Αφηρημένο

Η διαδικασία της κυτταρικής μετατροπής περιλαμβάνει καταρράκτες του μοριακές αλλαγές που διαμορφώνονται μέσω μεταβληθεί επιγενετική, μεταγραφή, μετα-μεταφραστική και ρυθμιστικών δικτύων πρωτεΐνη. Έτσι, ο προσδιορισμός του μετασχηματισμού-πρωτεΐνης που συνδέεται με μεταβολές μπορεί να δώσει μια εικόνα για σημαντικές ρυθμιστικές οδούς ενεργοποιείται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου. Στην παρούσα προσέγγιση προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης, προσδιορίσαμε απόκλιση σύνολα πρωτεϊνών σε ένα δύο διαστάσεων ηλεκτροφόρηση γέλης οθόνη ενός ορώδους μοντέλου εξέλιξης αδενοκαρκίνωμα των ωοθηκών. Λειτουργία με βάση κατηγοριοποίηση των πρωτεϊνών που συνδέονται αποκλειστικά με την προ-μετασχηματισμένα κύτταρα αναγνωρίζονται τέσσερις κυτταρικές διεργασίες από τις οποίες RXR-γ είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν την κυτταρική διαφοροποίηση και απόπτωση. Μπορούμε έτσι διερευνήθηκε η λειτουργική συνάφεια του RXR-γ έκφραση και σηματοδότηση σε αυτές τις δύο οδούς κατά την διάρκεια της προόδου του όγκου. έκφραση RXR-γ παρατηρήθηκε να ρυθμίζει την κυτταρική διαφοροποίηση και την απόπτωση σε προ-μετασχηματισμένα κύτταρα σε σταθερή κατάσταση. Είναι ενδιαφέρον, ρετινοειδές θεραπεία βρέθηκε να ενισχυθεί η έκφραση RXR-γ σε μετασχηματισμένα κύτταρα και να ευαισθητοποιήσει τους προς την απόπτωση

in vitro

, και επίσης να μειώσει την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων που προέρχονται από μετασχηματισμένα κύτταρα. Τα ευρήματά μας τονίζουν ότι η απώλεια των επιπέδων RXR-γ φαίνεται να παρέχει οφέλη σε μηχανιστικές μετασχηματισμένα κύτταρα έναντι της απόκτησης της ανθεκτικότητας σε απόπτωση γνώρισμα του καρκίνου, ενώ αποτελεσματική θεραπεία ρετινοειδούς μπορεί να παρουσιάσει μια βιώσιμη προσέγγιση για την ευαισθητοποίηση των καρκινικών κυττάρων σε απόπτωση μέσω επαγωγής RXR- γ έκφρασης

Παράθεση:. Kalra RS, Bapat ΑΕ (2013) έκφραση Πρωτεομική Προβλέπει Απώλεια RXR-γ κατά τη διάρκεια εξέλιξη του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 8 (8): e70398. doi: 10.1371 /journal.pone.0070398

Επιμέλεια: Ρατζίβ Samant, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Φεβ του 2013? Αποδεκτές: 18, Ιούνη 2013? Δημοσιεύθηκε: 6 Αυγ, 2013

Copyright: © 2013 Kalra, Bapat. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Τμήμα Βιοτεχνολογίας, η κυβέρνηση της Ινδίας, Νέο Δελχί για να προσχέδιο ΔΣΠ [Grant όχι. BT /PR7186 /MED /14/965/2006]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μια σύγχρονη άποψη της ογκογένεσης είναι ότι τα αποτελέσματα μετασχηματισμό ως μια διαδικασία πολλαπλών βημάτων που περιλαμβάνει τη γενετική, επιγενετική, κυτταρική και ιστού που σχετίζονται με τις αλλαγές [1], [2], [3]. Αυτές οι αλλαγές επίδραση σε διάφορα ρυθμιστικά και λειτουργικά δίκτυα μέσα στο κύτταρο που οδηγούν σε μια προοδευτική απόκτηση των δυνατοτήτων της αυτάρκειας σε σήματα ανάπτυξης, έλλειψη ευαισθησίας σε σήματα αντι-ανάπτυξης, απεριόριστο δυναμικό αντιγραφής, φοροδιαφυγή αποπτωτικών σημάτων, εισβολή των ιστών και τη μετάσταση, και υπέστησαν αγγειογένεση [4]. Πιο πρόσφατα, η ενέργεια επαναπρογραμματισμό του μεταβολισμού και να αποφύγει το ανοσοποιητικό καταστροφής έχουν λάβει αναγνώριση ως επιπλέον χαρακτηριστικά του μετασχηματισμού [5].

Τα επιθηλιακά καρκίνου των ωοθηκών (EOC) αναγνωρίζεται ως η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και την υψηλότερη αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτων γυναίκα [6], [7]. Ένας περιορισμός σε EOC μελέτες είναι η έλλειψη αναγνώρισης του προ-νεοπλασματικών βλαβών που οδηγούν σε ταχεία και επιθετική μετάσταση, στο οποίο στάδιο η νόσος διαγιγνώσκεται πιο συχνά. Αυτό περαιτέρω γίνει πιο πολύπλοκη από πρόσφατα ευρήματα που υποδηλώνουν υψηλής ποιότητας EOC να προέρχονται από επιθήλια σάλπιγγα, σε αντίθεση με την κλασική άποψη των επιθηλίων των ωοθηκών επιφάνεια να είναι το κύτταρο καταγωγής [8], [9]. Αν και η ανάλυση των σύγχρονων proteome παρέχει μια δυναμική και αποδοτική πηγή ταυτοποίησης των καταστολείς των όγκων, ογκογονίδια, διάγνωση του καρκίνου και θεραπευτικών [10], [11], [12], [13], μία εκτεταμένη κατανόηση του multi-βήμα τα γεγονότα μετασχηματισμού στο ΕΓΚ έναντι-a-vis αλλαγμένο μοριακή εκφράσεις μεταξύ μεταμορφωθεί και προ-μετασχηματισμένα κύτταρα μένει να επιλυθούν.

