Αφηρημένο

Ιστορικό

Kaempferol έχει προταθεί ως πιθανή φάρμακο για χημειοπροφύλαξη και θεραπεία του καρκίνου, διότι είναι μια φυσική πολυφαινόλη που περιέχεται στο φυτικής προέλευσης τρόφιμα. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι kaempferol προστατεύει από καρδιαγγειακά νοσήματα και τον καρκίνο. Με βάση αυτό το εύρημα, ερευνήσαμε τους μηχανισμούς με τους οποίους kaempferol παράγει το αντι-μεταστατική επίδραση στην ανθρώπινη γλώσσα κύτταρα SCC4 ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Σε αυτή τη μελέτη, υπό τον όρο μοριακή αποδεικτικά στοιχεία που σχετίζονται με το αντι-μεταστατική δράση των kaempferol αποδεικνύοντας μία σημαντική καταστολή της μετανάστευσης κυττάρων και SCC4 εισβολή. Αυτό το αποτέλεσμα συσχετίστηκε με μειωμένη εκφράσεις του ΜΜΡ-2 και ΤΙΜΡ-2 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. Ανάλυση της μεταγραφικής ρύθμισης ανέφερε ότι kaempferol ανέστειλε MMP-2 μεταγραφή από την καταστολή της δραστηριότητας c-Ιούνιος Kaempferol παρήγαγε επίσης ένα ανασταλτικό αποτέλεσμα επί της φωσφορυλίωση των ERK1 /2.

Συμπεράσματα

Αυτά τα ευρήματα παρέχουν νέες γνώσεις για τους μοριακούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στην αντι-μεταστατική δράση του καμπφερόλη, και είναι πολύτιμες η πρόληψη της στοματικής μετάστασης του καρκίνου

Παράθεση:. Lin CW, Τσεν PN, Τσεν ΜΚ, Γιανγκ ΕΜΕΙΣ, Tang CH, Yang SF, et al. (2013) Kaempferol Μειώνει μεταλλοπρωτεϊνάσης-2 Έκφραση από κάτω ρύθμιση ERK1 /2 και ο ενεργοποιητής πρωτεΐνης-1 μονοπάτια σηματοδότησης σε Oral Cancer Cells. PLoS ONE 8 (11): e80883. doi: 10.1371 /journal.pone.0080883

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: δεύτερης Οκτωβρίου του 2013? Αποδεκτές: 18, Οκτ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 του Νοέμβρη του 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε οικονομικά από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν (NSC-100-2632-B-040-001-my3). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

Στοματική ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (OSCC) είναι η έκτη πιο συχνή κακοήθεια σε όλο τον κόσμο και η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες στην Ταϊβάν [1]. Χειρουργική επέμβαση και ακτινοθεραπεία είναι ένα κρίσιμο τροπικότητα θεραπεία σε πρώιμο στάδιο της OSCC [2]. Παρά τις προόδους στη θεραπεία, OSCC εξακολουθεί να χαρακτηρίζεται ως επαναλαμβανόμενες και μετάσταση στην περιφερειακή κόμβους του τραχήλου της λέμφου, η οποία παράγει κακή πρόγνωση των ασθενών. Το ποσοστό επιβίωσης 5-χρόνια των ασθενών με καρκίνο είναι μικρότερη από 50%, αλλά οι πιθανότητες έγκαιρη διάγνωση και πρόληψη της νόσου αυτής είναι πιθανό να αυξηθεί εάν ο μοριακός μηχανισμός προσδιορίζεται [3]. Αν και η αιτία της OSCC είναι πολυπαραγοντική, μετάσταση, το οποίο είναι ανθεκτικό στις συμβατικές θεραπείες, είναι πιθανό να είναι η κύρια αιτία θανάτου [4].

Η αποδόμηση των βασικών μεμβρανών και στρωματικών εξωκυττάρια μήτρα (ECM) συστατικά συνιστά κρίσιμη διαδικασία κατά την τοπική εισβολή ιστού και μετάσταση [5]. Με εκκρίνουν πρωτεολυτικά ένζυμα, τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να δημιουργήσει ένα μονοπάτι για να μεταναστεύσουν τόσο σε τοπικό όσο και μακρινή. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) ανήκουν σε μία οικογένεια εξαρτώμενων από ψευδάργυρο ενδοπεπτιδασών που αποδομούν διάφορα συστατικά του ECM [6]. Η δομή και υπόστρωμα της οικογένειας ΜΜΡ επιτρέπει να διαιρεθεί σε υποομάδες των κολλαγενάσες, στρομελυσίνες, ζελατινάσες, MMPs τύπου μεμβράνης και άλλα MMPs [7]. Αυτά είναι κρίσιμα για κανονικές φυσιολογικές διεργασίες, όπως η εμβρυϊκή ανάπτυξη, φλεγμονή, αγγειογένεση, και επούλωση του τραύματος. Ωστόσο, πρόσφατη έρευνα απέδειξε ότι τα υψηλά επίπεδα των MMPs είναι συχνά συσχετίζονται με καρκίνους του ανθρώπου, όπως του πνεύμονα [8], του μαστού [9], το ήπαρ [10], και από του στόματος καρκίνων [11]. Οι δραστηριότητες των MMPs ρυθμίζονται από φυσιολογικές, αναστολείς μεταλλοπρωτεϊνασών ιστού (ΤΙΜΡ) [12]. Η ανισορροπία των ενεργών MMPs και TIMPs είναι ένα κρίσιμο στοιχείο που συμμετέχουν στην αναδιαμόρφωση της ECM εκτίθενται σε διάφορες νοσηρές καταστάσεις [13]. Gohji et al. πρότεινε ότι η ΜΜΡ-2 ορός:. αναλογία ΤΙΜΡ-2 είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης του ουροθηλιακά υποτροπής του καρκίνου [14]

