Αφηρημένο

πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα β /δ (ΡΡΑΚβ /δ) είναι ένα πυρηνικό υποδοχέα που εμπλέκεται στη ρύθμιση λιπιδίων και του μεταβολισμού της γλυκόζης, την επούλωση των πληγών και τη φλεγμονή. ΡΡΑΚβ /δ έχει συσχετιστεί επίσης με τον καρκίνο. Εδώ ερευνήσαμε την έκφραση του ΡΡΑΚβ /δ και συστατικά της προσταγλανδίνης βιοσυνθετικής οδού σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Βρήκαμε αυξημένη έκφραση του ΡΡΑΚβ /δ, Cox-2, cPLA

2, PGEs και VEGF σε ανθρώπινα NSCLC σύγκριση με το φυσιολογικό πνεύμονα. Σε κυτταρικές σειρές NSCLC ΡΡΑΚβ ενεργοποίηση /δ αυξημένο πολλαπλασιασμό και την επιβίωση, ενώ ΡΡΑΚβ /δ knock-down μειωμένη βιωσιμότητα και την αυξημένη απόπτωση. ΡΡΑΚβ /δ αγωνιστές επάγεται Cox-2 και VEGF μεταγραφή, γεγονός που υποδηλώνει την ύπαρξη βρόχων εμπρός τροφοδοσίας προώθηση κυτταρικής επιβίωσης, φλεγμονή και αγγειογένεση. Αυτές οι επιδράσεις παρατηρήθηκαν μόνο σε υψηλές ΡΡΑΚβ /δ που εκφράζουν τα κύτταρα, ενώ οι χαμηλές κύτταρα που εκφράζουν ήταν λιγότερο ή δεν επηρεάζονται. Τα αποτελέσματα επίσης καταργήθηκαν με ΡΡΑΚβ /δ knock-down ή την επώαση με ανταγωνιστή /δ ΡΡΑΚβ. Η επαγωγή του VEGF οφειλόταν τόσο πρόσδεση του ΡΡΑΚβ /δ με τον υποκινητή του VEGF και την ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ μέσω ενός μη-γονιδιωματικό μηχανισμό. Βρήκαμε ότι ΡΡΑΚβ /δ αλληλεπιδράσει με την κανονιστική υπομονάδα ΡΙ3Κ p85α που οδηγούν στην ενεργοποίηση της PI3K και φωσφορυλίωση της Akt. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι ΡΡΑΚβ /δ μπορεί να είναι ένα κεντρικό στοιχείο της πνευμονικής καρκινογένεσης έλεγχο πολλαπλές οδούς και αντιπροσωπεύει ένα δυνητικό στόχο για θεραπεία NSCLC

Παράθεση:. Genini D, Garcia-Escudero R, Carbone GM, Catapano CV (2012) Μεταγραφική και μη-μεταγραφική Λειτουργίες των ΡΡΑΚβ /δ με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (9): e46009. doi: 10.1371 /journal.pone.0046009

Επιμέλεια: Giuseppe Viglietto, Πανεπιστήμιο Magna Graecia, Ιταλία

Ελήφθη: May 11, 2012? Αποδεκτές: 23 Αυγούστου 2012? Δημοσιεύθηκε: 25 Σεπτεμβρίου 2012 |

Copyright: © Genini et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό ήταν υποστηρίζονται από «Fondazione Ticinese per la Ricerca sul cancro.» Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

υπεροξεισωμάτων υποδοχείς που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή (PPARs) είναι υποδοχείς πυρηνικής ορμόνης (NHRs) ενεργοποιείται από λιπόφιλες προσδέματα, συμπεριλαμβανομένων των λιπαρών οξέων μακράς αλύσου και οι προσταγλανδίνες [1]. PPARs σχηματίζουν ετεροδιμερή με τον υποδοχέα ρετινοειδούς Χ (RXR) και προσδένονται στα στοιχεία ειδικής σε υποκινητές γονιδίων. PPARs εμπλέκονται σε μεταβολικές και αναπτυξιακές διαδικασίες. ΡΡΑΚβ /δ έχει ένα σημαντικό ρόλο στην λιπιδίων και του μεταβολισμού της γλυκόζης και είναι ένας ελκυστικός θεραπευτικός στόχος για μεταβολικές και εκφυλιστικές διαταραχές [1]. ΡΡΑΚβ /δ εμπλέκεται επίσης στην φλεγμονή, την επούλωση των πληγών, την ανάπτυξη των κυττάρων και τη διαφοροποίηση. ΡΡΑΚβ /δ υπερεκφράζεται σε καρκίνους του ανθρώπου και μπορεί να είναι σημαντική στην έναρξη και την εξέλιξη του όγκου [1]. Προς στήριξη ενός προ-ογκογόνο λειτουργία, ΡΡΑΚβ /δ συνδέτες προωθείται επιβίωση των καρκινικών κυττάρων in vitro [2], [3], [4] και την ανάπτυξη του όγκου σε ποντικούς [5], [6], [7]. Αντιστρόφως, γενετικοί knock-out του ΡΡΑΚβ /δ σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου μειωμένη ανάπτυξη όγκου σε ποντικούς [8]. Άλλα στοιχεία, ωστόσο, χρησιμοποιώντας αγωνιστές και γενετική νοκ-άουτ στην κυτταρική και το ποντίκι μοντέλα έρχονται σε αντίθεση με αυτή τη λειτουργία προώθηση του όγκου [9]. Knock-out του ΡΡΑΚβ /δ σε μοντέλα καρκίνου του παχέος εντέρου έχει αναφερθεί για την προαγωγή του σχηματισμού όγκων σε ποντικούς, ενώ οι αγωνιστές μειωμένη πολλαπλασιασμού των κυττάρων in vitro και της ανάπτυξης του όγκου σε ποντικούς [10], [11], [12]. Διάφοροι παράγοντες μπορεί να επηρεάσουν την απόκριση σε ενεργοποίηση με συνδέτη, υπερ-έκφραση και knock-out των ΡΡΑΚβ /δ. Έχουμε αναφέρει προηγουμένως ότι η έκφραση και η δραστικότητα του ΡΡΑΚβ /δ διέφεραν σημαντικά σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC και το επίπεδο πρωτεΐνης /δ ΡΡΑΚβ εξαρτάται από την ικανότητα συνδέτες να προστατεύεται από αποικοδόμηση proteosomal [13]. Το βασικό επίπεδο του υποδοχέα και αυτή η μετα-μεταγραφική ρυθμιστική βήμα θα μπορούσε να εξηγήσει εν μέρει για τις μεταβλητές αποκρίσεις σε ΡΡΑΚβ /δ αγωνιστές σε διαφορετικές πειραματικές συνθήκες [14].

