μηχανιστική εξήγηση μιας τέτοιας προστατευτικής επίδρασης είναι η

in situ

απελευθέρωση αντι-καρκινογόνες μεταβολίτες όπως λιπαρά οξέα βραχείας αλύσου (SCFAs).

λιπαρά οξέα βραχείας αλυσίδας επάγουν απόπτωση των καρκινικών κυττάρων

SCFA, συμπεριλαμβανομένων οξικό, προπιονικό και βουτυρικό, είναι σημαντικά ανιόντα του εντερικού περιεχομένου και η συγκέντρωσή τους μπορεί να ρυθμίζεται με τη διατροφή. Είχαν δειχθεί ότι παίζει βασικό ρόλο σε σημαντικές φυσιολογικές λειτουργίες συμπεριλαμβανομένης της διαφοροποίησης του πεπτικού επιθηλιακών κυττάρων ισορροπία πολλαπλασιασμού /απόπτωσης. Αυτό συνεπάγεται SCFA μεσολάβηση διακοπή του κυτταρικού κύκλου, ιστόνης αποακετυλάσης αναστολή και διέγερση απόπτωσης σε μετασχηματισμένα κύτταρα, αλλά επίσης διέγερση διαφοροποίησης σε υγιή κύτταρα [11], [12]. Έχει επίσης αναφερθεί ότι το βουτυρικό και προπιονικό SCFAs τόσο επάγουν απόπτωση σε ανθρώπινα γαστρικού κυτταρικές γραμμές καρκινώματος [13] – [15]. Η απόπτωση είναι μια φυσική φυσιολογική διαδικασία που επιτρέπει ρύθμιση του αριθμού των κυττάρων και αποτελεί ένα στόχο για την χημειοθεραπεία κατά του καρκίνου [16]. Η απόπτωση επιτρέπει εξάντληση των καρκινικών κυττάρων σε ένα «καθαρό» τρόπο. Τα καρκινικά κύτταρα κομματιού σε ένα συντονισμένο αλυσιδωτή αντίδραση και τα υπολείμματα που απορροφάται από παρακείμενους ιστούς και το ανοσοποιητικό σύστημα [17], [18]. Δύο κύρια αποπτωτικά μονοπάτια έχουν περιγραφεί: την εξωγενή οδό, η οποία προκαλείται από την ενεργοποίηση των υποδοχέων θανάτου και κασπάσης 8, και το ενδογενή οδό, στις οποίες εμπλέκονται τα μιτοχόνδρια και κασπάσης 9 [16]. Γενικά, σε καρκινικά κύτταρα, η αποπτωτική λειτουργία είναι ανύπαρκτη, γεγονός που μπορεί να εξηγήσει παρατεταμένη πολλαπλασιασμό τους και, κατά συνέπεια το σχηματισμό όγκων. Η ικανότητα να επάγει απόπτωση των καρκινικών κυττάρων έτσι αναγνωρίζεται για το θεραπευτικό δυναμικό της [16]. Από τα γαλακτοκομικά propionibacteria είναι σε θέση να παράγουν ευεργετικές προ-αποπτωτικών SCFAs, που μπορεί να αποδειχθεί χρήσιμη στην πρόληψη ή τη θεραπεία του καρκίνου.

Propionibacterium freudenreichii

μπορεί να ευνοήσει αποπτωτική εξάντληση των πεπτικών κυττάρων καρκίνου

Αυτή η προβιοτικό γαλακτοκομικό Propionibacterium δείχθηκε ότι επάγει κυτταρικό θάνατο των διαφόρων καρκίνου του παχέος εντέρου ανθρώπινες κυτταρικές σειρές μέσω της επαγωγής της απόπτωσης, σε συν-καλλιέργειες [19]. Οι δραστικές ενώσεις, που εκκρίνεται εντός του μέσου, να προκαλέσει την εγγενή μιτοχονδριακό αποπτωτικό μονοπάτι σε καλλιεργημένα ανθρώπινα ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. Ειδικότερα, οι SCFAs οξικό μεθύλιο και το προπιονικό κυκλοφόρησε από

P. freudenreichii

επάγουν απόπτωση δρώντας επί της μιτοχονδριακής νουκλεοτιδίου αδενίνης, προκαλώντας μιτοχόνδρια αποπόλωση και διαπερατότητα, διαρροή του κυτοχρώματος c και ενεργοποίηση της κασπάσης [19], [20]. Ωστόσο, propionibacterial υπερκείμενα εξακολουθούν να είναι πιο προ-αποπτωτικών από το οξικό και το προπιονικό SCFAs, που χρησιμοποιούνται στις συγκεντρώσεις που μετρήθηκαν σε υπερκείμενα, υποδεικνύοντας ότι και άλλες ενώσεις μπορούν να συμμετέχουν σε αυτό το αποτέλεσμα. Επιλεγμένα στελέχη του