Τα φλαβονοειδή είναι πολυφαινολικές ενώσεις που βρίσκονται σε φρούτα και λαχανικά [15]. Τα φλαβονοειδή που χρησιμοποιούνται συνήθως σε καρδιαγγειακή νόσο πρόληψη [16], [17]. Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα διαιτητικά φλαβονοειδή αναστέλλουν την ανάπτυξη διαφόρων ανθρώπινων καρκίνων, όπως του καρκίνου του μαστού [18], του καρκίνου του προστάτη [19] και του παχέος εντέρου [20]. Kaempferol, ένα φυσικό πολυφαινόλες που ανήκουν στην ομάδα των φλαβονοειδών, είναι παρούσα σε υψηλά επίπεδα στο τσάι, σταφύλια, μπρόκολο, και τα μούρα [21], [22]. Αρκετές προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι kaempferol εμφανίζει αντιοξειδωτικές [23], αντι-φλεγμονής [24] και κατά του όγκου ιδιότητες [25]. Υπάρχουν τουλάχιστον έξι διαφορετικούς τύπους φλαβονοειδών. Kaempferol ανήκει στην flavonol και έχουν παρόμοια δομή με quercein και μυρικετίνη, που επίσης έχουν αντικαρκινικές επιδράσεις [26]. Kaempferol ανακαλύφθηκε ότι αναστέλλει την αγγειογένεση και την έκφραση του VEGF σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, και τα μονοπάτια που εμπλέκονται στην ρύθμιση του HIF-1α [27]. Kaempferol παρήγαγε επίσης ένα αποτέλεσμα απόπτωση μέσω της έκφρασης της ΑΚΤ σε ανθρώπινα κύτταρα γλοιώματος [28] και τα κύτταρα λευχαιμίας [29]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι kaempferol επάγει G2 /M αναστολή του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό θάνατο αυτοφαγικά σε ανθρώπινα ηπατικά καρκινικά κύτταρα [30]. Επιπλέον, Kang et al., Ανέφεραν ότι kaempferol και quercetin επάγεται κασπάσης-3-εξαρτώμενη απόπτωση σε καρκίνο στοματικής κοιλότητας κύτταρα [31]. Ωστόσο, η επίδραση του kaempferol στην μετάσταση του καρκίνου του OSCC, και οι υποκείμενοι μηχανισμοί αυτής της επίδρασης δεν έχει ακόμη μελετηθεί. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η καταστολή της μεταστατικής ικανότητας από kaempferol παράγεται από την προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης της ΜΜΡ-2, και ελπίζουμε να αποτελέσει το θεμέλιο για την περαιτέρω έρευνα.

Υλικά και Μέθοδοι

κυττάρου και κυτταρική καλλιέργεια

SCC-4, ένα ανθρώπινο γλώσσα πλακώδες καρκίνωμα κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από την ATCC (Manassas, VA, USA) καλλιεργήθηκε σε τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle συμπληρωμένο με ίσο όγκο ενός θρεπτικού μείγμα, μέσο F-12 του Ham (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ, USA), 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA), 2 mM γλουταμίνη, 100 U /mL πενικιλλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη , και 400 ng /mL υδροκορτιζόνη. Όλες οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2.

προσδιορισμό κυτταρικής βιωσιμότητας (ΜΤΤ δοκιμασία)

κύτταρα SCC4 σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με kaempferol σε μια συγκέντρωση μεταξύ 0-100 μΜ στους 37 ° C για 24 ώρες. Μετά την περίοδο έκθεσης, το μέσο απομακρύνθηκε, και τα κύτταρα πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και στη συνέχεια επωάστηκαν με 20 μι ΜΤΤ (5 mg /mL) (Sigma Chemical Co., St. Louis, ΜΟ, USA) για 4 h. Ο αριθμός βιώσιμων κυττάρων ανά δίσκο είναι ευθέως ανάλογη προς την παραγωγή φορμαζάνης, με αφυδρογονάσες στα μιτοχόνδρια εντός ζώντων κυττάρων, τα οποία μπορεί να μετρηθεί φασματοφωτομετρικά στα 563 nm μετά διαλυτοποίηση με ισοπροπανόλη.

