Αφηρημένο

Πυρηνική παράγοντα ερυθροειδή 2 p45 που σχετίζονται με συντελεστή 2 (Nrf2) είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει την έκφραση πολλών κυτταροπροστατευτικών γονίδια. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε ότι η έκφραση του Nrf2 κατεστάλη σε όγκο του προστάτη των διαγονιδιακών αδενοκαρκίνωμα του προστάτη Mouse (TRAMP) ποντικούς. Ομοίως, η έκφραση του Nrf2 και η επαγωγή NQO1 επίσης ουσιαστικά κατασταλεί σε ογκογόνα κύτταρα TRAMP C1 αλλά όχι σε μη ογκογόνα κύτταρα TRAMP C3. Η εξέταση της περιοχής προαγωγού του γονιδίου ποντικού Nrf2 εντόπισε νησί CpG, η οποία μεθυλιώθηκε σε συγκεκριμένες θέσεις CpG σε προστάτη TRAMP όγκου και σε κύτταρα TRAMP C1 αλλά όχι σε φυσιολογικό προστάτη ή κύτταρα TRAMP C3, όπως φαίνεται από όξινο θειώδες γονιδιωματική αλληλούχιση. δοκιμασίες Reporter έδειξαν ότι η μεθυλίωση αυτών των CpG θέσεων ανέστειλε δραματικά την μεταγραφική δραστικότητα του προαγωγού Nrf2. Χρωματίνης immunopreceipitation (μάρκας) δοκιμασίες αποκάλυψε αυξημένη δέσμευση της πρωτεΐνης μεθυλο-CpG-δεσμευτική 2 (MBD2) και τριμεθυλο-ιστόνης Η3 (Lys9) πρωτεΐνες σε αυτές τις περιοχές CpG στα κύτταρα TRAMP C1 σε σύγκριση με κύτταρα TRAMP C3. Σε αντίθεση, η δέσμευση της RNA ροΙ II και ακετυλιωμένης ιστόνης Η3 προς τον υποκινητή Nrf2 μειώθηκε. Επιπλέον, η θεραπεία των TRAMP C1 κυττάρων με DNA μεθυλοτρανσφεράση (DNMT) αναστολέα 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα) και αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC) αναστολέα τριχοστατίνη Α (TSA) αποκατέστησε την έκφραση του Nrf2 καθώς και την επαγωγή του NQO1 στα κύτταρα TRAMP C1. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση του Nrf2 καταστέλλεται επιγενετικώς με μεθυλίωση προαγωγού που συνδέονται με MBD2 και τροποποιήσεις των ιστονών στον όγκο του προστάτη ποντικών TRAMP του. παρόντα ευρήματα μας αποκαλύπτουν ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο η έκφραση Nrf2 καταστέλλεται στο TRAMP όγκων του προστάτη, να ρίξει νέο φως στο ρόλο της Nrf2 στην καρκινογένεση και παρέχουν πιθανές νέες κατευθύνσεις για την ανίχνευση και την πρόληψη του καρκίνου του προστάτη

Αιτιολογική αναφορά.: Yu S, Khor ΝΑ, Cheung KL, Λι W, Wu ΤΥ, Huang Y, et al. (2010) Έκφραση Nrf2 ρυθμίζεται από επιγενετική στον καρκίνο του προστάτη της TRAMP ποντικών. PLoS ONE 5 (1): e8579. doi: 10.1371 /journal.pone.0008579

Συντάκτης: Andy Τ Υ Lau, Πανεπιστήμιο της Μινεσότα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 του Σεπτέμβρη 2009? Αποδεκτές: 6 Δεκ του 2009? Δημοσιεύθηκε: 5 Γενάρη 2010

Copyright: © 2010 Yu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας χορηγεί R01-CA118947 και R01-094828 να A.-N. Τ Κονγκ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη, καθώς και πολλές άλλες μορφές καρκίνου σχετίζονται με την ηλικία, χαρακτηρίζεται από αυξημένη ενδοκυτταρική οξειδωτικό στρες [1], [2]. Χρόνιες οξειδωτικό στρες και των συναφών παθολογικών καταστάσεων, περιλαμβανομένης της φλεγμονής και μεταβολικών διαταραχών έχουν προταθεί για την οδήγηση σωματικές μεταλλάξεις και νεοπλασματικό μετασχηματισμό, έτσι θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη [3]. Αυξημένο οξειδωτικό στρες ή αντιδραστικά είδη οξυγόνου επίπεδα (ROS) θα μπορούσε να είναι συνέπεια της αυξημένης παραγωγής ROS και /ή μειωμένη αντιοξειδωτική ικανότητα και ή ROS αποτοξίνωση. Πρόσφατα η εξασθενημένη αντιοξειδωτικό σύστημα άμυνας στην καρκινογένεση του καρκίνου του προστάτη έχει κερδίσει αυξημένη προσοχή.

Το κυψελοειδές σύστημα αντιοξειδωτικό άμυνα περιλαμβάνει μια μπαταρία των αντιοξειδωτικών /ένζυμα αποτοξίνωσης και πρωτεΐνες όπως η υπεροξειδική δισμουτάση (SOD), η καταλάση, hemeoxgenase ( HO), UDP-γλυκουρονοσυλτρανσφερασών (UGT), γλουταθειόνη υπεροξειδάσης (GPx), γλουταθειόνη S-τρανσφεράσες (GST), και ΝΑϋ (Ρ) Η: κινόνη οξειδορεδουκτάσης (NQO) [4]. Κάτω ρύθμιση των GST από το DNA μεθυλίωση φαίνεται να είναι αρκετά συχνή στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη που έχει αναπτυχθεί ως ένας διαγνωστικός δείκτης [5]. Η έκφραση και οι δραστηριότητες των SOD, καταλάσης και GPx έχουν αναφερθεί να μειωθεί σε ιστούς καρκινώματος του προστάτη, καθώς και στο πλάσμα και τα ερυθροκύτταρα [6] – [8]. Πρόσφατες μελέτες από το εργαστήριο μας και άλλοι βρήκαν ότι τα επίπεδα έκφρασης της SOD, UGT1A1, NQO1 και πολλά οικογενειακά GST γονίδια σημαντικά κατέστειλε σε όγκους του προστάτη σε διαγονιδιακά αδενοκαρκίνωμα του προστάτη Mouse (TRAMP) ποντικούς [9] – [11]. Αν και η ρύθμιση προς τα κάτω των ενζύμων της GST στο ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη έχουν συνδεθεί με την υπερμεθυλίωση προαγωγού των γονιδίων GST [5], [12]? Προαγωγέα DNA υπερμεθυλίωση δεν φαίνεται να προκαλεί γονίδιο GST καταστολή σε όγκους TRAMP [9]. Αντ ‘αυτού, τα κάτω ρύθμιση πυρηνικού παράγοντα-ερυθροειδούς 2p45 (NF-Ε2)-σχετικών παράγοντα 2 (Nrf2), ένας ρυθμιστής κλειδί της κυτταρικής αντιοξειδωτικά ένζυμα, μπορεί να είναι υπεύθυνη για τη μεταγραφική καταστολή των GST και άλλη φάση ΙΙ αποτοξίνωση γονίδια ενζύμου [11 ].

