Αφηρημένο

Ιστορικό

Ρυθμιστικές Τ λεμφοκύτταρα (Treg) διηθούν ανθρώπινο γλοιοβλάστωμα (GBM)? εμπλέκονται στην πρόοδο του όγκου και να συσχετιστούν με το βαθμό του όγκου. Παροδική απομάκρυνση των Tregs χρησιμοποιώντας CD25 καταστρέφουν αντισώματα (PC61) έχει βρεθεί ότι μεσολαβεί GBM οπισθοδρόμηση σε προκλινικά μοντέλα όγκων του εγκεφάλου. Κλινικές μελέτες που συνδυάζουν την εξάντληση Treg με τον εμβολιασμό του όγκου είναι σε εξέλιξη για να διαπιστωθεί αν παροδική μείωση του Treg μπορεί να ενισχύσει αντικαρκινικές ανοσολογικές αποκρίσεις και τη βελτίωση της μακροπρόθεσμης επιβίωσης σε ασθενείς με καρκίνο.

Ευρήματα

Χρησιμοποιώντας ένα συγγενικό intracrabial γλοιοβλάστωμα (GBM) μοντέλο ποντικού δείχνουμε ότι η συστηματική εξάντληση των Tregs 15 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου χρησιμοποιώντας PC61 οδήγησε σε μείωση της Tregs παρόν σε όγκους, λεμφαδένες παροχέτευσης και σπλήνα και βελτιωμένη μακροπρόθεσμη επιβίωση (50% των ποντικών επιβίωσε ΝΙΗ /NINDS Δωρεές 1 RO1 NS 054.193,01? RO1 NS 42.893,01, U54 NS045309-01 και 1R21 NS047298-01 να P.R.L. Ο Bram και η Elaine Goldsmith και ο Όμιλος Μενταγιόν Προικισμένη Καρέκλες στο Gene Therapeutics να PRL και MGC, αντίστοιχα, το Linda Tallen & amp? David Paul Kane Ίδρυμα ετήσια υποτροφία και το Συμβούλιο των Διοικητών σε CSMC. MC υποστηρίζεται από ΝΙΗ /NINDS 1F32 NS058156.01

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (GBM) είναι ένα θανάσιμο πρωτοπαθούς όγκου του εγκεφάλου που είναι ιδιαίτερα επεμβατική με καρκινικά κύτταρα διηθούν τον περιβάλλοντα υγιή ιστό του εγκεφάλου [1]. Η διάμεση επιβίωση των ασθενών που έχουν διαγνωστεί με GBM είναι ένα έτος (4-6 μήνες μετά υποτροπή), με λιγότερο από 5% των ασθενών που παραμένουν εν ζωή 5 χρόνια μετά τη διάγνωση [2]. Βελτιώσεις σε χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία δεν έχουν μεταφραστεί σε σημαντικά βελτιωμένη πρόγνωση για τους ασθενείς με GBM? μακροπρόθεσμη επιβίωση (5 χρόνια μετά τη διάγνωση) δεν έχει βελτιωθεί από το 1950 [3]. Tumor επανάληψη συμβαίνει σχεδόν πάντοτε, ακόμη και αν η χειρουργική επέμβαση απομακρύνει επιτυχώς την πλειοψηφία του πρωτογενούς μάζας του όγκου. Novel θεραπείες για την πρόληψη ή τη θεραπεία της επανεμφάνισης του όγκου χρειάζονται επειγόντως για τη θεραπεία ασθενών με διάγνωση GBM.

Η ανοσοθεραπεία έχει προταθεί ως μια ισχυρή προσέγγιση για την πρόληψη της επανεμφάνισης του όγκου με την εξάλειψη των κυττάρων του όγκου ενώ διαφυλάσσει φυσιολογικό περιβάλλοντα υγιή κύτταρα [4], [5]. Αρκετές κλινικές μελέτες βρίσκονται σε εξέλιξη για να ελέγξετε αν ανοσοθεραπεία είναι ασφαλές και αποτελεσματικό για τη θεραπεία της GBM [6], [7]. GBMs πάνω αντιγόνα ρητή όγκου όπως MAGE, Her2 /neu, τυροσινάση, ΤΚΡ-1, TRP-2, gp100, IL13Rα2, Survivin (που επισκοπείται στο [8]) και EphA2 [9]. Το ανοσοποιητικό σύστημα σμιλεύει συνήθως όγκοι που προκύπτουν η απώλεια της έκφρασης αντιγόνου όγκου [10], [11], ωστόσο, η θέση του GBM στον εγκέφαλο, μια περιοχή του ανοσοποιητικού προνόμιο [12], [13], ή η παρουσία ενός εξαιρετικά ανοσοκατασταλτική περιβάλλον στους όγκους του εγκεφάλου [14], [15] μπορεί να είναι λόγοι για τους οποίους GBM συνήθως πάνω από αντιγόνα ρητή όγκου σε ασθενείς. Αυτόλογα δενδριτικά κύτταρα (DC) φορτωμένο με πεπτίδια GBM όγκου [16] ή λύμα αυτόλογο όγκο [17] έχουν χρησιμοποιηθεί για να εμβολιάσει ασθενείς σε δύο πρόσφατες κλινικές δοκιμές Φάσης Ι. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στην επιβίωση παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας αυτόλογα προϊόντα λύσης του όγκου [17]. Ωστόσο, ο διάμεσος χρόνος έως την εξέλιξη της νόσου και μέση επιβίωση των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με πεπτιδικά εμβόλια που βασίζονται αυξήθηκε σε σύγκριση με τους ασθενείς που υποβλήθηκαν σε θεραπεία κατά την ίδια χρονική περίοδο με τις συμβατικές θεραπείες [16]. Είναι ενδιαφέρον ότι, ένας υποπληθυσμός ανταποκρίθηκαν στη θεραπεία ταυτοποιήθηκαν από την έκφραση των χαμηλών συγκεντρώσεων του ΤΟΓβ στον εγκέφαλο. Εντός του όγκου έκφραση του TGFβ μπορεί να καταστείλει προσαρμοστικές αντιδράσεις του ανοσοποιητικού έναντι του αντιγόνου [4], [5] και ήταν προγνωστικά της κλινικής έκβασης μετά τον εμβολιασμό [16]. Επιπλέον, κυκλοφορούν αντιγόνο όγκου ειδικό CD8

+ Τ λεμφοκύτταρα έχουν ταυτοποιηθεί σε ασθενείς GBM [18], αλλά η ανοσοκατασταλτική περιβάλλον στον όγκο εμποδίζει την αποβολή του GBM από αυτούς τους ασθενείς.