μετανάστευση των κυττάρων και δοκιμασίες εισβολή

Μετά από θεραπεία με καμπφερόλη (0, 20, 40, 60, 80 και 100 μΜ) για 24 ώρες, επιζώντα κύτταρα συλλέχθηκαν και σπάρθηκαν σε Boyden θάλαμο (Neuro Probe, Cabin John, MD, USA) στους 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε μέσο ελεύθερο ορού και στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες ή 48 ώρες στους 37 ° C στην δοκιμασία δοκιμασία μετανάστευσης ή εισβολή, αντίστοιχα. Για την ανίχνευση εισβολής, 10 μL Matrigel (25 mg /50 ml? BD Biosciences, MA, USA) εφαρμόσθηκε σε μm πόρου φίλτρα μεμβράνης 8 μέγεθος πολυανθρακικό και ο θάλαμος πυθμένα περιείχε πρότυπο μέσο. Τα εισέβαλαν κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 100% μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 5% Giemsa. Οι αριθμοί των κυττάρων μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός. Η δοκιμασία μετανάστευσης διεξήχθη όπως περιγράφεται στη δοκιμασία εισβολή χωρίς επίστρωση Matrigel.

τζελ υποστρώματος ζελατίνης zymography

Οι δραστηριότητες των ΜΜΡ-2 σε μέσο υπό όρους μετρήθηκαν με προσδιορισμούς πρωτεάσης ζελατίνης ζυμογραφία . Εν συντομία, τα οποία συλλέγονται μέσα ενημέρωσης του κατάλληλου όγκου (ρυθμίζεται με ζωτική αριθμό κυττάρων) παρασκευάστηκαν με ρυθμιστικό δείγματος SDS χωρίς βρασμό ή τη μείωση και υποβλήθηκαν σε 0.1% ζελατίνη-8% SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση. Μετά την ηλεκτροφόρηση, τα πηκτώματα πλύθηκαν με 2,5% Triton Χ-100 και στη συνέχεια επωάστηκαν σε ρυθμιστικό αντίδρασης (40 mM Tris-HCl, ρΗ 8,0? 10 mM ΟαΟ

2 και 0,01% NaN

3) για 12 ώρες στους 37 ° C ΝΤΟ. Στη συνέχεια, γέλη βάφτηκε με Coomassie brilliant blue R-250. Συγκροτήματα που αντιστοιχεί σε δραστικότητα ΜΜΡ-2 έγιναν ορατά με αρνητική χρώση χρησιμοποιώντας 0.3% Coomassie blue σε 50% μεθανόλη και 10% οξικό οξύ.

Western ανάλυση κηλίδος

κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν με εναιώρηση 2 χ 10

6/10 cm πιάτο σε 200 μι RIPA αναστολείς πρωτεάσης ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει κοκτέιλ. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση 10,000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C, και το αδιάλυτο σφαιρίδιο απορρίφθηκε. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης των συνολικά κυτταρολύματα προσδιορίστηκε με δοκιμασία Bradford. Τα 20 μg δείγματα από συνολικά κυτταρολύματα ή πυρηνικά κλάσματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 10% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας το Mini-Protean Tetra Σύστημα ηλεκτροφόρησης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Η κηλίδα στη συνέχεια επωάστηκαν με 5% άπαχο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (20 mM Tris, 137 mM NaCl, ρΗ 7,6) για 1 ώρα για να εμποδίσει μη-ειδική σύνδεση και στη συνέχεια όλη τη νύκτα με πολυκλωνικά αντισώματα έναντι ΜΜΡ-2, ΤΙΜΡ -2 ή τρεις MAPKs (ERK 1/2, 1/2 JNK και ρ38) με τα ειδικά αντισώματα για μη φωσφορυλιωμένα ή φωσφορυλιωμένες μορφές της αντίστοιχης ERK 1/2, 1/2 JNK και ρ38. Οι κηλίδες κατόπιν επωάστηκαν με μία υπεροξειδάση αρμορακίας κατσίκας αντι-κουνελιού ή αντι-ποντικού IgG για 1 ώρα. Στη συνέχεια, το σήμα ανιχνεύθηκε με τη χρήση ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) εμπορικό κιτ (Amersham Biosciences) και η σχετική φωτογραφική πυκνότητα μετρήθηκε ποσοτικά με σάρωση των φωτογραφικά αρνητικά σε ένα σύστημα τεκμηρίωσης γέλης και ανάλυσης (AlphaImager Σύστημα HP, η Alpha Innotech Corporation, San Leandro, Καλιφόρνια, USA).

απομόνωση RNA, ημι-ποσοτική RT-PCR και TaqMan ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από 1 × 10