Η παρούσα μελέτη βασίζεται σε πρωτεομική προφίλ του

in vitro

μοντέλο του αδενοκαρκινώματος ορώδες ωοθηκών ( SeOvCa) ιδρύθηκε νωρίτερα στο εργαστήριό μας [14]. Εν συντομία, είχαμε θέσει αρκετές μονοκύτταροι κλώνος που προέρχεται πολιτισμούς από τα κακοήθη ασκίτη ενός ορώδες ασθενή ωοθηκών αδενοκαρκίνωμα βαθμού IV. Δεκαεννέα από αυτούς υποβλήθηκαν σε αυθόρμητη αθανατοποίηση και καθιερώθηκαν ως συνεχείς γραμμές. Ο κλώνος Α4 ήταν ένας από αυτούς τους κλώνους. Στην αρχική χωρία της, θεωρήθηκε να είναι αργή ποδηλασία και μη ογκογόνων? Ωστόσο, γύρω από το πέρασμα 20-25, μεταμορφώθηκε σε ένα επιθετικά ογκογόνο κλώνος με μεταστατικό δυνατότητες. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η έγκαιρη Α4 κύτταρα, αν και στερούνται tumorigenecity είχε ήδη αποκτήσει ορισμένα από τα χαρακτηριστικά του μετασχηματισμού. Ως εκ τούτου, εμείς αναφέρονται αυτά ως προ-μετασχηματισμένα (Α4-Ρ), ενώ τα μετασχηματισμένα κύτταρα που προέρχονται από Α4-Ρ κύτταρα ονομαστεί ως Α4-T. Αυτό μας παρείχε ένα κατάλληλο μοντέλο εξέλιξης των δύο λειτουργικά διακριτές ομάδες κυττάρων που προέρχονται από έναν κλώνο στον όγκο. προφίλ Proteome αυτού του μοντέλου εξέλιξης A4 επιλυθεί μέσω 2-Διάσταση Gel Electrophoresis (2DE) ακολουθούμενη από MS (MALDI-TOF /TOF) οδήγησε στην παραγωγή συγκεκριμένων ομάδων πρωτεϊνών με βάση αποκλειστικά και διαφορική πρότυπα έκφρασης τους.

Χαρακτηρισμός των λειτουργικών δικτύων που ορίζονται από αυτές τις πρωτεΐνες που παρέχονται σαφή εικόνα μεταβάλλεται κυτταρική λειτουργικότητα και μεγάλων οδών που εμπλέκονται στην μεταμόρφωση των κυττάρων των ωοθηκών. Από αυτά, RXR-γ διαμορφώνεται κυτταρική διαφοροποίηση και απόπτωση ήταν αποκλειστικά στα προ-μετασχηματισμένα κύτταρα. Διαμόρφωση του μεταβολισμού ρετινόλης έχει προταθεί σε συνδυασμό με την εξέλιξη της EOC [15], [16] το οποίο μειωμένα επίπεδα CRBP1 (κυτταρικής ρετινόλης πρωτεΐνη δέσμευσης-1) θεωρείται ένα κρίσιμο βήμα στην εξέλιξη της διαδικασίας μετασχηματισμού [17]. Ωστόσο, η ακριβής σημασία της σηματοδότησης RXR-γ παραμένει σε μεγάλο βαθμό μη χαρακτηρισμένο. Εμείς επιλυθεί λειτουργικό ρόλο της στα μετασχηματισμένα κύτταρα του μοντέλου εξέλιξης μας μέσω της επαγωγής της έκφρασης μέσω επεξεργασίας με επιλεκτική ρετινοειδή, συμπεριλαμβανομένων 9

Κις

-ρετινοϊκού οξέως (CRA), Adapalane (ADA) και 4 – [(Ε) – 2- (5,6,7,8-τετραϋδρο-5,5,8,8-τετραμεθυλ-2-ναφθαλενυλ) -1-προπενυλ] βενζοϊκό οξύ (ΤΤΝΡΒ). Τέτοια ρύθμιση της κυτταρικής διαφοροποίησης και απόπτωσης από RXR-γ σε SeOvCa επεκτείνει περαιτέρω την τρέχουσα κατανόηση της κυτταρικής μεταμόρφωσης.

Αποτελέσματα

ανάλυση της έκφρασης Συγκριτική πρωτεΐνη Α4-P και Α4-T επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών μοντέλο εξέλιξης

Τα λειτουργικά διαφορετικές επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών Α4 κύτταρα-P και Α4-T εμφανίζουν ένα διακριτό φαινότυπο, με την πρώην ον σχήματος ατράκτου ενώ το τελευταίο εμφανίζεται σαν επιθηλιακά μορφολογία (σχ. 1Α). 2-DE πηκτές παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας πρωτεώματος δείγματα κυττάρων Α4-P και Α4-T. Δύο τεχνικές ομάδες 2-DE αναλυτική πηκτές παρασκευάστηκαν από κάθε φαινότυπο σε κάθε πείραμα, που διεξήχθη εις τριπλούν (σύνολο 6 επαναλήψεις) και άργυρο. Σαρωμένες εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας PDQuest και πρωτεϊνών με διαφορική έκφραση σχολιάστηκαν. Μια μέση, 400-500 απόκλιση κηλίδες πρωτεΐνης έτσι οριοθετημένες. Σχολιασμός των κηλίδων οδήγησε στην παραγωγή των συνόλων πρωτεΐνης με βάση πρότυπα έκφρασης τους σε κάθε τύπο κυττάρου. Προς ταυτοποίηση των διαφορικής έκφρασης πρωτεΐνης, επιλεγμένα σημεία πρωτεΐνη χωνεύτηκαν και τα φάσματα μάζας δημιουργήθηκε στο MS /MS αναλύσεις. λογισμικό GPS Explorer (v.3.6) χρησιμοποιήθηκε για να υποβάλουν τις συνδυασμένες MS και MS /MS δεδομένα από MALDI-TOF /TOF να μασκότ εναντίον της βάσης δεδομένων SwissProt. Για όλες τις πρωτεΐνες έτσι αναλύονται, λογικές κάλυψη ακολουθία, χαμηλό δείκτη μάζας λάθη και υψηλής διάστημα εμπιστοσύνης (CI ≥95%) ελήφθησαν.

Α. Μορφολογικές διαφορές μεταξύ Α4 προ-μετασχηματισμένα μετασχηματισμένα κύτταρα (Α4-P) και Α4 (Α4-T) (Bar 100μ). Β, Αναλυτική αγωγού? Κάτω εικόνες gel Panel-Εκπρόσωπος δείχνει εκφράζεται αποκλειστικά πρωτεΐνες σε Α4-Ρ κύτταρα (αριστερά – EEx) και Α4-Τ κύτταρα (δεξιά – Lex). C, Venn διάγραμμα που δείχνει πρωτεΐνες κατηγοριοποιούνται σε όλες τις 4 υπο-ομάδες. D.i-ΙΙ, διάγραμμα πίτας δείχνει μοριακή λειτουργικότητα και μονοπάτια που σχετίζονται με εντοπίστηκαν Α4-P και πρωτεΐνες Α4-T αντίστοιχα. Ε, ποσοτικοί πρωτεΐνη έκφραση βιμεντίνης, Cytokeratin-8 και Cytokeratin-18? δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά 3 ξεχωριστά πειράματα που απεικονίζονται ως μέσος όρος ± SEM *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt? 0.00.

