Abstract

Η νικοτίνη είναι ένα γνωστό παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη καρκίνου και έχει δειχθεί ότι μεταβάλλει την έκφραση γονιδίων σε κύτταρα και ιστούς κατά την έκθεση. Χρησιμοποιήσαμε την τεχνολογία Illumina® Next Generation Sequencing (NGS) να αποκτήσουν αμερόληπτη βιολογική διορατικότητα στο μεταγραφικό της φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα (MCF-10Α) με την έκθεση νικοτίνη. Εμείς που παράγονται τα δεδομένα έκφρασης από 54699 μεταγραφές χρησιμοποιώντας τριπλότυπα του ελέγχου και της νικοτίνης τόνισε κύτταρα. Ως αποτέλεσμα, εντοπίσαμε 138 διαφορικά εκφραζόμενα μετάγραφα, συμπεριλαμβανομένων 39 μη χαρακτηρισμένα γονίδια. Επιπλέον, 173 μεταγραφές που σχετίζονται κυρίως με την αντιγραφή του DNA, ανασυνδυασμός, και επισκευή παρουσίασαν στοιχεία για εναλλακτικό μάτισμα. Ανακαλύψαμε τη μεγαλύτερη αντίδραση στο στρες της νικοτίνης από HPCAL4 (up-ρυθμίζεται από 4,71 φορές) και NPAS3 (κάτω-ρυθμίζονται από -2,73 φορές)? αμφότερα είναι γονίδια τα οποία δεν έχουν προηγουμένως εμπλακεί στην έκθεση νικοτίνη αλλά συνδέονται με τον καρκίνο. Ανακαλύψαμε επίσης σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω (-2.3 φορές) και εναλλακτικό μάτισμα του NEAT1 (lncRNA) που ενδέχεται να έχουν σημαντική, ακόμα ανεξερεύνητο ρυθμιστικό ρόλο. γονιδιακή ανάλυση οντολογία αποκάλυψε νικοτίνης έκθεσης επηρεάζεται γονιδίων που εμπλέκονται στην κυτταρική και μεταβολικές διαδικασίες. Αυτή η μελέτη αποκαλύπτει άγνωστες συνέπειες του στρες νικοτίνης στο μεταγραφικό της κανονικής του μαστού επιθηλιακών κυττάρων και παρέχει ενδείξεις για τη βασική βιολογική επίδραση της νικοτίνης στα φυσιολογικά κύτταρα, σηματοδοτώντας τη βάση για μελλοντικές μελέτες

Παράθεση:. Bavarva JH, Tae η Settlage RE, Garner HR (2013) Χαρακτηρισμός της γενετικής βάσης για νικοτίνη Induced την ανάπτυξη του καρκίνου: Μια μεταγραφικό αλληλουχίας Μελέτη. PLoS ONE 8 (6): e67252. doi: 10.1371 /journal.pone.0067252

Επιμέλεια: Εμμανουήλ Dias-Neto, AC Camargo Αντικαρκινικό Νοσοκομείο, Βραζιλία

Ελήφθη: 5 Φλεβάρη 2013? Αποδεκτές: 15η Μαΐου 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 Bavarva et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ταμείο του σκηνοθέτη Ιατρικής Πληροφορικής και Συστημάτων Τμήμα στο Virginia Ινστιτούτο Βιοπληροφορικής. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παγκοσμίως, περισσότεροι από 1 εκατομμύριο γυναίκες διαγιγνώσκονται με καρκίνο του μαστού κάθε χρόνο και πάνω από 410.000 πεθαίνουν από τη νόσο [1]. Μεγάλες μελέτες κοόρτης πραγματοποιήθηκαν στις Ηνωμένες Πολιτείες και την Ιαπωνία δείχνουν ότι ο κίνδυνος καρκίνου του μαστού συνδέεται με την ενεργό και παθητικό κάπνισμα [2], [3]. Μελέτες έχουν δείξει ότι το 80-90% των εισπνεόμενων νικοτίνης απορροφάται συστηματικά κατά την διάρκεια του καπνίσματος, 1 mg από ένα μόνο τσιγάρο, με αποτέλεσμα σε συγκεντρώσεις περίπου 15 ng πλάσματος /mL αμέσως μετά το κάπνισμα [4]. In vivo μελέτες αποδεικνύουν νικοτίνη προάγει την ανάπτυξη στερεών όγκων, γεγονός που υποδηλώνει ότι η νικοτίνη μπορεί να συμβάλλει στην πολλαπλασιασμό των κυττάρων, εισβολή, και την αγγειογένεση [5] – [7]. Περαιτέρω, η νικοτίνη έχει δειχθεί να παρακάμπτει DNA G1 του κυτταρικού κύκλου βλάβη που προκαλείται /S περιορισμού και έτσι προάγει την γενετική αστάθεια [8]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η διέγερση νικοτίνης θα μπορούσε να μεταβάλει την έκφραση του γονιδίου σε ενδοθηλιακά κύτταρα και νευροβλάστωμα [9], [10]. Μια μελέτη που βασίστηκε μικροσυστοιχιών συνδέονται διέγερση της νικοτίνης με τον παράγοντα μεταγραφής NF-kB, αλλά κατέληξε στο συμπέρασμα ότι θα απαιτούνταν μελλοντική ανάλυση, δεδομένου ότι αξιολογούνται μόνο 4.132 γονίδια και υπήρχε μεγάλη πιθανότητα σημαντικών γονιδίων είχαν χαθεί [9]. Μια άλλη μελέτη μικροσυστοιχίας των κυττάρων νευροβλαστώματος πρότεινε ότι φυσιολογικές και ψυχολογικές επιπτώσεις της έκθεσης νικοτίνης μπορεί να οφείλεται στις επιδράσεις στην γονιδιακή έκφραση, αλλά είχαν επίσης παρόμοιες τεχνικούς περιορισμούς [10]. Επιπλέον, μελέτες σε νικοτίνη έλλειψη συναίνεσης για τη δοσολογία νικοτίνης.