6 SCC4 κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (ϋίβ Technologies , Grand Island, ΝΥ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ολικό RNA (2 μα) μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA με SuperScript III First-Strand Synthesis Supermix (Invitrogen, Carlsbad, CA). Η PCR διεξήχθη σε ένα μίγμα αντίδρασης που περιέχει 2 μι cDNA, 0,2 μίγμα mM dNTP, 2 μΜ εκάστου εκκινητές, 1 U Taq DNA πολυμεράσης, και 1-φορές συγκέντρωση της θερμικής Pol Ρυθμιστικό (New England BioLabs, MA, USA) με μετουσίωση στους 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από ενίσχυση του υποδεικνύεται κύκλοι των 95 ° C για 30 sec, 62 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 30 sec. Οι ειδικές αλληλουχίες εκκινητή για τα γονίδια αυτά έχουν ως εξής: ΜΜΡ-2: 5′-GGCCCTGTCACTCCTGAGAT-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-GGCATCCAGGTTATCGGGG Α-3′ (αντίστροφο), και ΤΙΜΡ-2: 5’-GGCGTTTTGCAATGCAGATGTAG-3 ‘ (προς τα εμπρός), 5’-CACAGGAGCCGTCACTTCTCTTG-3 ‘(αντίστροφο). Ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Taqman ενός σταδίου PCR Master Mix (Applied Biosystems). 100 ng του συνολικού cDNA προστέθηκαν ανά 25 μΐ αντίδραση με ΜΜΡ-2 ή GAPDH εκκινητές και ανιχνευτές Taqman. Τα ΜΜΡ-2 και GAPDH εκκινητές και ανιχνευτές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικό λογισμικό (ΑΒΙ PRISM Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας? Applied Biosystems). Ποσοτική PCR δοκιμασίες σε πραγματικό χρόνο διεξήχθησαν εις τριπλούν σε ένα StepOnePlus σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας. Το όριο ορίστηκε παραπάνω υπόβαθρο ελέγχου μη-πρότυπο και εντός της γραμμικής φάσης της ενίσχυσης του γονιδίου-στόχου για τον υπολογισμό του αριθμού του κύκλου κατά την οποία ανιχνεύθηκε η μεταγραφή.

λουσιφεράσης δημοσιογράφος δοκιμασία γονιδιακής

SCC4 κύτταρα σπάρθηκαν σε μια συγκέντρωση 5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 6 φρεατίων. Ένα θραύσμα του υποκινητή ΜΜΡ-2 εισήχθη εντός του pGL3-βασικό φορέα για να δημιουργήσει το πλασμίδιο προαγωγό ΜΜΡ-2. Μετά από 24 ώρες επώασης, pGL3-βασικό (vector) και το πλασμίδιο προαγωγό ΜΜΡ-2 συν-επιμολύνθηκαν με φορέα έκφρασης β- γαλακτοζιδάσης (pCH110) σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Turbofect (Fermentas, Carlsbad, CA). Μετά από 12 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή καμπφερόλη (0, 20, 40, 60, 80 και 100 μΜ) για 24 ώρες. Λουσιφεράση και β-γαλακτοσιδάση δραστηριότητες δοκιμάστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Promega). Η φωταύγεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Tropix TR717 Microplate Luminometer (Applied Biosystems). Η αξία της δραστηριότητας της λουσιφεράσης κανονικοποιήθηκε προς αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης και παρακολουθούνται από την έκφραση β-γαλακτοσιδάσης.

μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας δοκιμασία

AP-1 προσδιορισμούς δέσμευσης σε πυρηνικά εκχυλίσματα εκτελέσθηκαν με επισημασμένο με βιοτίνη διπλό -stranded ολιγονουκλεοτίδια c-Jun (5′-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3 ‘), και η ηλεκτροφορητική κινητικότητα μετατόπιση δοκιμασία διεξήχθη με χρήση του κιτ Lightshift (Promega). Εν συντομία, η δέσμευση αντιδράσεις που περιέχουν 10 μg πυρηνικής πρωτεΐνης, 10 mM Tris, 50 mM ΚΟΙ, 1 mM διθειοθρεϊτόλη, 5 mM MgCl

2, 2 μg πολυ (δι · dC) και 2 pmole του ολιγονουκλεοτιδικού ανιχνευτή επωάστηκαν για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. σύμπλοκα DNA πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε 6% μη-μετουσίωσης γέλη ακρυλαμιδίου, μεταφέρθηκε σε θετικά φορτισμένη νάιλον μεμβράνες και, στη συνέχεια, με σταυροειδείς δεσμούς σε ένα Stratagene σταυροειδών δεσμών. μετατοπίσεις Gel οπτικοποιήθηκαν με στρεπταβιδίνη υπεροξειδάσης αρμορακίας ακολουθούμενη από ανίχνευση χημειοφωταύγειας. Τα μη επισημασμένα oligos του ΑΡ-1 σε 200 × προστέθηκαν για να ανταγωνιστούν ειδικά με δεσμευτικός επισημασμένο oligo στην ανταγωνιστική EMSA.

χρωματίνης ανάλυση ανοσοκαθίζησης (μάρκας)

ανάλυση ανοσοκαθίζησης χρωματίνης διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [33]. Εν συντομία, χρωματίνης και πρωτεΐνες από κατά προσέγγιση 2 χ 10

