Αφηρημένο

Οι αλλαγές στην έκφραση των miRNAs είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Αυτές οι αλλαγές που συμβαίνουν κατά τη μετάβαση από κανονική σε αδένωμα και από αδένωμα σε καρκίνωμα, ωστόσο, δεν έχουν καλά καθορισμένα. Επιπλέον, miRNA αλλαγές μεταξύ των υποομάδων του όγκου του καρκίνου του παχέος εντέρου έχουν, επίσης, δεν έχουν αξιολογηθεί επαρκώς. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την παγκόσμια έκφραση των miRNAs σε 315 δείγματα που περιλαμβάνονται 52 φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου, 41 tubulovillous αδενώματα, 158 αδενοκαρκινώματα με καλά επιδιόρθωσης του DNA (pMMR) που έχουν επιλεγεί για το στάδιο και την ηλικία έναρξης της νόσου, και 64 αδενοκαρκινώματα με την επισκευή ασυμφωνία ελαττωματικό DNA (dMMR) που επιλέγεται για σποραδικές (n = 53) και κληρονομούνται καρκίνου του παχέος εντέρου (n = 11). Σποραδικές όγκοι dMMR όλοι είχαν

MLH1

αδρανοποίηση λόγω υπερμεθυλίωση προαγωγού. Χωρίς επίβλεψη PCA και ανάλυση διασποράς έδειξε ότι το φυσιολογικό ιστό του παχέος εντέρου, αδενώματα, pMMR καρκινώματα και dMMR καρκινώματα ήταν όλοι σαφώς διακρινόμενη. Η πλειοψηφία των miRNAs που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των φυσιολογικών και των πολυπόδων επίσης διαφορικά εκφραζόμενο με ένα παρόμοιο μέγεθος κατά τη σύγκριση των κανονικών τόσο στον pMMR και ομάδες όγκου dMMR, γεγονός που υποδηλώνει μια σταδιακή εξέλιξη για το μετασχηματισμό από φυσιολογικό κόλον σε καρκίνωμα. Μεταξύ των miRNAs καταδεικνύοντας την μεγαλύτερη διπλώνουν επέκτασης ή υποβιβασμού ρυθμίζονται αλλαγές (≥4), τέσσερα νέα (MIR-31, miR-1, miR-9 και miR-99α) και δύο που έχουν αναφερθεί προηγουμένως (MIR-137 και miR-135b ) miRNAs εντοπίστηκαν στην κανονική /σύγκριση αδένωμα. Όλοι εκτός από ένα από αυτά (MIR-99a) έδειξε παρόμοιες διαφορές έκφραση των δύο συγκρίσεις κανονικές /καρκίνωμα, υποδεικνύοντας ότι αυτές οι αλλαγές όγκων σε πρώιμο στάδιο είναι σημαντικές τόσο στην pMMR- και dMMR προερχόμενο καρκίνους. Η σύγκριση μεταξύ pMMR και dMMR όγκοι εντοπίστηκαν τέσσερις miRNAs (miR-31, miR-552, miR-592 και miR-224), με στατιστικά σημαντικές διαφορές έκφρασης (≥2 φορές αλλαγή)

Παράθεση:. Oberg AL , Γαλλικά AJ, Sarver aL, Subramanian S, Morlan BW, Riska SM, et al. (2011) miRNA έκφραση σε πολυπόδων του παχέος εντέρου παρέχει ενδείξεις για μια πολλαπλών σημείων μοντέλο καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (6): e20465. doi: 10.1371 /journal.pone.0020465

Επιμέλεια: Rakesh Κ Srivastava, Το Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 του Μάρτη του 2011? Αποδεκτές: 26 Απρίλη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 9 Ιουνίου, 2011

Copyright: © 2011 Oberg et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από την Μινεσότα εταιρικής σχέσης για τη βιοτεχνολογία και την ιατρική Γονιδιωματική [Ιατρικό Ίδρυμα 2006-100412]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου (CC) είναι μια από τις κύριες αιτίες των θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο, με περίπου 148.000 νέα κρούσματα αναφέρθηκαν στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2009 [1]. Η εξέλιξη σε CC θεωρείται μια σταδιακή διαδικασία με τη συσσώρευση των διαφορετικών γενετικών και επιγενετικών μεταβολές που οδηγούν σε μετατροπή από ένα φυσιολογικό κύτταρο σε ένα προ-κακοήθη όγκου και τελικά σε μία κακοήθη και δυνητικά μεταστατικού όγκου (φυσιολογικό να αδένωμα με την αλληλουχία καρκίνωμα). Τα τρέχοντα δεδομένα καταδεικνύουν σαφώς την παρουσία της ετερογένειας σε αυτή την ακολουθία των γεγονότων. Αυτά περιλαμβάνουν: (i) την ανάπτυξη των διαφόρων τύπων προκαρκινικών βλαβών όπως λάχνης αδένωμα, σωληνοειδές αδένωμα, tubulovillous αδένωμα, και οδοντωτές πολύποδας με υποτιθέμενη διαφορές στο μοριακό ελαττώματα? (Ii) τη μετάβαση σε διηθητικό καρκίνο επιδεικνύοντας πολύ διαφορετικές μοριακές ανωμαλίες (π.χ., όγκων με και χωρίς ελαττωματικά επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων DNA)? και τέλος, (iii) την ανάπτυξη της σποραδικής έναντι διαφόρων μορφών κληρονομικής CC. Οι υποκείμενοι παράγοντες που ευθύνονται για αυτήν την ετερογένεια, ωστόσο, εξακολουθούν να είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη.

Ένα από τα σαφέστερα διακρίσεις αποδειχθεί μέχρι στιγμής για σποραδικές CC βασίζεται στην παρουσία ή απουσία των λειτουργικών επισκευή ασυμφωνία DNA (MMR) [2] , [3], [4]. έχουν όγκους με ελαττωματικό MMR (dMMR) έχουν ταυτοποιηθεί σε ~ 20% των σποραδικών CC και χαρακτηρίζονται από την παρουσία ενός συγκεκριμένου φαινοτύπου του όγκου, που ονομάζεται μικροδορυφορική αστάθεια (MSI). Σε σποραδικές CC, έχουν τρεις διακριτές φαινότυποι MSI έχουν περιγραφεί: MSS, MSI-L και MSI-H [5]. Ο φαινότυπος MSI-H συνδυάζεται με διακριτά χαρακτηριστικά κλινικοπαθολογική [2], [3], [4], συμπεριλαμβανομένης μιας πιο ευνοϊκό αποτέλεσμα [6]. Μεταξύ σποραδικές CC, η πλειοψηφία των περιπτώσεων MSI-H αποτελέσματα από την απενεργοποίηση του

MLH1

λόγω υπερμεθυλίωση προαγωγού (-95%) [2], [3], [4]. Το υπόλοιπο περίπου 80% των CC με καλά MMR (pMMR), από την άλλη πλευρά, ακολουθούν μια χρωμοσωμική αστάθεια (CIN) μονοπάτι και συνδέονται με υψηλή συχνότητα ανευπλοειδίας και αλληλομόρφων ανισορροπία [7].