P. freudenreichii

παραμένουν ζωντανά και μεταβολικά ενεργό μέσα στο έντερο των ανθρώπων και της ανθρώπινης μικροχλωρίδας που σχετίζεται με αρουραίους όπου παράγουν SCFAs [21], [22]. Κατά συνέπεια, ήταν δειχθεί ότι αυξάνει απόπτωση σε μετασχηματισμένα επιθηλιακά κύτταρα παχέως εντέρου τέτοιων αρουραίων τροφοδοτείται με το καρκινογόνο 1,2-διμεθυλυδραζίνη (DMH), αλλά όχι σε υγιή έλεγχο [23]. Propionibacteria θα μπορούσαν να αποτελέσουν τα προβιοτικά που ευνοούν την πρόληψη του καρκίνου του παχέος εντέρου, με την προϋπόθεση να φτάσουν το στόχο τους ζωντανοί και μεταβολικά ενεργό. Στο πλαίσιο αυτό, ο φορέας, ή προβιοτικά όχημα παράδοσης, δείχθηκε να προσδιοριστεί propionibacteria επιβίωση και δραστικότητα [21], [24], [25]. Complex γαλακτοκομικά προϊόντα όπως το γιαούρτι και το τυρί, ειδικότερα, την προστασία propionibacteria από το άγχος, αλλά περιέχουν ένα πολύπλοκο μείγμα βακτηρίων. Επομένως, δεν είναι δυνατό να αποδίδουν την ευεργετική επίδραση σε ένα συγκεκριμένο στέλεχος.

Ένα γάλα που έχει υποστεί ζύμωση αξιολογήθηκε ως όχημα παράδοσης propionibacteria στο πλαίσιο αυτό

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα νέο για τρόφιμα ζυμωμένο γάλα που περιέχει μόνο

P. freudenreichii

ως μοναδικός μικροχλωρίδα. Καθώς αυτό το προϊόν περιέχει τόσο ζωντανή propionibacteria και των δραστικών μεταβολιτών τους, θα πρέπει να τους φέρει σε επαφή με το γαστρικό βλεννογόνο, όταν προσλαμβάνεται. Αυτό ζυμωμένου γάλακτος διερευνήθηκε σε σχέση με επαγωγή απόπτωσης HGT-1 ανθρώπινου γαστρικού καρκινικά κύτταρα. Πράγματι, οι propionibacteria γνωστό ότι σκοτώνουν ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου, αλλά η επίδρασή τους στη γαστρική καρκινικά κύτταρα είναι άγνωστη. Το γάλα που έχει υποστεί ζύμωση σκότωσε HGT-1 κυττάρων σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Τυπικά χαρακτηριστικά της διαδικασίας απόπτωσης παρατηρήθηκαν, συμπεριλαμβανομένων πτώση βιωσιμότητας, συμπύκνωση χρωματίνης, σχηματισμός αποπτωτικών σωμάτων », κλιμάκωσης ϋΝΑ, την παραγωγή ROS, μιτοχονδριακό δυναμικό διατάραξη της μεμβράνης, την ενεργοποίηση της κασπάσης, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και εμφάνιση ενός πληθυσμού subG1.

Αποτελέσματα

P. γάλα freudenreichii

ζύμωση σκοτώνει τα ανθρώπινα γαστρικός και καρκίνος κύτταρα του παχέος εντέρου

P. freudenreichii

ITG P9 αυξήθηκε σε 72 ώρες στους 30 ° C σε συμπληρωμένο γάλα και συμπληρώθηκε υπερδιηθήματος γάλακτος για να φτάσουν στον τελικό του πληθυσμού των 9,43 log

10 μονάδες σχηματισμού αποικιών (CFU) /mL και 9,35 log

10 cfu /ml, αντίστοιχα. Οι συγκεντρώσεις SCFA ήταν 26.21 mM οξικό και 54,47 mM προπιονικό (αναλογία 2,08 προπιονικό /οξικό) στο υπερκείμενο ζύμωσης του γάλακτος, ενώ ήταν 24,00 mM και 53,32 mM (2,22 αναλογία) στο ζυμωμένο γάλα υπερκείμενο υπερδιήθημα. Οι αναλογίες αυτές αναμένονταν για propionibacteria, τα οποία γενικά παράγουν διπλάσια προπιονικό το οξικό [26]. Δώδεκα άλλα στελέχη γαλακτοκομικά propionibacteria food-grade δοκιμάστηκαν επίσης (βλέπε πίνακα S1 και το σχήμα S1). Χρησιμοποιώντας αυτά τα στελέχη, ελήφθησαν δώδεκα ζυμωμένα γάλατα. Οι συγκεντρώσεις κυμαίνονταν από Propionate 36 έως 67 mm και propionibacteria πληθυσμών από 9,0 να 9,7 log

10 cfu /ml, για τους λιγότερο και για τον πιο αποτελεσματικό στέλεχος, αντίστοιχα.

Το κυτταροτοξικό δυναμικό των υπερκειμένων που παρασκευάζεται από γάλα ή γάλα υπερδιήθησης, τόσο που έχουν υποστεί ζύμωση από

P. freudenreichii

ITG Ρ9, διερευνήθηκε. ΗΤ-29 ανθρώπινου κόλον καρκινικά κύτταρα και HGT-1 ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυτά τα υπερκείμενα. Διαφορετικές αραιώσεις κυμαινόμενες από ½ έως ελέγχθηκαν. Επιπλέον, η κυτταροτοξικότητα ενός μίγματος 15 mM οξικού και 30 mM προπιονικό ελέγχθηκε, σε συγκεντρώσεις κοντά σε αυτές ½ αραιωμένα υπερκείμενα. Ως θετικοί έλεγχοι της επαγωγής απόπτωσης, η καμπτοθεκίνη φάρμακα χημειοθεραπείας (4 μΜ) και ετοποσίδη (100 μΜ) χρησιμοποιήθηκαν για HGT-1 και κύτταρα ΗΤ-29, αντίστοιχα. συγκρίθηκαν τρεις διαφορετικές μεθόδους παρακολούθησης κυτταρικού θανάτου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S2, μπλε του μεθυλενίου, ΜΤΤ και κυανού ανιχνεύσεις αποκλεισμού έδωσε παρόμοια κινητική του θανάτου. Κατά συνέπεια, το κυανούν του μεθυλενίου δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη για να εκτιμηθεί περαιτέρω η κυτταρική βιωσιμότητα. Τα μη ζυμωμένα γαλακτοκομικά προϊόντα (γάλα ή γάλα υπερδιήθημα) δεν είχε καμία επίδραση, ούτε σε ΗΤ-29, ούτε στη βιωσιμότητα των κυττάρων HGT-1 (Σχ. 1 Α, Β). Το υπερκείμενο γάλακτος ή γαλακτοκομικών υπερδιήθησης που έχουν υποστεί ζύμωση από