Η

προέλευση των ομάδων πρωτεϊνών με βάση πρότυπο έκφρασης

MS /MS ταυτοποίηση πρωτεΐνης με βάση οδήγησε στην παραγωγή των δύο ομάδων διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών (Εικ. 1Β).

Ομάδα Ι

αποτελείται από πρωτεΐνες που εκφράστηκαν ποιοτικά (αποκλειστικά) είτε σε Α4-P ή A4-T (ονομαστεί ως πρωτεΐνες EEx και LEx αντίστοιχα), ενώ η

Ομάδα II

περιλαμβάνει πρωτεΐνες που εκφράζονται σε ποσοτικά διαφορετικά επίπεδα (τουλάχιστον διαφορική έκφραση δύο φορές μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων). Αμφότερες οι ομάδες διαιρέθηκαν περαιτέρω σε δύο υπο-ομάδες με βάση τις εκφράσεις τους στις αντίστοιχες κυτταρικούς τύπους. Σχολιασμός των ποιοτικών και ποσοτικών εκφράσεων έγινε μέσα σε κάθε αντιγραφική σύνολο των κυττάρων Α4-P και Α4-T. Ένα σύνολο 10 και 34

Ομάδα Ι

πρωτεΐνες και, 31 και 48

Ομάδα II

πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν ως να εκφράζεται σε Α4-P και Α4-Τ κύτταρα αντιστοίχως (Εικ 1C?. Πίνακας S1). Πίνακες 1 & amp? 2 παραθέτει τις προσδιοριζόμενες

Ομάδα Ι

και

πρωτεϊνών Ομάδα II

με συγκεκριμένους αριθμούς spot, μοριακή και λειτουργική περιγραφή μαζί με τις λεπτομέρειες του αγώνα πεπτίδια, το σκορ της πρωτεΐνης, η κάλυψη ακολουθία (%) και η σχετική έκφραση fold-αλλαγή.

Η

Κατηγοριοποίηση των λειτουργικών διαδρομών με βάση την αναφερόμενη οντολογίες και την επικύρωση της έκφρασης

Γονιδιακή οντολογία περαιτέρω αναλύσεις εντοπίστηκαν διακριτές μοριακές λειτουργίες και μονοπάτια που σχετίζονται με τις προσδιοριζόμενες προφίλ πρωτεΐνης στο οι δύο τύποι κυττάρων (Εικ. 1D.i). Έτσι, αρκετές κυτταρικών ρυθμιστικών μηχανισμών συμπεριλαμβανομένης της βιοσύνθεσης πρωτεϊνών, την οργάνωση του κυτταροσκελετού, μεταγωγής σήματος, ρύθμιση της απόπτωσης και της υποβάθμισης της πρωτεΐνης σε μεγάλο βαθμό εμπλουτισμένο σε και συνέβαλε στην λειτουργικότητα του Α4-Ρ κύτταρα. Αυτά προτάθηκαν να έχουν μια cross-talk με άλλες οδούς, όπως η πρωτεΐνη και η ενέργεια του μεταβολισμού, του μεταβολισμού του RNA, την κυτταρική διαφοροποίηση και τις αντιδράσεις οξειδοαναγωγής.

Αντίθετα, λειτουργική ομαδοποίηση των πρωτεϊνών σε Α4-Τ κύτταρα αποτελείται οδούς που συνδέονται με την τα κλασικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων

δηλαδή

. αντίσταση στην απόπτωση, το μεταβολισμό της ενέργειας, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αγγειογένεση και εισβολή και μεταστάσεων (σχ. 1D.ii). Έτσι, τα μόρια που εμπλέκονται στην σχετίζεται με τη βιοσύνθεση πρωτεϊνών, αναδίπλωση και μεταφορά ελέγχουν τη δυναμική διαδικασία του μεταβολισμού των πρωτεϊνών σε μετασχηματισμένα κύτταρα προς την αντιστοιχία πολλαπλασιασμού του.

Προς επιβεβαίωση επίπεδα ορισμένων από τις προσδιοριζόμενες πρωτεΐνες, εκφράσεις τους επικυρώθηκαν μεταξύ A4-P και Α4-Τ κυττάρων μέσω ανοσοκηλίδωση (Εικόνα 1 Ε?. Το Σχ. 2Α, Β, C, D). SeOvCa είναι μοναδικό στο ότι, ο μετασχηματισμός που σχετίζεται με την έκφραση των επιθηλιακών δεικτών [21]. Ενισχυμένη έκφραση vimentin στα κύτταρα Α4-P προτείνει μεσεγχυματικά ενώ αυξημένα επίπεδα Cytokeratin 8 και 18 σε Α4-Τ-κύτταρα συσχετίζεται με επιθηλιακά χαρακτηριστικά αντίστοιχα (Εικ. 1 Ε), εκτός του ότι είναι σε συμφωνία με κυτταρική μορφολογία τους και την επικρατούσα υπόθεση.

η ποσοτική επικύρωση της έκφρασης και διπλώστε την αλλαγή κάποιων πρωτεϊνών, εντοπίστηκαν και στις δύο ομάδες? πρωτεΐνες Ομάδα Ι, Α, εκφράζεται αποκλειστικά σε Α4-Ρ και Β, σε Α4-κυττάρου Τ, αντίστοιχα? λαμβάνοντας υπόψη ότι η D, πρωτεΐνες ομάδα-ΙΙ ποσοτικά up-ρυθμίζονται σε Α4-Ρ κύτταρα και Ε, σε A4-T. Ε σχετική έκφραση του RXR-γ και β-ακτίνης σε CRA, ADA ή ΤΤΝΡΒ ρετινοειδή επεξεργασμένα κύτταρα Α4-Τ (Τ) επιβεβαιώνεται με ανοσοκηλίδωση Α4-Ρ (Ρ) και. F. Η ποσοτικοποίηση του σχετική έκφραση RXR-γ σε Α4-P και Α4-Τ κύτταρα. Στατιστική ανάλυση των δοκιμών σημασία που δείχνει (* -Έλεγχος Α4-P και ρετινοειδή επεξεργασμένα κύτταρα? $ – Έλεγχος Α4-P και ρετινοειδή κύτταρα επεξεργασμένα) .Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων και απεικονίζονται ως μέση τιμή ± SEM *

p

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt?. 0.001

η

Λειτουργικός χαρακτηρισμός της RXR-γ μια αποκλειστική Ομάδα Ι πρωτεΐνη

Δέκα πρωτεΐνες της ομάδας Ι εκφράστηκαν αποκλειστικά στα Α4-Ρ κυττάρων (πρωτεΐνες EEx). Λογοτεχνία-based λειτουργικό σχολιασμού οδήγησε στην categorizat τους ιόντων σε τέσσερις λειτουργικές ομάδες