Κατά τη διάρκεια της επούλωσης του τραύματος και φλεγμονή ΡΡΑΚβ λειτουργία /δ είναι που συνδέονται με την επαγωγή της κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2) [1]. Cox-2 μετατρέπει το αραχιδονικό οξύ που απελευθερώνεται από φωσφολιπάση Α

2 (cPLA

2) μέσα PGH

2 [15]. PGH

2 στη συνέχεια μετασχηματίζεται σε προσταγλανδίνες, όπως η προσταγλανδίνη Ε

2 (PGE

2) και προσταγλανδίνης Ι

2 (PGI

2), προικισμένο πολύπλοκων βιολογικών δραστηριοτήτων. Το αραχιδονικό οξύ και ΠΓΕ

2 ενεργούν ως ΡΡΑΚβ /δ αγωνιστές [2], ενώ η PGE

2 ενισχύει τη δραστηριότητα των ΡΡΑΚβ /δ, χωρίς απευθείας σύνδεση με τον υποδοχέα [6]. Μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα (NSAIDs) και οι αναστολείς Cox-2 επηρεάζουν ΡΡΑΚβ /δ, με την πρόληψη της παραγωγής προσταγλανδινών [3]. Από την άλλη πλευρά, η αυξημένη έκφραση του ΡΡΑΚβ /δ έχει αναφερθεί ότι προστατεύουν τα καρκινικά κύτταρα από την αντι-πολλαπλασιαστική και προ-αποπτωτικά αποτελέσματα των NSAIDs και αναστολείς Cox-2 [3]. COX-2 είναι υπερ-εκφράζεται σε προ-κακοήθη και κακοήθεις αλλοιώσεις, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του πνεύμονα [16], και έχει ένα σημαντικό ρόλο στη φλεγμονή και αγγειογένεση [15] που σχετίζονται με όγκους. Επιπλέον, ΡΡΑΚβ /δ και Cox-2 μπορεί να έχουν επίδραση στην παραγωγή του προ-φλεγμονώδεις και προ-αγγειογόνοι παράγοντες σε όγκους, όπως αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) [17], [18]. Έτσι, τα τρέχοντα στοιχεία τοποθετεί ΡΡΑΚβ /δ, μαζί με Cox-2 και προσταγλανδίνης συνθάσες μέσα οδούς σηματοδότησης που θα μπορούσαν να ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και την αλληλεπίδρασή τους με το μικροπεριβάλλον του όγκου.

Καρκίνου

πνεύμονα είναι η κύρια αιτία του καρκίνου θανάτου παγκοσμίως [19]. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 85% όλων των καρκίνων του πνεύμονα. NSCLC είναι συχνά διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο και έχει μια πολύ κακή πρόγνωση. Μια καλύτερη κατανόηση των παραγόντων που εμπλέκονται στην προέλευση και την εξέλιξη του NSCLC μπορεί να οδηγήσει σε βελτίωση της θεραπείας και πρόληψης. Σε αυτή τη μελέτη ερευνήσαμε εάν και πώς ΡΡΑΚβ /δ θα μπορούσαν να συμβάλουν στην παθογένεια του NSCLC. Βρήκαμε ότι ΡΡΑΚβ /δ ήταν συχνά πάνω ρυθμισμένα σε NSCLC σύγκριση με το φυσιολογικό πνεύμονα. ΡΡΑΚβ /δ υπερέκφραση γενικά σχετίζεται με αυξημένη έκφραση του cPLA

2, COX-2, PGEs και VEGF. Εξετάσαμε τις συνέπειες της ενεργοποίησης /δ ΡΡΑΚβ επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης και στην έκφραση της COX-2 και VEGF σε κυτταρικές γραμμές NSCLC. Βρήκαμε στοιχεία που συνάδουν με μια φιλο-ογκογόνο ρόλο της ΡΡΑΚβ /δ με NSCLC. Επιπλέον, βρήκαμε ότι ΡΡΑΚβ /δ αγωνιστές οδήγησε στην επαγωγή του VEGF και μέσω ενός παράλληλου μη-μεταγραφικό μηχανισμό που συνδέεται με ΡΙ3Κ /Akt ενεργοποίησης. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι ΡΡΑΚβ /δ μπορεί να είναι ένα κεντρικό στοιχείο της πνευμονικής καρκινογένεσης έλεγχο πολλαπλές διαδικασίες και τις οδούς και, συνεπώς, αντιπροσωπεύει ένα δυνητικό στόχο για την ανάπτυξη νέων στρατηγικών για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές γραμμές

Ανθρώπινο πνευμονικό κυτταρικές γραμμές καρκινώματος Η358, Η441, Η23 και Α549 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (LGC Promochem, Molsheim, F) και διατηρήθηκαν σε RPMI συμπληρωμένο με 10% FBS. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ελεύθερο ερυθρού φαινόλης RPMI συμπληρωμένο με 5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό (HyClone, Logan, UT, USA) πριν από την επώαση με συνδέτες PPAR.

Χημεία

GW501516, LY294002 και κιγλιταζόνη αγοράστηκαν από τον Αλέξη (Λωζάνη, Ελβετία). cPGI

2 αγοράστηκε από την Biomol (Plymouth Meeting, ΡΑ). L165041 και NS398 ελήφθησαν από τη Sigma (Buchs, CH). Ουορτμανίνη αγοράστηκε από Calbiochem (Merk Βιοεπιστημών, Nottingham, UK). Η ΡΡΑΚβ ανταγωνιστής /δ GSK0660 παρασχέθηκε από τον Dr. Α Billin (GlaxoSmithKline, USA). Όλες οι ενώσεις διαλύθηκαν σε DMSO.