Nrf2 είναι ένα έλικα-βρόχος-έλικα παράγοντας μεταγραφής βασικές φερμουάρ λευκίνης που ρυθμίζει την έκφραση πολλών φάσης ΙΙ αποτοξίνωση και αντιοξειδωτικά ένζυμα, μέσω σύνδεσης αυτού με το στοιχείο αντιοξειδωτικό-απόκρισης (ARE) στην περιοχή υποκινητή [ ,,,0],4]. Νοκ-άουτ του Nrf2 σε ποντίκια καταργηθεί ουσιαστικά την επαγόμενη έκφραση της ARE μεσολάβηση αποτοξινωτική και αντιοξειδωτικά ένζυμα, και κατέστησε αυτά τα ποντίκια ιδιαίτερα ευαίσθητοι σε καρκινογόνους ή /και οξειδωτικές βλάβες [13], [14]. Σε αυτά τα πλαίσια, που προηγουμένως έχουμε βρει ότι τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του Nrf2 και γονιδίου Nrf2-στόχου αίμης-οξυγενάσης-1 (ΗΟ-1) έχουν εξασθενημένα στους όγκους του δέρματος ενός μοντέλου καρκινογένεσης δέρματος ποντικού [15]. Ομοίως, η έκφραση του Nrf2 καθώς και οι μεταγενέστεροι γονιδίων-στόχων της, όπως UGT1A1, GSTM1 και NQO1 βρέθηκαν να είναι βαθμιαία ρυθμίζεται προς τα κάτω σε όγκους του προστάτη με την πρόοδο της ογκογένεσης του προστάτη σε ποντίκια TRAMP [10]. Frolich et al. ανέφεραν πρόσφατα την έκφραση της Nrf2 και της οικογένειας γονιδίων GST mu μειώθηκαν σημαντικά σε TRAMP όγκου του προστάτη, και να συνδέεται αυτό το φαινόμενο να αυξημένο οξειδωτικό στρες και τις βλάβες του DNA στον καρκίνο του προστάτη. Μετα-ανάλυση της έκφρασης ιστού προφίλ δεδομένων από Oncomine βάση δεδομένων (www.oncomine.org) πρότεινε ότι οι εκφράσεις του Nrf2 και αρκετά γονίδια GST mu είναι επίσης σταδιακά κάτω-ρυθμίζονται σε ανθρώπινους καρκίνους του προστάτη [11].

Η μεταγραφή του Nrf2 έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι ρυθμίζεται από τον υποδοχέα αρυλ υδρογονάνθρακα (AhR) και το ίδιο Nrf2 [16], [17]. Ωστόσο, η τρέχουσα αποδεκτή πρότυπο της ρύθμισης Nrf2 φαίνεται ότι θα επιτευχθεί κυρίως μέσω μετα-μεταφραστικών μηχανισμών. Ως εκ τούτου, Nrf2 λειτουργικά καταστέλλεται από την Kelch-όπως ερυθροειδών κυττάρων που προέρχεται από πρωτεΐνη με CNC ομολογία (ECH) -Associated Protein 1 (Keap1), η οποία συνδέεται με και διαχωρίζει Nrf2 στο κυτταρόπλασμα που οδηγεί στην υποβάθμιση των Nrf2, και ως εκ τούτου αποτρέπει Nrf2 πυρηνική μετατόπιση και μετενεργοποίησης των γονιδίων στόχων του [18]. Μετά προκλήσεις από την οξειδωτική ή ηλεκτρονιόφιλη καταπονήσεις που θα μπορούσαν να ενέχουν τροποποίηση των κρίσιμων υπολειμμάτων κυστεΐνης σε Keap1 και ή ίδια η Nrf2 σε συνδυασμό με φωσφορυλίωση από κινάσες, Nrf2 απελευθερώνεται από Keap-1, μετατοπίζεται στον πυρήνα, διμερίζεται με μικρές πρωτεΐνες Maf, συνδέεται με ARE και μεταγραφικά ενεργοποιεί Nrf2-ΕΙΝΑΙ γονιδίων στόχων [4]. Μέχρι σήμερα, δεν είναι σαφές ως προς το πώς καταστέλλεται η έκφραση του Nrf2 στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη ή σε ΤΡΑΜΡ όγκου ποντικού.