υποθέτουμε ο συνδετικός κρίκος μεταξύ της πίεσης της νικοτίνης και του καρκίνου θα βρεθεί χρησιμοποιώντας μια αμερόληπτη προσέγγιση αλληλουχίας παρά μια προσέγγιση που βασίζεται στοχευμένη σειρά. αλληλουχίας επόμενης γενιάς (NGS) τεχνικές, σε αντίθεση με μικροσυστοιχίες cDNA που χρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως, επιτρέπει την συστηματική εξέταση των γνωστών, μη χαρακτηρισμένα έκφραση μεταγραφή σε ένα ευρύ δυναμικό εύρος, και εναλλακτικές και τα νέα γεγονότα ματίσματος χωρίς καμία τεχνολογική ή /και βιολογικές προκατάληψη. Αυτό το all-inclusive προσέγγιση μπορεί να παρέχει καλύτερη ενδείξεις για πολύπλοκα μονοπάτια, την κατανόηση των μη χαρακτηρισμένα μεταγραφές και να παρέχουν πληροφορίες που λείπουν σχετικά με τη ρύθμιση του γονιδίου κάτω από την πίεση της νικοτίνης που προηγουμένως δεν ήταν δυνατόν με μικροσυστοιχίες. Επιπλέον, έχουμε επιλέξει μια LD

50 δόση, διότι είναι τυποποιημένο και έχει καθιερωθεί ως μια ακριβής μέσο για τη μέτρηση των επιπτώσεων [11]. Εδώ, περιγράφουμε τα ευρήματα από αυτή τη συστηματική ανάλυση και ανακάλυψε προηγουμένως άγνωστες ενώσεις των μη χαρακτηρισμένα μεταγραφές.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια, χημικά και καλλιέργεια κυττάρων

Η νικοτίνη αγοράστηκε από Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). MCF-10Α, φυσιολογικά επιθηλιακά μαστού κυτταρική γραμμή, ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). κύτταρα ΜΟΡ-10Α καλλιεργήθηκαν σε DMEM /F12 μέσο (Invitrogen, Carlsbad, CA), συμπληρωμένο με ορό αλόγου (5% τελική, Invitrogen), antibiotics- Pen /Strep (1% τελικό, Invitrogen), την ανάπτυξη παράγοντα EGF (20 ng /mL τελική, Peprotech, Rocky Hill, NJ), υδροκορτιζόνη (0,5 mg /mL τελική, Sigma), τοξίνη χολέρας (100 ng /mL τελική, Sigma), και ινσουλίνη (10 μg /mL τελική, Sigma) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% διοξείδιο του άνθρακα.

πειράματα

Είκοσι τέσσερις ώρες πριν από τα πειράματα, τα κύτταρα ΜΟΡ-10Α σπάρθηκαν σε πυκνότητα περίπου 3 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες έξι φρεατίων ή 5 × 10

7/500 cm

2 τετραγωνικά πιάτα κυτταρικής καλλιέργειας (Corning). Η νικοτίνη αραιώθηκε σε πλήρες μέσο καλλιέργειας στα απαιτούμενα τελικές σειριακό συγκεντρώσεις. Η νικοτίνη πειράματα δοσολογία διεξήχθησαν σε έξι φρεατίων για 72 ώρες και στο τέλος? ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας μετρητή κυττάρων TC10 BioRad®. Αυτά τα πειράματα δόσεως αναλύθηκαν περαιτέρω και συγκρίνεται για τη LD νικοτίνη

50 δόση (5 mM /811 ng /mL) σε 500 cm

2 τρυβλία για 72 ώρες. Μετά την περίοδο έκθεσης, συνδεδεμένα κύτταρα συλλέχθηκαν για εκχύλιση του RNA χρησιμοποιώντας το κιτ Qiagen RNeasy® ενός του ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το RNA δοκιμαστεί σωστά για την ποιότητα σε Νανο-drop® και Bioanalyzer® πριν αλληλουχίας μεταγραφικό διεξήχθη χρησιμοποιώντας Illumina HiSeq®.

αλληλουχίας μεταγραφικό

βιβλιοθήκες RNA παρασκευάσθηκαν σύμφωνα με την προετοιμασία του δείγματος TruSeq® RNA καθοδηγούν ως ανά το προτεινόμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Illumina, San Diego, CA). Ολικό RNA για τις τρεις βιολογικούς αντίγραφα από τον έλεγχο και τη νικοτίνη τόνισε κυτταρικών πληθυσμών μεταγράφηκαν σε cDNA. Δείγματα δωρεάν DNA στη συνέχεια διατέμνεται με εκνέφωση (35 psi, 6 λεπτά). Διπλομερή αμβλεία άκρα (μεγάλο θραύσμα Klenow, Τ4 πολυνουκλεοτιδική κινάση και Τ4 πολυμεράση) και ένα ενιαίο τμήμα 3’adenosine προστέθηκε χρησιμοποιώντας Klenow εξω- και dATP. Illumina προσαρμογείς, που περιέχει εκκινητή θέσεις για ανόπτηση επιφάνεια των κυττάρων ροής, ενίσχυση και αλληλούχιση, συνδέθηκαν πάνω στα επισκευαστεί άκρα του cDNA. ηλεκτροφόρηση γέλης χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή για το DNA κατασκευάσματα 200-250 ζευγών βάσεων σε μέγεθος, τα οποία στη συνέχεια ενισχύθηκε με 18 κύκλους PCR με Phusion πολυμεράση (ΝΕΒ). Αυτές οι βιβλιοθήκες στη συνέχεια μετουσιώθηκαν με υδροξείδιο του νατρίου και αραιώνεται σε 3,5 μ.μ. σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα υβριδοποίησης για φόρτωση σε μόνο λωρίδα ενός κυττάρου ροής Illumina HiSeq®. σχηματισμός συμπλέγματος, αστάρι αντιδράσεις υβριδισμού και προσδιορισμού αλληλουχίας ήσαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Υψηλής αλληλουχίας διακίνηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ζεύγη-end, 100 ζεύγη βάσεων διαβάζει. Μία λωρίδα ροής χρησιμοποιήθηκε για προσδιορισμό της αλληλουχίας του cDNA, αποδίδοντας κατά μέσο όρο 45.260.000 διαβάζει ανά δείγμα με μέση βαθμολογία ποιότητας & gt?. 36.3