P. freudenreichii

προκάλεσε μια παρόμοια κυτταροτοξικότητα σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο σε ΗΤ-29 και τα κύτταρα HGT-1, και κοντά στην κυτταροτοξικότητα που επάγεται από φάρμακα είτε με ανάμιξη οξικού /προπιονικού. Ημι-μέγιστη θανάτωση των κυττάρων HGT-1 εμφανίστηκαν μετά από 24 ώρες και 26 ώρες της θεραπείας με το γάλα που έχει υποστεί ζύμωση και που έχουν υποστεί ζύμωση τα υπερκείμενα υπερδιηθήματος γάλακτος αντίστοιχα, μετά από 17 ώρες της θεραπείας με καμπτοθεκίνη και μετά από 24 ώρες θεραπείας με μίγμα SCFA (Εικ. S3) . Επιπλέον, η κυτταροτοξικότητα του ζυμωμένου γαλακτοκομικού προϊόντος υπερκειμένων σε κύτταρα HGT-1 ήταν δοσοεξαρτώμενη (Εικ. 1 C). Για κάθε αραίωση δοκιμάστηκε, η πτώση της βιωσιμότητας των κυττάρων HGT-1 που προκαλείται από το ζυμωμένο γάλα ή ζυμωμένου γάλακτος υπερδιήθημα ήταν πολύ παρόμοια (Σχ 1C & amp?. Εικ. S3). Γι ‘αυτό και τα επόμενα βήματα της μελέτης που διεξάγεται μόνο με τη ζύμωση του γάλακτος υπερκείμενο υπερδιηθήματος. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι propionibacteria σκοτώσει αποτελεσματικά ανθρώπινου κόλου και γαστρικά καρκινικά κύτταρα, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της παραγωγής προπιονικού και οξικού (Εικ. 1). Κάποια άλλα γάλατα που έχουν υποστεί ζύμωση, έχουν υποστεί ζύμωση από διαφορετικά στελέχη γαλακτοκομικά propionibacteria, έδειξε παρόμοια κυτταροτοξικά αποτελέσματα σε καρκινικά κύτταρα (Πίνακας S2).

P. freudenreichii

ITG P9 είναι γνωστή για την μεταβολική δραστηριότητα του

in vivo

[22], η αντίστοιχη γάλα που έχει υποστεί ζύμωση μελετήθηκε περαιτέρω.

(Α) Επίδραση του

P. freudenreichii

ζυμωμένο γάλα σε ΗΤ-29 ανθρώπινου ορθοκολικού καρκινικά κύτταρα. ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με αραίωση ½, σε DMEMc, υπερκειμένων που λαμβάνονται από γάλα που έχει υποστεί ζύμωση ή ζυμωμένο γάλα υπερδιηθήματος (τετράγωνα). Ως αρνητικοί μάρτυρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ½ αραιώσεις δεν έχουν υποστεί ζύμωση γάλα ή γάλα υπερδιήθημα (διαμάντια). Ως θετικοί μάρτυρες (τρίγωνα), τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMEMc περιέχει ένα μίγμα οξικού και προπιονικού (C2 /C3, 15/30 mM) ή ετοποσίδης (100 μΜ). (Β) Επίδραση των

P. freudenreichii

το γάλα που έχει υποστεί ζύμωση για HGT-1 ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου κύτταρα. κύτταρα HGT1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αραίωση ½, σε DMEMc, υπερκειμένων που λαμβάνονται από γάλα που έχει υποστεί ζύμωση ή ζυμωμένο γάλα υπερδιηθήματος (τετράγωνα). Ως αρνητικοί μάρτυρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ½ αραιώσεις δεν έχουν υποστεί ζύμωση γάλα ή γάλα υπερδιήθημα (διαμάντια). Ως θετικοί μάρτυρες (τρίγωνα), τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMEMc περιέχει ένα μίγμα οξικού και προπιονικού (C2 /C3, 15/30 mM) ή καμπτοθεκίνη (4 μΜ). (C) Δόση-εξάρτηση του ζυμωμένου γάλακτος κυτταροτοξική δράση. κύτταρα HGT-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές αραιώσεις του υπερκειμένου που λαμβάνεται από γάλα (άδειο σύμβολα) ή υπερδιήθημα γάλα (απλό σύμβολα) και οι δύο έχουν υποστεί ζύμωση με

P. freudenreichii

. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία κυανού του μεθυλενίου μετά από διαφορετικές περιόδους της θεραπείας. Το ποσοστό βιωσιμότητας υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: 100 (τιμές οπτικής πυκνότητας των επεξεργασμένων κυττάρων /τιμές οπτικής πυκνότητας των μη επεξεργασμένων κυττάρων) χ. Τα αποτελέσματα είναι μέσες τιμές τριών πειραμάτων.