Παρά το γεγονός ότι η πλειονότητα των CC φαίνεται να είναι σποραδικές με μέση ηλικία κατά τη διάγνωση στα μέσα της δεκαετίας των 60 s, κατά προσέγγιση 15-20% των περιπτώσεων προκύπτουν μέσα οικογενή αδρανή υλικά, με γνωστές γενετικές συνθήκες αντιπροσωπεύουν μόνο ένα μικρό κλάσμα από αυτά. Ενώ κληρονομική CC έχει αναγνωριστεί εδώ και αρκετό καιρό, η ταυτότητα των γονιδίων που εμπλέκονται στη διαδικασία της νόσου έχει μόλις πρόσφατα έχουν ταυτοποιηθεί για πολλές από τις κληρονομικές συνθήκες. Η πιο διαδεδομένη κληρονομική μορφή της CC είναι κληρονομική μη πολυποδίαση καρκίνο του παχέος εντέρου (HNPCC), αντιπροσωπεύοντας το ~ 2-3% όλων των περιπτώσεων [8].

Για HNPCC, μεταλλάξεις βλαστική στα γονίδια του DNA MMR είναι επίσης υπεύθυνη για την κατάσταση αυτή, με το

MLH1

και

MSH2

αντιπροσωπεύουν την πλειοψηφία των περιπτώσεων (~ 40% το καθένα) και

MSH6

και

PMS2

λογιστικών για ένα μικρότερο ποσοστό, περίπου 10% και 5%, αντίστοιχα [2], [8]. Όγκοι από αυτούς τους ασθενείς είναι επίσης χαρακτηρίζονται από την παρουσία του MSI-Η και από την απώλεια της πρωτεϊνικής έκφρασης MMR για την πληγείσα γονίδιο. Έτσι, η μοριακή αιτιολογία των όγκων που αφορούν dMMR είναι πολύ ετερογενής, με τη συμμετοχή πολλών διαφορετικών γονιδίων και πολλές μηχανισμούς γονιδιακής απενεργοποίησης, συμπεριλαμβανομένης της επιγενετικής, σωματικά και βλαστικής σειράς αλλαγών.

Φαίνεται να είναι τουλάχιστον δύο σημαντικές οδούς που οδηγούν σε σποραδικές υπάρχουν και κληρονομική CC. Το πρώτο μονοπάτι, με τη συμμετοχή dMMR, πιστεύεται ότι κατάγονται από οδοντωτή πρόδρομος (η άμισχα οδοντωτή αδένωμα) και αντιπροσωπεύει όλες τις σποραδικές MSI-H CC (αν και όχι όλοι οι καρκίνοι που προκύπτουν μέσω της οδοντωτή οδού είναι MSI-H). HNPCC δίνει αφορμή για επίσης MSI-H CC. Η δεύτερη οδός είναι πιθανά να προκύψουν από tubulo /λαχνών αδενώματα και οδηγεί σε σποραδικές CC ή FAP που σχετίζονται με CC χαρακτηρίζεται από νεοπλασματικά CIN και pMMR. Η κατανόησή μας από αυτά τα μονοπάτια σε μοριακό επίπεδο και η συμμετοχή τους κατά τη μετάβαση από την κανονική σε πολύποδα σε καρκίνωμα, αν και βελτιώνεται, παραμένει ελλιπής.

Γονιδίωμα-ευρύ προσεγγίσεις (προφίλ έκφρασης, γονιδίωμα-ευρεία ανάλυση SNP, aCGH, αλληλουχίας επόμενης γενιάς) συνεχίζουν να βελτιώσετε την κατανόησή μας για τη διαδικασία της ογκογένεσης. Η ανακάλυψη ενός αυξανόμενου κατηγορία των μικρών μη-κωδικοποίησης RNAs, συμπεριλαμβανομένων των miRNAs, αποκάλυψε ένα ακόμη μεγαλύτερο επίπεδο πολυπλοκότητας για τη βιολογία του καρκίνου [9], [10], [11]. microRNAs (miRNAs) είναι 18-24 nt μικρά μη-κωδικοποίησης RNA μόρια τα οποία αναστέλλουν την έκφραση του γονιδίου κατά κύριο λόγο στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο [9]. Όπως miRNAs ρυθμίζουν την έκφραση ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, ένα ευρύ φάσμα των βιολογικών διεργασιών επηρεάζονται, όπως ο μεταβολισμός, οργανογένεση, την ανάπτυξη, και τον προσδιορισμό της κυτταρικής μοίρας, συμπεριλαμβανομένου του θανάτου [10]. Η αλλαγμένη έκφραση του miRNAs έχει επίσης συνδεθεί με μια ποικιλία των ανθρώπινων ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [11]. Παρά το γεγονός ότι ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχουν ασχοληθεί με την έκφραση των miRNAs σε CC [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], λίγοι έχουν δημοσιεύθηκε στις προκακοήθων αλλοιώσεων στο παχύ έντερο [21], [22], [23], [24], [25]. Ειδικότερα, ο ρόλος του miRNAs στη μετάβαση μεταξύ φυσιολογικό κόλον και των πολυπόδων και μεταξύ των πολυπόδων και του καρκίνου δεν είναι κατανοητός.