επιγενετικές ή Γενετικής μηχανισμούς, ιδιαίτερα μεθυλίωσης του DNA, έχουν συχνά εμπλέκονται στις αλλοιώσεις του γονιδίου έκφραση σε καρκίνο του προστάτη [19], [20]. Συντονισμένη υπερμεθυλίωση APC και GSTP1 στις αρχές καρκινογένεση έχει χρησιμοποιηθεί ως πιθανοί διαγνωστικοί δείκτες για την ανίχνευση του καρκίνου του προστάτη [21]. Επιπλέον, αλλοίωση του προφίλ μεθυλίωσης του DNA έχει συνδεθεί με την εξέλιξη του καρκίνου [20]. Μεθυλίωσης του DNA, σε συνδυασμό με τις τροποποιήσεις των ιστονών, θα μπορούσε να επηρεάσει τις αλληλεπιδράσεις των υποκινητών των κρίσιμων γονιδίων με μεταγραφική συγκαταστολείς και συνενεργοποιητές που οδηγούν σε αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση, η οποία θα μπορούσε να είναι μία από τις κινητήριες δυνάμεις για την καρκινογένεση του προστάτη. Αποσιώπηση πολλαπλών γονιδίων με DNA μεθυλίωση έχει αναφερθεί σε όγκους του προστάτη TRAMP και κυτταρικές σειρές που προέρχονται από όγκους του προστάτη TRAMP [22] – [24]. Η αναστολή της δραστικότητας ϋΝΑ μεθυλτρανσφεράση με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα) έχει δειχθεί ότι εμποδίζει την ογκογένεση του προστάτη σε ποντίκια TRAMP [25]. Επιπλέον, η έκφραση του Keap1 έχει αναφερθεί ότι ρυθμίζεται από μεθυλίωση του DNA στον καρκίνο του πνεύμονα [26]. Στην παρούσα μελέτη, αναγνωρίσαμε πρώτα ένα νησί CpG στην ανάντη 5′-πλευρική περιοχή του γονιδίου ποντικού που ακολουθείται από Nrf2 ανάκριση της κατάστασης μεθυλίωσης του DNA ολόκληρου του νησιού CpG μέσω διθειώδες γονιδιωματική αλληλούχιση. Βρήκαμε ότι ορισμένες θέσεις CpG στην απομακρυσμένη περιοχή του νησιού CpG ήταν υπερμεθυλιωμένο στους ιστούς TRAMP όγκων, καθώς και σε ογκογόνα TRAMP-C1-C2 και κύτταρα, αλλά όχι σε φυσιολογικό προστατικό ιστό και μη ογκογόνα κύτταρα TRAMP-C3. Αξιοποιώντας δοκιμασία μετουσιωμένο δημοσιογράφος, χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα δοκιμασία και θεραπείες με τριχοστατίνη Α (TSA) /5-αζα, παρείχαμε πειστικές αποδείξεις ότι η έκφραση της Nrf2 είναι επιγενετικώς ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των όγκων του προστάτη σε ποντίκια TRAMP. Nrf2 έκφραση κατεστάλη με μεθυλίωση ορισμένων χώρων CpG και αυτό συνοδεύτηκε από την πρόσληψη MBD2 και τριμεθυλο-ιστόνης Η3 (Lys9) με το γονίδιο υποκινητή της Nrf2 σε όγκο του προστάτη των ποντικών TRAMP.

Αποτελέσματα

υπερμεθυλίωση ειδικές θέσεις CpG στο νησί CpG σε μυοειδούς Nrf2 Gene

γονιδιωματικής αλληλουχίας του γονιδίου Nrf2 (NC_000068.6: 75544698 έως 75513576 Mus musculus χρωμόσωμα 2, συναρμολόγηση αναφοράς (C57BL /6J), συμπεριλαμβανομένου του 2 kb 5′-ανάντι αλληλουχία της) αναλύθηκε για CpG νησίδα CpG χρησιμοποιώντας Finder νησιού (https://people.usd.edu/~sye/cpgisland/CpGIF.htm). Δεδομένου ότι πολλά mRNA παραλλαγές με διαφορετικές θέσεις έναρξης μεταγραφής (TSS) έχουν αναφερθεί στην βιβλιογραφία [16], [27], [28], επομένως στην παρούσα μελέτη ορίζουμε την θέση έναρξης μετάφρασης (TIS) ως θέση 1 για να αποφευχθεί οποιαδήποτε πιθανή σύγχυση. Ένα νησί CpG εντοπίστηκε μεταξύ -1175 και 1240, με περιεκτικότητα σε GC του 61,53%, CpG παρατηρήθηκε /αναμενόμενη αναλογία 0,66 και ένα σύνολο 150 CpGs. Το νησί CpG περιλαμβάνει τον υποκινητή ποντικού Nrf2, το πρώτο εξόνιο και μέρος του πρώτου ιντρονίου (Σχήμα 1Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν κατά τη χρήση άλλων κριτηρίων και αλγόριθμος (https://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). 10 σύνολα θειώδους γονιδιωματικής αλληλουχίας (BGS) εκκινητές που σχεδιάστηκαν με τη χρήση του web server BiSearch (https://bisearch.enzim.hu/, [29]) για την κάλυψη της 5′-πλευρική περιοχή που εκτείνεται -1226 – 844 του γονίδιο ποντικού Nrf2 (Πίνακας S1). Όξινο θειώδες μετατρέπεται γονιδιωματικό DNA που προέρχεται από 12 ψηλαφητών όγκων του προστάτη 24 εβδομάδων ποντίκια ηλικίας TRAMP και 10 προφανώς φυσιολογικούς ιστούς προστάτη του C57BL /6J ποντικούς χρησιμοποιήθηκαν ως εκμαγεία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, αν και η πλειοψηφία του νησιού CpG είναι μεθυλιωμένα μετά βίας, τα 5 πρώτα CpG θέσεις βρέθηκαν να υπερμεθυλίωση (96%) σε όγκους του προστάτη σε σύγκριση με φαινομενικά φυσιολογικούς ιστούς προστάτη (4%). Αντιπροσωπευτικά χρωματογραφήματα που ακολουθεί που δείχνει τα 5 πρώτα CpGs σε όγκο του προστάτη και φυσιολογικό προστάτη φαίνεται στο Σχήμα S1. Οι ακόλουθες 10 CpGs που χωρίζονται από δύο CpG χωρίς κενά (-1131 έως -1060 και -886 έως -798) εμφανίζεται επίσης απόκλιση κατάσταση μεθυλίωσης σε όγκους (34%) σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς (2%). Επιπλέον, μια άλλη περιοχή που βρίσκεται στο πρώτο ιντρόνιο φαίνεται να είναι αραιά CpG-μεθυλιωμένα σε όγκο του προστάτη (4,5%).