Η

P. γάλα που έχει υποστεί ζύμωση freudenreichii

επάγει τυπικά σημάδια απόπτωσης σε ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα

Nucleus μορφολογία του HGT-1 κύτταρα επωάζονται παρουσία της

P. freudenreichii

ζυμωμένο γάλα υπερδιήθημα αναλύθηκε με μικροσκοπία φθορισμού μετά από χρώση Hoechst 33342 (Σχ. 2Α). Η πυρηνική φθορισμός των μη επεξεργασμένων κυττάρων (ελέγχου) παρέμεινε αμετάβλητο κατά τη διάρκεια της χρονικής πορείας του πειράματος με μπλε κανονική πυρήνες (χρόνος 0 ώρες, το Σχ. 2Αα). Κατά τη διάρκεια της θεραπείας, τα κύτταρα HGT-1 εμφανίζονται τα συμπυκνωμένη χρωματίνη και κατακερματισμένη πυρήνες χαρακτηριστικά αποπτωτικών πυρήνων (Σχ. 2Ab, γ), ακολουθούμενη από την εμφάνιση αποπτωτικών σωμάτων σε 72 ώρες (Εικ. 2Ad). Inter-νουκλεοσωμάτων κατάτμηση του DNA με αποτέλεσμα τμήση DNA, ένα τυπικό σημάδι απόπτωσης [27], επίσης παρακολουθείται κατά τη διάρκεια της θεραπείας ζυμωμένο γάλα υπερδιήθημα. κατάτμηση DNA Παρατηρήθηκε από 24 ώρες θεραπείας με ζυμωμένου γάλακτος υπερδιήθημα (Εικ. 2Β), και σε μικρότερο βαθμό με καμπτοθεκίνη (Εικ. S3). περιεχόμενο DNA επίσης ποσοτικοποιείται με κυτταρομετρία ροής μετά από σήμανση με ιωδιούχο προπίδιο για να μελετήσει την επίδραση που έχουν υποστεί ζύμωση υπερδιηθήματος γάλακτος σε HGT-1 κατανομή κυτταρικού κύκλου (Εικ. 2C). Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα HGT-1 παρουσίασε μια κατανομή του κυτταρικού κύκλου (σχ. 2Ca) χωρίς φάση subG1, η οποία παρέμεινε αμετάβλητη κατά τη διάρκεια της χρονικής πορείας του πειράματος (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Το ποσοστό των κυττάρων στη φάση subG1, ενδεικτικό μιας αποπτωτικής διαδικασίας, αυξήθηκε σημαντικά με το χρόνο κατά τη διάρκεια της ζυμωμένο θεραπείας γάλα υπερδιήθημα (Σχ 2Cb, Cc, Cd.): 24 h (39,24 ± 4,87%), στις 48 ώρες (91.63 ± 0.28 %) και στις 72 ώρες (94.79 ± 0.45%). Στις 48 h και 72 h της θεραπείας, όλα τα κύτταρα ήταν στην φάση του κύκλου subG1 κύτταρο, υποδεικνύοντας την πλήρη θάνατο των κυττάρων HGT-1. Ως μάρτυρας, καμπτοθεκίνη προκάλεσε παρόμοιες σφραγίδες αποπτωτικά σε HGT-1 κύτταρα (Σχ. S4).

(Α) προβιοτικά γαλακτοκομικά υπερδιήθημα που προκαλείται πυρηνική συμπύκνωση. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν (0 h) ή θεραπεία για 24, 48 ή 72 ώρες με μια αραίωση ½ του

P. freudenreichii

που έχουν υποστεί ζύμωση του γάλακτος υπερδιήθησης (UF) υπερκείμενο. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 πριν από τη μικροσκοπία φθορισμού. Τα βέλη δείχνουν συμπύκνωση χρωματίνης (β), πυρηνική κατάτμηση (γ) και σχηματισμό αποπτωτικών σωμάτων (δ). (Β) ζύμωση του γάλακτος υπερδιήθησης που προκαλείται από τον κατακερματισμό του DNA σε κύτταρα HGT-1. Γονιδιωματικό ϋΝΑ εξήχθη και αναλύθηκε σε γέλη αγαρόζης 1%. κύτταρα HGT-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο (Α). (C) που έχει υποστεί ζύμωση γάλα υπερδιήθησης που προκαλείται από τις αλλαγές στην κατανομή φάση του κυτταρικού κύκλου. περιεχόμενο DNA των κυττάρων HGT-1 αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Τα αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα που αντιστοιχούν στην ανάλυση του περιεχομένου του DNA των κυττάρων HGT-1 που παρουσιάζεται. Το ποσοστό του κυτταρικού πληθυσμού με περιεχόμενο DNA υπο-G1, ενδεικτική της απόπτωσης, υποδεικνύεται. Αναλογία κάθε κύτταρο υποσύνολα (υπο-G1, G0 /G1, S, G2 /M), εντός του συνολικού κυτταρικού πληθυσμού, παρουσιάζεται για κάθε χρόνο της θεραπείας. Τα αποτελέσματα είναι μέσες τιμές από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± sd. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, κατεργασμένα κύτταρα έναντι του ελέγχου (0 h). Η κατανομή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου των μη επεξεργασμένων κυττάρων (έλεγχος) παρέμεινε αμετάβλητη καθ ‘όλη τη πειράματος.