T κυτταρικές αποκρίσεις εναντίον αντιγόνο όγκου μετρήθηκε με τετραμερή και ELISPOT δεν συσχετίζονται πάντα με υποχώρηση του όγκου σε κλινικές δοκιμές ανοσοθεραπείες δοκιμές για ανθρώπινη GBM [19]. Αυτό υποδηλώνει ότι η καταστολή της αποτελεσματικής ανοσοαποκρίσεων έναντι αντιγόνων όγκου μπορεί να παρεμβαίνουν με το ανοσοποιητικό εξαρτώμενη υποχώρηση του όγκου. Πρόσφατα, οι ερευνητές έχουν διερευνήσει αν εξάντληση ενός υποσυνόλου των Τ λεμφοκυττάρων που ονομάζεται ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα (Tregs) μπορεί να ενισχύσει ανοσοθεραπειών κατά του καρκίνου. Tregs είναι ένας υποπληθυσμός CD4

+ Τ λεμφοκύτταρα που εκφράζουν ιδιοσυστατικά το μεταγραφικό παράγοντα Foxp3, την υψηλή συγγένεια IL2 υποδοχέα CD25 και το Β7 συνδετήρα CTLA4 [20]. Οι Tregs απαιτούνται για τη διατήρηση της ανοχής σε όλη τη διάρκεια ζωής του οργανισμού [21] και οι μεταλλάξεις σε Foxp3 είναι γνωστό ότι προκαλούν οξείες αυτοάνοσων διαταραχών σε ανθρώπους [22]. Foxp3

+ Tregs συσσωρεύονται μέσα στα ανθρώπινα γλοιώματα κατά την διάρκεια της προόδου του όγκου [23] και έχουν βρεθεί να συσχετίζονται με το βαθμό του όγκου [24]. Η επιβίωση βελτιώνεται όταν Tregs είχαν εξαντληθεί από GL261 ποντικών που φέρουν όγκο χρησιμοποιώντας CD25 αντισώματα χορηγούνται 7 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου και τρεις φορές την εβδομάδα για 3 εβδομάδες μετά από αυτή [25]. Επίσης, η χορήγηση του CD25 καταστρέφουν τα αντισώματα ήταν επίσης αποδειχθεί ότι βελτιώνουν την επιβίωση όταν χορηγείται σε συνδυασμό με DC επιμολυσμένα με mRNA όγκου σε ένα μοντέλο GBM [26].

Έχουμε αναπτύξει πρόσφατα ένα συνδυασμό γονιδίων θεραπευτική προσέγγιση με στόχο τη μηχανική του μικροπεριβάλλον του όγκου να επάγει την μετανάστευση εντός της μάζας του όγκου των APCs και προκαλούν το θάνατο των κυττάρων του όγκου [27]. Η προσέγγισή μας αποτελείται από εκφράζουν Fms-όπως τυροσίνη κινάση 3 συνδέτη (Flt3L), η οποία επάγει δενδριτικών κυττάρων (DC) διήθηση στο εγκεφαλικό παρέγχυμα [28], σε συνδυασμό με την υπό όρους κυτταροτοξικό γονίδιο κινάσης θυμιδίνης (ΤΚ) [27], [29], η οποία με την παρουσία της GCV επάγει θάνατο κυττάρου όγκου. Αυτή η συνδυασμένη προσέγγιση επάγει εξαρτώμενη Τ κυτταρική υποχώρηση του όγκου [27]. Θελήσαμε να αξιολογήσει τις επιπτώσεις που προκαλούνται από την εξάντληση των Tregs? επί εξέλιξης του όγκου σε ποντικούς που φέρουν χωρίς θεραπεία GBM και επί των κυττάρων Τ που εξαρτώνται από υποστροφή όγκου του εγκεφάλου που προκαλείται από Ad-Flt3L και θεραπεία Ad-ΤΚ. Τα δεδομένα μας απέδειξαν ότι η εξάντληση των Tregs χρησιμοποιώντας το CD25 ειδικού PC61 υβριδώματος υποχώρηση που επάγεται όγκου και μακροχρόνια επιβίωση όταν χορηγήθηκε 15 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου, ανεξάρτητα από το αντιγόνο όγκου ειδικών Τ λεμφοκυττάρων. Σε συνδυασμό με ενδοογκική διανομή του Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ, όμως, βρήκαμε ότι η χορήγηση PC61 24 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου (7 ημέρες μετά την αγωγή) εντελώς κατασταλεί προσαρμοστικές ανοσοαποκρίσεις έναντι αντιγόνων όγκου GL26. Εκτός από Tregs, CD25 εκφράζεται επίσης στην κυτταρική επιφάνεια των πρόδρομων Β και Τ λεμφοκύτταρα και ένα ώριμο υποπληθυσμό DC [30] και είναι επίσης ρυθμίζεται αυξητικά στην κυτταρική επιφάνεια των ενεργοποιημένων λεμφοκυττάρων Τ και Β λεμφοκυττάρων [31]. Στο μοντέλο μας, η χορήγηση του CD25-αντισωμάτων επίσης απαλείφονται ενεργοποιηθεί, CD25

+ Τ λεμφοκύτταρα και εμπόδισε κλωνική επέκταση των ειδικών αντιγόνου όγκου Τ κύτταρα. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η χρήση των PC61 με στόχο την εξάντληση Treg θα μπορούσε να μειώσει την αποτελεσματικότητα των ανοσοθεραπευτικών καθεστώτων καταστέλλοντας την ενεργοποίηση και κλωνική επέκταση του ειδικού αντιγόνου όγκου Τ λεμφοκύτταρα.

