Abstract

Ιστορικό

εκκρινόμενη πρωτεΐνη όξινο και πλούσια σε κυστεΐνη (SPARC), ένα δέσμευσης ασβεστίου matricellular γλυκοπρωτεΐνη, εμπλέκεται στην πρόοδο πολλών καρκίνων. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την έκφραση και τη λειτουργία των SPARC στον καρκίνο των ωοθηκών.

Μέθοδοι

ανάλυση cDNA μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε για σύγκριση της έκφρασης των γονιδίων του εξαιρετικά επεμβατικές και τα χαμηλά επεμβατική υποκλώνων που προέρχονται από η ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών SKOV3. Ανοσοϊστοχημεία χρώσης (IHC) διεξήχθη για να διερευνηθεί η έκφραση SPARC σε ένα σύνολο 140 δειγμάτων ωοθηκικού ιστού. Σε λειτουργικές δοκιμασίες, διερευνήθηκαν επιδράσεις της SPARC knockdown για την βιολογική συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Οι μηχανισμοί της SPARC στον πολλαπλασιασμό του καρκίνου των ωοθηκών, την απόπτωση και την εισβολή ήταν επίσης ερευνηθεί.

Αποτελέσματα

SPARC ήταν υπερεκφράζεται σε ιδιαίτερα επεμβατική υποκλώνο σε σύγκριση με το χαμηλό επεμβατική υποκλώνο. έκφραση υψηλού SPARC συσχετίστηκε με υψηλό στάδιο, χαμηλής διαφοροποίησης, μετάσταση λεμφαδένα και κακή πρόγνωση του καρκίνου των ωοθηκών. Knockdown έκφρασης SPARC κατέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, την επαγωγή απόπτωσης και ανέστειλε την εισβολή κυττάρων και τη μετάσταση.

Συμπέρασμα

SPARC υπερεκφράζεται σε μεγάλο βαθμό επεμβατικές υποκλώνο και τους ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη καρκίνου των ωοθηκών, την απόπτωση και μετάσταση

Παράθεση:. Chen J, Wang Μ, Xi Β, Xue J, Ο D, Zhang J, et al. (2012) SPARC αποτελεί βασικό ρυθμιστή της διάδοσης των πυρηνικών όπλων, η απόπτωση και εισβολή στο ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 7 (8): e42413. doi: 10.1371 /journal.pone.0042413

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 του Μαρ 2012? Αποδεκτές: 5 Ιουλ 2012? Δημοσιεύθηκε: 3, Αυγούστου, 2012

Copyright: © Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση-in-ενίσχυση για την επιστημονική έρευνα (2012TS088) από το Πανεπιστήμιο Shandong. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η δεύτερη πιο κοινή γυναικολογικό καρκίνο και μια από τις κύριες αιτίες των θανάτων από καρκίνο στις γυναίκες [1]. Υψηλό ποσοστό των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών διαγιγνώσκονται σε προχωρημένο στάδιο. Παρά το γεγονός ότι έχουν σημαντική πρόοδος στην έρευνα για τον καρκίνο των ωοθηκών, την επιβίωση σε αναλογία επίπτωση εξακολουθεί να είναι κακή και το συνολικό ποσοστό θεραπείας παραμένει πολύ χαμηλό [2]. Όγκου υποτροπής και μετάσταση θεωρούνται οι κυριότεροι λόγοι για την κακή κλινική έκβαση και των θανάτων από καρκίνο [3]. Ως εκ τούτου, μελέτη του μηχανισμού της εισβολής των όγκων και της μετάστασης θα παράσχει περαιτέρω γνώσεις σχετικά με την ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών.