Σε αυτή τη μελέτη, οι παγκόσμιες miRNA (735 στόχοι miRNA) έκφραση αξιολογήθηκε σε 315 δείγματα (52 κανονική κολονικό βλεννογόνο και 263 όγκους του παχέος εντέρου) χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα BeadArray ™ (Illumina, Inc.) [26]. Τα δείγματα που επελέγησαν για ανάλυση σε κατηγορίες ανάλογα με έναν αριθμό κλινικών και μοριακών κριτήρια να διερευνήσει ετερογένεια του όγκου με περισσότερες λεπτομέρειες, για να ανακαλύψει βιολογικώς σχετικό miRNAs και για την αντιμετώπιση των μεταβατικών αλλαγών από φυσιολογικό σε αδένωμα και αδένωμα σε καρκίνωμα. τύπους όγκων περιλαμβάνονται tubulovillous αδενώματα, αδενοκαρκινώματα με dMMR επιλεγεί τόσο για σποραδικές και κληρονόμησε περιπτώσεις, και αδενοκαρκινώματα με pMMR επιλεγεί για το στάδιο (Α, Β, C, και D) και την ηλικία έναρξης (τα παλαιού σύγκριση με νεαρά έναρξη της νόσου).

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

το Διοικητικό Institutional Review Mayo Clinic ελεγχθεί και εγκριθεί για ανθρώπινη μελέτες το πρωτόκολλο με τίτλο «προσδιορισμό και την επικύρωση των miRNA προφίλ Υπογραφή ως βιοδείκτες για τον καρκίνο του παχέος εντέρου εξέλιξη» από τον Δρ Stephen N. Thibodeau. Η επιτροπή επεσήμανε ότι οι πτυχές οι ανθρώπινες μελέτες περιλαμβάνουν τη χρήση των δειγμάτων που συλλέγονται στο πλαίσιο IRB-εγκεκριμένα πρωτόκολλα. Η Επιτροπή διαπίστωσε ότι η διαδικασία συναινούντων επιτρέπει τη μελλοντική χρήση των δειγμάτων, όπως επεξηγείται στο τρέχον πρωτόκολλο. Η πλειοψηφία των ασθενών που προβλέπεται γραπτή συγκατάθεση. Για όσους δεν το έκανε, δείγματα ανώνυμα.

επιλογής του δείγματος

Τα δείγματα από ασθενείς με CC ή πολύποδες επιλέχθηκαν από δύο ξεχωριστά μητρώα του όγκου. Η πρώτη συλλογή των δειγμάτων που λαμβάνονται από όλους τους ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή για CC κατά τη διάρκεια μιας τριετούς περιόδου 1995-1998 (μη επιλεγμένο). Η δεύτερη συλλογή, που ξεκίνησε το 2000, είναι μια συνεχής συλλογή biospecimens από ασθενείς Mayo Clinic Rochester με ορθοκολικό νεοπλασία. Για την μετέπειτα μητρώου, δεν υπάρχουν κριτήρια προεπιλογής έχουν χρησιμοποιηθεί από το μητρώο εκτός από το ότι μόνο οι πολύποδες με διάμετρο ≥7 mm συλλέγονται για μελλοντική χρήση.

Όλα τα δείγματα ιστού καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο σε τη στιγμή της συλλογής και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -80 ° C για μεταγενέστερη χρήση. Κανονική περιοχές του επιθηλίου του παχέως ελήφθησαν από είτε το περιθώριο της εκτομής ή πλησίον του όγκου. Όλα εκτός από ένα από τα κανονικά δείγματα ιστού που χρησιμοποιούνται για αυτή τη μελέτη ήταν συνδυάζεται με όγκους. Ορθού καρκίνοι αποκλείστηκαν. Πολύποδες αξιολογήθηκαν για ιστολογικός τύπος, με μόνο tubulovillous αδενώματα έχουν επιλεγεί για μελέτη. Παθολογική σταδιοποίηση όγκου ταξινομήθηκε σύμφωνα με τα κριτήρια Dukes »[27]. Ασθενής αξιολογήσεις διάγραμμα διεξήχθησαν για να ληφθούν κλινικά χαρακτηριστικά του όγκου, συμπεριλαμβανομένων θέση του όγκου, το στάδιο και την ηλικία κατά τη διάγνωση.

Επεξεργασία Tumor και RNA Εκχύλιση

Κατεψυγμένα ιστός κόπηκε σε κρυοστάτη να παράγει αιματοξυλίνη και εωσίνη (Η &? Ε) χρώση διαφάνειες. Για πολύποδες, περιοχές με τουλάχιστον το 50% του αδενώματος ήταν μακρο-αποσυντίθενται. Για καρκίνους, περιοχές που περιέχουν τουλάχιστον 70% των νεοπλασματικών κυττάρων ή μεγαλύτερη ήταν μακρο-αποσυντίθενται. Tissue μεγέθη ισοδύναμο με 7 mm

2 και 10-microns πάχους κόπηκαν και τοποθετήθηκαν σε ένα φιαλίδιο που περιέχει 400 uL του RLT ρυθμιστικού (QIAGEN, Chatsworth, CA), συμπεριλαμβανομένων των 4 μΙ β-μερκαπτοαιθανόλης. Το φιαλίδιο στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -80 ° C μέχρις ότου να χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση του RNA χρησιμοποιώντας TRIzol® LSTrizol © (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

DNA MMR Κατάσταση

η πλειοψηφία των όγκων με επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων ελαττωματικό DNA επιλέχθηκαν για αυτή τη μελέτη ήταν οι ίδιες με αυτές που έχουν αναφερθεί προηγουμένως κατόπιν και έχουν εκτεταμένα χαρακτηριστεί [28]. Tumor MSI αξιολογήθηκε με σύγκριση ζευγών όγκου και φυσιολογικών DNA βλεννογόνου απομονώνεται (κιτ εκχύλισης Qiagen DNA) από, εγκλεισμένα σε παραφίνη υλικό σταθεροποιημένο με φορμαλίνη (FFPE) με τη χρήση 3-18 μικροδορυφορικών δεικτών, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Όγκοι ταξινομούνται ως MSI-H, αν ≥30% των δεικτών αποδεικνύεται αστάθειας, MSI-L αν & lt?. 30% απέδειξαν την αστάθεια, και MSS αν κανένας από τους δείκτες απέδειξαν την αστάθεια

Η ανοσοϊστοχημική (IHC) ανάλυση για την πρωτεΐνη έκφραση πραγματοποιήθηκε σε δείγματα FFPE για MLH1 και MSH2 (σε όλες τις περιπτώσεις) και MSH6 και PMS2 (υποσύνολο), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. DNA dMMR ορίστηκε από την παρουσία του MSI (MSI-H) και /ή την απουσία της έκφρασης πρωτεΐνης για MLH1, MSH2, MSH6 ή PMS2. DNA pMMR ορίστηκε από την απουσία υψηλών επιπέδων αστάθεια μικροδορυφόρου (MSS /MSI-L) και από την παρουσία της κανονικής έκφρασης πρωτεΐνης για MLH1, MSH2, MSH6 και PMS2.