(α) ένα νησί CpG προσδιορίστηκε στην 5′-πλευρική περιοχή του γονιδίου Nrf2 ποντικού , που εκτείνονται από τη θέση -1175 να +1240 με την θέση έναρξης της μετάφρασης ορίζεται ως θέση 1. Οι αλληλουχίες που καλύπτονται από όξινο θειώδες γονιδιωματική αλληλούχιση (-1,226 να 844) και περιέχουν μεθυλιωμένη CpGs είναι σχηματικά παρουσιάζονται με CpG θέσεις υποδεικνύονται με κάθετες γραμμές. (Β) Τα μοτίβα μεθυλίωσης και εκτάσεις των περιοχών CpG στον προαγωγέα του γονιδίου Nrf2 σε όγκο του προστάτη TRAMP και προφανώς φυσιολογικό προστάτη προσδιορίστηκαν με όξινο θειώδες γονιδιωματική αλληλούχιση όπως περιγράφεται στο Υλικά & amp? Μεθόδους. Μαύρες κουκίδες δείχνουν μεθυλιωμένα CpGs και ανοικτοί κύκλοι δείχνουν μη-μεθυλιωμένα CpGs. (C) προσδιορίστηκαν Τα μοτίβα μεθυλίωσης και εκτάσεις των περιοχών CpG στον προαγωγέα του γονιδίου Nrf2 σε TRAMP C1 και C3 κύτταρα. Οι CpGs στην αλληλουχία μεταξύ +296 να +594 δεν εμφανίζονται επειδή μεθυλίωση είναι ασήμαντη.

Η

TRAMP C1, κυτταρικές σειρές C2 και C3 προήλθαν από μία ετερογενή όγκο 32-εβδομάδων TRAMP ποντικού [30 ]. Ενώ TRAMP C1 και C2 κύτταρα είναι ογκογόνο όταν εμβολιάζονται σε συγγενή C57BL /6J οικοδεσπότες, τα κύτταρα TRAMP C3 δεν είναι. Γονιδιωματικό DNA από C1 και C3 κυττάρων ήταν όξινο θειώδες αλληλουχία όπως παραπάνω για την ανίχνευση της κατάστασης μεθυλίωσης του νησιού CpG σε γονιδιακή Nrf2. Απροσδόκητα, οι μεθυλιωμένες CpG «θερμά σημεία», όπως διαπιστώθηκε ανωτέρω στον όγκο TRAMP προστάτη επίσης μεθυλιωμένα σε ογκογόνα C1 κύτταρα αλλά όχι σε μη ογκογόνα κύτταρα TRAMP C3 (Σχήμα 1 C).

μεθυλίωση του πρώτου 5 CpGs κατέστειλε σημαντικά την μεταγραφική δραστικότητα του ποντικιού Nrf2 υποστηρικτής

Για να διερευνηθεί ο λειτουργικός ρόλος της μεθυλίωσης ειδικών θέσεων CpG, ιδιαίτερα στα πρώτα 5 CpGs στο νησί CpG, λουσιφεράση ρεπόρτερ οδηγείται από τον προαγωγό Nrf2 με ή χωρίς το πρώτο 5 CpGs (ορίζεται ως -1367 και -1065, αντίστοιχα) κατασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι (Σχήμα 2Α). Τα πλασμίδια μεθυλιώνεται χρησιμοποιώντας Μ SSSI CpG μεθυλοτρανσφεράση

in vitro

και την κατάσταση μεθυλίωσης επιβεβαιώθηκε με Ηρ /HhaII πέψη (Εικόνα S2). Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, ο υποκινητής -1065 Nrf2, η οποία είχε αναφερθεί προηγουμένως [17], [28], αύξησε σημαντικά τη δραστικότητα της λουσιφεράσης σε περίπου 200 πτυχώσεις. Σε αντίθεση, η Nrf2 υποκινητή -1367 έδειξε μια λιγότερο ισχυρή μεταγραφική δράση (-67 πτυχώσεις). Είναι σημαντικό ότι,

in vitro

CpG-μεθυλίωση του κατασκευάσματος ανταποκριτή οδήγησε σε δραματική μείωση της μεταγραφικής δραστηριότητας του υποκινητή -1367 Nrf2 (μείωση 84%)? ενώ, η δραστικότητα του υποκινητή -1065 μειώθηκε μόνο κατά 23,4% από CpG-μεθυλίωση. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε Hep G2 κύτταρα ηπατώματος και ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα ΗΕΚ 293 (Σχήμα S3).

(Α) Η κατασκευή της λουσιφεράσης δημοσιογράφους παρουσιάζεται σχηματικά. υποκινητές Nrf2 με (-1.367-1) ή χωρίς (-1065 – 1) την επιπλέον αλληλουχία που περιέχει τα 5 πρώτα CpGs ενισχύθηκαν από γονιδιωματικό DNA ποντικού και εισάγεται εντός pGL 4.15 φορέα. Οι προέκυψαν δημοσιογράφοι είχαν οριστεί ως pGL-1367 και pGL-1065, αντίστοιχα. (Β) pGL-1367 ή pGL-1065 ρεπόρτερ, είτε μεθυλιωμένες με CpG μεθυλοτρανσφεράση ή όχι, συν-επιμολύνθηκαν με pGL 4,75 φορέα ο οποίος περιέχει ένα Renilla reniformis γονίδιο λουσιφεράσης οδηγείται από CMV προαγωγό σε κύτταρα TRAMP C1, και μετρήθηκαν οι δραστικότητες λουσιφεράσης μετά από 24 ώρες. Η μεταγραφική δραστηριότητα κάθε κατασκευασμάτων υπολογίστηκαν με κανονικοποίηση των λουσιφεράση πυγολαμπίδας δραστηριότητες με αντίστοιχες δραστηριότητες λουσιφεράσης Renilla, και εκπροσωπούνται ως πτυχώσεις επαγωγής σε σύγκριση με τη δραστικότητα του κενού φορέα pGL 4.15. Οι τιμές είναι μέση τιμή ± SD από τέσσερα ξεχωριστά δείγματα.