ανάλυση

RNASeq δεδομένων

RNASeq δεδομένα αναλύθηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο περιγράφεται από Trapnell et al., [12]. Εν συντομία, ΤΟΡΗΑΤ C v2.0.3 χρησιμοποιήθηκε για να ευθυγραμμιστεί η RNAseq διαβάζει στο γονιδίωμα Ensemble GRCh37 όπως προβλέπεται από Illumina iGenome με σχολιασμούς. γονιδιακή έκφραση μετρήθηκε για κάθε γονίδιο από τη βάση δεδομένων Ensembl από αντιστοιχισμένη θραύσματα ανά κιλοβάσεων του Exon μοντέλο ανά εκατομμύριο χαρτογραφηθεί διαβάζει (FPKM) υπολογίζεται χρησιμοποιώντας Μανικετόκουμπα V2.0.1. Χρησιμοποιήσαμε το CuffDiff V2.0.1 πρόγραμμα για τη δοκιμή για διαφορική έκφραση μεταγράφου και εναλλακτικών γεγονότων ματίσματος σε κάθε ομάδα κυτταρικών γραμμών. Προεπιλεγμένη παράμετροι χρησιμοποιήθηκαν για όλες τις αναλύσεις. Γονίδια θεωρήθηκαν διαφορικά εκφρασμένων μετά την προσαρμογή για πολλαπλές δοκιμές? p ≤ 0,05. πακέτο ζωνάρι για την έρευνα χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει διαγράμματα διασποράς φαίνεται στην συμπληρωματικά στοιχεία. Γονίδια που έχουν απόδειξη του εναλλακτικού ματίσματος (εκείνα με τιμή Q & lt? 0.05 υποδηλώνοντας μια αλλαγή στη σχετική αφθονία των διαφόρων προϊόντων μετεγγραφής που προέρχονται από μία μόνο θέση έναρξης μεταγραφής) πιστοποιήθηκαν με CuffDiff. Μανικετόκουμπα εκτελεί μεταγραφή εξαγωγής συμπερασμάτων και εκτιμήσεων αφθονίας που ακολουθείται από διαφορική δοκιμασία της σχετικής αφθονίας χρησιμοποιώντας Jensen-Shannon Απόκλιση (JSD) ώστε να εντοπιστούν στοιχεία για το εναλλακτικό μάτισμα [13]. Σε αυτό το πλαίσιο, JSD είναι ένα μέτρο της μεταβολής στην σχετική αφθονία των πολλαπλών μεταγραφήματα από κάθε γενετικό τόπο σε δύο πειραματικές συνθήκες [14]. λειτουργίες των γονιδίων και βιολογικών διεργασιών διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ταξινόμησης PANTHER [15] και τον εμπλουτισμό παράγοντα μεταγραφής διεξήχθη χρησιμοποιώντας το λογισμικό Ingenuity Pathway Analysis (ΙΡΑ) (https://www.ingenuity.com). Ακολουθία διαβάζει είναι διαθέσιμα σε ΝΙΗ Σύντομη Διαβάστε Αρχείο υπό τον αριθμό προσχώρησης SRX254950 πείραμα.

Ποσοτική RT-PCR

Για κάθε δείγμα, 1 μg ολικού RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα χρησιμοποιώντας το Qiagen QuantiTect αντίστροφης μεταγραφής Kit (Valencia, CA) σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για Taqman πραγματικού χρόνου PCR, 1.0 μΐ αραιωμένου cDNA χρησιμοποιήθηκε για 20 μl πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας Taqman Gene Expression Master Mix σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. δοκιμασίες Taqman της Applied Biosystems που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως εξής: HPCAL4 (Hs04188853_g1), NEAT1 (Hs01008264_s1), ακτίνη (Hs01060665_g1) και 18S rRNA (Hs03928985_g1). Ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα σύστημα StepOnePlus πραγματικού χρόνου PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Ποιοτικός έλεγχος και ανάλυση διαφορικής έκφρασης

Αυτή είναι η πρώτη μελέτη αλληλουχίας μεταγραφικό νικοτίνης τόνισε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του μαστού. ανάλυση της έκφρασης μέσω της άμεσης αλληλουχίας μεταγραφικό (RNAseq) ανιχνεύει τα πιο σπάνια και σε κύτταρα και συγκεκριμένο πλαίσιο μεταγραφές. Επιπλέον, οι μέθοδοι RNAseq δεν ωθείται από προηγούμενη γνώση του ματίσματος και επιτρέπουν στην ανάλυση για να προσδιοριστεί το πλήρες ρεπερτόριο των εναλλακτικά ματισμένων ισομορφών. Τέλος, RNAseq ως μέθοδος έχει αποδειχθεί ότι είναι περισσότερο ποσοτική καθώς ο αριθμός των διαβάζει που παράγεται από ένα RNA αντίγραφο είναι συνάρτηση της εν λόγω μεταγραφής και έκφραση γονιδίων παρά μια χημική ιδιότητα του υβριδισμού ανιχνευτή που αλλάζει με τη σύνθεση του δείγματος [16 ] – [18]