Δείγματα Ασθενών

πνεύμονα δείγματα καρκίνου (πλακωδών κυττάρων καρκινώματα και αδενοκαρκινώματα, το στάδιο ΙΑ με ΙΙΙΑ) και δίπλα δείγματα φυσιολογικό πνευμονικό ιστό ήταν από το Ιατρικό Πανεπιστήμιο της Νότιας Καρολίνας (Τσάρλεστον, SC, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) και λήφθηκαν κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης με τη συγκατάθεση του ασθενούς ενημέρωσε. Δείγματα ιστών καταψύχθηκαν και αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο. RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNA Stat-60. RT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 100 ng του συνολικού RNA και 0.4 μΜ εκκινητών με SuperScript One-Step RT-PCR (Invitrogen). Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, οπτικοποιούνται χρησιμοποιώντας το AlphaImager (AlphaInnotech) και ποσοτικοποιείται με πυκνομετρική ανάλυση χρησιμοποιώντας το λογισμικό AlphaImager. Τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν ως αναλογία μεταξύ της έντασης ζώνης σε ζεύγη όγκου και τα κανονικά δείγματα κανονικοποιήθηκαν με το γονίδιο αναφοράς β-ακτίνης. ανάλυση συσχέτισης Pearson πραγματοποιήθηκε στα κανονικοποιημένα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου. Γονιδίωμα-ευρύ σύνολα δεδομένων μεταγραφικό από ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα και τα δείγματα φυσιολογικό πνευμονικό ιστό από τέσσερις διαφορετικές μελέτες (PMID: 18992152, 11707590, 20421987, 18641660) χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση συσχετίσεις μεταξύ δ και υποθετικών γονιδίων-στόχων ΡΡΑΚβ /. Κανονικοποιημένες τιμές γονιδιακής έκφρασης για κάθε μεταγραφή είχαν κατεβάσει και το συντελεστή συσχέτισης Pearson και η αντίστοιχη τιμή-p σε σχέση με ΡΡΑΚβ /δ υπολογίστηκαν για τα δείγματα σε κάθε σύνολο δεδομένων.

λουσιφεράσης Δοκιμασία

Η ΡΡΑΚβ /δ ανταποκρίνεται δημοσιογράφος (DRE) παρασχέθηκε από τον B. Vogelstein [3]. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με DRE ή βασικό αναφοράς λουσιφεράσης pGL3 μαζί με πλασμίδιο ελέγχου pRL-SV40 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με 5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό για 24 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ διπλής λουσιφεράσης (Promega) όπως περιγράφεται [20].

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού και Βιωσιμότητας

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε άνευ ερυθρού φαινόλης RPMI συμπληρωμένο με 5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό. Μετά από 24 ώρες τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με συνδετήρες ή DMSO (0.1%) σε 0.1% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό. Αριθμός βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ μετά από 72 ώρες [20]. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Για κυτταρικού κύκλου τα κύτταρα ανάλυση αναπτύχθηκαν σε 0.1% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό και συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες επώασης με συνδετήρες ή DMSO. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφεται [20].

παρεμβολή RNA

Για πειράματα knock-down, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε χαμηλή συγκέντρωση (30-50% συρροή ) και επιμολύνθηκαν με 10 ηΜ siRNA (Ambion, Huntingdon, UK) που κατευθύνεται προς ΡΡΑΚβ /δ (siPPARβ /δ) και λουσιφεράση πυγολαμπίδας (siGL3) χρησιμοποιώντας ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ σύμφωνα με το προτεινόμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Polyplus). Η επιμόλυνση του siRNA επανελήφθη κάθε τρεις ημέρες για τρεις φορές. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ μετά από 72 ώρες ανάπτυξης σε 0,1% του απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό από την τελευταία διαμόλυνση. Η απόπτωση παρομοίως αξιολογήθηκε μετά από 72 ώρες με Annexin V-FITC και κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφεται [20].

Απομόνωση RNA και RT-PCR

Κύτταρα (1 χ 10

6 κύτταρα) απλώθηκαν σε πιάτα 60-mm, αναπτύχθηκαν σε ορό και άνευ ερυθρού φαινόλης RPMI για 24 ώρες, και στη συνέχεια επωάστηκαν με διάφορες ενώσεις για 18 ώρες. RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen) και RNeasy MINIKIT (Qiagen). RT-PCR διεξήχθη υπό μη κορεσμού συνθήκες χρησιμοποιώντας το SuperScript ™ III One-Step RT-PCR System (Invitrogen) και το γονίδιο-ειδικούς εκκινητές (Πίνακας S1) [20]. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε πηκτές αγαρόζης 2%, χρωματίστηκαν με GelRed (Biotium, Basel, CH) και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το AlphaImager όπως περιγράφεται παραπάνω.

ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα λύθηκαν όπως περιγράφεται [13] . Τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 14,000 χ g για 10 λεπτά για να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα και συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε. Οι πρωτεΐνες φορτώθηκαν σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 10-12% και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση. Procaspase-3 (302), ΡϋΚ1, ΡΤΕΝ, Akt, και φωσφο-Akt (Ser 473) αντισώματα αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Cox-2 (Ε-29) και ΡΡΑΚβ /δ (H-74) αντισώματα ελήφθησαν από St Cruz (Χαϊδελβέργη, Γερμανία). Τουμπουλίνης αντίσωμα (Ab-1) αγοράστηκε από Oncogene (Merk Βιοεπιστημών, Nottingham, UK).

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (chip) θα

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε συρροή σε 75-cm

2 φιάλες, πεινασμένο, και επωάζονται με GW501516 ή όχημα για 18 ώρες. ChIP διεξήχθη όπως περιγράφεται [21] με αντι-ΡΡΑΚβ /αντισώματος 4 μg δ ή αντι-IgG ως αρνητικό μάρτυρα. PCR έγινε με εκκινητές που εκτείνονται τις περιοχές από -527 -298 να και από τις -1338 να -1123 του υποκινητή του VEGF παρουσία βεταΐνη και DMSO με χρήση AmpliTaq Gold (Applied Biosystem, Foster City, CA). Η πυκνομετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό AlphaImager.