όγκων με dMMR που δείχνει μία έλλειψη MLH1 εξετάστηκαν περαιτέρω για να προσδιοριστεί η αιτία του γονιδίου αδρανοποίησης, δηλαδή, επιγενετική (σποραδικά) έναντι βλαστική (κληρονομική). Είτε ένα μεθυλίωσης ειδικό PCR δοκιμασία που βασίζεται ή ένα ένζυμο ΗραΙΙ πέψη δοκιμασία που βασίζεται χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή για υπερμεθυλίωση προαγωγού [30]. Επιπλέον, μια βασιζόμενη σε PCR δοκιμασία για αλλαγές κατά την μετάλλαξη V600E σε BRAF πραγματοποιήθηκε επίσης. περιπτώσεις MLH1 αποδεικνύοντας

MLH1

υπερμεθυλίωση προαγωγού είχαν ταξινομηθεί ως σποραδική (dMMR1). περιπτώσεις MLH1 με άγριου τύπου BRAF και χωρίς να

MLH1

υπερμεθυλίωση προαγωγού είχαν ταξινομηθεί ως βλαστική (dMMR2). Οι περιπτώσεις που αφορούν MSH2, MSH6 ή PMS2 (από την απώλεια της έκφρασης της πρωτεΐνης από την IHC ή με δοκιμή βλαστική) έχουν επίσης χαρακτηριστεί ως βλαστική (dMMR2).

miRNA Profiling

Παγκόσμια miRNA (735 miRNA στόχους) έκφραση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα BeadArray ™ (Illumina, Inc.) ουσιαστικά όπως περιγράφεται από Sarver et al. [16]. Για κάθε δείγμα που ελέγχθηκε, 200 ng ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση.

Στατιστική Ανάλυση

Μελέτη.

χωριστά συστήματα τυχαιοποίηση δημιουργήθηκαν για να καθορίσει τη σειρά των ιστών κρυοτομής, εκχύλιση RNA και η κατανομή των δειγμάτων στα 96 και Sentrix Array Matrix πλάκες (SAM) για να εξασφαλίσει ότι οι ομάδες δείγμα ενδιαφέροντος και δημογραφικά χαρακτηριστικά ήταν καλά ισορροπημένα κατά τη διάρκεια αρκετών πιθανών πειραματικών αποτελεσμάτων.

αξιολογήσεων της ποιότητας.

Ένα σύνολο 336 δειγμάτων ιστού (281 όγκους και 55 δείγματα φυσιολογικού ιστού) από 282 άτομα ελέγχθηκαν αρχικά με την πλατφόρμα Illumina. Για 54 από τους ασθενείς, τόσο φυσιολογικών και καρκινικών ιστών ελήφθησαν από το ίδιο άτομο (Πίνακας 1). Για σκοπούς ελέγχου της ποιότητας, 8 δείγματα ελέγχθηκαν ένα επιπλέον χρόνο και 5 δείγματα ελέγχθηκαν τρεις επιπλέον φορές (τεστ για αναπαραγωγιμότητα), με αποτέλεσμα ένα σύνολο δειγμάτων 23 επαναληπτικές δοκιμάστηκαν (σύνολο δοκιμαστεί = 359). Είκοσι πέντε επιπλέον αρνητικά και κοπή έλεγχοι χρησιμοποιούνται επίσης για να εκτιμήσει τη συνολική ποιότητα.

Η

Εκτός από τις εκτιμήσεις ελέγχου της ποιότητας εργαστηρίου, παγκόσμια ποιότητα και την προκατάληψη αξιολογήθηκαν μέσω διαφόρων τεχνικών σχεδίαση. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στο ημερολόγιο

κλίμακας 2 και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στην κλίμακα πολλαπλή μεταβολή. οικόπεδα Box-and-μουστακιού χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της παγκόσμιας μέσης αλλαγές στην κατανομή miRNA ή συγκέντρωσης μεταξύ δειγμάτων και τα SAM. Ανά ζεύγη μείον έναντι μέσος (MVA) οικόπεδα για δύο δείγματα, που ορίζεται ως η διαφορά ανά ανιχνευτή ανάμεσα στα δύο δείγματα (κάθετος άξονας) έναντι του μέσου όρου ανά-ανιχνευτή (οριζόντιος άξονας) για τα δύο δείγματα [31], χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογήσει συμφωνία μεταξύ των τεχνικών επαναλήψεων. Υπολειμματική οικόπεδα MVA για ένα δεδομένο δείγμα, που ορίζεται ως η διαφορά μεταξύ αυτού του δείγματος και του μέσου όρου όλων των δειγμάτων (κάθετος άξονας) έναντι του μέσου όρου όλων των δειγμάτων (οριζόντιος άξονας) [32], χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η ύπαρξη και λειτουργική μορφή του , π.χ., τις προκαταλήψεις (μη) γραμμικότητα ως συνάρτηση της αφθονίας. Οικόπεδα της ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) τα αποτελέσματα χρησιμοποιήθηκαν για να εξεταστεί (DIS) ομοιότητα των δειγμάτων για αρνητικά δείγματα ελέγχου και ύπαρξη αποτελεσμάτων SAM. οικόπεδα κουτί και οικόπεδα dot χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της φύσης και της συνέπειας των ανά ανιχνευτή επιπτώσεις SAM. ποσοστά ανίχνευσης αξιολογήθηκαν για κάθε δείγμα, με ανίχνευση ανιχνευτής ορίζεται ως p-τιμές & lt?. 0.01

Με βάση την εν λόγω αξιολόγηση της ποιότητας των αναλύσεων, συνολικά 21 από τα 359 δείγματα (συμπεριλαμβανομένων ορισμένων επαναλήψεις) απομακρύνθηκαν από την περαιτέρω μελέτη. Δώδεκα βρέθηκαν να είναι πιο παρόμοια στη διανομή έκφραση σε αρνητικά δείγματα ελέγχου που βασίζεται σε οικόπεδα κουτί, τα ποσοστά ανίχνευσης και οικόπεδα PCA και ένα δείγμα είχε μια εξαιρετικά υψηλή, αλλά στενό εύρος της έκφρασης. Ένα επιπλέον επτά δείγματα είχαν προφανώς διαφορετικά αποτελέσματα δαπέδου και οροφής σε υπολειμματική οικόπεδα MVA και συγκεντρωμένα πιο κοντά στα αρνητικά δείγματα ελέγχου στο PCA. Ένα επιπλέον δείγμα είχε εξαλειφθεί, δεδομένου ότι ήταν το μοναδικό στην κατηγορία του. Έτσι, υπήρχαν 338 δείγματα (318 μοναδικά και 20 αντίγραφα) από 268 άτομα που απομένει για ανάλυση.