Για την ταυτοποίηση διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων και μεταγραφές, επιβεβαιώσαμε την πρώτη τα δεδομένα RNAseq ήταν απαλλαγμένη από προκαταλήψεις αλληλουχίας και εμφανίζεται μια ομοιόμορφη κάλυψη σε δείγματα (Σχήμα S1).. Στη συνέχεια ομαλοποιηθεί τα δείγματα (FPKM), υπολογίζεται ένα στατιστικό τεστ (p-value) και ρυθμίζεται τιμή p (q-αξίας). Από αυτό, υπήρχαν συνολικά 2.015 διαφορικά εκφρασμένων μεταγραφές (q-τιμή & lt? 0,05), 1,680 επάνω ρυθμισμένη και 335 ρυθμισμένα προς τα κάτω (Πίνακας S1). Ένα σύνολο 138 μεταγραφών εκφράζονται διαφορικά με ± αλλαγή 2 φορές (107 επάνω ρυθμισμένη και 31 ρυθμισμένα προς τα κάτω) κατά την έκθεση σε νικοτίνη και 39 από αυτά ήταν μη χαρακτηρισμένης (Πίνακας 1). Χρησιμοποιήσαμε Taqman πραγματικού χρόνου PCR για να επικυρώσει τις δύο πρώτες γονίδια (HPCAL4 και NEAT1) και επιβεβαίωσε τους πάνω και κάτω ρύθμιση, αντίστοιχα (Εικόνα S2).

Η

Ο καρκίνος είναι μια πολυπαραγοντική νόσος, που συνδέεται με ο αριθμός των βασικών βιολογικών γεγονότων όπως η φλεγμονώδης απόκριση, ογκοκατασταλτικά γονίδια, ογκογονίδια και παράγοντες μεταγραφής. Μια αμερόληπτη, all inclusive προσέγγιση με αλληλούχιση επόμενης γενιάς μπορεί συνεπώς να παρέχουν πιο πλήρη στοιχεία και να μας βοηθήσει να κατανοήσουμε καλύτερα τις ελλείπουσες συνδέσεις. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι HPCAL4, TREM1, EFNA2, SPATA22 και KRT85 είναι οι κορυφαίες πέντε ρυθμίζεται προς τα πάνω γονίδια και NPAS3, DEFB129, NEAT1, WDR96 και VRK2 είναι οι κορυφαίες πέντε μειωτικά γονιδίων κατά την έκθεση σε νικοτίνη. Hippocalcin όπως 4 (HPCAL4) και την ενεργοποίηση του υποδοχέα που εκφράζεται επί μυελοειδών κυττάρων 1 (TREM1) έχουν εξαιρετικά απορυθμίζεται γονίδια με μεγαλύτερη από τετραπλάσια αλλαγή μετά στρες νικοτίνη. HPCAL4 είναι μια σχετικά υπό-μελετήθηκε γονίδιο και έχει άγνωστη λειτουργία, αλλά έχει αναφερθεί ότι υπερεκφράζεται σε καρκίνωμα πνεύμονα [19]. Η περιοχή χρωμοσώματος 1p34.2, όπου βρίσκεται HPCAL4, συνδέεται επίσης με πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του πνεύμονα, νευροβλάστωμα, και του παχέος [19]. Είναι πιθανό ότι HPCAL4 γονίδιο θα μπορούσε να είναι ο λόγος για την εν λόγω ενώσεις σε αυτούς τους καρκίνους. TREM1 φαίνεται ότι εμπλέκεται στην φλεγμονώδη απόκριση και είναι ένας θετικός ρυθμιστής του ΤΝΡ-α και IL-8 [20]. TREM1 είναι επίσης ένας στόχος για μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs) που μπορούν να διασπούν πρωτεΐνες εξωκυτταρικής. Αυτή η διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη έχει μια ομοιάζουσα της Ig εξωτομέα εύκολα αποβληθούν από MMPs να δημιουργήσει Strem-1. Ενώ μεμβράνη αγκυροβολημένα TREM-1 ενισχύει φλεγμονώδεις αντιδράσεις, sTREM1 εμφανίζει αντι-φλεγμονώδεις ιδιότητες [21]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε παρατηρήσει επίσης προς τα πάνω ρύθμιση του ΜΜΡ2 που μπορεί να υποδηλώνει πιθανή αύξηση sTREM1 και επομένως αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις. Αυτό ενισχύει προηγούμενα ευρήματα νικοτίνη όπου αναφέρθηκε ότι εμφανίζουν ανοσοκατασταλτική και αντι-φλεγμονώδεις επιδράσεις [22]. EFNA2 ενεργοποίηση προάγει την ενδοθηλιακή κυτταρική φλεγμονώδης απόκριση [23], SPATA22 έχει ένα ρόλο σε μειωτική επιδιόρθωση του DNA ή ανασυνδυασμού και απαιτείται για μειωτική πρόοδος σε γεννητικά κύτταρα ποντικού [24] και KRT85 είναι ένα γονίδιο κερατίνη μαλλιών που έχει αναφερθεί ότι ενεργοποιείται μεταγραφικά από NF-κΒ τελεστή p65 /ΚεΙΑ [25]. Το πιο κάτω-ρυθμιζόμενο γονίδιο, NPAS3, απέδειξε δραστικότητα κατασταλτική του όγκου [26] και, ως εκ τούτου, η ρύθμιση του προβλέπεται στο νικοτίνη τόνισε κύτταρα υποδηλώνει πιθανή άγνωστος ο ρόλος NPAS3 στην αυξημένη ευαισθησία του καρκίνου. Είναι ενδιαφέρον ότι, κανένα από τα κορυφαία ρυθμισμένων γονιδίων ανιχνεύθηκαν ως διαφορικά εκφραζόμενα σε προηγούμενες μελέτες μικροσυστοιχίας [9]. Αυτό πιθανώς οφείλεται σε διάφορους λόγους συμπεριλαμβανομένων των διαφόρων τύπων κυττάρων που χρησιμοποιούνται, διαφορετικούς χρόνους δόση και έκθεσης και τεχνολογικούς περιορισμούς. Πιο εντυπωσιακό είναι το γεγονός ότι εκτός από την TREM1, όλες οι άλλες κορυφή ρυθμιζόμενα γονίδια είναι λογικά νέες και μελετημένη. Αυτό δικαιολογεί περαιτέρω την αιτία για την αλληλουχία transcriptomes για νικοτίνη τόνισε κύτταρα καθώς αποκαλύπτει πιθανώς προηγουμένως άγνωστη συνδέσεις.