-tagged His ΡΡΑΚβ /δ Τραβήξτε προς τα κάτω και Ανοσοκαταβύθιση

Ο φορέας έκφρασης /δ His-ΡΡΑΚβ περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Η His tagged-Ν- και C- τερματικές κολοβωμένες κατασκευάσματα του ΡΡΑΚβ /δ παράχθηκαν με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με Lipofectamine, αναπτύχθηκαν σε συρροή και επωάσθηκαν με και χωρίς δ συνδέτες ΡΡΑΚβ /. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA επί 30 λεπτά επί πάγου και με την επιφύλαξη να τραβήξει προς τα κάτω με επιλεγμένα His-γέλη συγγένειας νικελίου (Sigma). Οι πρωτεΐνες εκλούστηκαν με ρυθμιστικό Laemmli. Ισοδύναμα κλάσματα προϊόντων λύσεως, συνεχούς ροής και προϊόντα έκλουσης φορτώθηκαν επί πηκτών και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση. Ανοσοκατακρήμνιση (ΙΡ) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ορού αντι-p85α (ένα δώρο του Μ Thelen, IRB, Μπελιντσόνα, CH) και χάντρες A /G sepharose (Θέρμο Scientifics). His-ΡΡΑΚβ /δ ανιχνεύτηκε με ένα αντι-His αντίσωμα (Sigma).

Αποτελέσματα

Η έκφραση της ΡΡΑΚβ /δ με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

Εμείς αξιολογούνται το επίπεδο του ΡΡΑΚβ /δ, μαζί με PPARγ, cPLA

2, COX-2, PGEs και ΠΓΕ σε κυτταρικές γραμμές NSCLC. Η έκφραση αυτών των γονιδίων ποικίλει σημαντικά μεταξύ των κυτταρικών σειρών (Σχ. 1Α). κύτταρα Η441 είχαν υψηλά επίπεδα ΡΡΑΚβ /δ, Cox-2, cPLA

2, PGEs και ΡΡΑΚγ. H358 και H23 κύτταρα είχαν ενδιάμεσα επίπεδα ΡΡΑΚβ /δ και χαμηλή /μέτρια έκφραση της COX-2, ΡΟΕ, cPLA

2 και PPARγ. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα Α549, τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί σε πολλές μελέτες για να δοκιμαστούν τα αποτελέσματα ΡΡΑΚβ /δ αγωνιστές, είχε το χαμηλότερο επίπεδο του ΡΡΑΚβ /δ και PGEs, ενώ είχαν σχετικά υψηλή έκφραση του ΡΡΑΚγ και Cox-2. Η διαφορά στο επίπεδο /δ ΡΡΑΚβ μεταξύ Η441 και Α549 κύτταρα επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας ένα επιλεκτικό ΡΡΑΚβ /δ αποκρίνεται ρεπόρτερ λουσιφεράσης [3] (Σχ. 1 Β) και ήταν σύμφωνο με τα προηγούμενα δεδομένα από την ομάδα μας στο επίπεδο της πρωτεΐνης και την αντίδραση σε ενεργοποίηση με συνδέτη στην δύο κυτταρικές γραμμές [13]. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι περισσότερες από τις κυτταρικές σειρές NSCLC δεν εξέφρασαν ΠΓΕ, με την εξαίρεση των κυττάρων Η23 στα οποία ανιχνεύθηκε ένα χαμηλό επίπεδο ΠΓΕ mRNA. Αυτό πρότεινε ότι PGI

2 είναι απίθανο να παράγονται ενδογενώς στα περισσότερα κύτταρα NSCLC.

(Α) RNA που απομονώνεται από τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές γραμμές ενισχύθηκε με RT-PCR για να εκτιμηθεί το επίπεδο του ΡΡΑΚβ /δ, PPARγ, cPLA

2, Cox-2, ΠΓΕ, και ΡΟΕ RNA. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς. (Β) Η441 και Α549 κύτταρα μορφομετατράπηκαν με ένα /δ αποκρίνεται ρεπόρτερ ΡΡΑΚβ λουσιφεράσης (DRE) ή βασικό αναφοράς λουσιφεράσης pGL3 (Basic). Η δραστικότητα λουσιφεράσης αξιολογήθηκε μετά από 24 ώρες. * P & lt? 0,01. (C) RNA που απομονώθηκε από όγκους του πνεύμονα και γειτονικό φυσιολογικό ιστό πνεύμονα αναλύθηκε με RT-PCR με εκκινητές ειδικούς για ΡΡΑΚβ /δ και β-ακτίνης.

Η

Στη συνέχεια, εξετάσαμε την έκφραση των ίδιων γονιδίων σε φυσιολογικό πνεύμονα και του ιστού του όγκου δειγμάτων από ασθενείς με NSCLC (Σχήμα S1). Βρήκαμε αυξημένη ΡΡΑΚβ /δ mRNA σε πολλούς όγκους σε σύγκριση με τα ζεύγη κανονικά δείγματα πνευμόνων (Εικ. 1 C). Για τη σύγκριση του υποδείγματος εκφράσεως σε ολόκληρο το σύνολο του δείγματος, το επίπεδο του mRNA του κάθε γονιδίου προσδιορίστηκε με πυκνομετρική ανάλυση, κανονικοποιημένη σε β-ακτίνη και παρουσιάζονται ως λόγος του επιπέδου σε κάθε ζεύγος όγκου /φυσιολογικό αντίστοιχα δείγματα (Εικ. 2). ΡΡΑΚβ /δ mRNA ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα (αναλογία Τ /N ≥4) σε περίπου 50% των όγκων. Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές της υπερ-έκφρασης αυτού NHR σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των NSCLC [1], [22]. Cox-2, cPLA

