Αφηρημένο

τηλέφωνα εισβολή είναι ένας κρίσιμος μηχανισμός της μετάστασης του καρκίνου και κακοήθεια . Μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 (MMP-9) είναι ένας σημαντικός πρωτεολυτικό ένζυμο που εμπλέκονται στη διαδικασία εισβολής των καρκινικών κυττάρων. Υψηλά επίπεδα έκφρασης της ΜΜΡ-9 σε καρκίνο του στομάχου θετικά συσχετίζονται με την επιθετικότητα του όγκου και έχουν σημαντική αρνητική συσχέτιση με το χρόνο επιβίωσης των ασθενών. Πρόσφατα, οι μηχανισμοί καταστολής MMP-9 από τα φυτοχημικά έχουν γίνει όλο και διερευνώνται. Chrysin, ένα φυσικό χημικό στα φυτά, έχει αναφερθεί ότι καταστέλλει την μετάσταση του όγκου. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της chrysin επί MMP-9 έκφρασης σε καρκίνο του στομάχου δεν έχουν καλά μελετηθεί. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τις επιδράσεις της chrysin επί ΜΜΡ-9 έκφραση σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα, και προσδιορίζεται υποκείμενο μηχανισμό της. Εξετάσαμε τις επιδράσεις του chrysin επί MMP-9 έκφρασης και της δραστηριότητας μέσω RT-PCR, ζυμογραφία, μελέτη προαγωγό, και western αποτύπωση σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο AGS κύτταρα. Chrysin ανέστειλε φορβόλη-12-μυριστική 13-οξική (ΡΜΑ) επαγόμενη ΜΜΡ-9 έκφραση σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Χρησιμοποιώντας AP-1 ολιγοδεοξυνουκλεοτιδίων δόλωμα, επιβεβαιώσαμε ότι η ΑΡ-1 ήταν το κρίσιμο μεταγραφικός παράγοντας για την MMP-9 έκφρασης. Chrysin μπλοκάρει ΑΡ-1 μέσω καταστολής της φωσφορυλίωσης της c-Jun και c-Fos μέσω κλείδωμα των /2 και ERK1 /2 μονοπάτια ΙΝΚ1. Περαιτέρω, τα κύτταρα AGS προεπεξεργασία με ΡΜΑ έδειξαν σημαντικά αυξημένη διεισδυτικότητα, η οποία εν μέρει καταργηθεί με chrysin και ΜΜΡ-9 αντίσωμα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι chrysin μπορεί να ασκήσει τουλάχιστον ένα μέρος του αντικαρκινική δράση του με τον έλεγχο της ΜΜΡ-9 έκφραση μέσα καταστολής της δραστικότητας ΑΡ-1 μέσω ενός μπλοκ των οδών σηματοδότησης JNK1 /2 και ERK1 /2 σε καρκίνο του στομάχου AGS κύτταρα.

Παράθεση: Xia Υ, Lian S, Κόι PN, Yoon HJ, Joo YE, Chay KO, et al. (2015) Chrysin Αναστέλλει όγκου Ανάδοχος-Induced MMP-9 έκφρασης μπλοκάροντας AP-1 μέσω καταστολή της ERK και JNK οδών σε κύτταρα γαστρικού καρκίνου. PLoS ONE 10 (4): e0124007. doi: 10.1371 /journal.pone.0124007

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Pankaj Κ Singh, του Πανεπιστημίου της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 5 του Οκτωβρίου του 2014? Αποδεκτές: 9 Μαρτίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 15, Απριλίου 2015

Copyright: © 2015 Xia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από μια επιχορήγηση Ερευνών (0720570) από το Εθνικό Κέντρο Καρκίνου (www.ncc.re.kr), επιχορήγηση Βασική Επιστήμη ερευνητικό πρόγραμμα μέσα από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών Κορέα (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας (2.010 έως 0.009.910, www.moe.go.kr), και ένα ερευνητικό κέντρο Ιατρικής (2012-000-9442) επιχορήγηση από την κορεατική Επιστήμης και Τεχνολογίας του Ιδρύματος ( www.nrf.re.kr). Όλα τα παραπάνω χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου κατατάσσεται σήμερα στην δεύτερη θέση στην παγκόσμια θνησιμότητα από καρκίνο, με κατ ‘εκτίμηση 990.000 νέες περιπτώσεις και 738.000 θάνατοι από καρκίνο προκύπτουν σε όλο τον κόσμο κάθε χρόνο, αν και η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του στομάχου έχει μειωθεί τις τελευταίες δεκαετίες [1,2]. Distant όργανο ή μετάστασης ιστός είναι ένα σημάδι της κακής πρόγνωσης σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Η μετάσταση είναι ο πιο θανατηφόρος χαρακτηριστικό των κακοήθων όγκων, που αντιπροσωπεύουν περισσότερο από το 90% των θανάτων που σχετίζονται με όγκους [2]. Έχει δειχθεί ότι η χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία δεν μπορεί να παρατείνει σημαντικά και να βελτιώσει την ποιότητα ζωής των ασθενών σε αυτές τις περιπτώσεις [3,4]. Τα καρκινικά κύτταρα μετάσταση είναι μια πολύ σύνθετη διαδικασία που αποτελείται από τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, εισβολή, και η επακόλουθη προσκόλληση και την αγγειογένεση σε άλλα όργανα ή ιστούς [3].