δηλαδή

Η

διαφοροποίηση των κυττάρων και την απόπτωση –

RXR-γ, PRDX4?.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

– GNA11, PIBF-1, ΑΝΧΑ5, καθεψίνη D (CTSD)?

Μίτωση και κυτταροκίνηση

– KLH9?

τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT)

-. TPM1, ΑΝΧΑ5

η

Αν και όλες οι παραπάνω λειτουργίες είναι σχετικές με τη διαδικασία του μετασχηματισμού, επικεντρωθήκαμε στη μελέτη της λειτουργικότητας της κυτταρικής διαφοροποίησης και απόπτωσης ότι είναι κρίσιμη για τη διατήρηση της ομοιόστασης των ιστών και είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται από RXR-γ στο μεταγραφικό επίπεδο από διμερισμού με ρετινοϊκό οξύ ή υποδοχείς ρετινοϊκού οξέος Χ (RAR ή RXR αντίστοιχα) ή άλλους συνεργάτες ανεκτική ετεροδιμερές σαν PPAR-γ [22], [23 ], [24]. έτσι αποφασίσαμε να διερευνήσουμε το ρόλο της RXR-γ σε επιθηλιακά μοντέλο ωοθηκών εξέλιξη του καρκίνου μας.

αλληλεπιδράσεις RXR-γ με πυρηνικούς υποδοχείς και τη ρύθμιση της κυτταρικής διαφοροποίησης σε Α4-Ρ κύτταρα κατά την αγωγή ρετινοειδή

Ρετινοειδές θεραπεία αυξημένα επίπεδα RXR-γ σε Α4-Ρ κύτταρα? και έχει ενδιαφέρον, επαναλαμβάνεται σημαντική έκφραση σε Α4-Τ κύτταρα, καθώς και (Σχ. 2Ε, F). CRA και ADA ατομική μεταχείριση αυξημένα επίπεδα RXR-γ στους δύο τύπους κυττάρων, αν και αυτό επαγωγή ήταν λιγότερο αποτελεσματική σε συνδυασμό με ΤΤΝΡΒ. Προς επικύρωση των αλληλεπιδράσεων RXR-γ με άλλους πυρηνικούς υποδοχείς, συν-ανοσοκαταβύθιση και ανοσοστύπωση επιβεβαίωσε αλληλεπιδράσεις με PPAR-γ, RAR-γ, RXR-α και ΚΑΚ-α σε προ-μετασχηματισμένα κύτταρα (Σχ. 3Α, Β). Αξιολόγηση των RXR-γ εμπλοκή στην κυτταρική διαφοροποίηση επιτεύχθηκε μέσω profiling επιθηλιακά δείκτες Ε-καδερίνης (Ε-cad), Cytokeratin 18 (CK-18) και Μουκίνη-1 (MUC-1) σε επίπεδα γονιδιακής έκφρασης και την πρωτεΐνη, σε σταθερή κατάσταση και την έκθεση σε φυσικό

δηλαδή

. CRA και συνθετικά ρετινοειδή (ADA και ΤΤΝΡΒ) (Σχ. 3C). Σε σταθερή κατάσταση, χαμηλότερη έκφραση της E-Cad παρατηρήθηκε σε κύτταρα Α4-P. Έκφραση της Ε-Cad αυξήθηκε περαιτέρω με την CRA, αλλά και με την ADA? CRA δόθηκε μόνη ή σε συνδυασμό με ADA και ΤΤΝΡΒ. Τα επίπεδα της E-Cad, CK18 και MUC-1 ήταν ενδογενώς υψηλότερα σε Α4-Τ κύτταρα. Συνθετικό ADA ρετινοειδές μόνη ή σε συνδυασμό με CRA απορυθμίζεται έκφραση CK18 στους δύο τύπους κυττάρων. Παρά το γεγονός ότι, ειδικός ρόλος της ΤΤΝΡΒ στην κυτταρική διαφοροποίηση είναι άγνωστη, η θεραπεία ΤΤΝΡΒ οδήγησε σε ελάσσονα ρύθμιση προς τα πάνω του δεικτών διαφοροποίησης. Και οι τρεις δείκτες ενισχύθηκαν σε απόκριση σε έκθεση ρητινοειδούς στα κύτταρα Α4-P επιβεβαιώνοντας έτσι την εμπλοκή του RXR-γ σε ρύθμιση της κυτταρικής διαφοροποίησης. Ρητινοειδούς θεραπεία στις Α4-Τ κυττάρων οδήγησε σε επαγωγή του RXR-γ χωρίς σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα αυτών των επιθηλιακών δείκτης διαφοροποίησης στη γονιδιακή έκφραση και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (σχ. 3D, 3Ε).

A. Συνανοσοκαθίζησης (Co-ΙΡ) με παρουσίαση RXR-γ εκλούεται ανοσοσύμπλοκο με χρώση αργύρου. B. Επικύρωση RXR-γ δείχνει αλληλεπίδραση Co-IP με RXR-γ με PPAR-γ, RAR-γ, RXR-α και ΚΑΚ-α σε Α4-Ρ κύτταρα επικυρωθεί μέσω ανοσοστύπωσης. C. Έκφραση των χαρακτηριστικών των CK-18, MUC-1 και Ε-καδερίνης στο μεταγραφικό (Tr) και πρωτεΐνη (Pr) που εκτελούνται από ημι-ποσοτική RT-PCR και ανοσοστύπωμα σε CRA, ADA ή ΤΤΝΡΒ ρετινοειδή θεραπεία Α4-Ρ (Ρ) και Α4-Τ κύτταρα (Τ). D. Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης mRNA του Ε-Cad, CK18 και MUC1 δείκτες επιθηλιακής διαφοροποίησης σε Α4-Ρ (Ρ? Γραμμή) και Α4-Τ κύτταρα (Τ? Διακεκομμένη γραμμή) μετά ρετινοειδή θεραπεία επικυρωθεί μέσω RT-PCR. Ε ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης έκφραση της Ε-Cad, CK18 και τους φορείς χάραξης MUC1 σε Α4-P (P? Γραμμή) και Α4-Τ κύτταρα (Τ? Διακεκομμένη γραμμή) μετά από ρετινοειδή θεραπεία επικυρωθεί μέσω ανοσοαποτύπωση. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων απεικονίζονται ως μέσος όρος ± SEM *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt? 0.001.