προεπεξεργασία.

Η κατανομή της αφθονίας του 735 miRNA και 20 ανιχνευτές ελέγχου κάλυψαν ευρύ φάσμα, με 40% -60% των ανιχνευτών ανιχνεύθηκαν σε δείγματα που περνά αξιολόγησης της ποιότητας (χρησιμοποιώντας ένα όριο p-value 0,01 ανίχνευσης). Επιπλέον, δεν υπήρχε

a priori

λόγο να περιμένουμε μια ασύμμετρη κατανομή των αλλαγών [16]. Έτσι, τα 338 δείγματα που διέρχεται η αρχική αξιολόγηση της ποιότητας ομαλοποιήθηκαν μαζί μέσω ποσοστημόριο εξομάλυνση [31]. Μετά την εξομάλυνση υπολειμματική οικόπεδα MVA έδειξε ότι κατά μέσο όρο μη γραμμική πόλωση αφαιρέθηκε με επιτυχία. Ωστόσο, οικόπεδα των αποτελεσμάτων PCA έδειξε ότι ένα φαινόμενο SAM παρέμεινε. εκτιμήσεις αντίθεση και οικόπεδα dot αποκάλυψε ότι, ενώ δεν υπήρξε σχεδόν καμία επίδραση SAM για την πλειοψηφία των ανιχνευτών, μια χούφτα έδειξε αλλαγές μέχρι και 2 φορές μεταξύ τα SAM που ήταν συνεπής σε όλα τα δείγματα σε κάθε SAM και δεν καθοδηγείται από ακραία σημεία. Δηλαδή, παρατηρήθηκαν συνεπής SAM-by-ανιχνευτή αλληλεπιδράσεις. Έτσι, υπολείμματα από γραμμικά μοντέλα με SAM στο μοντέλο ταιριάζει σε μια βάση ανά-ανιχνευτής για ποσοστημόριο κανονικοποιημένα δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν ως τελική κανονικοποιημένη, SAM-διορθωμένα στοιχεία. Αυτά τα γραμμικά μοντέλα έδωσαν αποτελέσματα εντός δεκαδικά σκόνη εμπειρικές μεθόδους Bayes δεδομένου ότι το μέγεθος του δείγματος είναι μεγάλο [33].

Υπολειμματική MVA οικόπεδα, οικόπεδα κουτί και ανά ανιχνευτή οικόπεδα dot δεν έδειξαν τάση την πάροδο του χρόνου για το ένα δείγμα που εξυπηρετούν ως ένας έλεγχος κοπής με ιστός κόβεται επτά φορές πάνω από τους δύο μήνες που απαιτούνται για τη διεκπεραίωση όλων των δειγμάτων ιστού. Υπολειμματική και ζεύγη MVA οικόπεδα έδειξε καλή συνολική συμφωνία μεταξύ των τεχνικών επαναλήψεων τοποθετούνται σε διαφορετικά τα SAM. Το μεγαλύτερο SAM επίδραση που παρατηρήθηκε ήταν 2,33 φορές (log

2 κλίμακας διαφορά 1,22), και μόνο μια χούφτα των ανιχνευτών είχε επιπτώσεις SAM 2 φορές. 91,5% (691/755) των ανιχνευτών είχε εκτιμήσεων αποτέλεσμα SAM & lt?. 1.2 φορές

ποσοστά ανίχνευσης Per-ανιχνευτή μαζί με οικόπεδα ανά-Probe τυπική απόκλιση (SD) για όλες τις κανονικοποιημένες δείγματα (n = 338 ) έναντι μέσου όρου έκφραση πάνω από όλα κανονικοποιούνται δειγμάτων κατέδειξε σαφή αποτελέσματα δάπεδο και η οροφή στην κατανομή της αφθονίας. Μια ανά-ανιχνευτής όριο SD της ≤0.4 σε αυτά τα δείγματα που αφορούν το ημερολόγιο

2 κλίμακας χρησιμοποιήθηκε για να φιλτράρει τα «μη ενημερωτικά» ανιχνευτές με τρόπο αγνωστικιστής στην ομάδα [34]. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα 123 ανιχνευτές με ποσοστά ανίχνευσης 0%, 37 κορεσμένα ανιχνευτές, και 376 ανιχνευτές μέσα αφθονία με χαμηλή SD που φιλτράρονται, αφήνοντας 199 πληροφοριακοί ιχνηλάτες με SD & gt?. 0.4

Η διαφορική έκφραση

Per-ανιχνευτή γραμμικής αναμιγνύεται επιδράσεις μοντέλα με δηλώσεις αντίθεση χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση διαφορικής έκφρασης με τη χρήση των κανονικοποιημένων ποσοστημόριο, SAM-διορθωμένα στοιχεία. Θέμα συμπεριλήφθηκε ως τυχαίο αποτέλεσμα, προκειμένου να λογοδοτήσει για τη συσχέτιση μεταξύ πολλαπλών παρατηρήσεων ανά θέμα (τεχνικές επαναλήψεις και το αντιστοιχισμένο φύση της όλα, αλλά ένα κανονικό δείγμα). Ένα αποτέλεσμα SAM συμπεριλήφθηκε στο μοντέλο να λαμβάνονται υπόψη οι βαθμοί ελευθερίας χρησιμοποιούνται στην απομάκρυνση ανά ανιχνευτή του αποτελέσματος SAM. Κατανομές των p-τιμές και ψευδείς τιμές ανακάλυψη [35], [36] (που υπολογίζεται με βάση τα αποτελέσματα του μοντέλου για όλες τις 735 miRNA ανιχνευτές) χρησιμοποιήθηκαν για να δώσει μια γενική αίσθηση από το αν υπάρχουν πραγματικές διαφορές. Πραγματική σημασία αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την πιο συντηρητική Bonferroni διορθωθεί τιμές p βασίζονται σε 0,05 /735 = 6,8 × 10

-5 για κάθε σύγκριση μαζί με αποκοπές φορές αλλαγή να ενσωματώσει βιολογική σημασία. Έξι κύριες ομάδες συγκρίθηκαν: κανονική, πολύποδας, pMMR1 (παλαιά εμφάνιση), pMMR2 (νέοι έναρξη), dMMR1 (σποραδικά) και dMMR2 (βλαστική). Πρόσθετες συγκρίσεις περιλαμβάνονται pMMR1 Στάδια Β, Γ και Δ (Φάση Α με n = 3 έμεινε έξω από τη σύγκριση αυτή, λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος), καθώς και οι ομάδες pMMR1 MSS και MSI-L.