Η

Για να επιβεβαιωθεί η επαγωγή της απόπτωσης, phosphatdylserine μετατόπιση από το εσωτερικό προς το εξωτερικό φύλλο της μεμβράνης πλάσματος αξιολογήθηκε με χρώση HGT-1 κύτταρα με ένα συνδυασμό αννεξίνης V-FITC (AV) και 7-AAD, που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής φθορισμού (Εικ. 3). Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (0 h) παρουσίασε μια υψηλή αναλογία των ζωντανών κυττάρων (AV

– /7ΑΑΌ

-? 92%) και μόνο το 5% των κυττάρων χρωματίστηκαν με αννεξίνη V (Σχήμα 3Β).. Τα ποσοστά αυτά προσδιορίζονται ακατέργαστα κύτταρα δεν άλλαξε κατά τη διάρκεια της χρονικής πορείας του πειράματος (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Κατά τη διάρκεια της θεραπείας του HGT-1 κύτταρα με ½ αραιωμένο ζυμωμένο γάλα υπερδιηθήματος σε DMEMc, το ποσοστό των κυττάρων χρωματίστηκαν μόνο με 7-AAD (υποδεικνύοντας νέκρωση) ήταν πολύ χαμηλή (Σχ. 3Β). Ωστόσο, τα ποσοστά των κυττάρων που χρωματίζονται με αννεξίνη V αυξήθηκε σημαντικά σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο και έφθασε το 80% σε 72 h (Σχ. 3Β). Ως εκ τούτου, τα κύτταρα HGT-1 υπέστησαν απόπτωση μετά από θεραπεία με

P. freudenreichii

ζύμωση υπερδιηθήματος γάλακτος, η οποία χαρακτηρίζεται από το πρώτο AV θετική χρώση, υποδεικνύοντας την έκθεση φωσφατιδυλσερίνης, και στη συνέχεια οι δύο AV και θετική χρώση 7-AAD, υποδεικνύοντας μια μεταγενέστερη απώλεια της ακεραιότητας της μεμβράνης. Ως μάρτυρας, καμπτοθεκίνη προκάλεσε παρόμοιες σφραγίδες αποπτωτικά (Εικ. S5).

κυτταρομετρίας ροής κινητική ανάλυση του κυτταρικού θανάτου σε HGT-1 κύτταρα κατεργασμένα με

P. freudenreichii

ζύμωση υπερδιηθήματος γάλακτος. (Α) Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα αννεξίνης V /7-AAD χρώση των κυττάρων HGT-1 σε κάθε χρόνο της θεραπείας παρουσιάζεται, με αναλογίες αννεξίνης V θετικών κυττάρων (AV +? Αποπτωτικά κύτταρα). (Β) Ποσοτική ανάλυση FACS αννεξίνης V-FITC (AV) δέσμευση σε κύτταρα HGT-1 πραγματοποιήθηκε μετά αντικηλίδωση με 7-αμινοακτινομυκίνης-D (7ΑΑϋ). Παρουσιάζονται τιμές αντιστοιχούν στην αναλογία του κάθε κυττάρου υποσύνολα, εντός του συνολικού πληθυσμού κυττάρων, για κάθε χρόνο θεραπείας. Τα αποτελέσματα είναι μέσες τιμές από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± sd. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01, κατεργασμένων κυττάρων έναντι του ελέγχου (0 h)

Η

Όπως ΕΕΑΥ πράξη άμεσα σε μιτοχόνδρια, τρεις σημαντικές μιτοχονδριακή παράμετροι προσδιορίστηκαν επίσης: το δυναμικό ΔΨm εσωτερική μεμβράνη, και την παραγωγή ROS, χρησιμοποιώντας δύο φθορίζοντες ανιχνευτές, DiOC (6) 3 (η οποία είναι ΔΨm ευαίσθητη) και DHE (η οποία ανιχνεύει O

2

– επίπεδο), και ο εντοπισμός του κυτοχρώματος c. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (0 h) εμφάνισαν ένα υψηλό φθορισμό (υψηλή ΔΨm) και ένα χαμηλό φθορισμό διυδροεργοταμίνης (χαμηλή παραγωγή O

2

-) (Εικ. 4Α, Β). Μετά τη θεραπεία με ζυμωμένο γάλα υπερδιήθημα, μια χρονο-εξαρτώμενη μείωση στην ενσωμάτωση DiOC6 (3), φθορίζων ανιχνευτής παρατηρήθηκε, αποκαλύπτοντας ένα απώλεια ΔΨm και ως εκ τούτου μιτοχονδριακή αποπόλωση της μεμβράνης (Σχ. 4Α). Τα ποσοστά των επεξεργασμένων HGT-1 κυττάρων με μειωμένο δυναμικό εσωτερική μεμβράνη αυξήθηκε με χρονο-εξαρτώμενο τρόπο να φθάσει το 96% των κυττάρων σε 72 ώρες. θεραπεία FCCP χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος της μιτοχονδριακής εκπόλωση της μεμβράνης. Αυτή η απώλεια ΔΨm επιβεβαιώθηκε από την χαρακτηριστική απώλεια σε κόκκινο φθορισμό εξής JC-1 χρώσης (Εικ. 4Β). Όσον αφορά την παραγωγή ROS σε κύτταρα HGT-1, που έχουν υποστεί ζύμωση θεραπεία υπερδιηθήματος γάλακτος επαγόμενη συσσώρευση O