η

προκαλείται από Ρετινοειδές επίπεδα RXR-γ ευαισθητοποιήσει μετασχηματισμένα κύτταρα έναντι της απόπτωσης μέσω της ενδογενούς οδού

ο ρόλος των RXR-γ στη μεσολάβηση απόπτωση για την αντιμετώπιση φυσικών και συνθετικών ρετινοειδών αξιολογήθηκε (Εικ . 4Α). Σε σταθερή κατάσταση, η απόπτωση ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε Α4-Τ κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα Α4-Ρ υποδεικνύει απόκτηση ανθεκτικότητας στην απόπτωση κατά τη διάρκεια της διαδικασίας μετασχηματισμού. Η απόπτωση ενισχύθηκε σε δύο τύπους κυττάρων κατά την έκθεση σε CRA και ADA – είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό (σχήμα 4Β). Ενώ ΤΤΝΡΒ από μόνη της απέτυχε να επάγει κυτταρικό θάνατο, σε συνδυασμό με ADA και CRA το ευαισθητοποιημένο Α4-Τ κύτταρα σε απόπτωση. Ρητινοειδούς διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση του RXR-γ έκφραση βρέθηκε επίσης να συσχετίζεται άμεσα με υψηλότερα επίπεδα απόπτωσης (Σχ. 2Ε, F). Εμείς προφίλ έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Snail (που ανταγωνίζεται p53-μεσολάβηση προ-επιβίωσης σηματοδότησης μέσω της ενεργού καταστολής των προ-αποπτωτικών μορίων PUMA /BBC3, ΑΤΜ και PTEN στην ωοθηκών καρκινικά κύτταρα κάτω από την πίεση? [19]) για να αξιολογηθεί η επίδραση της RXR-γ οδήγησε απόπτωση σε αυτό. Κασπάση 9, ένας δείκτης της ενδογενούς οδού απόπτωσης, ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της RXR-γ και ΡΡΑΚ-επαγωγή γ και Bcl-2 ως δείκτες της απόπτωσης [25]. Σαλιγκάρι και έκφραση Bcl-2 μειώθηκαν, ενώ σημαντικά αυξημένη έκφραση του RXR-γ, PPAR-γ και Caspase 9 ήταν εμφανείς στις ρετινοειδών θεραπεία (Εικ. 4C, 4D, 4Ε). Η έκφραση αυτών των μορίων ενισχύθηκε περαιτέρω σε συνδυαστική θεραπεία ρετινοειδών. Εμείς ανιχνεύθηκαν περαιτέρω οι επιδράσεις ρετινοειδών στα προφίλ του κυτταρικού κύκλου (σχ. S1A, 1Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, σταθερή κατάσταση Α4-Τ κύτταρα έχουν υψηλότερο ενισχυτή S &? πληθυσμούς G2 /M από τα κύτταρα Α4-P δείχνει ενεργό πολλαπλασιασμό. επεξεργασία CRA ενισχύει την απόπτωση, μαζί με G2 /M σύλληψης σε Α4-Ρ κύτταρα ενώ ADA και ΤΤΝΡΒ προκαλούν μόνο G2 /M σύλληψη. Στις συνδυαστικές θεραπείες, CRA με ADA ή παρουσία και των τριών ρετινοειδή επάγουν μία G1 /S σύλληψης σε μετασχηματισμένα κύτταρα.

A. δεδομένα προσδιορισμού αννεξίνης V-FITC δείχνει απόπτωση σε κύτταρα Α4-P και Α4-T σε διαφορετικά καθεστώτα ρετινοειδή θεραπεία? όπου i. που δεν έχουν ρητινοειδούς θεραπεία, ii. αντιμετωπίζονται με CRA, iii. με ADA και iv. με δύο έχουν εναλλακτική θεραπευτική αγωγή άλλης συνθετικών ρετινοειδών δηλαδή ΤΤΝΡΒ. B. Η στατιστική ανάλυση της δοκιμασίας απόπτωσης δείχνει σημαντική απόπτωση μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων σε διαφορετικές ομάδες θεραπείας ρετινοειδών. C. Έκφραση αναλύσεις RXR-γ, PPAR-γ, Bcl-2, κασπάσης 9 και σαλιγκάρι στο μεταγραφικό (Tr.) Και στο επίπεδο πρωτεΐνης (Pr.) Μέσω RT-PCR και ανοσοστύπωμα αντίστοιχα. D. Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης mRNA, i. έκφραση του RXR-γ, PPAR-γ, κασπάση 9, Bcl-2 και σαλιγκάρι κατά την κατεργασία ρετινοειδών σε Α4-Ρ κύτταρα ενώ, ii. δείχνει τα επίπεδα τους σε Α4-Τ κύτταρα για την επικύρωση μέσω RT-PCR. Ε Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης πρωτεϊνών, i. εκφράσεις του RXR-γ, PPAR-γ, κασπάση 9, Bcl-2 και σαλιγκάρι σε Α4-Ρ κύτταρα, ενώ, ii. δείχνει τα επίπεδα τους σε Α4-Τ κύτταρα κατά την αγωγή ρετινοειδή επικυρωθεί μέσω ανοσοαποτύπωση.