2 και PGEs επίσης πάνω ρυθμισμένα στα περισσότερα δείγματα όγκου (Εικ. 2). Up-ρύθμιση αυτών των γονιδίων ήταν ιδιαίτερα εμφανής σε όγκους με ΡΡΑΚβ /δ υπερ-έκφραση. Αξιοσημείωτα, ΠΓΕ ανιχνεύθηκε σε φυσιολογικό πνεύμονα και άλλαξε μόνο ελαφρά σε ένα μικρό κλάσμα των περιπτώσεων. ΡΡΑΚγ ήταν μετρίως αυξημένα σε μερικούς όγκους, αλλά πιο συχνά ρυθμίζεται προς τα κάτω, σύμφωνα με το υποθετικό ρόλο ογκοκατασταλτικό αποδοθεί σε αυτό το ΝΗΚ. VEGF, η οποία είναι μια υποθετική στόχος του ΡΡΑΚβ /δ και Cox-2, ήταν επίσης τα πάνω ρυθμισμένη σε πολλούς όγκους με ΡΡΑΚβ /δ υπερ-έκφραση (Εικ.). Αξίζει να σημειωθεί ότι, το επίπεδο των ΡΡΑΚβ /δ συσχετίζεται σημαντικά με την έκφραση της COX-2 (0,76 Pearson συντ? P-value, 2.91E-05.), CPLA

2 (0,69 Pearson συντ?. P-value 2.72E- 04) και VEGF (Pearson συντ 0,54?. p-value 0,018). Να παράσχει περαιτέρω υποστήριξη για τη σύνδεση μεταξύ ΡΡΑΚβ /δ, VEGF και Cox-2 εξετάσαμε το επίπεδο αυτών των γονιδίων σε διαθέσιμες στο κοινό σύνολα δεδομένων γονιδιακής έκφρασης από την κανονική και καρκίνο του πνεύμονα δείγματα ιστών. Βρήκαμε σημαντικές συσχετίσεις της ΡΡΑΚβ /δ με VEGF και της έκφρασης mRNA του Cox-2 σε πολλαπλά σύνολα δεδομένων (Πίνακας S2). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν συχνές και ταυτόχρονη ανοδική ρύθμιση του ΡΡΑΚβ /δ, VEGF και τα συστατικά του Cox-2 /προσταγλανδίνης συνθετική οδό σε ένα υποσύνολο του NSCLC και παρέχει υποστήριξη στην υπόθεση ότι η ενεργοποίηση αυτών των οδών μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην πνεύμονα καρκινογένεση.

RNA εξήχθη από όγκους και γειτονικό φυσιολογικό ιστό πνεύμονα από ασθενείς με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και εξετάστηκε με RT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν την αναλογία της γονιδιακής έκφρασης σε όγκους σε σχέση με τον φυσιολογικό ιστό ζεύγη με βάση την πυκνομετρική ανάλυση και ομαλοποιήθηκε ως προς β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς. Μαύρες μπάρες σηματοδοτούν τους όγκους με την υψηλότερη έκφραση της ΡΡΑΚβ /δ (T /N αναλογία ≥4).

Η

ΡΡΑΚβ /δ προωθεί τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα

Η απορρύθμιση της έκφρασης του ΡΡΑΚβ /δ μπορεί να ευνοήσει τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, μελέτες που έγιναν σε διάφορα μοντέλα κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα απέτυχαν να παρέχουν συνεπή αποτελέσματα [9], [23]. Τα δεδομένα που περιγράφονται παραπάνω δείχνουν ότι το πλαίσιο στο οποίο έγιναν κάποιες μελέτες ήταν αρκετά ετερογενής και θα μπορούσαν να επηρεάσουν τις ποικίλες κυτταρικές αποκρίσεις στην ενεργοποίηση /δ ΡΡΑΚβ. Βρήκαμε ότι οι αγωνιστές ΡΡΑΚβ /δ αυξημένο πολλαπλασιασμό και να προωθηθεί η επιβίωση των κυττάρων NSCLC. Η ενεργοποίηση του ΡΡΑΚβ /δ με cPGI

2 σε χαμηλό μέσο αυξημένη βιωσιμότητα των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό (Εικ. 3Α) του ορού. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με άλλο αγωνιστή ΡΡΑΚβ /δ, L165041 (Σχ. 3Β). Σταθερά, ανάλυση κύκλου κυττάρου έδειξε αύξηση των κυττάρων S φάσης μετά την κατεργασία με cPGI

2 σε μέσο χαμηλού ορού ενώ G1 κύτταρα φάσης μειώθηκε (Σχ. 3C). Αξιοσημείωτα, όλα αυτά τα αποτελέσματα ήταν εμφανή σε κύτταρα με υψηλή έκφραση του ΡΡΑΚβ /δ (π.χ., Η441 και Η358), ενώ δεν υπήρχε ή ελάχιστη επίδραση στην ανάπτυξη και του κυτταρικού κύκλου σε Α549 κύτταρα με χαμηλό επίπεδο του υποδοχέα (Εικ. 3Α- ΝΤΟ). Αυτά τα αποτελέσματα προ-ανάπτυξη και την επιβίωση ήταν ειδικά για δ αγωνιστές ΡΡΑΚβ /ως την επώαση με το σιγλιταζόνη συναγωνιστή ΡΡΑΚγ ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων (Εικόνα S2). Επιπλέον, η υψηλή έκφραση του ΡΡΑΚβ /δ συσχετίστηκε με μειωμένη ευαισθησία σε ΜΣΑΦ και αναστολείς Cox-2, όπως θειώδες σουλινδάκ, σουλφονικό σουλινδάκ και NS398, σε κύτταρα Η441 σε σύγκριση με Α549 κυττάρων με χαμηλή έκφραση /δ ΡΡΑΚβ (Εικόνα S2). Προς στήριξη της λειτουργίας προ-επιβίωσης, knock-down της ΡΡΑΚβ /δ, χρησιμοποιώντας μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) επηρέασε τη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικ. 3D). ΡΡΑΚβ /δ knock-down αύξησαν επίσης τον αριθμό των Αννεξίνη V θετική αποπτωτικών κυττάρων (Εικ. 3Ε) και προκαλούμενη από την ενεργοποίηση της κασπάσης-3, ενός γνωστού δείκτη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο (Σχ. 3F). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση του ΡΡΑΚβ /δ προάγει την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του υποδοχέα.

(Α) Η441, Η358 και Α549 κύτταρα επωάστηκαν με cPGI

2 σε μέσο και κυτταρική βιωσιμότητα ελεύθερο ορού εκτιμήθηκε μετά από 72 ώρες με ανάλυση ΜΤΤ. * Ρ & lt? 0,01 σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. (Β) Τα κύτταρα επωάστηκαν με L165041 όπως παραπάνω. * Ρ & lt? 0,01 σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. (C) Τα κύτταρα επωάστηκαν με cPGI

2 (10 μΜ) για 24 ώρες και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Top πίνακα

, αντιπροσωπευτικό προφίλ κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων Η358 επωάζονται με και χωρίς cPGI

2.