Μια ξεχωριστή κάτω ρυθμισμένα γονίδιο είναι NEAT1, η οποία είναι μια μεγάλη μη-κωδικοποίησης RNA (lncRNA) είναι γνωστό ότι είναι ένας ουσιαστικό διαρθρωτικό παράγοντα των paraspeckles [27]. Ο λειτουργικός ρόλος του μη κωδικοποιητικού RNAs δεν είναι σαφώς καθορισμένες? Ωστόσο, Chen et. al., πρότειναν πρόσφατα έναν λειτουργικό ρόλο του NEAT1 στη ρύθμιση του mRNA εξαγωγή [28]. Είμαστε, για πρώτη φορά, την αναφορά τη διαφορική απόκριση του lncRNA στη νικοτίνη. Αυτό δημιουργεί ευκαιρίες για να εμπλακούν σε νέες ανεξερεύνητες κατευθύνσεις στην έρευνα για τον καρκίνο και αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγμα ένα μεγαλύτερο ρόλο για lncRNAs στους κανονισμούς της μεταγραφής και την ανάπτυξη του καρκίνου.

Το εναλλακτικό μάτισμα ανάλυση

Τα ελαττώματα του mRNA μάτισμα είναι μια σημαντική αιτία της ασθένεια και αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ειδική για τον καρκίνο εναλλακτικό μάτισμα ακόμη και εν απουσία του γενωμικού μεταλλάξεων [29]. Εμείς εντοπίστηκαν 173 γονίδια τα οποία παρουσίασαν στοιχεία από εναλλακτικό μάτισμα (Πίνακας S2). Είκοσι τρία από αυτά είναι επίσης εκφράζονται διαφορικά (Πίνακας S3). Είναι επίσης σημαντικό να σημειωθεί ότι NEAT1 είναι ένα από τα πιο κάτω ρυθμίζονται lncRNAs που παρουσιάζονται επίσης στοιχεία για εναλλακτικό μάτισμα κατά στρες νικοτίνη. Οι κορυφαίες δέκα οκτώ γονίδια με τετραγωνική ρίζα του

Jensen-Shannon απόκλιση

& gt? Τα 0,8 παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Disher et. al., πρότειναν ότι mis-μάτισμα εξής οξειδωτικό στρες αντιπροσωπεύει μία νέα και σημαντική γονοτοξικές αποτέλεσμα και ότι δεν είναι απλώς βλάβες του DNA που επάγεται από το οξειδωτικό στρες που οδηγεί σε λανθασμένη μάτισμα αλλά οι αλλαγές στον ίδιο τον εναλλακτικό μηχανισμό ματίσματος [30]. Η νικοτίνη έχει αναφερθεί ότι προκαλούν οξειδωτικό στρες στα κύτταρα του πολιτισμού [31] και, ως εκ τούτου, ότι θα μπορούσε να είναι ένας λόγος για την ανίχνευση των παραλλαγών ανώμαλης ματίσματος σε νικοτίνη τόνισε κύτταρα. Πολλαπλές ματισμένες μορφές ενός γονιδίου θα μπορούσε να έχει αντίθετες βιολογικές ιδιότητες. Για παράδειγμα, παραλλαγές ματίσματος του MDM2 εμφανίζει και τις δύο ογκογόνους και την αναστολή της ανάπτυξης ιδιότητες [32]. Ως εκ τούτου, για να αποκαλύψει βιολογική σημασία του εναλλακτικού ματίσματος γονιδίων κατά του στρες νικοτίνης δικαιολογεί περαιτέρω έρευνες.