Αποτελέσματα

Συγγενής ενδοκρανιακών όγκων GBM είναι πυκνά διεισδύσει με ανοσοποιητικού κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των Tregs

η συσσώρευση των Foxp3

+ Tregs σε ανθρώπινα γλοιώματα συσχετίζεται με το βαθμό του όγκου και της επιβίωσης των ασθενών [24]. Συσσώρευση Foxp3

+ Tregs σε συγγενικά γλοιώματα ποντίκι έχει επίσης περιγραφεί και εξάντληση των Tregs με CD25-ειδικές ανοσοσφαιρίνες μπορούν να προκαλέσουν υποχώρηση του όγκου και να βελτιώσει την επιβίωση σε αυτές τις προκλινικά μοντέλα [25], [32], [33]. Για να διερευνηθεί αν η εξάντληση Treg θα μπορούσε να βελτιώσει θεραπευτικό αποτέλεσμα σε συνδυασμό με ανοσοθεραπεία /γονιδιακή θεραπεία, πρέπει πρώτα διαπιστωθεί αν Tregs διεισδύσει μέσα στο συγγενικό γλοιώματος ποντικού που προκύπτουν από την ενδοκρανιακή εμφύτευση κυττάρων GL26 εντός του ραβδωτού σώματος του εγκεφάλου. Εμφύτευση συγγενικά κύτταρα GL26 αναπαραγώγιμα οδήγησε στην γραμμική ανάπτυξη των όγκων (R

2 & gt? 0,99) με ένα μέσο όγκο όγκου περίπου 0,5 χιλιοστά

3 κατά την ημέρα 15 και 30 φορές μεγαλύτερη (15 χιλιοστά

3) σε ημέρα 24 (Εικ. 1Α). Οι όγκοι αυτοί παρουσιάζουν έντονη διείσδυση των CD45

+ και /80

+ κύτταρα F4, που είναι εμφανής σε όλη τη μάζα του όγκου και επίσης στα σύνορα (Σχήμα 1Β). Διείσδυση ανοσοκυττάρων εντός των όγκων εκτιμήθηκε επίσης με κυτταρομετρία ροής 24 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου (Σχ. 1 C). Διαπιστώσαμε διηθούν όγκο MDC (CD11c

+ CD45

+ ΙΑ

b +, σχ. 1 Ci) και Μφ (CD11b

+ CD45

+ ΙΑ

b +, σχ. 1 CII), ότι εκπροσωπούμενη 3,5% και 19% του συνολικού αριθμού των CD45 + κυττάρων του ανοσοποιητικού παρόν στον όγκο αντίστοιχα. Τα λεμφοκύτταρα εντοπίστηκαν επίσης και αποτελούσαν -80% του συνολικού αριθμού των CD45 + κυττάρων του ανοσοποιητικού που διηθούν τους όγκους (Σχ. 1 C III-VI). Αυτά περιλαμβάνονται CD4

+ Τ κύτταρα (Οϋ3ε

+ CD4

+ CD8a

– 26%), CD8a

+ Τ κύτταρα (Οϋ3ε

+ CD4

– CD8a

+, 18%), Foxp3

+ Tregs (Οϋ3ε

+ CD4

+ Foxp3

+, 8,4%), τα κύτταρα NK (Οϋ3ε

– NK1.1

+ CD45

+, 18%), ΝΚ-Τ κύτταρα (Οϋ3ε

+ NK1.1

+ CD45

+ 7%) και Β κύτταρα (Οϋ3ε

– CD19

+ CD45

+, 5%). Η παρουσία των CD4

+, CD8a

+, CD19

+ λεμφοκύτταρα καθώς και CD205 MDC παρατηρήθηκαν επίσης με ανοσοφθορισμό (Εικ. 1 D). Επιπλέον, μεγάλοι αριθμοί λεμφοκυττάρων που ήταν ανοσοαντιδραστικά για CD25 παρατηρήθηκαν εντός του όγκου, χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία (Εικ. 1 D) και κυτταρομετρία ροής (Οϋ3ε

+ CD25

+ CD45

+) (Σχ. 1 E, F). Επιπλέον, το ποσοστό των Οϋ3ε

+ Τ κυττάρων που εκφράζουν επιφάνεια CD25 κυττάρων ήταν ~ 40% του συνολικού αριθμού των διηθούν όγκο Τ κύτταρα και ήταν πολύ αυξημένα στο αποστράγγιση (τραχήλου) λεμφαδένα (DLN) (ρ & lt? 0,05) και του όγκου (ρ & lt? 0,01) (Εικ. 1 Ε). σε σύγκριση με την σπλήνα του όγκου ποντικών που φέρουν