Από εισβολή είναι μια από τις θεμελιώδεις ιδιότητες των κακοηθών καρκινικών κυττάρων, ελέγχοντας εισβολή, είναι ένας σημαντικός θεραπευτικός στόχος. Κυττάρου-εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) αλληλεπιδράσεις, αποσύνδεση ενδοκυτταρικής προσκόλλησης, αποικοδόμηση του ECM, και η εισβολή της λέμφου και των αιμοφόρων αγγείων είναι σημαντικά βήματα στην εισβολή καρκίνου και μετάσταση [5]. Όγκων εισβολή απαιτεί μια αυξημένη έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs) [6]. MMPs, μια οικογένεια εξαρτώμενη από ψευδάργυρο ενδοπεπτιδασών οι οποίες προκαλούν καρκίνο εισβολή των κυττάρων και την εξάπλωση, παίζουν σημαντικό ρόλο στη μετάσταση από την αποικοδόμηση του ECM και της βασικής μεμβράνης [7]. Μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 (MMP-9), που είναι γνωστή ως 92 kDa τύπου IV κολλαγενάση ή ζελατινάση Β, είναι ένα από τα πιο σημαντικά MMPs, και κωδικοποιείται από το γονίδιο ΜΜΡ-9 σε ανθρώπους [8]. Έχει αναφερθεί ότι η υπερέκφραση των MMPs μπορεί να αυξήσει απόσπαση των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση, οι οποίες σχετίζονται με κακοήθεια και φτωχών κλινικά αποτελέσματα σε διάφορους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του στομάχου [9,10].

Λόγω της λειτουργίας του MMP- 9 κατά τη διάρκεια της κακοήθειας, η καταστολή των επιπέδων ΜΜΡ-9 είναι μια σημαντική στρατηγική για τον έλεγχο του καρκίνου. Τα τελευταία χρόνια, όλο και περισσότερη προσοχή έχει επικεντρωθεί στην εύρεση ενός αναστολέα ΜΜΡ-9, ιδιαίτερα από φυσικά υλικά. Kim et al. ανακάλυψαν ότι silibinin αναστέλλει ΡΜΑ-επαγόμενη έκφραση ΜΜΡ-9, μέσω καταστολής της φωσφορυλίωσης ERK σε MCF-7 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού [11]. Πιο πρόσφατα, Κόι et al. ανέφεραν ότι η (-) – όγκοι Epigallocatechin-3-gallate επαγόμενων από τη νικοτίνη MMP-9 έκφρασης και ικανότητα εισβολής μέσω της καταστολής του ΝΡ-κΒ και ΑΡ-1 σε ενδοθηλιακά κύτταρα ECV304 [12]. Chrysin, 5,7-dihydroxyflavone, ένα είδος φυσικά φλαβονοειδή, έχει γίνει γνωστό ότι αναστέλλουν την αγγειογένεση και την μετάσταση [13,14]. Lin et al. απέδειξαν ότι chrysin καταστέλλει IL-6 που προκαλείται από αγγειογένεση μέσω ρύθμιση προς τα κάτω του μονοπατιού σηματοδότησης διαλυτό υποδοχέα IL-6 /gp130 /JAK1 /STAT3 /VEGF [13]. Πρόσφατα έχει αναφερθεί ότι chrysin μπορούσε να ενισχύσει την κασπάση-εξαρτώμενη απόπτωση ρυθμίζεται από TRAIL σε HCT 116 κυτταρική γραμμή και τα κύτταρα CNE1 [15]. Yang et al. ανακάλυψαν ότι chrysin κατέστειλε την κυτταρική διείσδυση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα TNBC. Επιπλέον, chrysin μειώνει μόρια μετάστασης που σχετίζονται με βιμεντίνη, σαλιγκάρι και γυμνοσάλιαγκα, και μπλοκάρει το μονοπάτι σηματοδότησης Akt [16]. Ωστόσο, τα ανασταλτικά αποτελέσματα της chrysin επί ΜΜΡ-9, καθώς και το μηχανισμό, δεν έχουν καλά μελετηθεί, ειδικά σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε επιπτώσεις chrysin για PMA-επαγόμενη έκφραση MMP-9 σε καρκίνο του στομάχου, και αποκάλυψε υποκείμενο μηχανισμό της.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και συνθήκες καλλιέργειας

το AGS ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή ελήφθη από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και 0.6% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Για τον προσδιορισμό των επιπτώσεων της chrysin επί ΡΜΑ επαγόμενη έκφραση ΜΜΡ-9, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις chrysin και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΡΜΑ. Το επίπεδο της ΜΜΡ-9 αγγελιοφόρο RNA (mRNA) προσδιορίστηκε με ανάλυση ανάστροφης μεταγραφής-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR). Ο ρόλος των ειδικών οδών σηματοδότησης στο ΡΜΑ-επαγόμενη έκφραση ΜΜΡ-9 εξετάστηκαν με προκατεργασία των κυττάρων AGS με τον αναστολέα PD98059 ERK 1/2 (New England Biolabs, Beverly, ΜΑ), το SP600125 αναστολέα JNK (Calbiochem, La Jolla , CA), η SB203580 αναστολέα p38 ΜΑΡΚ (Calbiochem, La Jolla, CA), και chrysin (Sigma Aldrich, USA) για 1 ώρα πριν την διέγερση με PMA.

η βιωσιμότητα των κυττάρων

Cells ( 5 × 10

3) επωάστηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα σε RPMI με 10% FBS που περιέχει 0-100 μΜ chrysin για 24 ώρες, και η κυτταρική αναπνοή προσδιορίστηκε με μια καθιερωμένη 3- [4,5-διμεθυλθειαζολ-2 -υλ] -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ? Sigma-Aldrich) δοκιμασίας. Μετά την επώαση, 10 μΐ από 5 mg /ml ΜΤΤ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο των πλακών 96-φρεατίων και επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 ώρες. Οι κόκκοι που λαμβάνονται φορμαζάνης διαλύθηκαν σε 100% διμεθυλοσουλφοξείδιο, και η απορρόφηση στα 570 nm ανιχνεύτηκε με ένα 96-φρεατίων αναγνώστη ELISA (Biotek Inc., Winooski, νΤ, USA).