Η

Γονιδιακή οντολογία

Για να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με τη φύση των γονιδίων που ρυθμίζονται και εναλλακτικό μάτισμα κατά του στρες νικοτίνης , πραγματοποιήσαμε γονίδιο ανάλυση οντολογίας με τη χρήση του συστήματος ταξινόμησης PANTHER αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας στατιστικές διωνυμική δοκιμή και τη διόρθωση Bonferroni. Σημαντικά εμπλουτισμένο βιολογικές διαδικασίες και λειτουργίες των γονιδίων παρουσιάζονται στο Σχήμα 1. Κατά τη διάρκεια του στρες νικοτίνη, η πλειονότητα των γονιδίων διαφορικά ρυθμιζόμενα και εναλλακτικά ματισμένες συμμετείχαν στη μεταβολική, κυτταρική και αναπτυξιακών διαδικασιών και να έχουν καταλυτικές και δεσμευτικές λειτουργίες. Είναι ενδιαφέρον, διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (DE) είχε υψηλότερη συσχέτιση με τις διαρθρωτικές μοριακή δραστηριότητα στίχους της μεταγραφικής ρυθμιστικής λειτουργίας του εναλλακτικού ματίσματος γονιδίων. γονίδια DE αναλύθηκαν περαιτέρω με Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση (IPA) για τον εντοπισμό βιοχημικές οδούς που μπορεί να επηρεαστούν. Το Σχήμα S3 δείχνει το δίκτυο των γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο, το ενδοκρινικό και το νευρικό σύστημα, τα οποία επηρεάζονται από τη νικοτίνη. Το συγκρότημα NF-κΒ και του υποδοχέα οιστρογόνων βρίσκονται επίσης στο δίκτυο των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων που υποδηλώνει τη σχέση τους με το στρες που προκαλείται από τη νικοτίνη γονίδια DE. Όπως προκύπτει από την ανάλυση αυτή ότι η νικοτίνη επηρεάζει το ανοσοποιητικό γονίδια που σχετίζονται απόκριση, υποδεικνύοντας την πιθανή επίδραση της νικοτίνης στην διαμόρφωση της κανονικής δραστηριότητας του ανοσοποιητικού συστήματος. Επιθηλιακού καρκίνου και των δερματολογικών διαταραχών ήταν οι κορυφαίοι δύο βιολογικές λειτουργίες που σχετίζονται με νικοτίνη τόνισε ρυθμιζόμενων γονιδίων, όπως αποκαλύπτεται από το IPA. Είναι ενδιαφέρον, υποδοχέα οιστρογόνου συνδέεται έμμεσα με το δίκτυο προτείνοντας μια μακρινή σχέση και πιθανή επίδραση του στρες νικοτίνης. Επίσης, οι εν λόγω γονίδια που συνδέονται με την κίνηση των κυττάρων, σηματοδότηση, πολλαπλασιασμό, θάνατος και τις λειτουργίες επιβίωσης. Η Canonical καρκίνο σηματοδότηση μονοπατιών των ωοθηκών ήταν σημαντικά σχετίζονται με αυτά τα αποτελέσματα. Τρία από τα μόρια από την κανονική πορεία του καρκίνου των ωοθηκών, ΜΜΡ2, CGA και WNT7B ήταν μέχρι ρυθμιζόμενη κατά την έκθεση σε νικοτίνη. Λειτουργική σημασία του εναλλακτικού ματίσματος γονιδίων αξιολογούνται μέσω του ΜΠΒ αποκάλυψε την κορυφή δίκτυο γονιδίων που σχετίζονται με την αντιγραφή του DNA, ανασυνδυασμός και επιδιόρθωση (Σχήμα S4).

πίτας γράφημα απεικονίζει τις ομοιότητες και τις διαφορές μεταξύ των όρων GO σύμφωνα με τις ακόλουθες κατηγορίες. (1Α) Βιολογική διαδικασία για διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων. (1Β) Βιολογική διαδικασία για εναλλακτικά ματισμένες γονίδια. (1C) Molecular λειτουργία για διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων. (1D) Μοριακή λειτουργία για εναλλακτικό μάτισμα γονιδίων.

Η

ρυθμιστής Μεταγραφή ανάλυση

Για να προσδιορίσετε ποια ρυθμιστές της μεταγραφής ρυθμίζουν την διαφορική έκφραση αυτών των γονιδίων που περιγράφονται σε αυτά τα πειράματα, το πάνω και κάτω ρυθμιζόμενων γονιδίων επανεισάγονται στο ΙΡΑ και αναλύθηκαν για τον εμπλουτισμό των ρυθμιστών της μεταγραφής που σχετίζονται με υποκινητές των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Υπήρχαν πέντε έως γονιδίων ρυθμιστή (S100A14, HEY1, CGA, IGFBP2 και LGALS1) από τη λίστα. μόρια στόχο τους, συμπεριλαμβανομένων των ΜΜΡ2 και PROX1, επίσης επάνω ρυθμίζονται στη μελέτη που δείχνει μια σφιχτή συσχέτισης (Πίνακας 3). Όλες οι πιθανές ρυθμιστικές μεταγραφής των οποίων τα γονίδια-στόχοι εκφράζονται διαφορικά αναλύονται στον πίνακα S4. Μέχρι ρύθμιση του S100A14 συνδέεται με καρκίνους του μαστού βασική τύπου σε σύγκριση με μη-βασική τύπων [33]. S100A14 προτείνεται επίσης να είναι ένας χρήσιμος δείκτης για την ανίχνευση μεταστατικού καρκίνου του παχέος και του καρκίνου του μαστού [34]. CGA ταυτοποιείται ως νέο ER-α γονίδιο που αποκρίνεται σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού και, ενδεχομένως, μια ισχυρή δείκτης για την πρόβλεψη της ταμοξιφένης ανταπόκριση στον καρκίνο του μαστού [35]. Σημαντικά υψηλότερη έκφραση του IGFBP2 αναφέρεται σε ιστούς καρκίνου του μαστού σε σύγκριση με καλοήθη ιστό μαστού [36]. LGALS1 καταστέλλει τη μεσολάβηση κυττάρων Τ κυτταροτοξικών ανοσολογικές απαντήσεις και προάγει την αγγειογένεση του όγκου [37]. Ως εκ τούτου, κατά την έκφραση του S100A14, CGA, IGFBP2 και LGALS1 στη νικοτίνη τόνισε κύτταρα είναι ενδεικτικό των σωρευτικών ρόλο τους στην αυξημένη ευαισθησία του καρκίνου στους καπνιστές. Στη μελέτη μας, το στρες νικοτίνη up-ρυθμίζει HEY1 και ΜΜΡ2. Η αντίστροφη σενάριο παρατηρήθηκε κατά την αξιολόγηση αντικαρκινικές επιδράσεις της κουρκουμίνης που προέκυψαν σε ρύθμιση προς τα κάτω του HEY1 και ΜΜΡ2, λόγω της αδρανοποίησης του Notch-1, όπως η κουρκουμίνη ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή [38]. Αυτά δείχνουν το ρόλο της νικοτίνης στην υποστήριξη της ανάπτυξης του καρκίνου και τη δυνατότητα της κουρκουμίνης για να βοηθήσει στη μείωση του κινδύνου και την ανάπτυξη του καρκίνου στους καπνιστές. ΜΜΡ-2 υπερέκφραση έχει αναφερθεί σε πολλές νεοπλάσματα [39], συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών [40] και του μαστού [41] καρκίνους. Έχει προταθεί ότι η ΜΜΡ-2 μπορεί μόνο να μην είναι ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης αυξημένης επιθετικότητας του όγκου αλλά επίσης σημαντική στην ενεργοποίηση των άλλων πρωτεασών που εμπλέκονται άμεσα στην αγγειογένεση του όγκου [42]. Έχει αναφερθεί ότι η νικοτίνη αυξάνει την έκφραση ΜΜΡ2 και διεγείρει το οισοφαγικό καρκίνωμα πλακώδους κυττάρου (ΤΕ-13) μετανάστευση και εισβολή [43]. Ως εκ τούτου, up-ρύθμιση του ΜΜΡ2 κατά του στρες νικοτίνης στη μελέτη μας ενισχύει περαιτέρω τις προηγούμενες διαπιστώσεις και αναδεικνύει την πιθανότητα ότι ΜΜΡ2 αποτελεί σημαντικό βιοδείκτη για την αξιολόγηση του κινδύνου καρκίνου στους καπνιστές. PROX1 είναι ένας μεταγραφικός ρυθμιστής που εμπλέκονται στην νευρογένεση, καθώς και μια ποικιλία τύπων καρκίνου. Μεταβολές σε PROX1 αναφερθεί σε αρκετές μορφές καρκίνου, αν και δεν είναι πάντοτε σαφές εάν PROX1 εξασκεί κατασταλτική του όγκου ή ογκογόνες ιδιότητες. Colon και ο καρκίνος του εγκεφάλου δείχνει PROX1 πάνω έκφραση, ότι ο καρκίνος του μαστού αποκαλύπτει μειωμένη έκφραση οφείλεται σε υπερμεθυλίωση [44]. Ως εκ τούτου, στη μελέτη μας, οι επιδράσεις της αυξημένης έκφρασης PROX1 κατά του στρες νικοτίνη είναι άγνωστες.