6 κύτταρα συνδέθηκαν σταυροειδώς με 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτά τα κύτταρα συλλέχθηκαν, λύθηκαν, και υφίσταται κατεργασία με υπερήχους επί πάγου για τη διάτμηση του DNA χρωματίνη σε ένα μήκος μεταξύ 200 – 1000 ζευγών βάσης με Sonicator 3000 (Misonix, ΝΥ, USA). Η επεξεργασία με υπερήχους λύμα χρωματίνη ανοσοκαταβυθίστηκε με αντι-c-Jun αντίσωμα, και συλλέγονται με σφαιρίδια αγαρόζης πρωτεΐνης Α /Ο (Pierce, IL, USA). Οι σταυρωτές συνδέσεις πρωτεΐνης /DNA των ανοσοκατακρημνισμένων συμπλεγμάτων αντιστράφηκαν με επώαση σε 0,2 Μ NaCl στους 65 ° C για 4 ώρες, και στη συνέχεια το DNA καθαρίστηκε και εφαρμόζεται σε PCR όπως περιγράφεται παραπάνω για να προσδιοριστεί η ικανότητα δέσμευσης του c-Jun να MMP- 2 προαγωγό. Οι αλληλουχίες των εκκινητών είναι 5′-CTCTTTAGCTCTTCAGGTCTCAGC-3 ‘(προς τα εμπρός), και 5′-TGTTGGGAACGCCTGACT-3’ (αντίστροφο).

Η στατιστική ανάλυση

Για όλες τις μετρήσεις, την ανάλυση της διακύμανσης ακολουθούμενη από Scheffe σύγκριση των υστέρων χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθούν οι διαφορές μεταξύ ελέγχου και κύτταρα επεξεργασμένα με διάφορες συγκεντρώσεις kaempferol. Μια διαφορά σε ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική και τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές

Αποτελέσματα

Επίδραση της kaempferol στην βιωσιμότητα των κυττάρων SCC4

Αναλύσαμε. οι κυτταροτοξικές επιδράσεις των kaempferol σε διάφορες συγκεντρώσεις (0-100 μΜ) σε κύτταρα SCC4 χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, με τη χρήση θεραπείας kaempferol επί των κυττάρων δεν παρήγαγε SCC4 κυτταροτοξική επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων. Συνεπώς, αυτή η περιοχή συγκέντρωσης kaempferol χρησιμοποιήθηκε στα ακόλουθα πειράματα.

κύτταρα SCC4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις (0, 20, 40, 60, 80, και 100 μΜ) του kaempferol για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό ΜΤΤ. Οι τιμές εκπροσωπούνται τα μέσα ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Kaempferol αναστέλλει τη μετανάστευση SCC4 κυττάρων και εισβολή

Για να εξεταστεί κατά πόσον η μετανάστευση των κυττάρων και την εισβολή είχαν κατασταλεί από καμπφερόλη, εμείς σπαρμένων κυττάρων SCC4 σε ένα θάλαμο Boyden και υπολογίζεται ο αριθμός των μεταστατικών κυττάρων σε παρουσία kaempferol. Παρατηρήσαμε ότι kaempferol ανέστειλε ουσιαστικά την μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων SCC4 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, με μόνο το 58% και το 56% που απομένει μετά από μια θεραπεία 100 μΜ kaempferol στις 24 ώρες και 48 ώρες, αντίστοιχα (Σχήματα 2Α και 2Β) .

Μετά την θεραπεία με kaempferol σε μία συγκέντρωση 0, 20, 40, 60, 80, και 100 μΜ, (Α), η κυτταρική μετανάστευση και (Β) εισβολή κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν θάλαμο Boyden για 24 ώρες και 48 ώρες, αντίστοιχα. Οι τιμές αντιπροσωπεύονται τα μέσα ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Kaempferol μειώνει την έκφραση των ΜΜΡ και ΤΙΜΡ

Για να αποδειχθεί κατά πόσον η καταστολή της μετανάστευσης SCC4 επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση ρύθμιση της έκφρασης ΜΜΡ-2 , μία δοκιμασία ζελατίνη ζυμογραφία διεξήχθη. Τα δεδομένα ζυμογραφία ζελατίνης έδειξε ότι η δραστικότητα του ενζύμου ΜΜΡ-2 ανεστάλη κατά 53% στην υψηλότερη συγκέντρωση του kaempferol (100 μΜ) (Σχήμα 3Α). Το Σχήμα 3Β δείχνει ένα στύπωμα Western ανάλυση των επιπέδων πρωτεΐνης ΜΜΡ-2 και ΤΙΜΡ-2. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης τόσο ΜΜΡ-2 και ΤΙΜΡ-2 μειώθηκαν σημαντικά. Η έκφραση mRNA κατέδειξε επίσης τα ίδια αποτελέσματα (Σχήμα 3C). Χρησιμοποιήσαμε επίσης μια ποσοτική PCR δοκιμασία σε πραγματικό χρόνο για την επιβεβαίωση της έκφρασης του mRNA των ΜΜΡ-2 (Σχήμα 3D). Έτσι, Kaempferol αναστέλλει σημαντικά την έκφραση του mRNA των ΜΜΡ-2 σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο.