SPARC (εκκρινόμενη πρωτεΐνη όξινο και πλούσια σε κυστεΐνη), που ονομάζεται επίσης οστεονεκτίνη, BM-40, και 43 Κ πρωτεΐνη, είναι μια δέσμευσης ασβεστίου matricellular γλυκοπρωτεΐνη, της οποίας η λειτουργία είναι να ρυθμίζει τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-μήτρας και τη λειτουργία των κυττάρων χωρίς να συμμετέχουν στη δομική ικρίωμα της εξωκυττάριας ουσίας [4]. Αν και υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις για ένα σημαντικό ρόλο για SPARC σε μία ποικιλία καρκίνων, δεν υπάρχει ενωτική μοντέλο, το οποίο εξηγεί όλες τις πτυχές της λειτουργίας και η συμβολή του στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του [5]. SPARC εκφράζεται διαφορικά σε όγκους και γύρω στρώμα του σε διάφορους καρκίνους σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό. Για παράδειγμα, έχουν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης SPARC έχουν αναφερθεί στον καρκίνο του μαστού [6], [7], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [8], [9], του καρκίνου του προστάτη [10], ορθοκολικό καρκίνο [11], [12], και των ωοθηκών καρκίνος [13], [14]. Ωστόσο, μια αντίθετη συσχέτιση έχει επίσης καταδειχθεί, υποδηλώνοντας ότι SPARC μπορεί να είναι σε θέση να αναστέλλουν ογκογένεση ή την πρόοδον όγκου στον καρκίνο του μαστού [15], [16], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [17], του καρκίνου του προστάτη [18], ορθοκολικό καρκίνο [19] , [20], και τον καρκίνο των ωοθηκών [21]. Ως εκ τούτου, η λειτουργία του SPARC σε βάσιμο καρκίνο περαιτέρω έρευνα.

Στην παρούσα μελέτη, εκτελέσαμε ανάλυση cDNA μικροσυστοιχιών για τη διερεύνηση του προφίλ διαφορική γονιδιακή έκφραση του άκρως διεισδυτική υποκλώνο S1 και η χαμηλή επεμβατική υποκλώνος S21, και τα δύο τα οποία προέρχονται από την ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών SKOV3. Βρήκαμε ότι πολλά γονίδια διαφορικά εκφραζόμενα σε αυτούς τους δύο τύπους υποκλώνων. Ιδιαιτέρως, SPARC βρέθηκε να υπερεκφράζεται σημαντικά στην ιδιαίτερα επεμβατική υποκλώνο S1 σε σύγκριση με εκείνη στο χαμηλό επεμβατική υποκλώνο S21. Για να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ SPARC και εξέλιξης του καρκίνου των ωοθηκών, οι εκφράσεις του SPARC σε δείγματα ανθρώπινου ωοθηκικού ιστού μετρήθηκαν με ανοσοϊστοχημεία (IHC). Στην δοκιμασία λειτουργία, με φακοϊό μεσολάβηση παρεμβολή RNA, εμείς μείωσε την έκφραση της SPARC σε ιδιαίτερα επεμβατική υποκλώνο S1 και HO8910PM να προσδιοριστεί η επίδραση της SPARC επί των ωοθηκών πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων, την απόπτωση, την εισβολή και τη μετάσταση.

Υλικά και μέθοδοι

τηλέφωνα γραμμές

SKOV3, ΝΙΗ3Τ3 και HO8910PM (μια ιδιαίτερα μεταστατική κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών [22]) κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από τη Σαγκάη Ινστιτούτο Βιολογικών Επιστημών, κινεζική Ακαδημία Επιστημών. Η ιδιαίτερα επεμβατική υποκλώνος (S1) και το χαμηλό επεμβατική υποκλώνος (S21) προήλθαν από την καρκινική κυτταρική σειρά SKOV3 του ανθρώπου ωοθήκης [23]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 για SKOV3 ή DMEM για ΝΙΗ3Τ3 και HO8910PM συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και αντιβιοτικά (Gibco BRL, Rockville, MD).