(Α) GL26 όγκο του όγκου 7, 14 και 21 ημέρες μετά την εμφύτευση στον εγκέφαλο ραβδωτό σώμα του C57BL /6 ποντικούς προσδιορίστηκε. Δραστικές αστροκυτταρικές χρώσης (GFAP +) χρησιμοποιήθηκε για να καθορίσει το περίγραμμα του όγκου με μη κακοήθη εγκεφαλικό ιστό. Αντιπροσωπευτικά τμήματα των εγκεφάλων ποντικού που φέρουν όγκους εμφυτεύονται 7, 14 και 21 ημέρες προηγουμένως και χρωματίστηκαν με GFAP φαίνεται στα αριστερά. κινητική ανάπτυξη του όγκου ήταν ουσιαστικά εκθετικός κατά την περίοδο του χρόνου αναλύθηκε με χρόνο διπλασιασμού περίπου 1,8 ημερών. 5 ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό του όγκου του όγκου σε κάθε χρονικό σημείο. (Β) διείσδυση ανοσοκυττάρων σε ενδοκρανιακών όγκων GL26. τομές εγκεφάλου από ποντικούς που φέρουν όγκο υπέστησαν χρώση με αντισώματα έναντι CD45 (λευκοκύτταρα) ή F4 /80 (μακροφάγοι /ενεργοποιημένη μικρογλοία). Αντιπροσωπευτικά Ομοεστιακή εικόνες δείχνουν ανοσοκύτταρα (πράσινο) εντός της μάζας του όγκου και στα σύνορα του όγκου. ΫΑΡΙ (μπλε) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των πυρήνων. Κίτρινα βέλη δείχνουν ανοσοδραστικών κυττάρων. Τ: όγκου. (Γ) Tumor διηθητικά κύτταρα του ανοσοποιητικού απομονώθηκαν από όγκους 24 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. (I) Dot οικόπεδο CD11c κατά Ι-Ab, που για πρώτη φορά περιφραγμένη για ζωντανή CD45 + λευκοκύτταρα. DC (CD11c + CD45 + I-Ab +) εμφανίζονται στο κόκκινο κουτί. (Ii) Τα μακροφάγα (Μφ) αξιολογήθηκαν από gating ζωντανά λευκοκύτταρα με CD45, τότε σχεδιάζοντας CD11b έναντι I-Ab. Το κόκκινο κουτί περιγράφει τον πληθυσμό της διηθούν όγκο μακροφάγα (CD11b + CD45 + Ι-Ab +). (Iii) Τ κύτταρα βάφτηκαν με Οϋ3ε-ΡΕ, CD4-PerCP και CD8a-FITC. Το οικόπεδο εμφανίζει CD4 κατά CD8a όταν κύτταρα πρώτη πύλη για Οϋ3ε + ζωντανά λευκοκύτταρα. Τα CD4 + Τ κύτταρα και CD8a + Τ κύτταρα εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα κουτιά. (Iv) του όγκου διείσδυση Tregs παρατηρήθηκαν με χρώση με Οϋ3ε-PE, CD4-PerCP και Foxp3-FITC. Οϋ3ε + ζωντανά λευκοκύτταρα ήταν περιφραγμένη και οικόπεδα οθόνη dot Foxp3 κατά χρώση CD4. Ο πληθυσμός των Tregs (CD4 + Foxp3 + Οϋ3ε +) παρουσιάζονται στο κόκκινο κουτί. (V) ΝΚ και ΝΚ-κύτταρα Τ έγιναν ορατά με gating ζωντανών CD45 + λευκοκύτταρα, τότε εμφανίζοντας ΝΚ1.1 έναντι Οϋ3ε. Ο πληθυσμός των ενδοδιηθητικά όγκου κύτταρα ΝΚ (CD45 + CD3ε- ΝΚ1.1 +) και ΝΚ-κυττάρων Τ (Οϋ3ε + CD45 + ΝΚ1.1 +) εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα κουτιά. (Vi) Tumor διηθητικά Β κύτταρα ορατά με gating για τα ζωντανά λευκοκύτταρα, τότε σχεδιάζοντας CD45 έναντι CD19. Ο πληθυσμός των Β κυττάρων (CD19 + CD45 +) εμφανίζεται σε ένα κόκκινο κουτί. Τα ποσοστά του κάθε κυτταρικού πληθυσμού ανοσοποιητικού που διηθούν τον όγκο σε σχέση με τον συνολικό αριθμό των CD45 + κυττάρων όγκου ενδείκνυται σε αντιπροσωπευτικά διαγράμματα στιγμών. χρώσης (D) Nissl χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει όγκους στον εγκέφαλο. Οι όγκοι είναι πυκνά σε Nissl ουσία, έτσι ώστε να λεκιάσουν πιο σκούρο από το κανονικό εγκεφαλικό ιστό. Αντιπροσωπευτικά Ομοεστιακή εικόνες δείχνουν διηθούν όγκο CD4 + Τ κύτταρα, CD8 + Τ κύτταρα, CD205 + mDCs, CD19 + Β κυττάρων, και CD25 + κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος (που παρουσιάζονται σε πράσινο) και DAPI (μπλε) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση των πυρήνων. Κίτρινα βέλη δείχνουν ανοσοδραστικών κυττάρων. (Ε) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του ποσοστού των κυττάρων Τ που εκφράζουν CD25 σε σπλήνες, ϋίΝ και όγκων σε ποντίκια που φέρουν ενδοκρανιακό εγκεφάλου GL26 όγκους 24 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου. (F) Αντιπροσωπευτική διαγράμματα στιγμών CD25 vs Οϋ3ε σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος που απομονώνονται από τον σπλήνα, LN και όγκου. Τα ποσοστά των CD25 + κυττάρων του πληθυσμού σε σχέση με το συνολικό αριθμό των Οϋ3ε + κυττάρων στον όγκο, λεμφαδένες παροχέτευσης ή σπλήνα αναφέρεται σε αντιπροσωπευτικές διαγράμματα στιγμών.

Η

Η εξάντληση των Tregs χρησιμοποιώντας PC61 επάγει υποχώρηση των όγκων του εγκεφάλου αλλά επίσης μειώνει τα κύτταρα Τ στον όγκο και ϋίΝ

Θεωρώντας ότι ανιχνεύσαμε εκτεταμένη διήθηση του regs Τ εντός των ενδοκρανιακών όγκων GL26, έχουμε ως στόχο να καταστρέφουν αυτό το ανοσοποιητικό κυτταρικό πληθυσμό προκειμένου να καθοριστεί η επίδρασή τους επί της εξέλιξης των καρκινικών κυττάρων και σε κατά του όγκου ανοσοαπόκριση που προκαλείται από ένα Τ-κυττάρων που εξαρτάται ανοσοθεραπευτική προσέγγιση, δηλαδή Ad-Flt3L /ΤΚ. Η PC61 υβρίδωμα IgG1 επίμυος βρέθηκε να συνδέεται με υψηλή συγγένεια τον υποδοχέα ποντικού IL-2 (CD25) [34] και

in vivo

χορήγηση PC61 σε ποντικούς προκαλεί την εξάντληση των Tregs για περισσότερο από μία εβδομάδα [33] , [35]. Έτσι, χρησιμοποιείται αυτό το αντίσωμα για την επαγωγή εξάντληση Τ reg

in vivo

σε ένα μοντέλο γλοιώματος ενδοκρανιακή συνγονιδιακό ποντικό. Πρέπει πρώτα καθοριστεί αν PC61 θα μπορούσε να επηρεάσει τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων και την ανάπτυξη

in vitro

και

in vivo

. Η επώαση των κυττάρων με GL26 PC61 δεν επηρέασε την κυτταρική βιωσιμότητα GL26 (Σχ. 2Α) ή τον πολλαπλασιασμό

in vitro

(Εικ. 2Β). Στη συνέχεια χορηγείται PC61 ή ισοτυπικού ελέγχου IgG σε αθυμικά ποντίκια που φέρουν όγκο ηυ /ηυ, οι οποίες έχουν αποδειχθεί ότι είναι ανεπαρκής σε Τ regs [26], [36]. Συμπίπτοντας με άλλες εκθέσεις [26], βρήκαμε ότι η ανάπτυξη του όγκου σε Τ reg ανεπάρκεια

nu /nu

ανοσοποιητικό ανεπαρκή ποντίκια δεν επηρεάστηκε από PC61? τόσο ισοτυπικού ελέγχου ή ποντίκια PC61 ένεση υπέκυψαν λόγω του φορτίου του όγκου 18-22 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου.