Η

Είναι ενδιαφέρον, ρυθμιστής μεταγραφής HEY1 βρίσκεται σε κυτταρογενετική ζώνη 8q21. Η ενίσχυση του 8q21 σχετίζεται με κακή πρόγνωση των ασθενών σε καρκίνο μαστού και είναι ανεξάρτητη από MYC [45]. Άλλα κοντινά ενδιαφέροντα γονίδια που επηρεάζονται από το στρες της νικοτίνης περιλαμβάνουν εναλλακτικά συγκολλημένα NAPRT1 και CPSF1 σε κυτταρογενετική ζώνη 8q24. Παρά το γεγονός ότι δεν είχαμε μελετήσει την ενίσχυση των χρωμοσωμάτων σε αυτή τη μελέτη, η επίδραση του στρες νικοτίνης στο ρυθμιστή μεταγραφής HEY1, NAPRT1 και CPSF1 σε ή κοντά 8q21 είναι προκλητική. Να διερευνήσει τις συνολικές επιπτώσεις της νικοτίνης στην γονιδίων ανά χρωμόσωμα, αναλύσαμε όλα τα διαφορικά εκφρασμένων και εναλλακτικό μάτισμα γονιδίων (ψευδή ανακάλυψη διόρθωση q≤0.05) (Σχήμα S5). Δώδεκα τοις εκατό των γονιδίων που βρίσκονται στο χρωμόσωμα 19 εκφράστηκαν διαφορικά και 14 μεταγραφές στο χρωμόσωμα 12 παρουσίασαν στοιχεία για εναλλακτικό μάτισμα κατά στρες νικοτίνη. Ωστόσο, χρωμόσωμα 17 είχαν τόσο υψηλό επίπεδο των διαφορικά εκφρασμένων και εναλλακτικά ματισμένες μεταγραφές και είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι η BRCA1 δείκτης του καρκίνου του μαστού βρίσκεται επίσης στο χρωμόσωμα 17. Ενώ ο λόγος για χρωμοσωμικές προκατάληψη είναι άγνωστη, ανισορροπία έκφραση είναι προηγούμενη τεκμηριώνεται στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [46]. Χρωμοσωμικές προκατάληψη των διαφορικά εκφρασμένων μεταγραφές κατά τη νικοτίνη άγχος, συνεπώς, εγγυάται το μέλλον σε βάθος έρευνες.

Αν και αυτή η πιλοτική μελέτη επιχειρεί να χρησιμοποιήσει τυποποιημένη συγκέντρωση της νικοτίνης για να τεκμηριώσουν φυσιολογικές και γονοτοξικές επιδράσεις, χαμηλότερη συγκέντρωση της νικοτίνης όμοια με εκείνα που βρέθηκαν σε το πλάσμα μετά το κάπνισμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί στο μέλλον για την περαιτέρω αξιολόγηση των επιπτώσεων.