2

-, σημαντικά μετά από 48 ώρες και 72 ώρες της θεραπείας (σχήμα 4Γ).. Αυτή η συσσώρευση ROS μπορεί να αποτραπεί εν μέρει εάν τα κύτταρα προ-επεξεργασία με την ROS καθαριστή TEMPOL (Εικ. S6). Το κυτόχρωμα c απελευθέρωση από μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα είναι μια βασική κυτταρική εκδήλωση της αποπτωτικής προγράμματος. Ανοσοκηλίδωση εξέταση των κλασμάτων κυτταρόπλασμα εμπλουτισμένα για την παρουσία του κυτοχρώματος c επιβεβαίωσε μια αλλαγή στην υποκυτταρική εντόπιση του (Εικ. 4D). Το κυτόχρωμα c ανιχνεύθηκε στο κυτταρόπλασμα εμπλουτισμένο κλάσμα από 24 ώρες της αγωγής, υποδεικνύοντας μετεγκατάσταση αυτής της πρωτεΐνης (Εικ. 4D). Αυτό επανατοπικοποίηση του κυτοχρώματος c στο κυτταρόπλασμα επιβεβαιώθηκε από ανοσοχρώση, δείχνοντας διάχυτη ανοσοχρώση σε όλο το κύτταρο μετά τη θεραπεία, ενώ Διακοπτόμενης χρώση πριν από τη θεραπεία (Εικ. 4Ε).

Κινητική ανάλυση του μιτοχονδριακού γεγονότα στην HGT-1 κύτταρα επεξεργασμένα με

P. freudenreichii

υποστεί ζύμωση υπερδιηθήματος γάλακτος (Α) κυτταρομετρίας ροής κινητική ανάλυση του μιτοχονδριακού εσωτερική μεμβράνη (ΔΨm) απαγωγή με DiOC (6) 3 χρώση. Μια προβολή επικάλυψης ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος φαίνεται. Η αποσύνδεση FCCP (50 μΜ, 20 λεπτά) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Οι ποσοτικές αναλύσεις της απώλειας ΔΨm σε 3 ανεξάρτητα πειράματα φαίνονται. Οι τιμές παρουσιάζονται ως ποσοστό των κυττάρων με χαμηλή ΔΨm, εντός του συνολικού πληθυσμού κυττάρων, για κάθε επεξεργασία. Τα αποτελέσματα είναι μέσες τιμές από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± sd. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, αντιμετωπίζονται έναντι του ελέγχου (0 h). (Β) HGT-1 κύτταρα χρωματίστηκαν με JC-1. Η απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης υποδεικνύεται από την προοδευτική απώλεια των ερυθρών-JC-1-συσσωμάτωμα φθορισμού και κυτταροπλασματική διάχυση του πράσινου φθορισμού μονομερούς (C) κυτταρομετρίας ροής κινητική ανάλυση του ανιόντος υπεροξειδίου (O

2

-) συσσώρευση με χρώση DHE. Μια επικάλυψη ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος ανίχνευσης ROS σε κάθε χρόνο της θεραπείας δείχνεται. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με dihydroethidium και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Το οξειδωτικών menadione (Men., 100 μΜ, 15 λεπτά) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Οι τιμές παρουσιάζονται ως ποσοστό των κυττάρων με αυξημένη ROS (αύξηση της έντασης φθορισμού), εντός του συνολικού κυτταρικού πληθυσμού, για κάθε επεξεργασία. Τα αποτελέσματα είναι μέσες τιμές από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± sd. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, αντιμετωπίζονται έναντι του ελέγχου (0 h). (Δ) Η γ μετεγκατάσταση κυτοχρώματος καθ ‘όλη τη διάρκεια της θεραπείας με

P. freudenreichii

ζύμωση υπερκείμενο γάλα υπερδιήθησης ½ αξιολογήθηκε με ανάλυση Western blot. Μετά την αγωγή των κυττάρων, κλάσματα κυτταροπλάσματος-εμπλουτίζουν αναλύθηκαν με western αποτύπωση και αποκάλυψε τη χρήση ενός αντι-κυτοχρώματος c αντισώματος. Αντισώματα που κατευθύνονται έναντι Hsc-70 χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης. (Ε) Υποκυτταρικός εντοπισμός του κυτοχρώματος c. Τα κύτταρα ανοσοχρώση με το αντίσωμα αντι-κυτόχρωμα c, μετά από χρώση Mitotracker και πριν από τη χρώση του DNA με τη χρήση TO-PRO 3. Το βέλος δείχνει διάχυση του κυτοχρώματος c στο κυτταρόπλασμα.