Ρύθμιση μεταβλητές που περιλαμβάνονται, ενδεχομένως να αποφευχθούν πιθανές συγχητικές με ιστολογία. το στάδιο του όγκου συμπεριλήφθηκε ως συμμεταβλητή σε μοντέλα αξιολόγηση διαφορές μεταξύ των τύπων όγκων για την προσαρμογή για πιθανές ανισορροπίες της σοβαρότητας της νόσου λόγω στάδιο. Θέση στο κόλον δεν περιελήφθη ως συμμεταβλητή σε μοντέλα συγκρίνοντας pMMR και dMMR όγκων όπως αυτό θεωρήθηκε μέρος της βιολογίας των όγκων. Δεν συμμεταβλητές συμπεριλήφθηκαν σε μοντέλα συγκρίνοντας τα πολύποδα ή κανονικές ομάδες με άλλες ομάδες εφόσον ούτε το στάδιο ούτε θέση στο παχύ έντερο είναι σχετικό για τις ομάδες αυτές.

Οπτικοποίηση των δεδομένων.

Οπτικοποίηση για την παρουσία παγκόσμιες επιπτώσεις επιτεύχθηκε μέσω μη επιβλεπόμενη ομαδοποίηση και PCA χρησιμοποιώντας μοναδικά δείγματα ιστών μόνο (318 από 338 δείγματα)? τα τεχνικά αντίγραφα εξαιρέθηκαν από αυτές τις αναλύσεις. Για δείγματα με πολλαπλές τεχνικές επαναλήψεις, το δείγμα αναπαράγουν την ένδειξη «1» επιλέχθηκε. PCA αναλύσεις διεξήχθησαν σε ανά-ανιχνευτή σημαίνει με επίκεντρο και τα δεδομένα SD-κλίμακας χρησιμοποιώντας Partek [37] και το prcomp λειτουργία R [38]. Χωρίς επίβλεψη αναλύσεις ομαδοποίηση πραγματοποιήθηκαν σε ανά-αισθητήρα δεδομένων μέση με επίκεντρο το Partek χρησιμοποιώντας μήτρα ανομοιότητας Pearson για τον υπολογισμό των αποστάσεων μεταξύ των επιμέρους δειγμάτων και τη μέθοδο του μέσου σύνδεσης για τον υπολογισμό των αποστάσεων μεταξύ των δύο ομάδων. Σημεία ή δείγμα ετικέτες χρωματιστές σε οικόπεδα με γνωστή κλινική ομαδοποίηση των πληροφοριών.

Αποτελέσματα

χαρακτηριστικά του δείγματος

Μετά από εκτενή αξιολόγηση της ποιότητας των miRNA προφίλ αποτελέσματα (βλέπε Μέθοδοι), 338 δείγματα ιστών από 268 ασθενείς χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων ιστού (μη συμπεριλαμβανομένων οποιοδήποτε από τα τεχνικά αντίγραφα) περιλαμβάνονται 52 κανονικό βλεννογόνο του κόλου, 41 tubulovillous αδενώματα, 158 αδενοκαρκινώματα με pMMR επιλεγεί για το στάδιο (3 Στάδιο Α, 72 Φάση Β, 43 Στάδιο C και 30 Στάδιο D) και την ηλικία έναρξης (148≥50 χρόνια έναντι 10 & lt? 50 χρόνια), και 64 αδενοκαρκινώματα με dMMR επιλεγεί τόσο για σποραδικές (53 dMMR1) και κληρονόμησε CC (11 dMMR2) όπως περιγράφεται στον πίνακα 1.

Όλες οι περιπτώσεις με σποραδικές dMMR (dMMR1) είχε

MLH1

αδρανοποίηση λόγω υπερμεθυλίωση προαγωγού. Η κληρονομική ομάδα dMMR (dMMR2) αποτελούνταν από τις περιπτώσεις που έχουν: (i) μια γνωστή μετάλλαξη βλαστικής γραμμής είτε σε

MLH1

(n = 1) ή

MSH2

(n = 3)? ή (ii) απώλεια της έκφρασης πρωτεΐνης για MSH2 (n = 3), MSH6 (n = 2) ή PMS2 (n = 2) με IHC και θεωρείται ότι έχει μία μετάλλαξη γαμετικής σειράς σε αυτά τα γονίδια. Αρκετές περιπτώσεις με dMMR δεν ήταν εύκολα κατηγοριοποιηθούν (dMMR3) και λόγω του μικρού αριθμού, αυτά εξαλείφονται από περαιτέρω ανάλυση. Από τα 268 άτομα, 119 ήταν γυναίκες και 149 ήταν άνδρες.

διαφορές έκφρασης Παγκόσμια miRNA μεταξύ της κανονικής του παχέος εντέρου, αδένωμα και καρκίνωμα

PCA και ιεραρχική σύμπλεγμα αναλύσεις, τόσο χωρίς επίβλεψη, χρησιμοποιήθηκαν για να απεικονίσει miRNA πρότυπα έκφρασης παρόν σε παγκόσμιο επίπεδο στο σύνολο δεδομένων έκφρασης μας. Συνολικά, υπήρχε σαφής διαχωρισμός μεταξύ των ομάδων που αποτελούνται από την κανονική, αδένωμα, pMMR1 και dMMR1 προέρχονται ιστούς όταν εξετάζεται τόσο από ανεξέλεγκτους PCA (Εικόνα 1Α) και ιεραρχική ομαδοποίηση (Εικόνα 1Β) χρησιμοποιώντας το σύνολο των 199 «ενημερωτική» ανιχνευτές που λαμβάνεται όπως περιγράφεται στο μεθόδους. Ενδιαφέροντος, ωστόσο, ιεραρχική ομαδοποίηση προτείνει επίσης την παρουσία δύο υπο-πληθυσμούς για την ομάδα dMMR1 των όγκων, η οποία φαίνεται να οδηγείται από ένα σύμπλεγμα miRNAs (η πλειοψηφία από το χρωμόσωμα 14) δείχνει χαμηλή έκφραση σε μία ομάδα και υψηλή έκφραση σε το άλλο (υποδεικνύεται από το βέλος στο Σχήμα 1Β).