Εν κατακλείδι, αυτή η μελέτη αποκαλύπτει ότι το άγχος νικοτίνη προκαλεί αντιδράσεις από διάφορες μελετημένο και μη χαρακτηρισμένα γονίδια και προκαλεί παρεκκλίνουσα γεγονότα ματίσματος που θα μπορούσαν να συμβάλλουν αθροιστικά προς την κατεύθυνση της ανάπτυξης του καρκίνου και μεταβάλλεται δραστηριότητα του ανοσοποιητικού συστήματος στους καπνιστές. Επιπλέον, τα γονίδια που βρίσκονται στο χρωμόσωμα 12, 17, και 19 δείχνουν προκατειλημμένη ευαισθησία στο στρες νικοτίνη υποδεικνύοντας άγνωστη βιολογική σημασία. Αυτό συνεπάγεται ότι η νικοτίνη θα ήταν ένα πρόσθετο στο διάδοση του καρκίνου με ρύθμιση του ανοσοποιητικού δραστηριότητα των ωοθηκών μονοπατιών σηματοδότησης. Η μελέτη αυτή έχει ευρύτερες επιπτώσεις, όπως έχουμε παρουσιάσει το νέο πιθανές σχέσεις μεταξύ των γονιδίων, όπως HPCAL4 (up-ρύθμιση), NPAS3 (κάτω-ρυθμιζόμενες) και NEAT1 (εναλλακτικό μάτισμα, καθώς και εξαιρετικά κάτω-ρυθμίζονται lncRNA) που θα μπορούσαν να έχουν ως στόχο ή να παρακολουθούνται για τη μείωση των ή την αξιολόγηση του κινδύνου ανάπτυξης καρκίνου σε καπνιστές (κυρίως) και ασθενείς με καρκίνο. Παρατηρήσεις από τη μελέτη αυτή μεταγραφικό παρέχουν έτσι φρέσκο ​​βιολογικό εικόνα άγχος νικοτίνη σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του μαστού που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε κλινικές ρυθμίσεις για να αξιολογήσει τις βλαβερές συνέπειες της νικοτίνης στους καπνιστές.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Πυκνότητα γράφημα και διάγραμμα διασποράς. (1Α) ζωνάρι χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργηθεί ένα γράφημα πυκνότητα των πυκνοτήτων των τιμών FPKM σε όλες γονίδια. Τα δείγματα ελέγχου και νικοτίνη ήταν πολύ παρόμοιες, δεικνύοντας καμία μεροληψία στην κάλυψη αλληλούχιση μεταξύ των δειγμάτων. (1Β) Οι τιμές FPKM για όλα τα γονίδια απεικονίσθηκαν για τα δείγματα ελέγχου και νικοτίνη, μετά μέσου όρου απέναντι επαναλήψεις και ομαλοποίηση. Κάθε κουκίδα αντιπροσωπεύει ένα γονίδιο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s001

(JPG)

Εικόνα S2.

Επικύρωση των δύο κορυφαίων γονιδίων από Taqman πραγματικού χρόνου RT-PCR. TaqMan πραγματικού χρόνου αξιολόγησης επικύρωση RT-PCR του HPCAL4 (μέχρι ρυθμιζόμενη) και NEAT1 (κάτω ρυθμιζόμενη) δείχνει τη γενική συμφωνία των RNASeq εύρημα και ποσοτική PCR. Fold αλλαγές ήταν σε σχέση με τον έλεγχο και ομαλοποιούνται στη πολυπλεγμένων γονίδια καθαριότητα (ακτίνη και 18S rRNA). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικά σφάλματα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s002

(JPG)

Εικόνα S3. ανάλυση μονοπάτι

εφευρετικότητα των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Top δικτύου από την ανάλυση οδό Ingenuity δείχνει ότι DE γονίδια έχουν σημαντικό ρόλο στον καρκίνο. Εκείνοι που φαίνεται με κόκκινο χρώμα είναι up-ρύθμιση, το πράσινο είναι κάτω-ρυθμίζονται και αυτά στα λευκά χρησιμεύουν για να κάνουν την έμμεση σύνδεση μεταξύ των γονιδίων DE

doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s003

(JPG)

Εικόνα S4. ανάλυση μονοπάτι

εφευρετικότητα των εναλλακτικό μάτισμα γονιδίων. Top δικτύου από την ανάλυση οδό Ingenuity δείχνει ότι εναλλακτικό μάτισμα γονίδια έχουν σχέση με την αντιγραφή του DNA, ανασυνδυασμός και επιδιόρθωση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s004

(JPG)

Εικόνα S5.

διαφορικά εκφράζονται και εναλλακτικό μάτισμα μεταγραφές ανά χρωμόσωμα και το ποσοστό τους. (4Α) γραφική παράσταση δείχνει Ραντάρ σχετικά ποσοστά του DE μεταγραφές ανά χρωμόσωμα. (4Β) γραφική παράσταση καταδεικνύει Ραντάρ σχετικά ποσοστά των εναλλακτικά ματισμένων μεταγράφων ανά χρωμόσωμα. . (4C) Πίνακας που απεικονίζει τον συνολικό αριθμό των διαφορικά εκφρασμένων και εναλλακτικό μάτισμα μεταγραφές ανά χρωμόσωμα

doi: 10.1371 /journal.pone.0067252.s005

(JPG)

Πίνακα S1.

Κατάλογος όλων των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων και μη χαρακτηρισμένα μεταγραφές (Q & lt? 0,05)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s006

(XLS)

Πίνακας S2.

μεταγραφές οι οποίες παρουσίασαν αποδείξεις εναλλακτικό μάτισμα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s007

(XLS)

Πίνακα S3.

Επικάλυψη γονίδια που έδειξαν διαφορική έκφραση και απόδειξη εναλλακτικό μάτισμα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s008

(XLS)

Πίνακας S4. ανάλυση εμπλουτισμό μεταγραφικού παράγοντα

IPA παρουσιάζοντας όλους τους παράγοντες μεταγραφής που μπορεί να επηρέασαν διαφορικά ρυθμιζόμενα γονίδια

doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s009

(XLS)

Ευχαριστίες

η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το ταμείο του σκηνοθέτη Ιατρικής Πληροφορικής και Συστημάτων του στο Virginia Ινστιτούτο Βιοπληροφορικής.