Η

P. freudenreichii

που έχουν υποστεί ζύμωση του γάλακτος ενεργοποιεί κασπάσες

Για να επιβεβαιώσετε τις αποπτωτικών μηχανισμών που προκαλούνται από ζύμωση υπερδιηθήματος γάλακτος στην HGT-1 κύτταρα, η επεξεργασία των κασπασών 3, 8 και 9 αναλύθηκε με Western και αντίστοιχη παρακολούθηση ενζυματικές δραστηριότητες στην HGT -1 εκχυλίσματα κυττάρων (Εικ. 5). Το μη-ζυμωμένο γάλα υπερδιήθημα δεν προκάλεσε ενεργοποίηση της κασπάσης σε κύτταρα HGT-1: μόνον οι πρόδρομες μορφές της κασπάσης-3 και -9 ανιχνεύθηκαν σε κηλίδα western (Εικ. 5Α) και καμία δραστηριότητα κασπάσης μετρήθηκε (Σχήμα 5Β).. Το ζυμωμένο γάλα υπερκείμενο υπερδιήθημα, καθώς και η καμπτοθεκίνη ή το μίγμα προπιονικό και οξικό με μια μοριακή αναλογία [2: 1], που προκαλείται από τη διάσπαση της προ-κασπάσης 3 και την παραγωγή των δραστικών μορφών της κασπάσης-3, οι υπομονάδες ρ17 και ρ12 (Εικ. 5Α). Η ενεργοποίηση της κασπάσης-3, το οποίο είναι ένα κασπάσης τελεστή, επιβεβαίωσε την επαγωγή απόπτωσης. Επιπλέον, ζυμωμένο γάλα υπερδιήθημα επαγόμενη διάσπαση του procaspase-9, που οδηγούν στα 35 και 37 kDa επεξεργασμένες μορφές. Η κασπάση-8 δεν ανιχνεύτηκε σε μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου HGT-1. Ωστόσο, η θεραπεία με propionibacterial υπερκείμενα ή μίγμα /C3 C2 οδήγησε σε σαφή ανίχνευση της προκαταρκτικής μορφής 54 kDa, που ακολουθείται από διάσπαση του μετά από 48 ώρες θεραπείας.

Επεξεργασία των τελεστών κασπάσης 3 και εκκινητή κασπάσες 8 και 9 που ακολουθείται από κηλίδωση Western και ειδική παρακολούθηση ενζυματικές δραστηριότητες σε κύτταρα HGT-1. (Α) Οι πρόδρομες μορφές και διασπάται υπομονάδες της κασπάσης 3, 8, και 9 ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western σε λύματα HGT-1 κύτταρα κατεργασμένα με

P. freudenreichii

που έχουν υποστεί ζύμωση του γάλακτος υπερκείμενο υπερδιηθήματος ½. Μη ζυμωμένο γάλα υπερδιήθημα (UF ½, 48 ώρες), ένα μίγμα οξικού και προπιονικού (C2 /C3, 15/30 mM, 48 ώρες) και καμπτοθεκίνη (4 μΜ, 48 ώρες) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Αντισώματα που κατευθύνονται έναντι Hsc-70 χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) κασπάσες ειδικές δραστηριότητες των προϊόντων λύσης από κύτταρα επεξεργασμένα ως ανωτέρω μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας υποδεικνύεται πεπτίδια και υπολογίζεται όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Τα αποτελέσματα είναι μέσες τιμές τριών πειραμάτων ± SD. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01, αντιμετωπίζονται έναντι του ελέγχου (0 h)

Η

Η ποσοτικοποίηση της κασπάσης-3, -8 και -9 ενζυματικές δραστηριότητες επιβεβαίωσε την ενεργοποίηση της κασπάσης και από τις δύο propionibacterial μεταβολίτες και από καμπτοθεκίνη. Πράγματι, κασπάσες-9 και -3 ενεργοποιήθηκαν στα αρχικά στάδια της θεραπείας, ενώ η κασπάση-8 φαίνονταν ενεργοποιηθεί αργότερα (Σχ. 5Β). Καμπτοθεκίνη και το μείγμα ΕΕΑΥ ενεργοποιηθεί όλες τις τρεις μελετηθεί κασπασών. Αυτά τα δεδομένα επιβεβαίωσαν την ενεργοποίηση της ενδογενούς οδού απόπτωσης με ζυμωμένου γάλακτος θεραπεία υπερδιήθημα, με μια πρώιμη ενεργοποίηση της κασπάσης-9 και στη συνέχεια της κασπάσης-3 και -8.

P. γάλα που έχει υποστεί ζύμωση freudenreichii

αυξάνει καμπτοθεκίνης κυτταροτοξικότητα

Campthotecin είναι ένα κυτταροτοξικό αλκαλοειδές κινολίνη η οποία αναστέλλει το ένζυμο DNA τοποϊσομεράση Ι (topo Ι) και χρησιμοποιείται ευρέως στην χημειοθεραπευτική αγωγή του GC. Δείξαμε παραπάνω ότι propionibacterial μεταβολίτες επάγει απόπτωση σε HGT-1 κύτταρα μέσω του μιτοχονδριακό μονοπάτι θανάτου. Εμείς επόμενη μελέτησαν την απόπτωση που επάγεται από το συνδυασμό των δύο καμπτοθεκίνης και ζυμωμένο γάλα υπερδιηθήματος σε κύτταρα HGT-1. Αυξημένες συγκεντρώσεις καμπτοθεκίνης (0, 0,25, 0,5, 1, 2 μΜ) σε συνδυασμό με αυξημένες συγκεντρώσεις του ζυμωμένου υπερδιηθήματος γάλακτος (0,, ⅛, ¼) εξετάστηκαν στη βιωσιμότητα των κυττάρων HGT-1 και δύο προκαλούμενη απώλεια HGT-1 βιωσιμότητα , με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 6). Επιπλέον, η προσθήκη του ζυμωμένου υπερδιηθήματος γάλακτος ενίσχυσε σημαντικά την κυτταροτοξικότητα της καμπτοθεκίνης στα κύτταρα HGT-1 (Εικ. 6). Για παράδειγμα, 0,25 μΜ καμπτοθεκίνη και ζυμωμένο υπερδιηθήματος γάλακτος αραιώνονται σε ⅛ οδήγησε σε απώλεια βιωσιμότητας του 8,6% και 18,6%, αντίστοιχα. Ο συνδυασμός αυτών των δύο ενώσεων οδήγησε σε απώλεια κυτταρικής βιωσιμότητας του 29,8% (Εικ. 6), προτείνοντας μια προστιθέμενη επίδραση κυτταροτοξικότητα όταν καμπτοθεκίνης συνδυάστηκε με ζυμωμένο γάλα υπερδιηθήματος σε κύτταρα HGT-1. Κατά συνέπεια, ο δείκτης συνδυασμού (CI), η οποία υπολογίζεται όπως και στο παρελθόν [28], έχει την τιμή 1, υποδεικνύοντας μια αθροιστική δράση της camptothecin έχουν υποστεί ζύμωση και θεραπείες υπερδιηθήματος γάλακτος.