Η

Microarray Analysis

Ολικό RNA εξήχθη από το εξαιρετικά επεμβατικές υποκλώνος (S1) και το χαμηλό επεμβατική υποκλώνος (S21) χρησιμοποιώντας RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε με φασματοφωτομετρία και μετουσιωτική ηλεκτροφόρηση γέλης. RNA ενισχύθηκε και σημαίνονται με τη χρήση Agilent Γρήγορη Amp κιτ επισήμανσης και υβριδοποιήθηκε σε Agilent ολόκληρο το γονιδίωμα ολιγο μικροσυστοιχιών. Διαφάνειες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας Agilent DNA scanner μικροσυστοιχιών. Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας Agilent Feature Extraction λογισμικού (έκδοση 10.5.1.1) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Agilent GeneSpring GX (έκδοση 11.0). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Tissue Δείγματα

δείγματα ιστού ελήφθησαν με τη γραπτή συγκατάθεση από 80 γυναίκες με επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (με 29 ορώδης κυσταδενοκαρκίνωμα, 25 βλεννώδες κυσταδενοκαρκίνωμα και 26 ενδομητριοειδές καρκίνωμα ), από 35 γυναίκες με καλοήθεις όγκους των ωοθηκών, και από 25 φυσιολογικό ωοθηκικό ιστό ελέγχου στο Τμήμα Γυναικολογίας και Μαιευτικής, Shandong Επαρχιακό Νοσοκομείο μεταξύ 2005 και 2007. Όλα τα ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών ήταν κλινικά οργάνωσε σύμφωνα με το σύστημα σταδιοποίησης ΦΥΓΩ [με 38 χαμηλή όγκους σταδίου (ΦΥΓΩ στάδια Ι και ΙΙ) και 42 όγκους υψηλής στάδιο (ΦΥΓΩ στάδια ΙΙΙ και IV)]. Κανένας από τους ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών έλαβαν προεγχειρητική ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Θεσμική υγειονομική επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Shandong.

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Σύμφωνα με το πρότυπο στρεπταβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης πολύπλοκες διαδικασίες, IHC διεξήχθη σε φορμόλη σταθερό, παραφίνη -embedded τομές (πάχους 5 μm) και πλακίδια κυττάρων μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη. Εν συντομία, μετά την αποκήρωση, ενυδάτωση, και την ανάκτηση του αντιγόνου, οι τομές επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-ανθρώπινης SPARC (AF941, R &? D Systems και BS-1133R, BIOSs) με αραίωση 15 μg /ml για AF941 και 10 μg /ml για την εργασία BS-1133R στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Το δευτερεύον αντίσωμα ήταν συζευγμένη με υπεροξειδάση κοχλιαρίας IgG αντι-κατσίκας για AF941 και IgG αντι-κουνελιού για BS-1133R. Ένας αρνητικός μάρτυρας ελήφθη με αντικατάσταση του πρωτογενούς αντισώματος με φυσιολογική ανοσοσφαιρίνη κουνελιού (IgG). Θετική έκφραση της SPARC πρωτεΐνη ορίστηκε ως η παρουσία της καφέ κόκκους στο κυτόπλασμα ή στρώμα.

(Α) Διάγραμμα διασποράς εμφαίνον τιμές πολλαπλή μεταβολή έναντι Ρ-τιμές για την οπτικοποίηση διαφορική έκφραση μεταξύ της υψηλής και χαμηλής επεμβατικές επεμβατική κλώνους. Οι κάθετες γραμμές αντιπροσωπεύουν 1,5 φορές πάνω και προς τα κάτω ρύθμιση, αντίστοιχα. Η οριζόντια γραμμή αντιπροσωπεύει ένα P-τιμή των 0,05. Τα κόκκινα σημεία στο οικόπεδο αντιπροσωπεύουν τις διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων με στατιστική σημασία. (B, C, D) έκφραση SPARC, όπως μετράται με κηλίδα Western (Β), q-RT-PCR (C), και ανοσοϊστοχημεία (D) (Μεγέθυνση χ 200). * P & lt?. 0.05