Ζελατίνη zymography

Cells προεπεξεργασία με ή χωρίς Chrysin για 1 ώρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 100 ηΜ ΡΜΑ επί 20 ώρες. Μετά την επώαση, συλλέξαμε το υπερκείμενο των μέσων ενημέρωσης και εκτελείται ζυμογραφία ζελατίνης για να ελεγχθεί η δραστικότητα ΜΜΡ-9. Στη συνέχεια, το μέσο αναμίχθηκε με ένα ίσο όγκο 2P-9 activityrazolium b [62.5 mM Tris-HCl (ρΗ 6,8), 25% γλυκερίνη, 4% SDS, και 0.01% κυανό βρωμοφαινόλης] και φορτώθηκε σε ένα 7,5% ακρυλαμιδίου: δισακρυλαμίδιο (29: 1? Bio-Rad, USA) που περιείχε γέλη 625 μg /ml ζελατίνης (Sigma). Μετά την ηλεκτροφόρηση, το πήκτωμα πλύθηκε με 2,5% Triton Χ-100 τρεις φορές (20 λεπτά ανά ώρα), στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C, στο ρυθμιστικό επώασης [50 mM Tris (ρΗ 7,5), 100 mM NaCl, 5 mM ΟαΟ

2, και 1 μΜ ΖηΟ

2]. Τα πήγματα βάφτηκαν με Coomassie Brilliant Blue R250 (Bio-Rad, USA) για 3 ώρες, και στη συνέχεια ξεπλένονται. Πρωτεολυτική δραστηριότητα αντικατοπτρίζεται τόσο σαφής ζώνες κατά το γαλάζιο φόντο του χρωματισμένο ζελατίνη. Φόρτωση ελέγχου για ζυμογραφία ζελατίνης: Coomassie Brilliant Blue R-250 γέλη λεκέ για 10% δωδεκυλοθειικό νάτριο πολυακρυλαμιδίου χωρίς ζελατίνη, για να δείξει ίση ποσότητα υπερκειμένου φορτώθηκε σε κάθε λωρίδα

Αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ

το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα AGS χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). Ένα μg ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για πρώτου κλώνου συμπληρωματικού σύνθεση DNA με χρήση τυχαίων εκκινητών και M-MLV μεταγραφάσης (Promega). Το συμπληρωματικό DNA υποβλήθηκε σε ενίσχυση PCR με σύνολα εκκινητών για GAPDH και ΜΜΡ-9 χρησιμοποιώντας μια PCR κύριο μείγμα διαλύματος (Intron, Κορέα). Οι ειδικοί εκκινητές αλληλουχίες ήταν ως εξής: GAPDH νόημα, 5′-TTG TTG CCA TCA ATG ACC CC-3 ‘και GAPDH αντινόημα, 5′-TGA CAA AGT GGT CGT TGA GG-3′ (836 bp)? και MMP-9 νόημα, 5’-ΑΑΟ ΤΟΟ CAC CAC CAC AAC ΑΤ -3 ‘και MMP-9 αντίθετης φοράς, 5′-ΤΤΤ CCC ATC AGC ΑΤΤ GCC GT-3′ (497 bp)? c-Jun νόημα, 5’-GGA AAC GAC CTT CTA TGA CGA TGC CCTCAA-3 ‘, και c-Jun αντίθετης φοράς, 5′-GAA CCC CTC CTG CTC ATC TGT CAC GTT CTT-3′ (287bp)? c-Fos νόημα, 5’-CAG TCA GAT CAA GGG AAG CCA CAG ACA TCT-3 ‘και c-Fos αντίθετης φοράς, 5′-ΟΑΑ ΤΑΑ GAT GGC TGC AGC ΥΠΑ ATG CCG CA-3’ (246bp). Οι συνθήκες PCR ήταν ως εξής: α. Μετουσίωση στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 52 ° C για 20 δευτερόλεπτα και επέκταση στους 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα

Μέτρηση της δραστικότητας προαγωγού ΜΜΡ-9

Η μεταγραφική ρύθμιση της ΜΜΡ-9 εξετάστηκε από την παροδική επιμόλυνση ενός ΜΜΡ-9 κατασκεύασμα ανταποκριτή υποκινητή-λουσιφεράσης (pGL4-ΜΜΡ-9). Το πλασμίδιο pGL4-MMP-9 υποκινητή (που καλύπτει τα νουκλεοτίδια -925 έως 13) παρασχέθηκε ευγενώς από το Δρ Young-Χαν Λι (Konkuk Πανεπιστήμιο, την Κορέα). AGS κύτταρα σπάρθηκαν και αναπτύχθηκαν μέχρις ότου έφθασαν το 70% συρροή. Στη συνέχεια, τα πλασμίδια υποκινητή pGL4-ΜΜΡ-9 διαμολύνθηκαν στα κύτταρα χρησιμοποιώντας FuGENE 6 (Promega, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. PRL-TK διαμολύνθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Τα κύτταρα επωάστηκαν στο μέσο επιμόλυνσης για 12 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΡΜΑ επί 4 ώρες. Οι επιδράσεις της chrysin στη δραστηριότητα υποκινητή ΜΜΡ-9 προσδιορίστηκαν με προκατεργασία κυττάρων με chrysin για 1 ώρα πριν από την προσθήκη ΡΜΑ. Οι μελέτες συν-επιμόλυνσης πραγματοποιείται παρουσία ή απουσία του φορέα έκφρασης που κωδικοποιεί το κυρίαρχο αρνητικό μετάλλαγμα ΜΕΚ-1 (PMCL-K97M), κυρίαρχη αρνητική μετάλλαξη JNK (PMCL-TAM67), ή κυρίαρχη αρνητική ρ38 μεταλλαγμένη ΜΑΡΚ (PMCL-MP38 ) τα οποία ευγενώς από το Δρ NG Ahn (Πανεπιστήμιο του Κολοράντο-Boulder, CO), από τον Dr. M.J. Birrer (NCI, Rockville, MD), και από τον Dr. J. Han (Research Institute Scripps, CA), αντίστοιχα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με ένα αντιδραστήριο λύσης κυτταρικής καλλιέργειας (Promega, USA), και η λουσιφεράση δραστηριότητες προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο (Centro XS lb960 μικροπλάκας φωτόμετρο, Berthold Technologies, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Παροδική επιμόλυνση ΑΡ-1 ρεπόρτερ

Ο ΑΡ-1 πλασμίδιο αναφοράς λουσιφεράσης αγοράστηκε από την Clontech (Palo Alto, CA, USA). Όταν τα κύτταρα έφθασαν AGS 60-70% συρροή, αυτά πλύθηκαν με μέσο Opti-ΜΕΜ και επιμολύνθηκαν με ένα φορέα pGL-3 περιέχει το ρεπόρτερ ΑΡ-1 με τη χρήση Fugene 6 (Promega) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Reporter-επιμολυσμένα κύτταρα προκατεργάστηκαν με chrysin για 1 ώρα και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 100 ηΜ ΡΜΑ επί 4 ώρες και τα λουσιφεράσης δραστηριότητες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο.