Η

υπερμεθυλίωση CpG νησί συνδέθηκε με μεθυλο-CpG-Δεσμευτική τομέα (MBD2) και ιστόνης τροποποιήσεις, η οποία είναι αναστρέψιμη με 5-αζα /TSA Θεραπεία

Η καταστολή της έκφρασης του γονιδίου με CpG μεθυλίωση επιτυγχάνεται γενικά με MBD πρωτεΐνες που δεσμεύονται με DNA μεθυλιωμένο οδηγούν στην πρόσληψη της χρωματίνης αναδιαμόρφωσης και σύμπλοκα μεταγραφικός καταστολέας [31]. Στην παρούσα μελέτη, οι προσδιορισμοί ChIP χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση των πρωτεϊνών που θα μπορούσαν δυνητικά να συνδέεται με Nrf2 προαγωγό σε TRAMP C1 και C3 κύτταρα. Με βάση την κατάσταση μεθυλίωσης του Nrf2 υποκινητή, σύνολα εκκινητών σχεδιάστηκαν για να καλύψουν τις πρώτες 5 CpGs και το TSS για την ανίχνευση της σύνδεσης των ειδικών πρωτεϊνών που δεσμεύονται με DNA, καθώς και RNA πολυμεράση II (ροΙ II). Η ιδιαιτερότητα των δοκιμασιών ChIP ελέγχθηκαν από μη ειδικές IgG η οποία δεν γκρεμίζουν τίποτα. Ως θετικός έλεγχος, β-ακτίνης προαγωγός εξίσου σχετίζεται με ροΙ II στο C1 και C3 (Σχήμα 3Α). Η δέσμευση του Ροΐ II στο γονίδιο Nrf2 TSS μειώθηκε σημαντικά σε κύτταρα C1 σε σύγκριση με τα κύτταρα σε C3, υποδεικνύοντας μία κατέστειλε την μεταγραφή του Nrf2 σε κύτταρα C1 (Σχήμα 3Α & amp? Β). Σε συμφωνία με αυτήν την παρατήρηση, η σύνδεση του MBD2 και τρι-μεθυλιωμένης ιστόνης 3-Lys9, (H3K9me3) στα μεθυλιωμένα CpGs στην Nrf2 υποστηρικτής ήταν υψηλότερη στα κελιά C1 από ό, τι στα κύτταρα C3, ενώ η ένωση των ακετυλιωμένων ιστονών 3 (H3Ac) εμφανίζονται ένα αντιστραφεί μοτίβο (Σχήμα 3Α & amp? Β). πρωτεΐνη μεθυλο CpG πρόσδεσης 2 (MeCP2) και Sin3A θηλαστικών (mSin3A) επίσης εξετάστηκαν για σύνδεση τους με αυτόν τον υποκινητή Nrf2? Ωστόσο καμία ανιχνεύσιμη πρόσδεση παρατηρήθηκε (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). δοκιμασία

(Α) τσιπ για την ανίχνευση της πρόσδεσης του υποδεικνύεται πρωτεϊνών σε συγκεκριμένες περιοχές του γονιδίου Nrf2 σταυροδεσμούς και ανοσοκαταβυθίστηκε από TRAMP C1 και τα κύτταρα C3. Τα αποτελέσματα από 3 ανεξάρτητα πειράματα ποσοτικά με πυκνομετρία όπως φαίνεται στο (Β). κύτταρα (C) TRAMP C1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα, 5-αζα ή 5-αζα + TSA όπως περιγράφεται, τότε τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία chip. Τα αποτελέσματα από 2 ανεξάρτητα πειράματα ποσοτικά με πυκνομετρία όπως φαίνεται στο (D). δοκιμασίες ChIP πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά & amp? Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούν αντισώματα έναντι Pol II, MBD2, H3K9m3 και AcH3. 3 σετ των εκκινητών ChIP χρησιμοποιήθηκαν (Πίνακας S2), με Nrf2P1 καλύπτει τα πρώτα 5 CpGs (-1.190 με -1.092) στο νησί CpG και Nrf2P2 καλύπτει μια περιοχή κοντά στο TSS (-62 – 20). Η μη ειδική IgG χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος και η σύνδεση του Ροΐ II σε β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε για να επαληθευτεί η αποτελεσματικότητα της δοκιμασίας chip. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Η κατάσταση μεθυλίωσης του DNA ρυθμίζεται από DNA μεθυλο-τρανσφεράσες (DNMTs) και 5-αζα είναι ένας αναστολέας DNMT, συχνά χρησιμοποιείται για να εξετάσει την επιδράσεις της μεθυλίωσης του DNA [32]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C & amp? D, 5-αζα επεξεργασία των κυττάρων C1 μειώνει την πρόσδεση του MBD2 και H3K9me3 προς τον προαγωγό Nrf2, ενώ ο H3Ac εμφανίζει κανένα παρατηρήσιμο αποτέλεσμα. Ωστόσο, συνδυασμένη αγωγή C1 κυττάρων με 5-αζα και ενός αναστολέα ιστόνης deactylase (HDAC), TSA, αυξάνει σημαντικά την πρόσδεση του H3Ac με τον υποκινητή Nrf2, και περαιτέρω μειώνει τις δέστρες του MBD2 και H3K9me3 με τον υποκινητή Nrf2. Σε συμφωνία με τα παραπάνω αποτελέσματα, η πρόσληψη του Ροΐ II με τον υποκινητή Nrf2 αυξάνει επίσης αντιστοίχως, ενώ σύνδεση προς β-ακτίνης Pol II δεν άλλαξε (Σχήμα 3C).

Η μεταγραφική επαγωγή της Nrf2 και NQO- 1 σε TRAMP Γραμμές κυττάρων συσχετίστηκε με CpG νησιά μεθυλίωση κατάστασης και θα μπορούσε να αποκατασταθεί με 5-αζα /TSA Θεραπεία