Κάτω πίνακα

, κατανομή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα μετά από 24 ώρες επώαση με και χωρίς cPGI

2. Η αύξηση των κυττάρων φάσης S σε Η441 και Η358 κύτταρα προσδιορίζεται σε πειράματα εις τριπλούν ήταν στατιστικά σημαντική (Ρ & lt? 0,01). (D) Κύτταρα Η441 διαμολύνθηκαν με siRNA για ΡΡΑΚβ /δ και GL3 και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε μετά από 72 ώρες με ΜΤΤ. * Ρ & lt? 0,01 σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. (Ε) κύτταρα επιμολυσμένα με Η358 ΡΡΑΚβ /δ siRNA και GL3 χρωματίστηκαν με ανεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό των αννεξίνη V θετικών κυττάρων (αποπτωτικά κύτταρα) υποδεικνύονται σε κάθε πίνακα. P & lt? 0,05. (F) Κύτταρα Η358 διαμολύνθηκαν με siRNA για ΡΡΑΚβ /δ και GL3, λύθηκαν και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση με ένα αντίσωμα κασπάσης-3. * P & lt?. 0.01

Η

ΡΡΑΚβ /δ Ενεργοποίηση Προκαλεί Cox-2 και VEGF έκφραση

Cox-2 και ΡΡΑΚβ /δ μπορεί λειτουργικά να αλληλεπιδρούν και αμοιβαία ρύθμιση ο ένας τον άλλον. Η ταυτόχρονη ανοδική ρύθμιση του ΡΡΑΚβ /δ και συστατικά του Cox-2 /προσταγλανδίνης συνθετική οδό σε ιστούς NSCLC και κυτταρικές σειρές υποστηρίζεται περαιτέρω αυτό το σύνδεσμο και μας διεγείρονται για να ελεγχθεί αν ΡΡΑΚβ /δ θα μπορούσαν να επηρεάσουν την έκφραση COX-2 σε κύτταρα NSCLC. Παρατηρήσαμε μια αύξηση του Cox-2 mRNA κατά την κατεργασία των κυττάρων με το NSCLC /δ συνδέτη ΡΡΑΚβ GW501516 (Σχ. 4Α). Αξιοσημείωτα, Cox-2 mRNA δεν αυξήθηκε σε Α549 κύτταρα υποδηλώνοντας ότι η επίδραση εξαρτάται από το επίπεδο των ενδογενών ΡΡΑΚβ /δ. GW501516 επήγαγε επίσης την μεταγραφή του γονιδίου λιπώδη διαφοροποίησης που σχετίζονται με πρωτεΐνη (ADRP), το οποίο είναι ένα γνωστό στόχο του ΡΡΑΚβ /δ, σε Η358 και Η441 κύτταρα και μόνο σε μικρό βαθμό σε κύτταρα Α549 (Σχ. 4Α). Αντιθέτως, PDK, ένα γονίδιο στόχος ΡΡΑΚβ /δ αναφέρθηκαν σε άλλες μελέτες [24], δεν επηρεάστηκε (Σχ. 4Α). Μια ανάλυση χρονικής πορείας έδειξε ότι οι αλλαγές στην COX-2 και ADRP mRNA επίπεδο ήταν εμφανής μέσα σε 4-8 ώρες από την προσθήκη του προσδέματος και αυξήθηκε περαιτέρω σε 24 ώρες (Εικ. 4Β).

(Α ) Η358, Η441 και Α549 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε συρροή, πεινασμένο για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με GW501516 (5 μΜ) για 18 ώρες. Ολικό RNA απομονώθηκε και εξετάστηκε με RT-PCR. (Β) Η358 κύτταρα επωάστηκαν με GW501516 για τους υποδεικνυόμενους χρόνους πριν από την εκχύλιση του RNA και ανάλυση.

Η

ΡΡΑΚβ /δ και Cox-2 θα μπορούσαν να αποτελέσουν εμπρόσθιας τροφοδότησης ρυθμιστικών βρόχος διατήρηση κυτταρική επιβίωση και πολλαπλασιασμό. Επιπλέον, ΡΡΑΚβ /δ αναγνωρίστηκε ως βασική συνιστώσα της αγγειογενετικής διακόπτη κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου [25] και VEGF, η οποία είναι ο κύριος μεσολαβητής της αγγειογένεσης, αναγνωρίστηκε ως στόχος της ΡΡΑΚβ /δ [18]. Ανάλυση της έκφρασης του VEGF στον NSCLC και φυσιολογικά δείγματα πνεύμονα έδειξαν αυξημένη έκφραση του VEGF και υψηλή συσχέτιση με ΡΡΑΚβ /δ σε καρκίνους του πνεύμονα (Εικ. 2 και Πίνακας S2), σε συνέπεια με την ιδέα ότι ΡΡΑΚβ /δ μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση του VEGF. Για να δοκιμαστεί η επίδραση του ΡΡΑΚβ /δ επί της έκφρασης VEGF, εμείς κατεργασμένα κύτταρα NSCLC με GW501516. VEGF mRNA αυξήθηκαν σε Η358 και Η441 κύτταρα επωάζονται με GW501516, ενώ δεν άλλαξε σε κύτταρα Α549 (Σχ. 4Α). Όπως φαίνεται για Cox-2 και ADRP, VEGF mRNA αυξήθηκε μέσα σε 4-8 ώρες και αυξήθηκε περαιτέρω μετά από 24 ώρες (Σχ. 4Β). Προς έκπληξή μας, η έκφραση των υποδοχέων του VEGF VEGFR1 και VEGFR2 μειώθηκε κατά την αγωγή με GW501516 (Εικ. 4Α-Β).