Η επιμόλυνση του ΑΡ-1 ολιγοδεοξυνουκλεοτιδίων δόλωμα

Με βάση την θέση πρόσδεσης ATGAGTCAT ΑΡ-1, σχεδιάσαμε το AP-1 δόλωμα phosphorothioated διπλής έλικας δεοξυνουκλεοτιδίων ολιγο (ODNs), ως εξής, 5′-CGsT CTT CTG AGT CAT GAA TTC ATG ACT CAG AAG ACsG-3 ‘, και 3 «-GsCA GAA GAC TCA ΟΤΑ CTT ΑΑΟ TAC TGA GTC TTC TsGC-5 ‘. Όταν τα κύτταρα AGS αυξήθηκε σε 60-70% συρροή, ΑΡ-1 ODNs και pGL4-ΜΜΡ-9 πλασμίδια υποκινητή συν-επιμολύνθηκαν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά από επώαση για 20 ώρες, τα επιμολυσμένα κύτταρα κατεργάστηκαν με ΡΜΑ επί 4 ώρες και τα λουσιφεράσης δραστηριότητες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο.

Western ανάλυση κηλίδος

AGS κύτταρα επεξεργασμένα με ΡΜΑ πλύθηκαν σε φωσφορικό άλας (PBS), αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό Τρυψίνη-ΕϋΤΑ και αποθηκεύθηκε στους -70 ° C μέχρι να χρειαστούν. Η κυτταρική πρωτεΐνη εκχυλίζεται με ένα ρυθμιστικό RIPA [1% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% δωδεκυλοθειϊκό νάτριο (SDS)] και αναστολείς πρωτεάσης (απροτινίνη, λευπεπτίνη, φαινυλομεθανοσουλφονυλοφθορίδιο (PMSF), βενζαμιδίνη, αναστολέα τρυψίνης, ορθοβαναδικό νάτριο ). Πενήντα μικρογραμμάρια των πρωτεϊνών στην συνέχεια διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση SDS-πολυακρυλαμιδίου 10% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες Hybond-P (Amersham Pharmacia Biotech). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε ένα διάλυμα TBST που περιέχει 5% αποβουτυρωμένο γάλα, επωάστηκαν με ένα πρωτογενές αντίσωμα σε ένα διάλυμα δεσμεύσεως όλη τη νύκτα στους 4 ° C, και πλένεται τρεις φορές με 0,1% Tween-20 σε ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα (TBST) σε διαστήματα 10 λεπτά με τα . Η υπεροξειδάση χράνου-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες με χημειοφωταύγεια. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ (ERK-1/2) (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA), αντι-φωσφο-ΙΝΚ /SAPK (Cell Signaling Technology), αντι-MMP- 9 (Cell Signaling Technology), αντι-φωσφο-c-Fos (Cell Signaling Technology), και αντι-φωσφο-c-Jun (Cell Signaling Technology). Τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης αναλύθηκαν με έκπλυση της κηλιδωμένη μεμβράνη με ένα διάλυμα απογύμνωσης που αποτελείται από 100 mM 2-μερκαπτοαιθανόλη, 2% SDS, και 62.5 mM Tris-HCl (ρΗ 6.7) για 30 λεπτά στους 50 ° C, και η μεμβράνη στη συνέχεια εκ νέου ανιχνεύθηκαν με είτε το αντι-β-ακτίνης (Cell Signaling Technology), αντι-ολική ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), αντι-ολική JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), αντι-c-Fos (Santa Cruz Biotechnology , Inc., CA, USA) ή αντι-c-Jun (Santa Cruz).

Matrigel δοκιμασία εισβολής

Η δοκιμασία κύτταρο εισβολή διεξήχθη χρησιμοποιώντας το θάλαμο chemotasis 10-φρεατίων (Neuro Probe, Gaithersburg, Maryland, USA) με 8 μεμβράνη μΜ πόρου (Neuro Probe) με 10% FBS που περιείχε RPMI ως χημειοελκτικό στον κατώτερο θάλαμο. AGS κύτταρα (10

5 σε 280 μΐ) προστέθηκαν σε άνω θάλαμο με PMA παρουσία χρυσίνη, ΜΜΡ-9 αντίσωμα ή μη ειδική IgG, και επωάστηκαν να εισβάλει στο Matrigel επί 24 ώρες. Για να προσδιοριστεί η επίδραση της chrysin και αναστολέων σηματοδότησης επί προκαλείται από ΡΜΑ κυττάρων εισβολής, AGS κύτταρα προ-επωάστηκαν με χρυσίνη, κουρκουμίνη, PD98059, ή SP600125 για 1 ώρα και επωάστηκαν με ΡΜΑ για την περίοδο εισβολής 24 ωρών. Τα μη εισβάλλοντα κύτταρα επί της άνω επιφανείας της κάθε μεμβράνης αφαιρέθηκαν από τον θάλαμο και τα εισβάλλοντα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια κάθε μεμβράνης βάφτηκαν με την Quick-Diff κιτ χρώσης (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) . Μετά από δύο εκπλύσεις με νερό, οι θάλαμοι αφέθηκαν να στεγνώσουν στον αέρα. Ο αριθμός των κυττάρων που εισβάλλουν μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης.