Εμείς και άλλοι έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι η έκφραση της Nrf2 και γονιδίων στόχων του καταστέλλεται σε όγκους του προστάτη TRAMP [10], [11]. Marvis et al., Είχε αναφέρει ότι η έκφραση της οικογένειας γονιδίων GST κατεστάλη στα κύτταρα TRAMP C2 και 5-αζα και θεραπεία TSA θα μπορούσε να αποκαταστήσει την έκφραση [9]. Εδώ εξετάσαμε την έκφραση του Nrf2 και ένα από κατάντη γονιδίων στόχων του NQO1 σε TRAMP C1 και C3 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, το επίπεδο του mRNA του Nrf2 είναι σημαντικά χαμηλότερη στα κύτταρα C1 παρά σε κύτταρα C3. Η έκφραση του NQO1 προκλήθηκε εύκολα από ΤΒΗQ, ένα κλασικό Nrf2 αγωνιστή, σε κύτταρα C3, ενώ τέτοια επαγωγή αμβλύνθηκε στα κύτταρα C1 (Σχήμα 4Α & amp? C). Η επεξεργασία των κυττάρων με C1 5-αζα και TSA συγκρατημένα αποκατασταθεί Nrf2 έκφρασης και ενίσχυσε σημαντικά την επαγωγή του NQO 1 με tBHQ. Ωστόσο, η επεξεργασία των κυττάρων C3 κάτω από τις ίδιες συνθήκες παρουσίασαν καμία επίδραση στην έκφραση του Nrf2 ή NQO1 (Σχήμα 4Α, Β & amp? C). Κηλίδωση Western Διεξήχθη να εξεταστούν τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης του Nrf2, NQO1, MBD2, H3Ac και H3K9me3 (Εικόνα 4D). Τα επίπεδα πρωτεΐνης της Nrf2 και NQO1 ήταν χαμηλότερες σε κύτταρα C1 παρά σε κύτταρα C3, και 5-αζα και θεραπεία TSA αύξησε την επαγωγή του NQO 1 πρωτεΐνης με tBHQ. Αν και 5-αζα και θεραπεία TSA δεν αύξησε το βασικό επίπεδο Nrf2 πρωτεΐνης η θεραπεία αύξησε σημαντικά tBHQ προκαλούμενη έκφραση πρωτεΐνης Nrf2. θεραπεία TSA αύξησε έντονα ακετυλιωμένης ιστόνης 3 πρωτεΐνης, ενώ δεν είχε καμία επίδραση επί της ιστόνης 3 κατάσταση μεθυλίωσης. Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και το επίπεδο πρωτεΐνης του MBD2 δεν επηρεάστηκε από 5-αζα και θεραπεία TSA, ήταν πολύ υψηλότερη σε κύτταρα C1 παρά σε κύτταρα C3 (Εικόνα 4D).

TRAMP C1 και C3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2 μΜ 5-αζα, 200 ηΜ TSA, ή 1 μΜ 5-αζα συν 100 ηΜ TSA για 60 ώρες ή 48 ώρες και ακολούθησε επώαση σε παρουσία 5 μΜ tBHQ για περαιτέρω 12 ώρες. Μετά τις θεραπείες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ολική πρωτεΐνη ή RNA εκχυλίσεις. (Α) τα επίπεδα mRNA του Nrf2 και NQO1 προσδιορίστηκαν με RT-PCR, με GAPDH χρησιμεύει ως εσωτερικός έλεγχος, και τα αποτελέσματα από 3 ανεξάρτητα πειράματα ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία και τα αποτελέσματα φαίνονται στα Β και C. (D) της πρωτεΐνης τα επίπεδα της Nrf2, NQO1, MBD2, H3K9me3 και H3Ac προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western, με ακτίνη ως μάρτυρας φόρτωσης. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Συζήτηση

Προηγούμενα ευρήματα από διάφορα εργαστήρια, συμπεριλαμβανομένων εργαστήριο μας έχουν δείξει ότι η Nrf2 διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο στην ανάπτυξη διαφόρων μορφών καρκίνου [ ,,,0],33]. Nrf2 ρυθμίζει την έκφραση των αντιοξειδωτικών και της φάσης ΙΙ ένζυμα αποτοξίνωσης συμπεριλαμβανομένων NQO 1, ΗΟ-1 και GST [33]. Ως εκ τούτου, ο έλεγχος του μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων Nrf2 και Nrf2-στόχου φαίνεται να είναι ένας σημαντικός ομοιοστατικό μηχανισμό που προστατεύουν την κυτταρική τραυματισμούς ή ζημιές προέκυψαν από το οξειδωτικό στρες [33]. Nrf2 ανεπάρκεια μπορεί να οδηγήσει σε βλάβη στο σύστημα κυτταρικής άμυνας έναντι του οξειδωτικού στρες, με πιθανό αποτέλεσμα την έναρξη του καρκίνου, την προώθηση και την εξέλιξη [34]. Η καταπιεσμένη έκφραση των αντιοξειδωτικών και ένζυμα αποτοξίνωσης όπως GSTP1 σε καρκίνο προστάτη έχει εκτενώς μελετηθεί [2], [5]. Ωστόσο, ο ρόλος του Nrf2 στον καρκίνο του προστάτη δεν έχουν λάβει αρκετή προσοχή μέχρι πρόσφατα [10], [11].

Frolich et al. ανέφεραν ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του Nrf2 φαίνεται να είναι υπεύθυνη για τη μειωμένη έκφραση της GST, αυξημένα οξειδωτικό στρες και τις βλάβες του DNA σε ογκογένεση του προστάτη σε ποντίκια TRAMP [11]. Έχουμε βρει πρόσφατα ότι η έκφραση του Nrf2 καθώς και γονίδια Nrf2-στόχος είναι σταδιακά ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη σε ποντίκια TRAMP [10]. Προηγούμενη ανάλυση των ηλεκτρονικών συνόλων δεδομένων γονιδιακής έκφρασης προστάτη του ανθρώπου έδειξαν ότι η έκφραση του Nrf2 και GST [11], καθώς και NQO1 σταδιακά μειώνονται κατά την ανθρώπινη καρκινογένεση προστάτη (Σχήμα S4). Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι διάφορα γονίδια GST είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω σε πρωτογενείς αλλά όχι σε μεταστατικούς όγκους TRAMP [9]. Στην τρέχουσα μελέτη, βρήκαμε ότι η έκφραση του Nrf2 και η επαγωγή NQO1 επηρεάστηκε σε ογκογόνα κύτταρα TRAMP C1 αλλά όχι σε μη ογκογόνα κύτταρα TRAMP C3 (Σχήμα 4Α). Αυτή η καταστολή της έκφρασης Nrf2 και γονίδιο NQO1 Nrf2-στόχου σε δύο από αυτά τα TRAMP κυτταρικές σειρές θα απέκλειε την πιθανότητα ότι η έκφραση Nrf2 θα επηρεαστούν από το διαγονίδιο SV40, δεδομένου ότι αυτά τα TRAMP κυτταρικές σειρές δεν εκφράζουν την SV40 διαγονίδιο [30].