Η

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC) Ανάλυση

Μια ημιποσοτική σύστημα βαθμολόγησης που βασίζεται στην ένταση της χρώσης και την κατανομή των θετικών κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της έκφρασης SPARC [24]. Η ένταση της SPARC θετική χρώση κυμαίνεται από 0 έως 3 (αρνητικό = 0, αδύναμη = 1, μέτρια = 2, ή ισχυρά = 3) και του ποσοστού των θετικά χρωματισμένων κυττάρων βαθμολογήθηκε ως 0 (0%), 1 (1 έως 25 %), 2 (26 έως 50%), 3 (51 και 75%) και 4 (76 έως 100%). Το άθροισμα της έντασης και ποσοστό βαθμολογίας χρησιμοποιήθηκε ως το τελικό σκορ χρώσης (0 έως 7). Οι άθροισμα-δείκτες (-), (+), (++), και (+++) έδειξε τελικό σκορ χρώση των 0, 1-3, 4-5, και 6-7, αντίστοιχα. Για στατιστική ανάλυση, άθροισμα-δείκτες (-) και (+) ορίστηκαν ως χαμηλή έκφραση SPARC, ενώ άθροισμα-δείκτες (++) και (+++) ορίσθηκαν ως υψηλή έκφραση SPARC. Κάθε τμήμα ήταν ανεξάρτητα σκόραρε από δύο παθολόγους. Αν συμβεί μια ασυνέπεια, ζητήθηκε η γνώμη του ενός τρίτου παθολόγος για την επίτευξη συναίνεσης.

Το πεπτίδιο δοκιμασίας αναστολής

Για να ελεγχθεί η ειδικότητα των αντι-SPARC, το αντίσωμα επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη SPARC (941-SP, R &? D Systems). Ανοσοϊστοχημεία στη συνέχεια διεξήχθη όπως περιγράφεται παραπάνω, αλλά το αποκλεισμένο αντι-SPARC χρησιμοποιήθηκε ως κύριο αντίσωμα.

(Α) Φυσιολογικό ανθρώπινο ωοθηκικό ιστό χρησιμοποιώντας AF941 αντίσωμα, (Β) καλοήθης όγκος ωοθηκών χρησιμοποιώντας AF941 αντίσωμα, (Γ) Υψηλή διαφοροποίηση καρκινώματος ωοθηκών χρησιμοποιώντας AF941 αντίσωμα, (Δ) μέσο διαφοροποίησης του καρκινώματος ωοθηκών χρησιμοποιώντας AF941 αντίσωμα, (Ε) Χαμηλή διαφοροποίηση καρκινώματος ωοθηκών χρησιμοποιώντας AF941 αντίσωμα, (F) Κανονική ανθρώπινο ιστό ωοθήκης χρησιμοποιώντας BS-1133R αντίσωμα, (G) Καλοήθης ωοθηκών όγκου BS-1133R με τη χρήση αντισωμάτων, (H) υψηλής διαφοροποίησης του καρκίνου των ωοθηκών χρησιμοποιώντας BS-1133R αντισώματος, (Ι) Μεσαία διαφοροποίηση του καρκινώματος των ωοθηκών χρησιμοποιώντας BS-1133R αντισώματος, (J) Χαμηλή διαφοροποίηση των ωοθηκών καρκίνωμα χρήση αντισώματος BS-1133R ( μεγέθυνση χ 200). Μαύρα βέλη δείχνουν κυτταρόπλασμα χρώση, κόκκινα βέλη δείχνουν στρώμα βάφονται.