Στατιστικά

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD, και αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή τουλάχιστον τριών ξεχωριστών πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν. Διαφορές μεταξύ κάθε δύο συνόλων δεδομένων προσδιορίστηκαν με t-tests. Οι διαφορές που περιγράφεται ως σημαντική στο κείμενο αντιστοιχούν σε

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Η ανασταλτική επίδραση της chrysin στην PMA διεγείρονται MMP-9 έκφρασης

Για να διερευνηθεί η επίδραση της καταστολής chrysin ενάντια στην προς τα πάνω ρύθμιση της ΜΜΡ-9, AGS κύτταρα προκατεργάστηκαν με chrysin επωάστηκαν με ΡΜΑ, και ζελατίνη ζυμογραφία και ανάλυση RT-PCR διεξήχθησαν. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, ΡΜΑ-διεγερμένα ΜΜΡ-9 παρεμποδίστηκε από Chrysin με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο όπως απεικονίζεται μέσω της δοκιμασίας ζελατίνης ζυμογραφία. Πριν από το πείραμα μας, είτε άμεσα chrysin ανέστειλε την δραστικότητα του ΜΜΡ-9 ή ανέστειλε την έκφραση της ΜΜΡ-9 ήταν ακόμη άγνωστη. Για να απαντήσουμε στο ερώτημα αυτό, θα συν-επωάζεται το AGS-εκκρίνεται MMP-9 με chrysin για 3 ώρες, και ζυμογραφία ζελατίνης έγινε για να ελέγξει το τελικό επίπεδο της δραστηριότητας ΜΜΡ-9. Όπως δείχνει το Σχ 1Β, chrysin δεν μπορούσαν να επηρεάσουν εκκρίνεται ΜΜΡ-9 δραστηριότητες. Έτσι, υποθέσαμε ότι η αναστολή της chrysin έναντι ΜΜΡ-9 μπορεί να είναι μέσω καταστολής της MMP-9 έκφρασης. Για να επαληθευτεί αυτή η υπόθεση, αντίστροφη μεταγραφική PCR και προσδιορισμούς MMP-9 υποστηρικτής έγιναν για να ελέγξετε τα επίπεδα μεταγραφής MMP-9. Όπως φαίνεται στο Σχ 1C, μετά από επεξεργασία με χρυσίνη, το PMA-επαγόμενη MMP-9 mRNA μειώθηκε με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, η ΜΜΡ-9 δραστικότητα λουσιφεράσης υποκινητή αναστάλθηκε από Chrysin με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1 D). Και κηλίδωση Western έδειξε επίσης την ανασταλτική δράση των chrysin επί MMP-9 έκφρασης (Εικ 1Ε). Οι συγκεντρώσεις των chrysin που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα των κυττάρων (Σχήμα 1 F). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι chrysin αναστέλλει δραστικότητα ΜΜΡ-9 σε κύτταρα AGS μέσω της μείωσης της μεταγραφικής αποτελεσματικότητας.

Ένα σύνολο 2 × 10

6 κύτταρα προκατεργάζονται με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις chrysin για υπέστησαν αγωγή 1 ώρα με 100 ηΜ ΡΜΑ για 20 ώρες. Μετά την επώαση, το υπερκείμενο μέσα κυτταρικής καλλιέργειας συλλέχθηκε και ζυμογραφία ζελατίνης έγινε για να αναλυθεί η δραστικότητα ΜΜΡ-9 (Α). Τα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας που περιέχει AGS κύτταρα εκκρίνεται ΜΜΡ-9 επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις chrysin σε 37 ° C για 3 ώρες, στη συνέχεια η ζελατίνη ζυμογραφία διεξήχθη για να αναλυθούν οι τελικές ΜΜΡ-9 δραστηριότητες (η πρώτη λωρίδα, τη φόρτωση ενός ελέγχου, περιείχε το καλλιέργειας κυττάρων υπερκείμενο μέσο χωρίς επώαση με chrysin) (Β). Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις chrysin επί 1 ώρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 100 ηΜ ΡΜΑ επί 4 ώρες. Μετά την επώαση, RT-PCR πραγματοποιήθηκε για να αναλυθεί η mRNA ΜΜΡ-9. #

P

& lt? 0,05 έναντι ελέγχου? *

P

& lt? 0,05 έναντι μόνο PMA (C). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή υποκινητή pGL4-ΜΜΡ-9. Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις chrysin για 1 h, στη συνέχεια επωάστηκαν με 100 ηΜ για 4 ώρες, στην οποία η δραστικότητα της λουσιφεράσης σημείο προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο. #

P

& lt? 0,05 έναντι ελέγχου? *

P

& lt? 0,05 έναντι μόνο PMA (D). Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις chrysin επί 1 ώρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 100 ηΜ ΡΜΑ για 8 ώρες. Μετά την επώαση, η δυτική μπουλόνι διεξήχθη η ανάλυση του επιπέδου της πρωτεΐνης ΜΜΡ-9. #

P

& lt? 0,05 έναντι ελέγχου? *

P

& lt? 0,05 έναντι μόνο PMA (Ε). Τα κύτταρα συν-επωάστηκαν με 0-80 μΜ chrysin για 24 ώρες και στη συνέχεια βιωσιμότητες τους ελέγχθηκαν με τη μέθοδο ΜΤΤ. *

P

& lt? 0,05 έναντι του ελέγχου (χωρίς chrysin) (F). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από μετρήσεις εις τριπλούν.