Η

In vivo θεραπεία ρετινοειδή μειώνουν σημαντικά την ανάπτυξη ξενομοσχεύματος σε NOD-SCID ποντίκια μέσω RXR-γ μεσολάβηση ευαισθητοποίηση των μετασχηματισμένων κυττάρων προς απόπτωση

Θα επεκταθεί περαιτέρω την παραπάνω εκ νέου την ευαισθητοποίηση των επιπέδων RXR-γ σε Α4-Τ επιπτώσεις κύτταρα που λαμβάνονται

in vitro

σε πειραματικούς όγκους (Σχ. 5Α). Ο μέσος όγκος του όγκου (Σχ. 5Β, 5C) σε κάθε σημείο θεραπεία μαζί με μέσο μέγεθος όγκου και του βάρους κατά την 7η εβδομάδα (Σχ. S1c, S1D) έδειξαν σημαντική μείωση στους όγκους ποντικούς που υπέστησαν αγωγή ρητινοειδούς έναντι εκείνων σε DMSO αγωγή μάρτυρες. Συνολικά, η συνδυαστική θεραπεία ρητινοειδούς ήταν πιο αποτελεσματική. Τα ευδιάκριτα αυξητικά εκφράσεις RXR-γ στους όγκους ρητινοειδούς αγωγή υποδεικνύουν έντονα ευαισθητοποίηση των μετασχηματισμένων κυττάρων Α4 σε απόπτωση. Συνδυασμένη δράση των ρετινοειδών βρέθηκε να είναι πιο θανατηφόρα για την ανάπτυξη του όγκου μέσω της επαναλαμβάνεται RXR-γ απόπτωση των καρκινικών κυττάρων

in vivo

. επίπεδα RXR-γ βρέθηκαν σημαντικά υψηλότερα σε όλα τα 5 σετ συμπεριλαμβανομένων των οργανισμών αξιολόγησης πιστοληπτικής ικανότητας, ΟΑΠΙ & amp? ΤΤΝΡΒ, ADA, ADA & amp? ΤΤΝΡΒ και CRA, ADA & amp? ΤΤΝΡΒ? σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα DMSO. Αυτό είναι ένας οριστικός συσχετισμός με διέγερση RXR-γ και διέγερση απόπτωσης σε αυτά τα κύτταρα

in vitro

(Σχήμα 5D).

A. Πειραματική διαδικασία απεικονίζει ρετινοειδή αγωγή θεραπείας σε NOD-SCID ποντικούς. Τα ποντίκια παρατηρήθηκαν μέχρι 3 την εβδομάδα μέχρι το μέγεθος του όγκου μεγαλώνει 25-30 mm

3, θεραπεία DMSO, CRA, CRA + ΤΤΝΡΒ, ADA, ADA + ΤΤΝΒΡ και CRA + ADA + ΤΤΝΒΡ ξεκίνησε στις 4

ης εβδομάδας και προχώρησε μέχρι 7

ου εβδομάδα. αναπαράσταση Β Γραφική δείχνει όγκοι του όγκου του ελέγχου και ρετινοειδή αγωγή NOD-SCID σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Γ μεγέθη Συγκριτική όγκου ελέγχου και ρετινοειδή θεραπεία όγκων. Δ ποσοτική έκφραση των RXR-γ σε έλεγχο και ρετινοειδή αντιμετωπίζονται οι όγκοι επικυρωθεί μέσω ανοσοαποτύπωση. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων (η = 6 για το

in vivo

πειράματα) και απεικονίζονται ως μέσος ± SEM *

ρ

& lt? 0,05, **

p

& lt? 0,01, ***

σ

& lt?. 0.001

Η

Συζήτηση

Η ύπαρξη πολλών ιστολογικών υποτύπων που συσχετίζονται με διαφορετικό κύτταρο (-α) -Από προέλευσης στον καρκίνο των ωοθηκών [26] εξακολουθεί να αποτελεί εμπόδιο για τη δημιουργία αντιπροσωπευτικών μοντέλων εξέλιξης σε αυτή την ασθένεια. Αυτό είναι σε αντίθεση με άλλες κακοήθειες όπως ο καρκίνος του προστάτη κατά τις οποίες τέτοιες μοντέλα έχουν εφαρμοστεί κατά τη διάρκεια των δύο τελευταίων δεκαετιών στην αποσαφήνιση μοριακών μηχανισμών της νόσου του [1], [27], [28], [29]. Στην παρούσα μελέτη, λεπτομερή αποκλειστικά και διαφορική πρωτεΐνη προφίλ ενός μοντέλου εξέλιξης ιδρύθηκε νωρίτερα στο εργαστήριό μας απέδωσε νέες γνώσεις για αλλοιωθεί μοριακών μοντέλων κατά τη διάρκεια της εξέλιξης SeOvCa. A4-Ρ κυττάρων με αντιγραφική αθανασία αντιπροσωπεύουν ένα προ-νεοπλαστικό στάδιο ενώ Α4-Τ κυττάρων με επιθετική και μεταστατική χαρακτηριστικά είναι αντιπροσωπευτικά του μετασχηματισμού και της εξέλιξης της νόσου.

Τα στοιχεία μας επιβεβαιώνει ότι οι δύο λειτουργικές καταστάσεις του μοντέλου που σχετίζεται με διακριτά προφίλ πρωτεΐνης. Εντός της ομάδας των πρωτεϊνών αποκλειστικά στα κύτταρα Α4-P, χαρακτηρισμός του ρόλου των RXR-γ αποκάλυψε ευαισθησίας των προ-μετασχηματισμένα κύτταρα σε απόπτωση και διαφοροποίηση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. διακυβεύεται επίπεδα RXR-γ επίσης αναφερθεί σε διάφορα κακοήθειες συμπεριλαμβανομένων μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [31]? όπου επίσης έχει αναφερθεί ότι η επιγενετική αποσιώπηση του RXR-γ συσχετίζονται με μειωμένη συνολική επιβίωση των ασθενών [32]. Στην προ-μετασχηματισμένα κύτταρα μας, RXR-γ συνεργάζεται με PPAR-γ, RAR-γ, ΚΑΚ-α και RXR-α για να σχηματίσουν λειτουργικά ετεροδιμερών συμπλοκών, όπου RXR-γ με ΡΡΑΚ-γ συντεταγμένες κυτταρική απόπτωση μέσω της ενδογενούς οδού επιβεβαιώθηκε με αυξημένη κασπάση-9 επίπεδα. Περαιτέρω, παρατηρήσαμε ότι η ενεργοποίηση ΡΧΡγ σε μετασχηματισμένα κύτταρα αυτά εκ νέου ευαισθητοποιεί σε απόπτωση ως συνεργική δράση των αγωνιστών που διαμεσολαβούν κυτταροτοξικά αποτελέσματα

in vitro

καθώς και σε πειραματικούς όγκους (Εικ. 6). Αυτό είναι ένα σημαντικό αναγνώριση προς εφαρμογή θεραπειών που βασίζονται ρετινοειδών. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε χαρακτηρίσει την πλειότροπο φύση της σηματοδότησης RXR-γ στο σύστημα της μοντέλο SeOvCa-εξέλιξη. Απώλεια επίπεδα RXR-γ υποδεικνύεται για τη διευκόλυνση μηχανιστική οφέλη για μετασχηματισμένα κύτταρα προς την απόκτηση της αντίστασης στην απόπτωση? ως εκ τούτου, τα καρκινικά κύτταρα ρετινοειδών ευαισθητοποιημένα upregulate επίπεδα RXR-γ που οδηγεί σε σημαντική κυτταρικό θάνατο.