ΡΡΑΚβ /δ εμπλέκεται άμεσα στον κανονισμό του VEGF Μεταγραφή

Επαγωγή της έκφρασης του VEGF με ΡΡΑΚβ /δ μπορούσε αντιπροσωπεύει μια σημαντική λειτουργία του υποδοχέα. Για την απόδειξη της συμμετοχής της ΡΡΑΚβ /δ στην επαγωγή του VEGF που το έριξε κάτω με παρεμβολή RNA. Η απόδοση του siRNA μεσολάβηση knock-down επιβεβαιώθηκε με RT-PCR (Σχ. 5Α). ΡΡΑΚβ /δ knock-down μείωσε το βασικό επίπεδο VEGF mRNA και την ικανότητα του να επάγει GW501516 VEGF mRNA σε σύγκριση με τον έλεγχο επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 5Α). Η επίδραση της εξάντλησης /δ ΡΡΑΚβ ήταν περισσότερο εμφανής σε Η358 από κύτταρα Η441, πιθανώς λόγω του χαμηλότερου αρχικού επιπέδου του υποδοχέα. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με ADRP στόχο της άμεσης ΡΡΑΚβ /δ. Βασική έκφραση ADRP και η ανταπόκριση σε GW501516 ήταν χαμηλότερη σε ΡΡΑΚβ /δ απεμπλουτισμένο κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 5Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, knock-down του ΡΡΑΚβ /δ ελαφρώς μείωσε το βασικό επίπεδο VEGFR1 και VEGFR2 και ενισχυμένη, παρά ανταγωνίζονται, την επίδραση της GW501516 (Εικ. 5Α). Έτσι, η εξάντληση του ΡΡΑΚβ /δ είχε αντίθετα αποτελέσματα επί VEGF και VEGFRs, συνεπής με την αντίληψη ότι PPARs μπορεί να επηρεάσει την γονιδιακή έκφραση με διακριτούς μηχανισμούς [26].

(Α) Η358 και Η441 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ΡΡΑΚβ /δ siRNA και ελέγχου GL3 και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με GW501516 (5 μΜ) για 18 ώρες. επίπεδα Gene προσδιορίστηκαν με RT-PCR. (Β) Τα κύτταρα επωάστηκαν για 2 ώρες με GSK0660 (10 μΜ) και στη συνέχεια με GW501516 (5 μΜ) για 18 ώρες πριν από την ανάλυση με RT-PCR. (Γ) Η358 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GW501516 για 18 ώρες και υποβάλλονται σε επεξεργασία για χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση χρησιμοποιώντας αντι-ΡΡΑΚβ /δ και αντισώματα αντι-IgG. Η περιοχή του υποκινητή του VEGF που περιέχει PPRE (-527 /-298) και ένα μη-στοχευμένη περιοχή (-1338 /-1123) ενισχύθηκαν με PCR. Το PPRE περιέχει περιοχή του υποκινητή ADRP ενισχύθηκε ως θετικός έλεγχος.

Top πίνακα

, εκπρόσωπος σάρωσης gel.

Κάτω πίνακας

, πυκνομετρική ποσοτικοποίηση των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων σε κύτταρα Η441. * P & lt?. 0.01

Η

Εκτός από siRNA μεσολάβηση knock-down, ελέγξαμε το ΡΡΑΚβ /ανταγωνιστή δ GSK0660 [27]. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 2 ώρες με GSK0660 (10 μΜ) πριν από τη θεραπεία με GW501516. Αυτή η δόση των GSK0660 δεν επηρέασε κυτταρική βιωσιμότητα αλλά αποτελεσματικά ανέστειλε την δραστηριότητα /δ ΡΡΑΚβ. GSK0660 είχε περιορισμένες επιπτώσεις στην βασικό επίπεδο VEGF mRNA, αλλά μπλοκάρει την επαγωγή του VEGF με GW501516 (Εικ. 5Α). GSK0660 είχε μια παρόμοια επίδραση στην ADRP mRNA τόσο στη βασική κατάσταση και με την ενεργοποίηση συνδέτη. GSK0660 μείωσε επίσης το επίπεδο της VEGFR1 και VEGFR2 mRNA σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, τόσο σε βασικές συνθήκες και υπό την παρουσία GW501516 (Εικ. 5Β). Έτσι, τόσο siRNA μεσολαβεί knock-down και ο ανταγωνιστής /δ ΡΡΑΚβ μπλοκάρει την μεταγραφή VEGF, συνεπή με την υπόθεση ότι ΡΡΑΚβ /δ συμμετείχε άμεσα στη διαδικασία και ενήργησε ως μεταγραφικός ενεργοποιητής.

Για να προσδιορίσετε αν ΡΡΑΚβ /δ ρυθμισμένη έκφραση VEGF δια απευθείας συνδέσεως με τον υποκινητή του VEGF, πραγματοποιήσαμε χρωματίνη ανοσοκαθίζηση και αξιολογούνται πρόσδεση του ΡΡΑΚβ /δ σε μία περιοχή του υποκινητή του VEGF (-527 /-298) που περιέχει ένα PPRE [28]. Μια ανοδική περιοχή του προαγωγέα VEGF (-1338 /-1123) που στερείται PPREs χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Κατά την ενεργοποίηση συνδέτη, η δέσμευση του ΡΡΑΚβ /δ ανιχνεύθηκε στο PPRE περιέχει θέση ενώ καμία δέσμευση ανιχνεύθηκε στην απομακρυσμένη περιοχή (Εικ. 5C). Η πυκνομετρική ανάλυση των αποτελεσμάτων επιβεβαιώθηκε πρόσδεση του ΡΡΑΚβ /δ με τον υποκινητή του VEGF κατά την ενεργοποίηση συνδέτη, ενώ δεν υπήρχε δέσμευση απουσία του συνδετήρα και σε δείγματα IgG ελέγχου (Εικ. 5C). Επιπλέον, η έκταση του ΡΡΑΚβ /δ που συνδέεται με τον υποκινητή του VEGF ήταν συγκρίσιμη με εκείνη με την υποστηρικτής ADRP, ένας γνωστός του ΡΡΑΚβ στόχου /δ (Εικ. 5C).