Η

Ο ρόλος της ΑΡ-1 σε ΡΜΑ-επαγόμενη έκφραση ΜΜΡ-9

Όπως αναφέρθηκε από προηγούμενη βιβλιογραφία, ΑΡ-1 είναι ο σημαντικότερος παράγοντας μεταγραφής σε ΜΜΡ-9 έκφραση [17]. Σε αυτή τη μελέτη, για να επιβεβαιώσει ότι η ΑΡ-1 είναι κριτικά που απαιτούνται σε αυτό το μάθημα, θα χρησιμοποιηθεί ένα AP-1 δόλωμα phosphorothioated διπλής έλικας ολιγοδεοξυνουκλεοτίδιο (ΟϋΝ) και pGL3-AP-1 πλασμίδιο λουσιφεράσης να συν-επιμόλυνση στα κύτταρα AGS. Οι συν-επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΡΜΑ, και η λουσιφεράση δραστηριότητες προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, το PMA-επαγόμενη δραστηριότητες λουσιφεράσης ΜΜΡ-9 υποκινητή ανεστάλησαν από την ΑΡ-1 δόλωμα. Σταθερά, ΑΡ-1 δόλωμα ανέστειλε επίσης προκαλείται από ΡΜΑ MMP-9 έκφραση mRNA (Σχήμα 2Β). Αποδείχθηκε ότι καταρρέει το ΑΡ-1 συστατικό c-fos και c-Jun επίσης μειώθηκε ΡΜΑ επαγόμενη έκφραση ΜΜΡ-9 (Σχ 2C). Επιπλέον, η κουρκουμίνη, ένας αναστολέας ΑΡ-1, επίσης χρησιμοποιήθηκε για να ελέγξει το ρόλο του ΑΡ-1 σε ΡΜΑ-επαγόμενη έκφραση ΜΜΡ-9. Καθώς τα δεδομένα RT-PCR απεικονίζει, κουρκουμίνη ανέστειλαν ΡΜΑ-επαγόμενη έκφραση ΜΜΡ-9 σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2D). Τα παραπάνω στοιχεία έδειξαν ότι η AP-1 είναι ο ουσιαστικός παράγοντας για την MMP-9 έκφρασης. Μετά αποδεικνύοντας τον κρίσιμο ρόλο του ΑΡ-1 στα υψηλά επίπεδα ΜΜΡ-9 έκφραση, υποθέσαμε ότι ο μηχανισμός αναστολής chrysin της ΜΜΡ-9 έκφραση θα ήταν η καταστολή της δραστικότητας ΑΡ-1. Ακολούθως, τα κύτταρα AGS επιμολυσμένα με πλασμίδια ανταποκριτές ΑΡ-1 λουσιφεράσης προκατεργάστηκαν με χρυσίνη, και στη συνέχεια διεγείρεται από ΡΜΑ. Όπως φαίνεται στο Σχ 2Ε, chrysin κατέστειλε ΡΜΑ-επαγόμενη AP-1lucifease δραστηριότητα σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, η οποία έδειξε ότι chrysin έχει την ικανότητα να μειώνουν δραστικότητα ΑΡ-1.

Το ολιγονουκλεοτίδιο δόλωμα ΑΡ-1 ήταν co -επιμολυσμένα με έναν υποκινητή pGL4-ΜΜΡ-9 σε AGS κύτταρα. Μετά την επώαση με 100 ηΜ ΡΜΑ επί 4 ώρες, ΜΜΡ-9 δραστικότητα λουσιφεράσης υποκινητή εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο (Α), και ΜΜΡ-9 mRNA εξετάστηκε με RT-PCR (Β). #

P

& lt? 0,05 έναντι ελέγχου? *

P

& lt? 0,05 έναντι μόνο PMA. C-Jun και c-Fos siRNA επιμολυσμένα κύτταρα AGS επωάστηκαν με 100 ηΜ ΡΜΑ επί 4 ώρες, και μετά από κυτταρική συγκομιδή MMP-9 mRNA εξετάστηκε με RT-PCR. #

P

& lt? 0,05 έναντι ελέγχου? *

P

& lt? 0,05 έναντι μόνο PMA (C). AGS κύτταρα προκατεργάστηκαν με τη δεικνυόμενη συγκέντρωση της κουρκουμίνης επί 1 ώρα επωάστηκαν με 100 ηΜ ΡΜΑ επί 4 ώρες. Μετά την επώαση, το mRNA ΜΜΡ-9 στα κυτταρικά λύματα προσδιορίστηκε με RT-PCR. #

P

& lt? 0,05 έναντι ελέγχου? *

P

& lt? 0,05 έναντι μόνο PMA (D). Οι pGL3-AP-1 επιμολυσμένα κύτταρα προκατεργάστηκαν με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις chrysin για 1 ώρα, και στη συνέχεια επωάστηκαν με 100 ηΜ ΡΜΑ επί 4 ώρες, και η δραστικότητα λουσιφεράσης ΑΡ-1 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο. #

P

& lt? 0,05 έναντι ελέγχου? *

P

& lt? 0,05 έναντι μόνο PMA (Ε). AGS κύτταρα προκατεργάζονται με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις chrysin για 1 ώρα επωάστηκαν με 100 ηΜ ΡΜΑ επί 4 ώρες. Μετά την επώαση, c-Jun και c-Fos mRNA στα κυτταρολύματα προσδιορίστηκε με RT-PCR (F). Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις chrysin επωάστηκαν με 100 ηΜ ΡΜΑ, και κυτταρολύματα αναλύθηκαν για την φωσφορυλιωμένη c-Jun (G), φωσφορυλιωμένη c-Fos (H), συνολικό c-Jun και το συνολικό c-Fos με western blot ανάλυση. #

P

& lt? 0,05 έναντι ελέγχου? *

P

& lt? 0,05 έναντι μόνο PMA. Τα παραπάνω δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από μετρήσεις εις τριπλούν.

Η

Chrysin αναστέλλει ΡΜΑ-επαγόμενη έκφραση ΜΜΡ-9 με αναστολή παράγοντα μεταγραφής ΑΡ-1 μέσω της καταστολής της c-Jun και c-Fos φωσφορυλίωση

είναι γνωστό ότι c-Jun και c-Fos είναι συστατικά του ΑΡ-1 μονοπάτι [18]. Θέλαμε να καθορίζει τον μηχανισμό πίσω από ανασταλτική επίδραση chrysin για AP-1, και διερεύνησε κατά πόσο chrysin που ασκείται στην πραγματικότητα επίδρασή της στην c-Jun και c-Fos. Μετρήσαμε την ποσότητα του συνολικού mRNA τόσο της c-Jun και c-Fos με RT-PCR. Όπως φαίνεται στο Σχ 2F, chrysin δεν αναστέλλει τα επίπεδα έκφρασης του c-Jun και c-Fos mRNA. Στη συνέχεια, για να ελεγχθεί αν chrysin αναστέλλει την ενεργοποίηση του c-Jun και c-Fos, κηλίδωση Western διεξήχθη για να παρακολουθεί την φωσφορυλιωμένη c-Jun και c-Fos. Σχήμα 2G και 2F δείχνει ότι chrysin έκανε καταστέλλουν την επαγόμενη από ΡΜΑ c-Jun και φωσφορυλίωση c-Fos με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο.