κύτταρα SCC4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις (0, 20, 40, 60, 80, και 100 μΜ) του kaempferol για 24 ώρες . Τα ρυθμισμένα μέσα συλλέχθηκαν και ανιχνεύθηκε η δραστικότητα της ΜΜΡ-2 (Α), ή ένα στύπωμα Western με αντι-ΜΜΡ-2 και-ΤΙΜΡ-2 αντι αντισωμάτων πραγματοποιήθηκε (Β). (Γ) ποσοτικαί RT-PCR πραγματοποιήθηκε για σύγκριση ΜΜΡ-2 και ΤΙΜΡ-2 mRNA επίπεδα. Τα επίπεδα mRNA του ΜΜΡ-2 (Δ) ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία PCR πραγματικού χρόνου. Οι τιμές αντιπροσωπεύονται τα μέσα ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt?. 0.05, σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Kaempferol αναστέλλει τη μεταγραφική δραστηριότητα των MMP-2

Για να διερευνηθεί περαιτέρω αν η kaempferol ρυθμίζεται η δράση του υποκινητή της ΜΜΡ-2, που εκτέλεσε μια λουσιφεράσης δοκιμασίας ρεπόρτερ, και ένα γονίδιο ανταποκριτή που περιείχε την περιοχή προαγωγέα ΜΜΡ-2 επιμολύνθηκε μέσα στα κύτταρα SCC4. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, η δραστικότητα προαγωγέα ΜΜΡ-2 μειώθηκε με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας ότι kaempferol παρεμποδίζει την έκφραση της ΜΜΡ-2 στο μεταγραφικό επίπεδο.

(Α) κύτταρα SCC4 επιμολύνθηκαν με pGL3 βασικό ή ένα ΜΜΡ-2 πλασμιδίου υποκινητή /αναφοράς, στη συνέχεια κατεργάζεται με διάφορες συγκεντρώσεις (0, 20, 40, 60, 80, και 100 μΜ) του kaempferol. Μετά από 24-ωρη επώαση, η λουσιφεράση δραστηριότητες προσδιορίστηκαν και ομαλοποιήθηκε ως προς β-γαλακτοσιδάση δραστικότητα. (Β) Πυρηνικό εκχύλισμα που παρασκευάστηκε από SCC4 κυττάρων με διάφορες συγκεντρώσεις (0, 20, 40, 60, 80, και 100 μΜ) του kaempferol επωάστηκαν με βιοτίνη σημασμένο AP-1-ειδικά ολιγονουκλεοτίδια με συναινετική αλληλουχία για την ΑΡ-1 σύνδεση. Συνδεδεμένα σύμπλοκα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας. (Γ) Η πρόσδεση του c-Jun προς τον προαγωγό ΜΜΡ-2 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία chip. (D) Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα της c-Jun και τα επίπεδα πρωτεΐνης c-Fos χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Οι τιμές αντιπροσωπεύονται τα μέσα ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt?. 0.05, σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Kaempferol μειώνει c-Jun /ΑΡ-1 ενεργοποίηση σε κύτταρα SCC4

Επειδή τα προηγούμενα δεδομένα αποκάλυψαν ότι ΑΡ-1 ήταν ένας βασικός μεταγραφικός ρυθμιστή σε προαγωγή ΜΜΡ-2 [33], δοκιμασίες EMSA και το chip διεξήχθησαν στη συνέχεια για να διερευνηθεί η επίδραση της kaempferol στη δραστικότητα ΑΡ-1 δέσμευσης DNA. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 4Β, η δεσμευτική δραστικότητα της ΑΡ-1 προς τον προαγωγό ΜΜΡ-2 μειώθηκε σημαντικά σε κύτταρα SCC4 μετά από επεξεργασία με kaempferol σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Συγκεκριμένα, η ικανότητα σύνδεσης του ΑΡ-1 επί του υποκινητή του γονιδίου ΜΜΡ-2 κατεστάλη στα κύτταρα SCC4 μετά από επεξεργασία με 60 μΜ kaempferol (Σχήμα 4C) .Για τον προσδιορισμό των παραγόντων μεταγραφής, χρησιμοποιήσαμε μία δοκιμασία κηλίδος Western για την ανίχνευση πυρηνική μετατόπιση του c-Jun και c-Fos. Αγωγή κυττάρων SCC4 με kaempferol μείωσε την πυρηνική μετατόπιση του c-Jun, αλλά δεν προκάλεσε καμία επίδραση στο επίπεδο του c-Fos (Σχήμα 4D).

Kaempferol αναστέλλει τη φωσφορυλίωση των ERK1 /2

Σύμφωνα με τα δεδομένα που συλλέγονται, kaempferol ανέστειλε την κυτταρική μετανάστευση SCC4 με μείωση της έκφρασης της ΜΜΡ-2. Για να διερευνηθεί περαιτέρω τον υποκείμενο μηχανισμό της αντι-μεταστατική ικανότητα των kaempferol σε κύτταρα SCC4, χρησιμοποιήσαμε μία δοκιμασία κηλίδος Western για να ανιχνευθεί η έκφραση των ΜΑΡΚ. Το σχήμα 5Α δείχνει ότι η φωσφορυλίωση της ERK κατεστάλη μετά από επεξεργασία των κυττάρων με SCC4 kaempferol. Ωστόσο, η φωσφορυλίωση των οδών JNK1 /2 και p38 παρέμεινε ανεπηρέαστη (Σχήματα 5Β-5C).