(Α) κύτταρα GL26 επωάστηκαν για 48 ώρες με 100 μg /ml PC61 ή 100 μg /ml IgG 1 επίμυος ελέγχου ισοτόπου. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με Αννεξίνη V-FITC και ιωδιούχου προπιδίου για την αναγνώριση αποπτωτικά κύτταρα. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στην απόπτωση σημειώθηκε όταν τα κύτταρα επωάστηκαν με PC61 ή ισοτυπικού ελέγχου ανοσοσφαιρίνες συγκρίνει με χωρίς θεραπεία ελέγχους (ρ & gt? 0,05). Μια μεγάλη αύξηση στην απόπτωση παρατηρήθηκε όταν τα κύτταρα επωάστηκαν για 4 ώρες με Η2Ο2 (ρ & lt? 0.001). Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα από 3 επαναλήψεις και η δοκιμασία επαναλήφθηκε 3 φορές. Ένας τρόπος ANOVA με μετά τη δοκιμή του Tukey χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό σημαντικές διαφορές (*** ρ & lt? 0.001). (Β) πολλαπλασιασμό των κυττάρων GL26 μετρήθηκε με ανίχνευση ενσωμάτωσης BrdU εντός του DNA. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην πολλαπλασιασμού (ρ & gt? 0,05) όταν τα κύτταρα επωάστηκαν με PC61 (αρουραίος IgG1αCD25) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου ισοτύπου (IgG 1 επίμυος), ή μη κατεργασμένα κύτταρα (*** ρ & lt? 0.001 σε σύγκριση με αρνητικό (όχι κύτταρα) ελέγχου, ns = μη σημαντική). (Γ) Αθυμικοί ηυ /ηυ ποντικοί (Balb /c φόντο) προκλήθηκαν με ένα μόνο ενδοκρανιακή ένεση κυττάρων GL26 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία 15 d αργότερα με 1mg είτε PC61 ή ισοτυπικού ελέγχου ανοσοσφαιρίνες εγχέονται ί.ρ. Η επιβίωση παρακολουθήθηκε και τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία όταν ετοιμοθάνατο. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην επιβίωση παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα τεστ log rank (p & gt? 0,05) (n = 5)

Η

Μετά αποκλείοντας οποιαδήποτε άμεση επίδραση των PC61 στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μελετήθηκε η επίδραση του Τ. εξάντληση reg σε άγριου τύπου ποντίκια C57 /Β6 φέρουν ενδοκρανιακή γλοίωμα GL26. Το πειραματικό παράδειγμα που χρησιμοποιείται απεικονίζεται στο Σχ. 3Α. Εξάντληση των Tregs 15 ημέρες μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου αυξήθηκε σημαντικά ο αριθμός των μακροχρόνια επιζώντες με το 40% των ποντικών ήταν ακόμη ζωντανοί 150 ημέρες αργότερα (p & lt? 0.05, Σχήμα 3Β.). Αυτό ήταν περισσότερο από 5 φορές μεγαλύτερη από την μέση επιβίωση των ποντικών που έφεραν όγκους ελέγχου (Σχ. 3Β). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στην μακροπρόθεσμη επιβίωση παρατηρήθηκε όταν Tregs είχαν εξαντληθεί σε μεγαλύτερους όγκους (24 ημέρες) (p & gt? 0,05) και μόνο το 10% των ποντικών επιβίωσε μακροχρόνια από αυτή την ομάδα (σχήμα 3Β).. Είναι ενδιαφέρον, δεν παρατηρήσαμε καμία DTH αποκρίσεις όταν εγχέεται ακτινοβολημένα κύτταρα GL26 στην πατούσα του μακροχρόνιοι επιζώντες από Treg απεμπλουτισμένο ποντικούς (Σχ. 3C). Προκειμένου να εκτιμηθούν τα αποτελέσματα της θεραπείας με PC61

in vivo

, αναλύσαμε την παρουσία των Foxp3

+ CD4

+ Tregs που διηθούν την μάζα GBM, καθώς και στις αποστράγγιση των λεμφαδένων και του σπλήνα μετά από ενδοπεριτοναϊκή ένεση PC61 (ημέρες 15 και 24) ή με τον έλεγχο ισότυπο IgG1 επίμυος (ημέρα 15 ημέρες) σε ποντίκια που φέρουν όγκο. ένεση PC61 την ημέρα 15 οδήγησε σε μείωση 9 φορές (ρ & lt? 0.001) του αριθμού των διηθούν όγκο Tregs όταν μετράται χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής 12 ημέρες αργότερα (ημέρα 27), και την έγχυση PC61 την ημέρα 24 οδήγησε στη σχεδόν πλήρη εξάντληση των Tregs (ρ & lt? 0.001) στον όγκο 3 ημέρες αργότερα (ημέρα 27) (Εικ. 3D). Όπως ήταν αναμενόμενο, περιφερική πληθυσμούς Treg στα λεμφογάγγλια παροχέτευσης (Εικ. 3Ε) και οι σπλήνες (Εικ. 3F) ήταν επίσης σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τους μάρτυρες που έλαβαν ισοτύπου (ρ & lt? 0.001). Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε μία μείωση 3 φορές στο απόλυτο ποσοστό των CD4

+ Τ κύτταρα (Σχ. 4Α) και CD8a

+ Τ κύτταρα (Σχ. 4Β) διεισδύοντας εντός του όγκου μετά τη χορήγηση του PC61. Επιπλέον, PC61 μειωθεί σημαντικά τους πληθυσμούς των CD4

+ Τ κύτταρα (p & lt?. 0.05, Σχήμα 4C) και CD8

+ Τ κύτταρα (p & lt?. 0.01, Σχήμα 4D) στον όγκο αποστράγγισης λεμφαδένες. Δεν υπήρξε καμία αλλαγή σημειώνεται στα ποσοστά των CD4

+ Τ κυττάρων και CD8a

+ Τ κυττάρων στη σπλήνα (ρ & gt?. 0.05, Σχήμα 4Ε-F) και Μφ και DC παρέμεινε αμετάβλητη σε όγκους και λεμφαδένες παροχέτευσης αν και αυξήθηκε ελαφρά σε σπλήνα (Εικ. 5).