Η

πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR (Q-RT-PCR)

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ ( Invitrogen) και να αντιστραφεί μεταγραφή. Ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ΑΒΙ PRISM 7500 πραγματικού χρόνου PCR System (Applied Biosystems). Κάθε φρεάτιο (20 μΙ όγκου αντιδράσεως) περιείχε 10 μΐ Ισχύς SYBR Green PCR κύριο μείγμα (Applied Biosystems), 1 μΙ από κάθε αρχικό τεμάχιο (5 μmol /l) και 1 μΙ προτύπου cDNA (50 ng /μl). Οι εκκινητές (Πίνακας 1) σχεδιάστηκαν από εκκινητή 5 λογισμικό και συντέθηκαν από την Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd

Western Blot

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA που περιέχει 1 mM PMSF. Πενήντα μικρογραμμάρια πρωτεΐνης ανά λωρίδα επιλύθηκε με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF και αποκλείστηκαν με 5% BSA. Οι μεμβράνες επωάστηκαν πρώτα με πρωτογενές αντίσωμα έναντι SPARC, PCNA, κυκλίνη D1, ρ53, Ρ21, Βαχ και Bcl-2 σε 1:1000 αραιώσεις τη διάρκεια της νύχτας, και στη συνέχεια επωάστηκαν με χρένο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αντι-κατσίκας ή αντι-ποντικού IgG για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, οι κηλίδες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ECL. ένταση της ζώνης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Gel-Pro Analyzer λογισμικό (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD).

παρεμβολή RNA

Αυτο-αδρανοποίηση φορέας λεντοϊού (GeneChem, Σαγκάη, Κίνα) που περιέχουν CMV με γνώμονα αναφοράς GFP και έναν υποκινητή U6 ανοδικά των θέσεων κλωνοποίησης (Age Ι και EcoR Ι) χρησιμοποιήθηκε για την κλωνοποίηση μικρών RNAs φουρκέτα (τα siRNAs). Η αλληλουχία στόχος για την αρχιτεκτονική SPARC ήταν 5′- AACAAGACCTTCGACTCTTCC-3 ‘? η αρνητική ακολουθία ελέγχου ήταν 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘. Οι εξαιρετικά μεταστατικών κυττάρων υποκλώνος (S1 και HO8910PM) καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας ιστών έξι φρεατίων και μολύνθηκαν με φακοϊό σε μια πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 100 για 24 ώρες. Στη συνέχεια, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​πλήρες μέσο. Μετά από 4 ημέρες, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού για να επιβεβαιωθεί ότι περισσότερο από το 80% των κυττάρων ήταν GFP-θετικά.

Η

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Δοκιμασίες

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με χρησιμοποιώντας δοκιμασία ΜΤΤ και το αγκυροβόλιο ανεξάρτητη δοκιμασία σχηματισμού αποικίας μαλακού άγαρ. Για τη δοκιμασία ΜΤΤ, 20 μΐ ΜΤΤ (5 mg /ml σε PBS) προστέθηκε απευθείας σε κάθε φρεάτιο της πλάκας 96-φρεατίων και επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 ώρες. Στη συνέχεια τα μέσα απομακρύνθηκαν και 200 ​​μΐ DMSO προστέθηκαν για να διαλυθεί κρύσταλλοι φορμαζάνης. Η οπτική πυκνότητα στα 570 nm αναγνώστηκε με έναν αναγνώστη μικροπλακών (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Για προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού agar, 500 μΙ 2 χ DMEM συμπληρωμένο με 20% FBS αναμίχθηκε με 500 μΐ 1.2 % Sea Plague άγαρ και στερεοποιούνται σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 24 φρεατίων για να σχηματίσει στρώμα άγαρ βάσης. Για άνω στρώμα άγαρ, 25 μl κυττάρων (5 × 10

3 /ml) αναμίχθηκαν με 500 μΙ 2 χ DMEM και 500 μΐ 0,7% Sea Plague άγαρ και προστέθηκε στην κορυφή του στρώματος βάσης άγαρ. Μετά καλλιεργούνται για 14 ημέρες, σχηματισμό αποικίας παρακολουθήθηκε κάτω από μικροσκόπιο. Ένα σύμπλεγμα δέκα κυττάρων ή περισσότερα ορίστηκε ως αποικία.