(Α) Οικόπεδα από τις κύριες συνιστώσες από το PCA αναλύσεις. Οριζόντιος άξονας αντιστοιχεί στο κύριο συστατικό 1 (PC1), κάθετος άξονας αντιστοιχεί στο PC2, τον άξονα βάθους αντιστοιχεί σε PC3. Η επί τοις εκατό της μεταβολής εξηγείται από ένα συγκεκριμένο PC αναγράφεται στην ετικέτα άξονα. Τα σημεία χρωματισμένα με βάση την κατάσταση της ομάδας με μπλε αντιπροσωπεύει φυσιολογικό επιθήλιο, μοβ αντιπροσωπεύει πολύποδα, πράσινο αντιπροσωπεύει pMMR1, και το κόκκινο αντιπροσωπεύει dMMR1. Δύο διαφορετικές κατευθύνσεις παρέχονται. (Β) Ανεξέλεγκτη ιεραρχική συσταδοποίηση προφίλ miRNA χρησιμοποιώντας το σετ των 199 «πληροφοριακό» ανιχνευτές που λαμβάνεται όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα δείγματα που αναφέρονται στον οριζόντιο άξονα και περιλαμβάνουν κανονική του παχέος εντέρου, αδενώματα, pMMR1 καρκινώματα και dMMR1 καρκινώματα με την ιδιότητα μέλους της ομάδας που υποδεικνύεται από το μπαρ το χρώμα ανάμεσα στο δενδρόγραμμα και τη θερμότητα χάρτη. Τα miRNAs που υποδεικνύεται από τον κατακόρυφο άξονα. κάτω από το μπαρ χρώμα υποδηλώνει το επίπεδο της έκφρασης.

Η

Τα παγκόσμια πρότυπα έκφρασης των miRNAs στη συνέχεια εξετάστηκαν οπτικά σε διάφορες προκαθορισμένες όγκου υπο-ομάδες για να καθορίσει αν αυτές θα μπορούσαν να διακριθούν. Τα οικόπεδα PCA για αυτές τις αναλύσεις δείχνονται στο Σχήμα 2 (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα για τις αναλύσεις της ιεραρχικής σύμπλεγμα). Στο πλαίσιο της ομάδας pMMR1 των όγκων, δεν υπήρχαν εμφανείς διαφορές διακριτό με βάση το στάδιο, είτε σε όλες τις τρεις φάσεις ή μεταξύ οποιωνδήποτε δύο στάδια (Φάση Α δεν περιλαμβάνονται λόγω του μικρού αριθμού), είτε με βάση το φύλο. Επιπλέον, δεν υπάρχει διαχωρισμός των ομάδων ήταν εμφανής μεταξύ των όγκων με μια παλαιότερη ηλικία έναρξης (≥50 y /o, pMMR1) και εκείνοι με μια νεότερη ηλικία έναρξης (& lt? 50 y /o, pMMR2). Μια ανάλυση των όγκων μέσα σε κάθε έναν από τους δύο υποτύπους dMMR, dMMR1 (σωματικά) έναντι dMMR2 (βλαστική), έδειξε επίσης δεν αισθητές διαφορές.

Οριζόντιος άξονας αντιστοιχεί στο κύριο συστατικό 1 (PC1), κάθετος άξονας αντιστοιχεί σε PC2 , και του άξονα βάθους αντιστοιχεί σε PC3. Τα σημεία χρωματισμένα με βάση την κατάσταση της ομάδας. Η επί τοις εκατό της μεταβολής εξηγείται από ένα συγκεκριμένο PC αναγράφεται στην ετικέτα άξονα. (Α) pMMR1 αξιολογούνται από το στάδιο κατά Dukes? (Β) αξιολόγηση από την ηλικία έναρξης (pMMR1 – παλαιά και pMMR2 – νέοι). (Γ) Αξιολόγηση των 2 ομάδων των περιπτώσεων dMMR (dMMR1 – επιγενετική σιγήσει MLH1 και dMMR2 – βλαστικής σειράς)? (Δ) οι ομάδες pMMR1 MSI-L και όγκους MSS. Χρώματα για κάθε μία από τις ομάδες που συγκρίνονται φαίνονται στην πάνω δεξιά κουτί μύθο.

Η

Επειδή οι όγκοι συχνά ταξινομούνται από την κατάστασή τους MSI (MSS, MSI-L και MSI-H), αυτές οι τρεις ομάδες εξετάστηκαν περαιτέρω για τις διαφορές έκφρασης μαζί, τότε συστηματικά σε ζεύγη. Όπως ήταν αναμενόμενο, η ομάδα MSI-H (που ορίζεται ως dMMR) συγκεντρωμένα χωριστά τόσο από την MSI-L και ομάδες MSS (τόσο ορίζονται ως pMMR). Ωστόσο, η MSI-L και ομάδες MSS δεν έδειξε διαφορές διακριτό (Σχήμα 2).

Η διαφορική έκφραση μεταξύ της κανονικής του παχέος εντέρου, αδένωμα και καρκίνωμα

Διενεργήσαμε ομάδα που βασίζεται σε στατιστικές συγκρίσεις σε probe- από-ανιχνευτή βάση τη χρήση γραμμικών μοντέλων για διάφορες προκαθορισμένες αναλύσεις, σε μια προσπάθεια να εντοπίσει στατιστικά σημαντική διαφορικά εκφρασμένων miRNAs. Συνολικά, πολύ παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ αρκετές από τις ομάδες για συγκεκριμένα miRNAs χρησιμοποιώντας ένα Bonferroni διορθωθεί όριο p-value για τη σημασία (6.8 × 10

-5). Ο πίνακας 2 παρέχει μια καταμέτρηση των miRNAs επιδεικνύοντας σημαντική έκφραση φορές αλλαγές σε διάφορες αποκοπές (≥2.0 και ≥4.0). Ο Πίνακας 3 δείχνει τα εννέα στατιστικά σημαντική διαφορικά εκφρασμένων miRNAs με την μεγαλύτερη αλλαγή φορές (fold αλλαγή ≥4), ενώ το σχήμα S1 δείχνει τα οικόπεδα κουκκίδα για κάθε μία από αυτές μεταξύ των διαφόρων υποομάδων ιστού.