κύτταρα SCC4 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες δόσεις καμπφερόλη (0, 20, 40, 60, 80, και 100 μΜ ) για 24 ώρες και τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου που παρασκευάζονται από αυτά τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση στυπώματος Western με (Α) αντι-ERK1 /2, (Β) αντι-JNK1 /2 και (Γ) αντι-ρ38 (συνολική και φωσφορυλιωμένο) αντισωμάτων ως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. Οι τιμές αντιπροσωπεύονται τα μέσα ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Επίδραση του kaempferol για την ΜΜΡ-2 έκφραση των κυττάρων σε επεξεργασία με SCC4 U0126

Για να αποδειχθεί κατά πόσον η καταστολή της MMP-2 έκφραση με kaempferol συνέβη κυρίως μέσω της αναστολής της /2 μονοπάτι σηματοδότησης ERK1, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία SCC4 με U0126, έναν αναστολέα ΜΕΚ. Τα δεδομένα ζυμογραφία ζελατίνης έδειξε ότι δραστικότητα του ενζύμου ΜΜΡ-2 κατεστάλη όταν θεραπεύονται μόνο kaempferol ή U0126 με 47% και 42%. Ωστόσο, ο συνδυασμός της θεραπείας του αναστολέα με kaempferol μειωμένη εντατικά δραστικότητα του ενζύμου ΜΜΡ-2 κατά 78% (Σχήμα 6Α). Επιπλέον, παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν από τη δοκιμασία του θαλάμου Boyden κυτταρική εισβολή. Το Σχήμα 6Β δείχνει ότι τόσο καμπφερόλη και εισβολή κυττάρων αναστέλλουν U0126, και θεραπείες που συνδυάζουν αυτά τα δύο χημικές ενώσεις ενισχύουν τη δραστηριότητα αντι-εισβολής. Συνεπώς, η αναστολή των οδών σηματοδότησης ERK1 /2 μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη έκφραση του ΜΜΡ-2, και μειωμένη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων.

κύτταρα SCC4 προ-αγωγή με U0126 (10 ή 20 μΜ) για 1 ώρα, και στη συνέχεια επωάστηκαν παρουσία ή απουσία kaempferol (60 μΜ) για 24 ώρες. (Α) Τα μέσα καλλιέργειας χρησιμοποιήθηκαν ως υποκείμενα για την ανάλυση της δραστηριότητας ΜΜΡ-2, και τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την δοκιμασία εισβολής (Β) όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. Οι τιμές αντιπροσωπεύονται τα μέσα ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Συζήτηση

Η κατανάλωση φρούτων και λαχανικών που περιέχουν φλαβονοειδή παράγει ζωτικής σημασίας οφέλη για την υγεία.. Kaempferol, ένα φλαβονοειδές, αποδεικνύει διάφορες βιολογικές και φαρμακολογικές επιδράσεις, όπως αντιοξειδωτική δράση και αντι-σχετίζονται με τον καρκίνο ιδιότητες [23], [31], [34]. Η μελέτη μας χρησιμοποιήθηκαν SCC4 στόματος πλακωδών κυττάρων καρκίνωμα, και τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι kaempferol (1) αναστέλλει τη μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων SCC4? (2) μειώνει την έκφραση γονιδίου και ενζυμική δραστηριότητα του ΜΜΡ-2? (3) μειώνει την πυρηνική μετατόπιση του AP-1 στον προαγωγέα ΜΜΡ-2? και (4) αναστέλλει την φωσφορυλίωση των ERK1 /2.

Αρκετές προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι πολυάριθμα φυτοχημικά χρησιμοποιούν αντι-μετάσταση ικανότητες καταστέλλοντας την ενεργότητα ενζύμου ή γονιδιακή έκφραση του ΜΜΡ-2 [35], [36] . Caffeic φαιναιθυλ οξέος αναστέλλει τον καρκίνο του στόματος κύτταρο μετάσταση με τη ρύθμιση των ΜΜΡ-2 και ΜΑΡΚ μονοπάτια [11]. Silibinin καταστέλλει ανθρώπινου οστεοσαρκώματος MG-63 εισβολή κυττάρων με αναστολή της ERK-εξαρτώμενη επαγωγή της ΜΜΡ-2 [37]. Wang et al παρατήρησαν ότι ΡΑΚ5-Egr1-ΜΜΡ-2 σηματοδότηση ελέγχει τη μετανάστευση και εισβολή σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [38]. Μολονότι το ΤΙΜΡ-2 ήταν ο φυσιολογικός αναστολέας της ΜΜΡ-2, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι kaempferol μειώνει ΜΜΡ-2 και ΤΙΜΡ-2 mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης. Σε προηγούμενες μελέτες, ΤΙΜΡ-2 υπερέκφραση μειωμένη εισβολή και την αγγειογένεση, και να προστατεύονται τα κύτταρα μελανώματος από απόπτωση [39]. Μπουρμπούλια et al. αποκάλυψε ότι ΤΙΜΡ-2 προάγει μία αντι-καρκινική μεταγραφικό προφίλ μέχρι ρύθμισης Ε-καδερίνης στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα [40]. Ωστόσο, de Vicente et al. έδειξαν ότι η έκφραση του ΤΙΜΡ-2 σε στοματικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων συσχετίστηκε με TNM στάσης, τοπική υποτροπή, και λιγότερο ευνοϊκά ποσοστά επιβίωσης [41]. Τα ίδια ευρήματα συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη που διενεργήθηκε από την Baker et al. ο οποίος ανακάλυψε υψηλότερα μέσα επίπεδα του ΤΙΜΡ-2 σε ιστό όγκου παρά σε κανονικό ιστό [42].

Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει πλήρως τον ρόλο του μονοπατιού ΜΑΡΚ στη ρύθμιση ΜΜΡ έκφραση [37], [43], [ ,,,0],44]. Shan et al. έδειξε ότι τα οιστρογόνα μπορούν να αυξάνουν την έκφραση του VEGF, και ενεργοποιούν το μονοπάτι ERK1 /2 για την επαγωγή ΜΜΡ-2 έκφραση [45]. Silibinin αναστέλλει την εισβολή των καρκινικών κυττάρων από το στόμα με την καταστολή της ενεργοποίησης των ERK1 /2 και την έκφραση της ΜΜΡ-2 [46]. Selaginella tamariscina (Beauv.), Ένα παραδοσιακό φαρμακευτικό φυτό, κατέχει αντιμεταστατική επιδράσεις σε ανθρώπινα κύτταρα οστεοσαρκώματος με μείωση ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 εκκρίσεις μέσω ρ38 και Akt μονοπατιών σηματοδότησης [47]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της μελέτης μας έδειξαν ότι kaempferol αναστέλλει μόνο φωσφορυλίωσης της ERK και δεν υπάρχουν σημαντικές επιπτώσεις ήταν εμφανείς στην JNK, και μονοπάτια σηματοδότησης ρ38. Πράγματι, όπως φαίνεται στα Σχήματα 5-6, kaempferol ανέστειλε την φωσφορυλίωση της ERK1 /2, και η συμμετοχή της οδού ΜΑΡΚ ήταν καλά αποδεικνύεται από τη χρήση του αναστολέα ΜΕΚ σε κύτταρα SCC4, έτσι που δείχνουν ότι μια θεραπεία που χρησιμοποιεί U0126 μπορούσε να οδηγήσει σε μια η αναστολή της ΜΜΡ-2 έκκριση και SCC4 κυττάρων εισβολής.

Η έκφραση του γονιδίου ΜΜΡ-2 ρυθμίζεται από την αλληλεπίδραση μετεγγραφικό επίπεδο της ΑΡ-1 με δεσμευτικές αλληλουχίες στο γονίδιο υποκινητή ΜΜΡ-2 [33], [48]. AP-1 δεν είναι ένας μόνο παράγοντας μεταγραφής, αλλά ένα ετεροδιμερές που αποτελείται από c-Fos και των οικογενειών c-Jun. Αρκετές αναφορές έχουν δείξει ότι πολυάριθμα φάρμακα αναστέλλουν τη μετάσταση του καρκίνου με διαμόρφωση των δραστηριοτήτων δέσμευσης DNA της ΑΡ-1. Hong et al. ανέφεραν ότι ascochlorin αναστέλλει ΜΜΡ-9 έκφραση με καταστολή ΑΡ-1 δραστικότητα [49]. Nobiletin, ένα φλαβονοειδές εσπεριδοειδών, εξασθενημένου ΜΜΡ-7 έκφραση μέσω της μείωσης δραστικότητα δέσμευσης DNA ΑΡ-1 [50]. παρόντα δεδομένα μας αποκαλύπτουν ότι kaempferol μείωσε την δραστικότητα ΜΜΡ-2 κυττάρων SCC4 με αναστολή της ενεργοποίησης ΑΡ-1. Αυτό το εύρημα υποστηρίζει προηγούμενες εκθέσεις που υποδεικνύεται silibinin κατέστειλε την ανθρώπινη εισβολή κυττάρων οστεοσαρκώματος με αναστολή της ERK-εξαρτώμενη ΑΡ-1 επαγωγή της ΜΜΡ-2 [37]. Ωστόσο, παρατηρήθηκε ότι kaempferol καταστέλλει μόνον την έκφραση c-Jun στον πυρήνα χωρίς να επηρεάζει c-Fos. Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι kaempferol αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων και SCC4 εισβολή με μείωση της πρόσδεσης ΜΜΡ-2 προαγωγό γονιδίου δραστικότητα των παραγόντων ΑΡ-1 μεταγραφή, συμπεριλαμβανομένης της c-Jun.

Συνοπτικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αναστέλλει kaempferol ΑΡ-1 δραστικότητα, μειώνει την έκφραση ΜΜΡ-2, και στη συνέχεια καταστέλλει την εισβολή των κυττάρων SCC4. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι kaempferol αναστέλλει /2 φωσφορυλίωση ERK1, αποτελεσματικά οδηγώντας σε ΜΜΡ-2 προς τα κάτω ρύθμιση. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι kaempferol μπορεί να είναι ένας ισχυρός υποψήφιος για την ανάπτυξη των παραγόντων που χρησιμοποιούνται για την πρόληψη μετάστασης καρκίνου.