αννεξίνης V-ΡΙ Δοκιμασίες για απόπτωση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με PBS, αιωρήθηκαν σε 200 μL ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης και 10 μL Annexin V-FITC για 20 λεπτά στο σκοτάδι, και ρυθμιστικό διάλυμα εν συνεχεία, δεσμευτική 300 μL και ιωδιούχο προπίδιο 5 μL (ΡΙ) προστέθηκαν σε κάθε δείγμα. Τα αποπτωτικά κύτταρα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson) με CellQuest (Becton Dickinson) λογισμικού.

Ανάλυση Κύκλου Κυττάρου

Distribution

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με παγωμένο PBS, και χρωματίστηκαν με 50 μg /mL ΡΙ και 250 μg /mL RNase για 30 λεπτά. Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με έναν υπολογιστή προγραμματισμένο ModFit LT2.0 DNA δοκιμασία (Becton Dickinson) χρησιμοποιώντας ένα κυτταρομετρητή ροής.

Κυττάρου Δοκιμασία εισβολή και Μετανάστευση Δοκιμασία

δοκιμασία εισβολή πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Κάθε φρεατίων (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ) επικαλύφθηκε με 50 μΙ 1:03 αραίωση Matrigel (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ). Τα κύτταρα (0.2 × 10

6) επαναιωρήθηκαν σε 200 μΙ μέσου χωρίς ορό και σπείρονται εντός του άνω θαλάμου. Προσαρμοσμένα μέσα καλλιέργειας κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 διηθήθηκε και προστέθηκε στον κάτω θάλαμο ως χημειοτακτικός παράγοντας. Μετά από 12 ώρες, η μη εισβάλλοντα κύτταρα που παραμένουν στην άνω επιφάνεια απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε), και μετρήθηκαν. δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων πραγματοποιήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας Transwells χωρίς επικάλυψη Matrigel. Κάθε πείραμα διεξήχθη τουλάχιστον εις τριπλούν. Εισβάλλοντας και τους αριθμούς κυτταρική μετανάστευση των θαλάμων Boyden μετρήθηκαν και τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SE.

(Α) Φυσιολογικό ανθρώπινο ωοθηκικό ιστό, (Β) καλοήθης όγκος ωοθηκών, (C) Υψηλή διαφοροποίηση των ωοθηκών καρκίνωμα, (Δ) μέσο διαφοροποίησης του καρκινώματος ωοθήκης, (Ε) Χαμηλή διαφοροποίηση καρκινώματος ωοθήκης (Μεγέθυνση χ 200). (F) ανάλυση Kaplan-Meier για τη συνολική επιβίωση των ασθενών των οποίων οι όγκοι είχαν υψηλή ή χαμηλή έκφραση SPARC.

Η

Ξενομοσχεύματα όγκου σε άτριχα ποντίκια

BALB /C-nu /nu 5 εβδομάδων παλιά γυναικεία γυμνά ποντίκια αγοράστηκαν από το Εθνικό Κέντρο Πληροφόρησης για τρωκτικών Εργαστήριο ζώων της Κίνας. Πέντε γυμνοί ποντικοί εγχύθηκαν υποδορίως με 5.0 × 10

6 κύτταρα και δέκα γυμνούς ποντικούς εγχύθηκαν μέσω της ουράς φλέβες με τα ίδια κύτταρα μία φορά την εβδομάδα για 3 συνεχόμενες εβδομάδες. Οι ποντικοί διατηρήθηκαν σε αποστειρωμένο εγκατάσταση ζώων και παρακολουθήθηκαν για ανάπτυξη όγκου. Οι όγκοι των όγκων παρακολουθήθηκαν στους υποδεικνυόμενους χρόνους και υπολογίζεται σύμφωνα με τον τύπο: 0.5 × μήκος × πλάτος

2. Μετά από 3 μήνες, τα ποντίκια θανατώθηκαν και ο όγκος και ο πνεύμονας αποκόπηκαν και εξετάστηκαν ιστολογικά. Παραφίνη τμήματα των ιστών του πνεύμονα έγιναν, χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) και παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο. Οι μέσες τιμές εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SE. Αυτό το πείραμα ζώων εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Πανεπιστημίου Shandong και ήταν σε συμμόρφωση με όλες τις κανονιστικές οδηγίες.