μεθυλίωσης του DNA έχει ενοχοποιηθεί στη σίγηση του γονιδίου GSTP1 στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη, και παρομοίως DNA-μεθυλίωση αποσιώπηση πολλών άλλων γονιδίων εμπλέκονται επίσης σε καρκινικά TRAMP προστάτη [5], [23], [24]. Ωστόσο, έχει ενδιαφέρον MassARRAY ποσοτικοί μεθυλίωσης του DNA Αναλύσεων (MAQMA) Ανάλυση της περιοχής 5 ‘αρκετών γονιδίων GST εμφανίζονται σημαντικές διαφορές μεταξύ των φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων του προστάτη και του όγκου του προστάτη από τα ποντίκια TRAMP [9]. Πρόσφατα, αρκετές αναφορές δείχνουν ότι τόσο TRAMP και Rb – /- όγκους του προστάτη, μια Rb /E2F-εξαρτώμενη αύξηση της έκφρασης και της δραστηριότητας DNMT1 μεθυλίωση [25], [35]. Η υπερμεθυλίωση προαγωγού Nrf2 αποκλείστηκε χρησιμοποιώντας MSP και ότι η 5-αζα αγωγή δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση Nrf2 (με τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) [11]. Αναλύσαμε την 5’-πλαγιοκοπική περιοχή του γονιδίου Nrf2 και προσδιόρισε CpG νησίδα που εκτείνεται στη θέση -1175 (Σχήμα 1Α). Χρησιμοποιώντας θειώδους αλληλουχίας, η οποία θα είναι πιο συγκεκριμένη για τον εντοπισμό CpG μεθυλίωση και θα αποκαλύψει περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με μεθυλίωση του DNA από MSP, βρήκαμε ότι τα πρώτα 5 CpGs στο νησί CpG υπερμεθυλίωση σε όγκους TRAMP προστάτη και την ογκογόνο TRAMP κύτταρα C1 αλλά όχι σε φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη και μη ογκογόνα κύτταρα TRAMP C3 (Σχήμα 1Β). Αξιοσημείωτα, αυτές οι 5 CpGs που βρίσκεται δίπλα στο προηγουμένως αναφερθεί Nrf2 υποκινητή [17]. Έτσι, η κατάσταση μεθυλίωσης των ειδικών αυτών CpGs φαίνεται να συσχετίζεται με την ογκογονικότητα καθώς και έκφραση Nrf2 και επαγωγή NQO1 (Σχήματα 1 και 4). Αξίζει να σημειωθεί ότι, παρόμοιο μοτίβο ειδικών μεθυλίωσης του περιφερικού CpG νησίδα έχει επίσης παρατηρηθεί στο γονίδιο Keap1 στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα [26]. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι μερικά από τα τρέχοντα ευρήματά μας φαίνεται να είναι κάπως αντιφατική με τα αποτελέσματα που αναφέρθηκαν προηγουμένως [11], ωστόσο τα προηγούμενα ευρήματα της εκτεταμένης κάτω ρύθμιση των Nrf2 και GST κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου του προστάτη σε ποντίκια TRAMP [11], είναι συνεπείς με τρέχοντα αποτελέσματα μας.

Για τον προσδιορισμό του λειτουργικού ρόλου της μεθυλίωσης αυτών των 5 CpGs στην καταστολή της Nrf2 expession, λουσιφεράση ρεπόρτερ του προαγωγού Nrf2 με ή χωρίς αυτά τα 5 CpGs δομήθηκαν (Σχήμα 2Α). Ο υποκινητής Nrf2 διαθέτει πολύ πλούσια σε GC μη κανονικά υποκινητή ο οποίος δεν περιέχει ούτε ΤΑΤΑ κουτί ούτε ένα κουτί CCAAT [28], ωστόσο, αυτό Nrf2-προαγωγός ενεργοποιείται ισχυρώς την μεταγραφή του γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης (Σχήμα 2Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, η προσθήκη αλληλουχιών από -1065 έως -1367 φαίνεται να είναι κατασταλτική στην μεταγραφική δραστικότητα του προαγωγού Nrf2 (Σχήμα 2Β). Τέτοια κατασταλτικά ακολουθία θα μπορούσε να λειτουργήσει με την πρόσληψη ειδικών παραγόντων κατασταλτική [36], αλλά ο ακριβής μηχανισμός που αντιπροσωπεύουν αυτή την κατασταλτική λειτουργία αυτής της αλληλουχίας ακόμη και εν απουσία της μεθυλίωσης θα απαιτούσε περαιτέρω έρευνα. Παρ ‘όλα αυτά, όταν μεθυλιώθηκαν οι ανταποκριτές

in vitro από

CpG μεθυλοτρανσφεράση, η δραστικότητα λουσιφεράσης του υποκινητή Nrf2 με την πρόσθετη αλληλουχία που περιέχει τα 5 CpGs (pGL-1367) μειώθηκε κατά περίπου 84%. Σε αντίθεση, η μεθυλίωση του ανταποκριτή χωρίς την επιπλέον αλληλουχία είχε σαν αποτέλεσμα περίπου 23% μείωση (Σχήμα 2Β). Αυτό πιθανώς οφείλεται στο βαρύ μεθυλίωση του συνόλου κατασκεύασμα που περιλαμβάνει το γονίδιο της λουσιφεράσης (αλλά θα χρειαζόταν περαιτέρω μελέτη για να αποδειχθεί αυτό). Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι τα επιπλέον 5 CpGs (-1.065 να -1,367) θα μπορούσε να παίξει έναν κρίσιμο ρόλο στη μεθυλίωση εξαρτώμενη καταστολή της δραστηριότητας Nrf2 υποκινητή.