Α. διαμόρφωσης RXR-γ σε σταθερή κατάσταση σε προ-μετασχηματισμένα κύτταρα? θεραπεία ρετινοειδή ενισχύει RXR-γ επιπέδων και αναβαθμίσουν την απόπτωση (κατόπιν RXR-γ αλληλεπίδραση με PPAR-γ) και την έκφραση των επιθηλιακών διαφοροποίησης ειδικών δεικτών (κατόπιν RXR-γ αλληλεπιδράσεις με RAR-γ, RXR-α και ΚΑΚ-α). Β Ανεπάρκεια του RXR-γ παρέχουν οφέλη της αντίστασης στην απόπτωση σε μετασχηματισμένα κύτταρα? ρετινοειδή θεραπεία που προκαλείται από ΡΧΡ-γ επίπεδα ευαισθητοποιούν αυτά τα κύτταρα προς την κατεύθυνση σημαντική απόπτωση.

Η

Η προσέγγιση του παρόντος πρωτεομική είναι ένα πρώτο υπόψη οι αλλαγές στη SeOvCa που αντανακλούν σε διάφορα μετασχηματισμού που σχετίζονται με λειτουργικές πορείες. Σημαντικά, σηματοδότηση RXR-γ θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός πύλη στην πρόληψη της εξέλιξης της νόσου. Η διαλεύκανση της σηματοδότησης RXR-γ εκτείνεται σύγχρονες προσεγγίσεις του κυτταρικού μετασχηματισμού σε SeOvCa που μπορούν τώρα να αξιοποιηθούν περαιτέρω στην ανάπτυξη και αξιολόγηση νέων θεραπευτικών μεθόδων.

Υλικό και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλες οι εργασίες των ζώων έγινε με το Εθνικό Κέντρο Cell Science έγκριση των πειραμάτων στο Μηχανισμό NCCS Πειραματική ζώων Σπίτι (EAH) (NCCS) Θεσμική Επιτροπή Δεοντολογίας ζώων (IAEC), και έγινε σύμφωνα με τους κανόνες, τους νόμους και τις πολιτικές που καθορίζονται από την επιτροπή.

καλλιέργειας κυττάρων, θεραπείες και επιμολύνσεις

Παραγωγή του μοντέλου εξέλιξης Α4 προ-μετασχηματιστεί και μετασχηματισμένα κύτταρα SeOvCa (κύτταρα Α4-P και Α4-T) περιγράφεται νωρίτερα [14], [18]. Ρετινοειδή (πρόσδεμα RXR-γ) κατεργασία πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας είτε φυσικό ρετινοειδών

δηλαδή

. 9

Cis

ρετινοϊκό οξύ (CRA? 10 μΜ) ή συνθετικά ρετινοειδή Adapalene (ADA? 2μΜ? RAR αγωνιστή) ή 4 – [(Ε) -2- (5,6,7,8 -Τετραϋδρο – 5,5,8,8-τετραμεθυλο – 2 ναφθαλινυλ) – 1 προπενυλίσουλφαυοϋλοξεικός] βενζοϊκό οξύ αροτινοειδούς οξύ (TTBPB? 10μΜ? RXR και RAR αγωνιστής) για 48 ώρες

Η προετοιμασία των δειγμάτων, ηλεκτροφόρηση σε πηκτή 2-διαστάσεων (. 2DE) και αναλύσεις εικόνας

οι σβώλοι κυττάρων (10

7) της Α4-Ρ και Α4-T αιωρήθηκαν σε 500 μl ml ουρίας ρυθμιστικού λύσης που περιέχει 8 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 100 mM DTT , 2% CHAPS και 0,2% αμφολυτών με κοκτέιλ πρωτεάσης-αναστολέα (Amersham USB κατευθυντήριας γραμμής). εκχύλισμα κυττάρων αφέθηκε να αναμιχθεί επί τουλάχιστον 15 λεπτά και επωάστηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να διευκολύνει τη σωστή πρωτεΐνη solublisation. Τα δείγματα πρωτεΐνης περαιτέρω φυγοκεντρήθηκαν (110.000 g για 1 ώρα στους 4 ° C) και εναιώρημα συλλέχθηκε. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης εκτιμήθηκε με κιτ quant 2DE (GE Healthcare) στα 480 nm (Bekman Coulter). Παρασκευασμένα δείγματα τρέχουν σε πρώτη διάσταση (ρΐ) που ακολουθείται από τη δεύτερη διάσταση σε μετουσιωτική SDS-PAGE (Mw). Ένα σύνολο 350 μg λύματος ολόκληρη την πρωτεΐνη των κυττάρων ελήφθη στις 18 εκατοστών ακινητοποιημένη κλίση ρΗ (IPG) λωρίδα (pH 4-7) και επανυδατώθηκαν τη διάρκεια της νύχτας. Ένα πρόγραμμα τάση IEF τρία βήμα παρασκευάστηκε στις λωρίδες σε ένα Protean IEF κύτταρο (Bio-Rad): 50 V για 20 λεπτά, 10.000 V για 2 ώρες λεπτά και 10.000 V για 45.000 V-hr. Λωρίδες μειώθηκαν περαιτέρω με επώαση σε ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης /αναγωγή (6 Μ ουρία, 0.375 Μ Tris ρΗ 8.8, 2% SDS, 20% γλυκερόλη, 2% (w /v) DTT (Sigma)) και στη συνέχεια αλκυλιώνεται το ίδιο ρυθμιστικό αλλά που περιέχει 2,5% (w /v) ιωδοακεταμίδιο (Sigma) αντί του DTT. Η δεύτερη διάσταση πραγματοποιήθηκε εκτελώντας τις λωρίδες IPG επί 1,0 mm σε πάχος από 10% – (w /v) – SDS-PAGE. Οι πηκτές χρωματίστηκαν με φασματομετρία μάζας συμβατό τροποποιημένα μπλε coomassie (Pierce, Thermo-Fisher) και χρώση αργύρου. απόκτηση εικόνας της πρωτεΐνης πηκτώματος επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας Ποσότητα One® λογισμικό του συστήματος VersaDocTM (Bio-Rad Laboratories, USA) με ίσες παραμετρικές τιμές. Η ανάλυση εικόνας και ανίχνευση κηλίδα εκτελέστηκαν σε PDQuest 2-DE λογισμικό ανάλυσης προηγμένη έκδοση 8.0 (Bio-Rad). Για την ποσοτική και ποιοτική σύγκριση σημείο σε όλη την τόσο τζελ, παιχνίδι-σετ (Μάστερ σύνολο) των έξι επαναλήψεων της Α4-P και Α4-T 2DE-τζελ παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν. Το λογισμικό διευκολύνει σχολιασμό του καθενός και μεμονωμένο σημείο, μοναδικές ταυτότητες δόθηκαν σε κάθε πρωτεΐνη σημεία των επαναληπτικών gel. Μια σειρά ανάλυση πρωτεϊνών έχουν συνταχθεί για να εντοπίσει τα σημεία που είναι σημαντικά διαφορετική. Ανάλυση που έγιναν με βάση αναγνωρισμένες πρωτεΐνες είδε την κίνηση του μοναδικό για Α4-P και Α4-T και τα κοινά σημεία μεταξύ των δύο όμοιες ομάδες με όριο διακύμανσης 2,0 φορές την ποσότητα. Μια συνολική εκτίμηση του ταιριάζουν και απαράμιλλη σημεία παρασκευάστηκε σε τελικές εικόνες και διαφορική πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν σε-μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων τζελ αντιπρόσωπο.