(Α) Διάγραμμα που απεικονίζει τις διαφορετικές θεραπευτικές αγωγές που χορηγήθηκαν 4 ομάδες ποντικών που φέρουν όγκο. κύτταρα GL26 εμφυτεύθηκαν στον εγκέφαλο όλων των ποντικών την ημέρα 0 και υποβλήθηκαν σε αγωγή με την ενδοογκική διανομή του φυσιολογικού ορού κατά την ημέρα 17 με εξάντληση των CD25

+ κύτταρα χρησιμοποιώντας PC61 την ημέρα 15 (πράσινο) ή την ημέρα 24 (κόκκινο). Οι ομάδες ελέγχου ποντικών που φέρουν όγκο έλαβαν αρουραίου IgG 1 ισοτύπου αναφοράς την ημέρα 15 (μπλε), ή καθόλου συστημική χορήγηση ανοσοσφαιρινών (Μαύρο) όπως υποδεικνύεται. Οι ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν είτε για μελέτες επιβίωσης, ή υποβάλλονται σε ευθανασία την ημέρα 27 μετά την εμφύτευση του όγκου για την ανάλυση των κυτταρικών πληθυσμών του ανοσοποιητικού με κυτταρομετρία ροής. καμπύλη (Β) Kaplan-Meier εμφανίζοντας επιβίωσης των 4 ομάδων ποντικών περιγράφεται στο (Α). Δέκα ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε ομάδα και μία δοκιμασία log-rank χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί σημασία μεταξύ μη θεραπευμένη ομάδα και ομάδες που έλαβαν PC61. * Ρ & lt? 0,05 σύγκριση με μη επεξεργασμένα ποντίκια και ποντίκια που έλαβαν θεραπεία ελέγχου ισοτύπου. (Γ) DTH δοκιμή πραγματοποιήθηκε σε μακροπρόθεσμη ποντικούς επιζών 100 d μετά την εμφύτευση του όγκου. Τα ποντίκια είχαν αρχικά υποβληθεί σε θεραπεία με PC61 την ημέρα 15 (πράσινες γραμμές). Ακτινοβολημένα GL26 κύτταρα σε PBS στην πίσω δεξί πέλμα (γεμάτο κουτί) ή μάρτυρα PBS στο πίσω αριστερό πέλμα (ανοιχτό πλαίσιο) των ποντικών. Το πάχος του πέλματος προσδιορίστηκε 0 h, 4 h, 24 h και 48 h μετά την ένεση ακτινοβολημένων κυττάρων ή PBS. Δύο Way ANOVA με μετά τη δοκιμή του Tukey χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό σημαντικές διαφορές. (D-F) Tregs (Οϋ3ε

+ CD4

+ Foxp3

+) που διεισδύουν όγκους (D), λεμφαδένες παροχέτευσης (Ε) ή οι σπλήνες (F) προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε ποντίκια χορηγήθηκε έλεγχο IgG1 ισοτύπου αρουραίου ( ισο) ή PC61 την ημέρα 15 (15) ή την ημέρα 24 (24), όπως αναφέρεται στα γραφήματα (αριστερά). Dot οικόπεδα (δεξιά) εμφανίζει αντιπροσωπευτικά δεδομένα από 5 ποντίκια ανά ομάδα. Τα ποσοστά των Τ regs σε σχέση με τον συνολικό αριθμό των CD45 + κυττάρων στους όγκους, λεμφαδένες παροχέτευσης (DLN) ή σπλήνα αναφέρεται σε αντιπροσωπευτικές διαγράμματα στιγμών. Ένας τρόπος ANOVA με μετά τη δοκιμή του Tukey χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστούν σημαντικές διαφορές (*** ρ & lt? 0.001).

Η

C57BL /6 ποντικοί προκλήθηκαν με κύτταρα όγκου την ημέρα 0, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία κατά την ημέρα 17 από ενδοογκική διανομή του φυσιολογικού ορού. Tregs είχαν εξαντληθεί σε κάθε ημέρα 15 ή την ημέρα 24 με ένεση ip της PC61. Ανοσοποιητικού κύτταρα απομονώθηκαν από την σπλήνα, το αυχενικό LN και ενδοκρανιακής όγκου την ημέρα 27 μετά την εμφύτευση του όγκου για να προσδιοριστεί το ποσοστό των CD4 + Τ κυττάρων και CD8a + Τ κυττάρων σε κάθε ιστό. Το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων του ανοσοποιητικού που διηθούν τα οποία ήταν CD4 + Τ κύτταρα (Οϋ3ε + CD4 + CD8a-) (Α) και CD8a + Τ κύτταρα (Οϋ3ε + CD4- CD8a +) (Β)? το ποσοστό των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος στα λεμφογάγγλια παροχέτευσης που ήταν CD4 + Τ κύτταρα (Οϋ3ε + CD4 + CD8a-) (C) και CD8a + Τ κύτταρα (Οϋ3ε + CD4- CD8a +) (D)? και το ποσοστό των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος στην σπλήνα που ήταν CD4 + Τ κύτταρα (Οϋ3ε + CD4 + CD8a-) (Ε) και CD8a + Τ κύτταρα (Οϋ3ε + CD4- CD8a +) (F) φαίνονται στις γραφικές παραστάσεις (αριστερά). Αντιπροσωπευτικά διαγράμματα σημείων για κάθε ομάδα αγωγής που εμφανίζεται στα δεξιά (περιφραγμένη για ζωντανή λευκοκύτταρα με FSC έναντι SSC και Οϋ3ε + Τ λεμφοκύτταρα). Τα ποσοστά εκάστου πληθυσμού ανοσοκυττάρων σε σχέση με τον συνολικό αριθμό των CD45 + κυττάρων στους όγκους, λεμφαδένες παροχέτευσης (DLN) ή σπλήνα αναφέρεται σε αντιπροσωπευτικές διαγράμματα στιγμών. One Way ANOVA με μετά τη δοκιμή του Tukey χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό σημαντικές διαφορές. (* Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01).