Ο ρόλος των CpG μεθυλίωσης στην καταστολή έκφρασης Nrf2 και ενεργοποίηση ήταν δοκιμάζεται με επεξεργασία με 5-αζα σε κύτταρα TRAMP. 5-Αζα έχει προηγουμένως δειχθεί να είναι σε θέση να αποτρέψει την εξέλιξη της νόσου νωρίς, καθυστερεί ανδρογόνου ανεξάρτητη ασθένεια και να βελτιώσει την επιβίωση των ποντικών TRAMP [25], [37]. Επιπλέον, το στάδιο και φαινότυπο ειδικά νησί μεθυλίωση και DNA μεθυλοτρανσφεράση έκφραση CpG έχουν τεκμηριωθεί καλώς κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη σε ποντίκια TRAMP [38], [39]. Αυτά δημοσίευσε τα ευρήματα υποδεικνύουν τη σημασία της χρήσης αυτού του συστήματος TRAMP για να ανακρίνουν τον πιθανό ρόλο των επιγενετικών αλλαγών στην καρκινογένεση του προστάτη. 5-αζα επεξεργασία των κυττάρων TRAMP C1 αυξήθηκαν μέτρια το επίπεδο mRNA του Nrf2, ενώ συνδυασμένες θεραπείες 5-αζα και TSA προκάλεσε μια πιο εμφανή αύξηση του Nrf2 (Σχήμα 4Α). Αυτό το αποτέλεσμα είναι συνεπές με την έκθεση του Mavis et al., Στην οποία συνδυασμένη 5-αζα και TSA θεραπείες ενίσχυσε σημαντικά την έκφραση των γονιδίων GST [9]. Το επίπεδο πρωτεΐνης του Nrf2 σε κύτταρα TRAMP C1 παρέμειναν ανεπηρέαστα από είτε 5-αζα ή 5-αζα θεραπείες /TSA, ωστόσο, η προσθήκη ενός ισχυρού Nrf2-ενεργοποιητής tBHQ θα ενισχύσει τη συσσώρευση Nrf2 πρωτεΐνης (Σχήμα 4Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, η επαγωγή του NQO1 mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης εμφανίζεται μια παρόμοια τάση με εκείνη της πρωτεΐνης Nrf2. Είναι πολύ πιθανό ότι αφού Nrf2 σηματοδότηση ρυθμίζεται κυρίως με μετα-μεταφραστικών μηχανισμών, χωρίς προκλήσεις με Nrf2-ενεργοποιητές όπως ΤΒΗQ, Nrf2 πρωτεΐνης θα ταχέως αναποδογυριστεί από πρωτεοσώματα αποικοδόμηση εξαρτώμενη [18]. Ο ακριβής λόγος ως προς το γιατί tBHQ είναι απαραίτητη για την επαγωγή NQO1 θα απαιτούσε περαιτέρω μελέτη.

Για να οριοθετηθούν περαιτέρω το μοριακό μηχανισμό με τον οποίο η συγκεκριμένη CpG-μεθυλίωση καταστέλλει Nrf2 έκφρασης, πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις chip. Το αποτέλεσμα φανερώνει ότι η πρόσδεση του MBD2 και H3K9m3 στις ειδικές CpGs ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κύτταρα TRAMP C1 παρά σε κύτταρα TRAMP C3 συσχέτιση με το γεγονός ότι οι CpGs ήταν ελάχιστα μεθυλιωμένο σε κύτταρα TRAMP C3 (Σχήμα 3Α). Σε αντίθεση, AcH3 εμφανίζεται ένα αντίθετο πρότυπο πρόσδεσης με την αλληλουχία ίδιο CpGs σε κύτταρα TRAMP C1 σε σύγκριση με τα κύτταρα TRAMP C3, και ομοίως η πρόσδεση του Ροΐ II προς τη θέση έναρξης της μεταγραφής έδειξε παρόμοιο πρότυπο όπως AcH3 (Σχήμα 3Α). Αυτά μεθυλίωση εξαρτώμενη ενώσεις συγκαταστολείς μπορούσε να διαμορφώνεται από την 5-αζα και TSA θεραπείες και τα αποτελέσματά μας (Εικόνα 3Β) συσχετίζεται πολύ καλά με το επίπεδο μεταγραφής του Nrf2 (επίπεδο mRNA) σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4Α). MBD2 έχει αναφερθεί ότι μεσολαβεί επιγενετική αποσιώπηση του 14-3-3σ σε κύτταρα TRAMP C1 και ανθρώπινα κύτταρα LNCaP του προστάτη [24], και έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στη μεταγραφική καταστολή του GSTP1 σε MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού [40] . MBD2 και άλλες πρωτεΐνες MBD δεσμεύονται σε μεθυλιωμένες CpGs και να προσλάβει συγκαταστολέας συμπλοκών τα οποία περιέχουν HDACs, χρωματίνη αναδιαμόρφωση πρωτεΐνες καθώς και άλλες πρωτεΐνες που οδηγεί στην καταστολή της έκφρασης των γονιδίων υπερμεθυλιωμένων [31]. Είναι ενδιαφέρον ότι, το επίπεδο της πρωτεΐνης των MBD2 ήταν πολύ υψηλότερο σε κύτταρα TRAMP C1 ό, τι σε TRAMP C3 κύτταρα (Σχήμα 4Α), γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή κοινή MBD2 μεσολάβηση επιγενετική καταστολή Nrf2 σε κύτταρα TRAMP C1. Αντίθετα, το επίπεδο της πρωτεΐνης της AcH3 ήταν προφανώς χαμηλότερη σε κύτταρα TRAMP C1 παρά σε κύτταρα TRAMP C3 αλλά αυξήθηκε δραματικά με κατεργασία TSA (Εικόνα 4D). Δεδομένου ότι η έκφραση του MBD2 θα εξαρτώνται από δραστηριότητες HDAC, παραπάνω αποτελέσματα μας θα μπορούσε να εξηγήσει δυνητικά την απαίτηση των αναστολέων HDAC για να ρυθμίζουν αποτελεσματικά συγκαταστολείς δέσμευσης και να αποκατασταθεί στο μέγιστο την επανέκφραση του Nrf2 καθώς και επαγωγή της NQO1 σε κύτταρα TRAMP C1. Επιπλέον, όταν αυτή η αλληλουχία κατασταλτικός περιέχει τα επιπλέον 5 CpGs αναλύθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας τον μεταγραφικό στοιχεία του συστήματος αναζήτησης (TESS, https://www.cbil.upenn.edu/tess) με βάση τη βάση δεδομένων TRANSFAC V6.0, αρκετές παράγοντα μεταγραφής θέσεις σύνδεσης ταυτοποιήθηκαν, συμπεριλαμβανομένων των θέσεων δέσμευσης του E2F1-ρ107 και NF-Ε2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).