In-gel πέψη και την ταυτοποίηση πρωτεΐνης με τη χρήση MALDI-TOF /TOF

επιλέχθηκαν σημεία πρωτεΐνη σε 2DE δείχνουν διαφορική έκφραση και την ικανοποίηση των στατιστικών κριτηρίων και αποκόπηκαν για την πέψη σε γέλη και αναλύει περαιτέρω σκλήρυνση κατά πλάκας. Spot εκτομή έγινε με το χέρι με τη βοήθεια στείρου αιχμηρό εργαλείο κοπής. Εν συντομία, οι φέτες του πήγματος αποχρωματίζονται σε 25 mM όξινο ανθρακικό αμμώνιο, μετέπειτα αφυδατωμένο με ένα μίγμα 2:01 από 50 mM διττανθρακικού αμμωνίου: 100% ακετονιτρίλιο (ACN) για επαναλήφθηκε 3 φορές το καθένα 5 λεπτά. φέτες Gel μειώθηκαν με 10 mM DTT στους 60 ° C για 1 ώρα. Μετά την ψύξη, φέτες πήγματος επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με 50 mM ιωδοοξικό οξύ. Μετά από πλύση και αφυδάτωση των φετών πήγματος με 25 mM διττανθρακικού αμμωνίου και ACN επί 10 λεπτά, ξηράνθηκαν υπό κενό και τρυπτική πέψη πραγματοποιήθηκε με 50 mM διττανθρακικού αμμωνίου που περιέχουν 20 μg /ml τροποποιημένου πρωτεομική θρυψίνη Βαθμός (Sigma-Aldrich) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και διατηρήθηκε σε πάγο για 30 λεπτά. Πρόσθετες 25 mM διττανθρακικού αμμωνίου προστέθηκε και η πέψη συνεχίστηκε όλη τη νύχτα στους 37 ° C. Εκχυλίσματα πεπτίδια στεγνώσει εντελώς χρησιμοποιώντας ένα speedvac και επαναιωρήθηκε σε 10 μΐ 20% αμμωνίου όξινο ανθρακικό άλας και διάλυμα 1% μυρμηκικό οξύ.

Μετά την επεξεργασία μέσα από τα ρύγχη πιπετών Zip-Tip (Millipore, USA), μίγματα πεπτιδίων διαλύθηκαν με διάλυμα μήτρας. Η μήτρα που χρησιμοποιείται για την ανάλυση MALDI ήταν ένα-κυανο-4-υδροξυκινναμωμικού οξέως (Sigma) στα 20 mg /ml σε 50% ακετονιτρίλιο, 0,1% τριφθοροξικό οξύ. Ίσοι όγκοι του πεπτιδίου και μήτρας διάλυμα αναμίχθηκαν, και 1 μΐ του προκύπτοντος διαλύματος τοποθετήθηκε σαν κηλίδα επί πλάκας MALDI δείγμα από ανοξείδωτο χάλυβα. Φάσματα πέψη πεπτίδια αποκτήθηκαν σε ένα φασματόμετρο μάζας MALDI-TOF /TOF 4800 (ΑΒ Sciex, Framingham, ΜΑ) που συνδέονται με 4000 το λογισμικό της σειράς Explorer (έκδοση 3.5.3). Παράγονται φάσματα μάζας καταγράφηκαν σε λειτουργία ανακλαστήρα μέσα σε μια περιοχή μάζας 800 έως 4000 Da, χρησιμοποιώντας ένα λέιζερ Nd: YAG 355 nm. Η τάση τάση επιτάχυνσης και εξόρυξη τέθηκαν στις 20 kV και 18 kV αντίστοιχα. Έξι σημείο βαθμονόμησης του οργάνου έγινε με πεπτίδιο πρότυπο σετ (ΑΒ Sciex). Όλα τα φάσματα MS ελήφθησαν από συσσώρευση 900 βολές. MS /MS φάσματα λήφθηκαν με συνολική συσσώρευση 1.500 βολές λέιζερ και ενέργεια σύγκρουσης του 1kV. Κατά την ολοκλήρωση της MS σαρώνει έρευνα, τα δεδομένα υποβάλλονται σε επεξεργασία για να δημιουργήσει μια λίστα των πρόδρομων ιόντων για ανάκριση από MS /MS. Οι συνδυασμένες MS και MS /MS λίστες κορυφή διερευνήθηκαν με τη χρήση του GPS

η έκδοση λογισμικού TM Explorer 3.6 (ΑΒ Sciex). προσδιορισμός πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε με αναζήτηση ιόντων MS /MS χρησιμοποιώντας ΜΑΣΚΩΤ (έκδοση 2.1) κινητήρα (https://www.martixscience.com) αναζήτηση στη βάση δεδομένων SwissProt.