Chrysin αναστέλλει c-Jun και φωσφορυλίωση c-Fos μπλοκάροντας JNK και ERK σηματοδότησης μονοπάτι

επόμενο διερευνηθεί πώς chrysin κατέστειλε c-Jun και φωσφορυλίωση c-Fos. Λόγω των σημαντικών παίζει ρόλο ΜΑΡΚ στην ενεργοποίηση του ΑΡ-1, διερευνήσαμε το ρόλο της οδού ΜΑΡΚ σε MMP-9 έκφρασης. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3Α, μεταξύ των αναστολέων MAPKs, PD98059 (ERK1 /2 αναστολέα), SP600125 (/2 αναστολέα JNK1), και SB203580 (αναστολέας ΜΑΡΚ p38), μόνο ΡΟ98059 και SP600125 ήταν ικανά να αναστείλουν ΡΜΑ-επαγόμενη έκφραση ΜΜΡ-9 , η οποία έδειξε ότι οι /2 και JNK1 /2 μονοπάτια ERK1 μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για την PMA-επαγόμενη έκφραση MMP-9. Περαιτέρω, με την ΜΕΚ-κυρίαρχο αρνητικό πλασμίδιο PMCL-K97M, JNK-κυρίαρχο αρνητικό πλασμίδιο PMCL-TAM67 και p38 ΜΑΡΚ-κυρίαρχο αρνητικό πλασμίδιο PMCL-MP38, επιβεβαιώσαμε τις κρίσιμες ρόλους των ERK και JNK στην MMP-9 έκφρασης σε καρκίνο του στομάχου AGS κύτταρα (Σχ 3Β). Επιπλέον, όπως φαίνεται στο Σχ 3C, ERK1 /2 και JNK1 /2 κριτικά απαιτούνται για την ΑΡ-1 ενεργοποίηση με ΡΜΑ, αποδεικνύεται μέσω πείραμα μας με ΜΕΚ και JNK κυρίαρχο αρνητικό πλασμίδια. Είμαστε δίπλα ελεγχθεί τους ρόλους των JNK1 /2 και ERK1 /2 σε c-Jun και ενεργοποίηση c-Fos. Όπως φαίνεται στο Σχ 3D, SP600125 και PD98059 κατέστειλε ΡΜΑ-επαγόμενη c-Jun και φωσφορυλίωση c-Fos, αντιστοίχως, υποδεικνύοντας ότι JNK1 /2 είναι κριτικά ανάντη του c-Jun, ενώ ERK1 /2 είναι κριτικά ανάντη του c-Fos. Επειδή ανακαλύψαμε ότι JNK1 /2 και ERK1 /2 έπαιξε ουσιαστικό ρόλο στην MMP-9 έκφραση μέσω του ΑΡ-1, υποθέσαμε ότι chrysin μπορεί να λειτουργήσει μέσω μιας αναστολής της JNK1 /2 ή ERK1 /2 για την καταστολή MMP-9 έκφρασης. Για την επαλήθευση υπόθεσή μας, κηλίδωση Western διεξήχθη για να προσδιοριστεί η επίδραση του chrysin επί JNK1 /2 ή ERK1 /2 φωσφορυλίωση. Όπως σχήμα 3Ε και 3F δείχνουν, η θεραπεία PMA οδήγησε σε αξιοσημείωτη αύξηση των JNK1 /2 και ERK Ρ42 /44 φωσφορυλίωση? Ωστόσο, με την παρουσία του χρυσίνη, που προκαλείται από ΡΜΑ JNK1 /2 και /2 φωσφορυλίωση ERK1 ανεστάλη με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο.

Cells προεπεξεργασία με μια συγκέντρωση 50μΜ PD98059 (PD), 50μΜ SP600125 (SP ) ή 20 μΜ SB203580 (SB) για 1 ώρα επωάστηκαν με 100 ηΜ ΡΜΑ επί 4 ώρες. Μετά την επώαση, το mRNA ΜΜΡ-9 στα κυτταρικά λύματα προσδιορίστηκε με RT-PCR. #

P

& lt? 0,05 έναντι ελέγχου? *

P

& lt? 0,05 έναντι μόνο PMA (Α). Οι φορείς έκφρασης που κωδικοποιεί ένα κυρίαρχο αρνητικό μετάλλαγμα ΜΕΚ (K97M), μεταλλαγμένες JNK (TAM67), ή μεταλλαγμένων ΜΑΡΚ p38 (MP38) συν-επιμολύνθηκαν με pGL4-ΜΜΡ-9 υποκινητή κατασκευασμάτων σε AGS κύτταρα. Μετά την επώαση με 100 ηΜ ΡΜΑ επί 4 ώρες, η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από μετρήσεις εις τριπλούν. #

P

& lt? 0,05 έναντι ελέγχου? *

P

& lt? 0,05 έναντι μόνο PMA (Β). Έκφραση PMCL κενό φορέα, το οποίο κωδικοποιεί ένα κυρίαρχο αρνητικό μετάλλαγμα ΜΕΚ (K97M) ή μεταλλαγμένης JNK (TAM67) συν-επιμολύνθηκε με pGL3-AP-1 λουσιφεράσης κατασκεύασμα σε AGS κύτταρα. Μετά την επώαση με 100 ηΜ ΡΜΑ επί 4 ώρες, η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από μετρήσεις εις τριπλούν. #