Η

κύτταρα GL26 εμφυτεύθηκαν στον εγκέφαλο ραβδωτό σώμα του C57BL /6 ποντίκια. ανοσοσφαιρίνες αρουραίου ελέγχου IgG1 ισοτύπου (-) χορηγήθηκαν την ημέρα 15 και PC61 χορηγήθηκε την ημέρα 15 ή την ημέρα 24, όπως υποδεικνύεται. Το ποσοστό των μακροφάγων που διεισδύουν σε όγκο (Μφ? CD11b + CD45 + I-Ab +) (A, C, E) και μυελοειδή δενδριτικά κύτταρα (MDC? CD11c + CD45 + I-Ab +) (Β, D, F) ποσοτικοποιήθηκαν σε ημέρα 27 μετά τον όγκο εμφύτευση χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής στον όγκο (Α, Β) ϋίΝ (C, D) και τη σπλήνα (E, F). Τα ποσοστά εκάστου πληθυσμού ανοσοκυττάρων σε σχέση με τον συνολικό αριθμό των CD45 + κυττάρων στους όγκους, λεμφαδένες παροχέτευσης (DLN) ή σπλήνα αναφέρεται σε αντιπροσωπευτικές διαγράμματα στιγμών. 5 και 10 ποντίκια αναλύθηκαν ανά ομάδα. Ένας τρόπος ANOVA με μετά τη δοκιμή του Tukey χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα.

Η

Η θεραπεία με PC61 εμποδίζει την ενεργοποίηση της προσαρμοστικής αντικαρκινικές ανοσοαποκρίσεις και αναστέλλει υποχώρηση του όγκου όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με Ad-Flt3L και Ad- TK

Θα είχε επίσης ως στόχο να διερευνήσει τις επιπτώσεις της εξάντλησης των Tregs χρησιμοποιώντας ανοσοσφαιρίνη αντι-CD25 για την αποτελεσματικότητα του κυττάρου-εξαρτώμενη ανοσοθεραπεία Τ διαμεσολαβείται από ενδοογκική παράδοση του Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ [27], [37]. Τα ενεργοποιημένα CD4

+ και CD8

+ Τ λεμφοκύτταρα ρυθμίζουν προς τα πάνω επιφάνεια CD25 κυττάρων μετά από αρχική σύνδεση του TCR με αντιγόνο που εμφανίζεται στην MHC [30], [31] και αυτό μπορεί να εξηγήσει την εμφανή μείωση στα Τ κύτταρα που παρατηρήθηκε σε όγκων (Σχ. 4Α-Β) και DLN (Σχ. 4C-D) μετά τη χορήγηση του PC61. Για να διερευνηθεί περαιτέρω το θέμα, και να καθορίσουν εάν εξάλειψη των Tregs χρησιμοποιώντας PC61 μπορούσαν να επηρεάσουν αρνητικά εξαρτώμενη Τ κυτταρική ανοσοθεραπεία του GBM, εμείς εμφυτευμένων όγκων στο ραβδωτό σώμα κατά την ημέρα 0 και οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε αγωγή με Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ 17 ημέρες αργότερα, ενώ PC61 ή ανοσοσφαιρίνες ισοτυπικού ελέγχου χορηγήθηκαν σε ομάδες την ημέρα 15 ή την ημέρα 24 (Σχ. 6Α). Όταν ενίεται Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ εντός του όγκου την ημέρα 17 (όταν ο όγκος ήταν 1 χιλιοστό

3 σε μέγεθος (Εικ. 1Α) παρατηρήσαμε μια ισχυρή αύξηση στην επιβίωση με 50% των ποντικών ζωντανό 150 d αργότερα ( p & lt? 0.01, Σχήμα 6Β) που δεν επηρεάστηκε αρνητικά από τη χορήγηση του ελέγχου IgG1 ισοτύπου αρουραίου (p & gt?.. 0.05) PC61 χορηγούνται τουλάχιστον 2 ημέρες πριν την ένεση του Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ μειωμένη επιβίωση στο 30%, αν και αυτό δεν ήταν στατιστικά διαφορετικό από τους μάρτυρες που έλαβαν ισότυπο (ρ & gt?. 0.05, Σχήμα 6Β). Ωστόσο, όταν ποντίκια που έλαβαν αγωγή με Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ την ημέρα 17 και εξαντλημένα Tregs την ημέρα 24, βρήκαμε ότι η μακροχρόνια επιβίωση ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τα ποντίκια που δεν έλαβαν PC61. (p & lt?. 0.05, Σχήμα 6Β) Μόνο το 10% των ποντικών που φέρουν όγκο επέζησαν 150 ημέρες αργότερα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η χορήγηση του PC6 17 d μετά την εντός του όγκου παράδοση του Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ επηρεάζει αρνητικά Τ . εξαρτώμενη κυτταρική υποχώρηση των όγκων του εγκεφάλου σε μακροχρόνια επιζώντες μετά τη θεραπεία με Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ, ένα DTH απόκριση σε ακτινοβολημένα κύτταρα GL26 στο πέλμα του ποδιού παρατηρήθηκε όταν τα ποντίκια είχαν χορηγηθεί είτε PC61 (p & lt? 0,01) ή έλεγχοι ισοτόπου (p & lt ? 0.001) (Σχ. 6C). Επιπλέον, η θεραπεία του ποντικών που φέρουν όγκο με Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ προκάλεσε μια ισχυρή αύξηση του συνολικού αριθμού των καρκινικών αποκρίνονται Τ κυττάρων που εκκρίνεται ΙΡΝγ όταν συν-επωάστηκαν με BMDC φορτωμένο με εκχυλίσματα GL26 κυττάρων (ρ & lt?. 0.001, Σχ 6D ). Είναι ενδιαφέρον ότι δεν παρατηρήσαμε καμία αύξηση ΙΡΝγ εκκρίνουν Τ λεμφοκύτταρα σε απάντηση BMDC φορτωμένο με GL26 εκχυλίσματα κυττάρων όταν PC61 εγχύθηκε είτε πριν (15 ημέρες) ή μετά (24 ημέρες) θεραπεία με τη χρήση του Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ (p & gt? 0.05, Σχ. 6D). Ο αριθμός των διηθούν όγκο Tregs μειώθηκε μετά συστημική απελευθέρωση του PC61 (ρ & lt?. 0,001, σχ 6Ε) και το ποσοστό των Tregs μειώθηκε επίσης σημαντικά σε ϋίΝ και σπλήνα, (ρ & lt?. 0.001, Σχ 6F-G) ανεξάρτητα από το εάν οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε αγωγή με φυσιολογικό ορό ή με Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ.