(Α) έκφραση της πρωτεΐνης SPARC στα κύτταρα φακοϊό μολυσμένα, όπως μετράται με κηλίδα Western. (Β) έκφραση SPARC mRNA σε φακοϊό κύτταρα μολυσμένα όπως μετράται με Q-RT-PCR. έκφραση της πρωτεΐνης (C) SPARC σε κύτταρα μολυσμένα με φακοϊό όπως μετρήθηκε με χρώση IHC (Μεγέθυνση χ 200). * P & lt?. 0,05 έναντι ελέγχου

Η

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Τα κύτταρα σε λογαριθμική φάση συλλέχθηκαν και ρυθμίστηκαν σε πυκνότητα 1~5 × 10

6 /ml με PBS , και στη συνέχεια χρωματίζονται με 20 μΙ ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), συζευγμένης μονοκλωνικά αντισώματα για 30 λεπτά στους 25 ° C. Όλα τα αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων αντι-ιντεγκρίνης β1, αντι-ιντεγκρίνης β3 και αντι-Ε-καδερίνης αγοράσθηκαν από BD Biosciences Pharmingen (San Jose, CA, USA). Τέλος, τα χρωματισμένα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του προγράμματος WinMDI. Η δοκιμή εκτελέστηκε εις τετραπλούν.

Δοκιμασία ΜΜΡ Δραστηριότητα με ζυμογραφία

Η δοκιμασία δραστικότητας μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας διεξήχθη σε 10% SDS-PAGE πηκτή που περιέχει 0,1 mg /ml ζελατίνη. 20 μg δείγμα πρωτεΐνης φορτώθηκε σε κάθε λωρίδα του SDS-PAGE γέλη. Μετά την ηλεκτροφόρηση, η πηκτή πλύθηκε δύο φορές με 2,5% Triton Χ-100 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου για να απομακρυνθεί SDS και επωάζονται στους 37 ° C για όλη τη νύχτα σε ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης (50 mmo1 /L Tris-HCl ρΗ 7.4, 8.775 g NaCl και 1.ll g CaCl

2). Μετά από χρώση με Coomassie λαμπρό μπλε, ΜΜΡ δραστηριότητα αναγνωρίστηκε ως σαφή ζώνες κατά γαλάζιο φόντο.

Στατιστική Ανάλυση

δεδομένα IHC αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ chi-square. Τα αποτελέσματα των κυττάρων και τα δεδομένα μοριακής βιολογίας εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SE. Για τη σύγκριση των μέσων μεταξύ δύο ομάδων, δύο tailed t-test χρησιμοποιήθηκε και τη σύγκριση των μέσων μεταξύ των τριών ομάδων, μονόδρομη ΑΝΟνΑ χρησιμοποιήθηκαν. καμπύλη επιβίωσης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και τη δοκιμασία log-rank. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του λογισμικού SPSS έκδοση 13.0. P-value & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων στον Εξαιρετικά Επεμβατική υποκλώνος S1 και χαμηλής Επεμβατική υποκλώνος S21

Για να ανακαλύψετε νέες βιοδείκτες για την επεμβατική. καρκίνο των ωοθηκών, εκτελέσαμε ανάλυση μικροσυστοιχιών για τον προσδιορισμό του προφίλ διαφορική γονιδιακή έκφραση του άκρως διεισδυτική υποκλώνο S1 και χαμηλής επεμβατική υποκλώνος S21. Αυτές οι δύο υποκλώνοι που προέρχεται από το πατρικό ανθρώπινου καρκίνου κυτταρική γραμμή ωοθηκών SKOV3 και είχε παρόμοια γενετικά υπόβαθρα? Ως εκ τούτου, είναι κατάλληλα για συγκριτική ανάλυση. Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το εκχωρημένο δείκτη έκφρασης cut-off 1,5 φορές αλλαγή και