P

& lt? 0,05 έναντι ελέγχου? *

P

& lt? 0,05 έναντι μόνο PMA (C). κύτταρα AGS προεπεξεργασία με 50 μΜ PD98059, 50 μΜ SP600125, και 20 μΜ SB203580 επωάστηκαν με 100 ηΜ ΡΜΑ, και κυτταρολύματα αναλύθηκαν για την φωσφορυλιωμένη c-Jun και φωσφορυλιωμένη c-Fos με ανάλυση κηλίδας Western. #

P

& lt? 0,05 έναντι ελέγχου? *

P

& lt? 0,05 έναντι μόνο PMA (D). κύτταρα AGS προεπεξεργασία με ενδεικνυόμενη συγκέντρωση chrysin επωάστηκαν με 100 ηΜ ΡΜΑ, και κυτταρολύματα αναλύθηκαν για την φωσφορυλιωμένη JNK1 /2 και φωσφορυλιωμένη ρ42 /44 με ανάλυση κηλίδος Western. #

P

& lt? 0,05 έναντι ελέγχου? *

P

& lt?. 0,05 έναντι μόνο PMA (Ε και F)

Η

Επίδραση των chrysin στο κελί εισβολής

Είναι γνωστό ότι τα υψηλά επίπεδα της MMP -9 έκφραση είναι σημαντικά για την επεμβατική φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων. Για να εξεταστεί η επίδραση της chrysin επί προκαλείται από ΡΜΑ κυττάρων εισβολής, εξετάσαμε την κυτταρική διείσδυση μέσω ενός τροποποιημένου θαλάμου Boyden εισβολή. κύτταρα επωάστηκαν σε AGS PMA οδήγησε σε αύξηση του αριθμού των κυττάρων τα οποία εισέβαλαν πέρασε μέσω της τεχνητής matrigel. Ωστόσο, με την παρουσία του chrysin ή ενός αντισώματος ΜΜΡ-9, ο αριθμός των κυττάρων μειώθηκε εισέβαλε, υποδεικνύοντας chrysin μπορεί να καταστείλει το PMA-επαγόμενο κυτταρικό διεισδυτικότητα με αναστολή ΜΜΡ-9 έκφραση (Σχ 4Α και 4Β). Επιπλέον, το Σχήμα 4C έδειξε chrysin μειώθηκε προκαλείται από ΡΜΑ AGS εισβολή με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση του αναστολέα σηματοδότησης επί προκαλείται από ΡΜΑ AGS κύτταρο εισβολή. Όπως φαίνεται στο Σχ 4D, χρυσίνη, κουρκουμίνη, PD98059 και SP600125 ανέστειλε την εισβολή κυττάρων που προκαλείται από ΡΜΑ, υποδεικνύοντας ότι chrysin αναστέλλει πιθανώς προκαλείται από ΡΜΑ ΜΜΡ-9 μέσω ΑΡ-1 καταστολή, η οποία προκύπτει από τον αποκλεισμό των JNK1 /2 και ERK1 /2 οδοί .

τα κύτταρα επωάστηκαν με 50 ηΜ ΡΜΑ με την παρουσία ή απουσία 30 μΜ chrysin ή 200 ng /ml MMP-9 αντίσωμα σε συσκευή BIOCOAT Matrigel επί 24 ώρες (Α και Β). Τα κύτταρα επωάστηκαν με 50 ηΜ ΡΜΑ παρουσία 0-50 μΜ chrysin (C). Τα κύτταρα επωάστηκαν με 50 ηΜ ΡΜΑ παρουσία 30 μΜ χρυσίνη, 20 μΜ κουρκουμίνη, και είτε 30 μΜ PD98059 (PD) ή 30 μΜ SP600125 (SP) (D). Μετά την επώαση, τα κύτταρα εισέβαλαν την κάτω των θαλάμων και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ελαφρύ μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης μετά από χρώση με Diff-Quick Stain Kit. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από μετρήσεις εις τριπλούν. #

P

& lt? 0,05 έναντι ελέγχου? *

P

& lt?. 0,05 έναντι μόνο PMA

Η

Συζήτηση

φυσικά συστατικά με τις δραστηριότητες κατά του καρκίνου επηρεάζει την ανάπτυξη του όγκου και την εξέλιξη του καρκίνου αναστέλλοντας διάφορους μηχανισμούς συμπεριλαμβανομένων κυτταρική μετανάστευση, εισβολή και μετάσταση. Chrysin, ένα φυσικό φλαβονοειδές που βρίσκεται ευρέως σε πολλά φυτικά εκχυλίσματα, μέλι, και πρόπολη, έχει χημειοπροληπτική ιδιότητες όπως αντι-πολλαπλασιαστική και την απόπτωση δραστηριότητες έναντι διαφόρων μορφών καρκίνου [19,20]. Ωστόσο, οι ιδιότητες αντι-εισβολή του chrysin δεν έχουν καλά μελετηθεί σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Είναι γνωστό ότι οι ΜΜΡ είναι η δύναμη πίσω από την καταστροφή της εξωκυτταρικής μήτρας, καθώς και οι κύριοι επαγωγείς κυτταρικού διεισδυτικότητα. Ερευνήσαμε τις ανασταλτικές επιδράσεις του chrysin επί της έκφρασης ΜΜΡ σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Chrysin ανέστειλε MMP-9 έκφρασης (Σχήμα 1) και άλλων MMPs όπως η ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-7 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ο μηχανισμός ρύθμισης με chrysin μπορεί να εξαρτάται από την κάθε ΜΜΡ, και σε αυτή τη μελέτη θα επικεντρωθεί στην ανονισμού MMP-9.

PMA, φορβόλη-12-μυριστικό 13-οξικό, ένας ενεργοποιητής της πρωτεϊνικής κινάσης, συνήθως χρησιμοποιείται ως βιοϊατρική ερευνητικό εργαλείο σε μοντέλα καρκινογένεσης. Σε αυτή τη μελέτη, ανακαλύψαμε PMA αυξημένη δραστικότητα ΜΜΡ-9, μέσω προς τα πάνω ρύθμιση του επιπέδου έκφρασης του. Με την παρουσία του χρυσίνη, το PMA-επαγόμενη ΜΜΡ-9 μειώθηκε σε chrysin-δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 1Α).