(Α) C57BL /6 ποντικοί προκλήθηκαν με κύτταρα όγκου την ημέρα 0, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία κατά την ημέρα 17 με ενδοογκική διανομή του Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ ή φυσιολογικό ορό, όπως υποδεικνύεται. Tregs αφαιρέθηκαν σε κάθε ημέρα 15 (πράσινο) ή ημέρα 24 (κόκκινο) από ίρ ένεση PC61 ή την ημέρα 15 με τον ισότυπο αναφοράς (μπλε). Ανοσοποιητικού κύτταρα απομονώθηκαν από την σπλήνα, το αυχενικό LN και του όγκου. Οι ποντικοί είτε χρησιμοποιήθηκαν για μελέτες επιβίωσης ή σε ευθανασία την ημέρα 27 για ανάλυση των κυτταρικών πληθυσμών του ανοσοποιητικού με κυτταρομετρία ροής και ELISPOT. (Β) καμπύλη Kaplan-Meier εμφανίζει δεδομένα επιβίωσης από 10 ποντίκια ανά ομάδα. Στατιστικά σημαντικές διαφορές σε Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ ποντίκια με αγωγή μόνο (μαύρη γραμμή, δεν εξάντληση PC61) υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank (* p & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01). Η χορήγηση του PC61 σε ποντικούς 24 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου (7 ημέρες μετά την αγωγή με Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ) μείωσε σημαντικά μακροχρόνια επιβίωση. (Γ) ποντικών που φέρουν όγκο υπέστησαν αγωγή με Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ μόνο (μαύρες γραμμές) ή με Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ με εξάντληση PC61 την ημέρα 15 (πράσινες γραμμές). Μακροπρόθεσμες επιζώντες (60 d μετά την εμφύτευση του όγκου) αξιολογήθηκαν για ένα DTH απόκριση σε ακτινοβολημένα κύτταρα GL26 εγχέεται στο δεξί πατούσα (σε σύγκριση με μόνο PBS στο αριστερό πέλμα). Δύο Way ANOVA με τη θέση τεστ Tukey χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων (*** p & lt? 0.001 ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ δεν εξάντληση, σ & lt? 0,01 Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ ποντίκια που έλαβαν αγωγή εξαντλούνται με PC61 κατά την ημέρα 15). (D) ΙΡΝγ ELISPOT που δείχνει το συνολικό αριθμό των ΙΡΝγ παραγωγής Τ λεμφοκυττάρων που διεγέρθηκαν με DC φορτωμένο με εκχυλίσματα όγκων GL26. Τ λεμφοκύτταρα καθαρίστηκαν από ποντικούς 10 ημέρες μετά τη θεραπεία με είτε Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ (+) ή φυσιολογικού ορού (-) όπως υποδεικνύεται. Μαύρες γραμμές είναι Τ λεμφοκύτταρα από τα ποντίκια που δεν έλαβαν CD25 εξαντλούνται ανοσοσφαιρίνες. Πράσινο ράβδοι είναι Τ λεμφοκύτταρα καθαρίστηκαν από ποντίκια απεμπλουτισμένου με PC61 2 ημέρες πριν τη θεραπεία με Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ (ημέρα 15 μετά την εμφύτευση του όγκου) και κόκκινες γραμμές είναι Τ λεμφοκύτταρα καθαρίστηκαν από ποντίκια απεμπλουτισμένου με PC61 7 ημέρες μετά την αγωγή με Ad-Flt3L και Ad-ΤΚ (ημέρα 24 μετά την εμφύτευση του όγκου). (Ε-G) Tregs (Οϋ3ε

+ CD4

+ Foxp3

+) που διεισδύουν όγκους (Ε), λεμφαδένες παροχέτευσης (F) ή οι σπλήνες (G) ποσοτικοποιήθηκαν σε ποντίκια χορηγήθηκε έλεγχο IgG1 ισοτύπου αρουραίου ( iso) ή PC61 την ημέρα 15 (15) ή την ημέρα 24 (24), όπως αναφέρεται στα γραφήματα (αριστερά). Η χορήγηση του PC61 σε ποντικούς οδήγησε σε μακροπρόθεσμη εξάντληση των Tregs σε περιφερειακές θέσεις (σπλήνα και οι λεμφαδένες) και στον όγκο. Dot οικόπεδα (δεξιά) εκπρόσωπο της οθόνης σημαίνει ± SEM των Foxp3

+ Tregs ποσοτικά από 5 ποντίκια ανά ομάδα. Ο συνολικός αριθμός των Τ regs στους όγκους (Ε) και τα ποσοστά των Τ regs σε σχέση με τον συνολικό αριθμό των CD45 + κυττάρων στα λεμφογάγγλια παροχέτευσης (DLN) ή σπλήνα (F και G) αναφέρονται σε αντιπροσωπευτικές διαγράμματα στιγμών. Δύο Way ANOVA με μετά τη δοκιμή του Tukey χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστούν σημαντικές διαφορές (*** ρ & lt? 0.001).

Η

Η θεραπεία με PC61 αποτρέπει αυξήσεις που διηθούν όγκο Τ κύτταρα και Μφ αλλά όχι ΑΧ μετά από αγωγή με Ad