Βιωσιμότητα των HGT-1 ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου αντιμετωπίζονται κατά τη διάρκεια της 24 ώρες αξιολογήθηκε με κυανού του μεθυλενίου δοκιμασίας. κύτταρα HGT-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις καμπτοθεκίνης (0 έως 2 μΜ) μαζί με διαφορετικές αραιώσεις του

P. freudenreichii

που έχουν υποστεί ζύμωση του γάλακτος υπερδιήθησης (UF) υπερκείμενο. Το ποσοστό βιωσιμότητας υπολογίστηκε με τον ακόλουθο τύπο: 100 (τιμές οπτικής πυκνότητας των επεξεργασμένων κυττάρων /τιμές οπτικής πυκνότητας των μη επεξεργασμένων κυττάρων) χ. Τα αποτελέσματα είναι μέσες τιμές τριών πειραμάτων ± SD. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01, κατεργασμένων κυττάρων έναντι των ελέγχων (ίδια συγκέντρωση καμπτοθηκίνη χωρίς να έχουν υποστεί ζύμωση υπερκείμενο γάλα υπερδιηθήματος και ίδια αραίωση που έχουν υποστεί ζύμωση υπερκείμενο γάλα υπερδιήθημα χωρίς καμπτοθεκίνη)

Συζήτηση

Ένα νέο γάλα που έχει υποστεί ζύμωση, που περιέχει

P. freudenreichii

ως μοναδικό βακτήριο, αναπτύχθηκε προκειμένου να διερευνήσει περαιτέρω το προβιοτικό δυναμικό αυτής της προετοιμασίας των γαλακτοκομικών προϊόντων της propionibacteria (αναθεωρούνται στο [29]). Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε ότι η υδατική φάση του παρόντος ζυμωμένου γάλακτος σκοτώνει ανθρώπινου κόλον και γαστρικού καρκίνου κύτταρα μέσω μεταβολιτών, συμπεριλαμβανομένων προπιονικό και οξικό, απελευθερώνεται από αυτό το βακτήριο. Αυτή η έννοια βασίζεται στις παρατηρούμενες κυτταροτοξικά αποτελέσματα του

P. freudenreichii

υποστεί ζύμωση υπερκείμενα γάλα σε καλλιεργημένα ΗΤ-29 και HGT-1 καρκινικών κυττάρων. Αυτό το αποτέλεσμα λήφθηκε με υπερκείμενα υπερφυγοκέντρηση, δηλαδή το ζυμωμένο γάλα υδατική φάση, άνευ καζεϊνών και των βακτηρίων, δείχνοντας ότι οι δραστικές ενώσεις που εκκρίνεται, όπως περιγράφηκε προηγουμένως για propionibacteria [19]. Για το λόγο αυτό, τα περισσότερα από τα πειράματα σε αυτό το έργο πραγματοποιήθηκαν με ζυμωμένου γάλακτος υπερδιήθημα (Εικ. 1). Δείξαμε για πρώτη φορά ότι

P. freudenreichii

ζυμωμένο γάλα υπερκείμενο επαγόμενη απόπτωση HGT-1 κυττάρων σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, με την εμφάνιση της κλασικής μορφολογικές και βιοχημικές λειτουργίες της απόπτωσης (συνοπτικές και κατακερματισμένη χρωματίνη, κλιμάκωσης ϋΝΑ και συσσώρευση κυττάρων σε κυτταρικό κύκλο subG1 φάση).

Εξετάσαμε στη συνέχεια, αν οι κυτταρικοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην HGT-1 μονοπάτι κυτταρικού θανάτου ήταν παρόμοιες με το μιτοχονδριακό μονοπάτι θανάτου ενεργοποιείται σε Caco-2 και ΗΤ-29 ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα με

P. freudenreichii

υπερκείμενα DMEMc πολιτισμού [19], [20]. Οι υπο-κυτταρικά και βιοχημικά γεγονότα που παρατηρήθηκαν σε αγωγή HGT-1 κύτταρα με ζυμωμένο υπερδιηθήματος γάλακτος ήταν παρόμοιες και περιλαμβάνονται, τουλάχιστον, μιτοχονδριακό απώλεια ΔΨm, ROS (O

2

-) γενιάς, κασπάσες επεξεργασία και ενεργοποίηση, κυτόχρωμα γ μετεγκατάσταση στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 3, 4, 5). Ζύμωση υπερκείμενο γάλα επαγόμενη επεξεργασία και την ενεργοποίηση της κασπάσης-8, εκτός από κασπάσες -3 και -9.