Η

Η αλλαγή στο επίπεδο έκφρασης που εμφανίζεται στο φυσιολογικό να αδενώματος προς αλληλουχία καρκίνωμα για καθένα από τα εννέα miRNAs μπορεί σαφώς να φανεί στο Σχήμα S1. Πέντε από τα εννέα δείξει συνεπή αλλαγές σε όλες τις ομάδες σε σύγκριση με το κανονικό, με miR-135b και miR-31 up-ρυθμίζονται και miR-1, miR-137 και miR-9 κάτω-ρυθμίζονται σε όλα τα δείγματα. HS_29 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε όλα τα καρκινώματα, αλλά όχι στα πολύποδες, miR-552 και miR592 τα επάνω ρυθμισμένη στους πολύποδες και όγκους pMMR αλλά όχι οι όγκοι dMMR, και, τέλος, miR99a ρυθμίζεται προς τα κάτω σε πολύποδες με ενδιάμεσα επίπεδα και στις δύο ομάδες όγκου pMMR και dMMR.

Χρησιμοποιώντας το όριο Bonferroni P-τιμή μαζί με μια φορές αλλαγή στο επίπεδο έκφρασης του ≥2, συνολικά 54 miRNAs εντοπίστηκαν μεταξύ των διαφόρων συγκρίσεις (Πίνακας 2, Πίνακας S1). Τριάντα μία miRNA εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ φυσιολογικού ιστού κόλον και αδενώματα. Μια σύγκριση του φυσιολογικού ιστού του παχέος εντέρου σε δύο κύριες ομάδες καρκίνωμα (pMMR1 και dMMR1) εντοπίστηκαν 31 και 28 σημαντικές miRNAs, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας αυτά τα κριτήρια. Τέλος, 6 και 11 σημαντικές miRNAs εντοπίστηκαν όταν αδενώματα συγκρίθηκαν με τις δύο ομάδες καρκίνωμα. Ο χάρτης θερμότητα, που φαίνεται στο Σχήμα 3, απεικονίζει τις σχετικές διαφορές έκφραση αυτών των miRNAs μεταξύ των ομάδων που μελετάται.

Τα δείγματα υποδεικνύονται κατά μήκος του οριζόντιου άξονα και περιλαμβάνουν φυσιολογικό κόλον, αδενώματα, pMMR καρκινώματα (1 και 2 σε συνδυασμό ) και καρκινώματα dMMR (1 και 2 μαζί) με την ιδιότητα μέλους της ομάδας που υποδεικνύεται από το μπαρ το χρώμα ανάμεσα στο δενδρόγραμμα και τη θερμότητα χάρτη. Τα miRNAs που υποδεικνύεται από τον κατακόρυφο άξονα. κάτω από το μπαρ χρώμα υποδηλώνει το επίπεδο της έκφρασης.

Η

Από ενδιαφέρον, η πλειοψηφία (23 από 31) των miRNAs που εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ της κανονικής και αδένωμα με φορές αλλαγές ≥2 επίσης διαφορικά εκφρασμένων σε η σύγκριση της κανονικής τόσο για τις ομάδες των ιστών pMMR και dMMR, για παράδειγμα miR-135b και miR-31 (Πίνακας S1). Επιπλέον, τα επίπεδα και η κατεύθυνση των αλλαγών σε σχέση με την κανονική για τα περισσότερα από αυτά ήταν συνεπή μεταξύ αδενώματος και καρκινώματος. Εκτός από τις ομοιότητες σημειωθεί για τις ομάδες αδενώματος και καρκινώματος, ωστόσο, οι διαφορές στην έκφραση ταυτοποιήθηκαν επίσης. Από τις 43 miRNAs που ήταν σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο με πλάσια αλλαγές ≥2 στις δύο ομάδες όγκου, 20 δεν πληρούσαν τα κριτήρια αυτά στην ομάδα των πολυπόδων (π.χ., miR-375, mir-147, κλπ), αν και αρκετά άλλα miRNAs είχε σημαντική, αλλά μικρότερα επίπεδα της διαφοράς έκφρασης στην ομάδα πολύποδα (π.χ., miR-188-5p, miR-210) (Πίνακας S1). Όταν οι ομάδες του όγκου συγκρίθηκαν άμεσα με την ομάδα των πολυπόδων, ταυτοποιήθηκαν 20 miRNAs? 9 up-ρύθμιση (π.χ., miR-483-3p, miR34b) και 11 κάτω-ρυθμίζονται (π.χ., miR-552, miR-592).

Αν και PCA και ανάλυση διασποράς ήταν σε θέση να διαχωρίσει το pMMR1 και dMMR1 υποομάδες (Σχήμα 1), υπήρχαν εκπληκτικά λίγες miRNAs που ήταν σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο μεταξύ αυτών των δύο ομάδων (Πίνακας 2 και Πίνακας S1). Μόνο τέσσερις miRNAs (miR-31, miR-224, miR-552, miR-592,) βρέθηκαν σε ένα 2-φορές αλλαγή ή υψηλότερη. Όπως σημειώνεται για τις συγκρίσεις αδένωμα, η πλειοψηφία των miRNAs που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ του φυσιολογικού ιστού του παχέως εντέρου και την ομάδα pMMR1 με πλάσια αλλαγές ≥2 επίσης εκφράζονται διαφορικά κατά τη σύγκριση του φυσιολογικού ιστού του παχέος εντέρου στην ομάδα ιστό dMMR1. Και πάλι, τα επίπεδα και την κατεύθυνση αυτών των αλλαγών σε σχέση με την κανονική για τα περισσότερα από αυτά τα miRNAs ήταν συνεπείς μεταξύ αυτών των δύο συγκρίσεις (Πίνακας S1).

Ένας αριθμός επιπρόσθετων προ-προγραμματισμένη συγκρίσεις έδειξαν ελάχιστες διαφορές μεταξύ συγκεκριμένων υποομάδων.