ΡΙ3Κ ενεργοποίηση εμπλέκεται σε VEGF Induction με ΡΡΑΚβ /δ

Εμείς διερευνηθεί κατά πόσον επιπλέον μονοπάτια που έχουν συσχετιστεί με ΡΡΑΚβ /δ θα μπορούσαν να συμβάλουν στη ρύθμιση του VEGF σε απάντηση ΡΡΑΚβ /δ αγωνιστές. Η οδός ΡΙ3Κ /Akt ενεργοποιείται σε πολλούς καρκίνους και εμπλέκεται στην αγγειογένεση του όγκου [29]. ILK και PDK, δύο κατάντη κινάσες στόχος της Akt, δείχθηκε ότι ρυθμίζεται από ΡΡΑΚβ /δ [24] και την ενεργοποίηση του ΡΡΑΚβ /δ αυξήθηκε φωσφορυλιωμένο Akt (pAkt) σε ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα [30] και τα κύτταρα NSCLC [31]. Ως εκ τούτου, εξετάστηκε κατά πόσο η οδός PI3K /Akt συμμετείχε στην επαγωγή VEGF από ΡΡΑΚβ /δ αγωνιστές στα κύτταρα NSCLC. Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν για 2 ώρες με το LY294002 αναστολέα της ΡΙ3Κ που ακολουθείται από GW501516. Η προ-επώαση με LY294002 σε δόσεις γνωστό ότι αναστέλλει Akt phopshorylation μείωσε την έκφραση του VEGF και εμπόδισε την επαγωγή του VEGF σε απόκριση της ΡΡΑΚβ /συνδετήρα δ (Σχ. 6Α). LY294002 είχε μια παρόμοια επίδραση στην ADRP. Ωστόσο, ο αναστολέας ΡΙ3Κ δεν μπλοκάρουν τα κάτω ρύθμιση των VEGFR1 και VEGFR2 που προκαλείται από GW501516. Η βορτμαννίνη, ένας άλλος ισχυρός αναστολέας της ΡΙ3Κ, είχε παρόμοια αποτελέσματα επί VEGF, ADRP και VEGFRs (Σχ. 6Α).

(Α) Η358 κύτταρα αναπτύχθηκαν προς συρροή, σε νηστεία επί 24 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν για 2 ώρες με LY294002 (25 μΜ) ή wortmannin (200 ηΜ) ακολουθούμενη από GW501516 (5 μΜ) για 18 ώρες. RNA εκχυλίστηκε και αναλύθηκε με RT-PCR. (Β) Η358 και Η441 κύτταρα επωάστηκαν με και χωρίς GW501516 για τον υποδεικνυόμενο χρόνο. Τα κυτταρολύματα εξετάστηκαν με ανοσοκηλίδωση με αντισώματα για το σύνολο και φωσφορυλιωμένο Akt, PTEN και p85α. (Γ) Κύτταρα Η358 διαμολύνθηκαν με ΡΡΑΚβ His-/δ ή κενό φορέα pcDNA3.1 και επωάζονται με και χωρίς GW501516 για 18 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA και His-ΡΡΑΚβ /δ κατεδαφίστηκε με επιλεγμένα His-τζελ συγγένειας νικελίου. Τα ανοσοστυπώματα αναπτύχθηκαν με αντισώματα για ΡΡΑΚβ /δ και p85α. (D) Η358 κύτταρα επιμολύνθηκαν με pcDNA3.1, πλήρους μήκους His-ΡΡΑΚβ /δ (ΡΡΑΚβ /δ 1-441), ή κολοβωμένο ΡΡΑΚβ /δ συγκράτησης το Ν-τερματικό τμήμα (ΡΡΑΚβ /δ 1-168) και C- τερματικό τμήμα (ΡΡΑΚβ /δ 168 – 441), λύθηκαν σε RIPA ρυθμιστικό διάλυμα και υπόκειται σε ανοσοκαθίζηση με αντι-p85α αντίσωμα. Ανοσοστυπώματα των προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου και ανοσοϊζήματα (

μέση και κάτω πάνελ

, αντίστοιχα) πραγματοποιήθηκαν με αντισώματα που κατευθύνονται προς p85α, τουμπουλίνης και His-tag. Τα βέλη δείχνουν πλήρους μήκους και κολοβωμένες ΡΡΑΚβ /δ που ανιχνεύθηκε σε ανοσοστυπώματα προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου και ανοσοκαταβύθισης.

Top πίνακα

, σχηματική αναπαράσταση της δομής ΡΡΑΚβ /δ και την οργάνωση του τομέα.

Η

Μαζί, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η PI3K συνέβαλαν στην ΡΡΑΚβ /δ μεσολάβηση επαγωγή του VEGF. Το ομόλογο φωσφατάσης και tensin διαγράφονται στο χρωμόσωμα 10 (ΡΤΕΝ) είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της δραστηριότητας PI3K [29]. Διαφοροποίηση των ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι σε απόκριση στην ενεργοποίηση του PPARs έχει αποδοθεί σε αλλαγές στο επίπεδο ΡΤΕΝ. ΡΡΑΚγ αγωνιστές αυξημένη ΡΤΕΝ με επακόλουθη αναστολή της ΡΙ3Κ [32]. Από την άλλη μεριά, η ενεργοποίηση του ΡΡΑΚβ /δ που μειώνεται ΡΤΕΝ που οδηγεί σε αυξημένη pAkt [22], [31]. Ωστόσο, όταν αντιμετωπίζονται Η441 και Η358 κυττάρων με GW501516 δεν παρατηρήσαμε καμία συνεπής αλλαγή στο επίπεδο της PTEN (Εικ. 6Β). Επιπλέον, βρήκαμε ότι GW501516 επάγεται pAkt κατά πολύ νωρίς. Αυξημένη pAkt παρατηρήθηκε εντός 1-2 ώρες αγωγής και διατηρήθηκε για τουλάχιστον 4 ώρες (Σχ. 6Β). Σύνολο Akt, ΡΤΕΝ και p85α όχι ή ελάχιστα επηρεάζονται ήταν αυτή τη στιγμή, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι αλλαγές στο επίπεδο των πρωτεϊνών αυτών ήταν απίθανο να ευθύνονται για την επαγωγή της pAkt από τον αγωνιστή ΡΡΑΚβ /δ.

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι ΡΙ3Κ μπορεί να ενεργοποιηθεί με φυσική αλληλεπίδραση της ρυθμιστικής υπομονάδος p85α ΡΙ3Κ με NHRs.