P

-τιμές ≤0.05. Οι αναλύσεις που προσδιορίζονται 1596 διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια (Πίνακας S1 και Σχήμα 1Α). Μεταξύ αυτών των γονιδίων, SPARC ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα στην ιδιαίτερα επεμβατική υποκλώνο σύγκριση με τη χαμηλή επεμβατική υποκλώνο (13.8 φορές,

P

= 0,023). Σε πραγματικό χρόνο Q-RT-PCR, στύπωμα Western και τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την IHC υπερέκφραση της SPARC στην εξαιρετικά διεισδυτική υποκλώνο (Σχήμα 1BCD).

(Α) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, όπως εξετάζεται με ανάλυση ΜΤΤ. ανεξάρτητη ανάπτυξη (Β) Anchorage όπως μετρήθηκε με προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού agar. (Γ) κατανομές κυτταρικού κύκλου όπως μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. (D) απόπτωσης των κυττάρων όπως μετράται με δοκιμασίες V-ΡΙ Annexin. (Ε) Η μετανάστευση των κυττάρων και προσδιορισμού εισβολή χρησιμοποιώντας θαλάμους Boyden. * P & lt?. 0,05 έναντι ελέγχου

Η

Εκφράσεις του SPARC σε ιστούς του Ανθρώπου των ωοθηκών

Χρησιμοποιώντας δύο δύο αντι-SPARC αντισώματος σε φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών, εκφράσεις SPARC ήταν χαμηλό και κυρίως επικεντρώθηκε γύρω από το αγγειώσεις στο στρώμα (Σχήμα 2Α και 2F), και καλοήθεις όγκους των ωοθηκών, η έκφραση SPARC ήταν επίσης χαμηλή και εστιάζεται κυρίως όχι μόνο στο στρώμα, αλλά και στο κύτταρο του όγκου κυτόπλασμα (Σχήμα 2Β και 2G), τελικά στα περισσότερα καρκινώματα ωοθηκών, η ανοσοαντιδραστικότητα ήταν υψηλή, και η έκφραση υψηλού SPARC βρέθηκε όχι μόνον σε στρώμα, αλλά και στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών (Εικόνα 2CDE και 2HIJ). Επιπλέον, η υψηλή έκφραση SPARC συσχετίστηκε με χαμηλή διαφοροποίηση, υψηλή στάδιο και θετική κατάσταση λεμφαδένων των ωοθηκικών καρκινωμάτων (Πίνακας 2 και 3). Τα αποτελέσματα των πειραμάτων αποκλεισμού πεπτιδίου κατέδειξε την ειδικότητα του πρωτογενούς αντισώματος (Σχήμα 3ABCDE). Για να αξιολογηθεί η προγνωστική αξία της SPARC στον καρκίνο των ωοθηκών, πραγματοποιήσαμε ανάλυση επιβίωσης χρησιμοποιώντας ανάλυση Kaplan-Meier. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι οι ασθενείς με υψηλή έκφραση SPARC είχε μια πολύ χειρότερη πρόγνωση από εκείνους με χαμηλή έκφραση SPARC (log rank,

σ

= 0,004? Σχήμα 3F).

(Α) Φωτογραφία ξενομοσχευμάτων αποκόπηκαν από γυμνά ποντίκια μετά από 3 μήνες υποδόριο εμβολιασμό (n = 5). (Β) εξόντωση SPARC ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου in vivo. (C) έκφραση SPARC στον όγκο που σχηματίζεται από τα μολυσμένα κύτταρα SPARC shRNA όπως μετράται με χρώση IHC (Μεγέθυνση χ 200). (D) έκφραση SPARC στον όγκο που σχηματίζεται από τα μολυσμένα κύτταρα ελέγχου shRNA όπως μετράται με χρώση IHC (Μεγέθυνση χ 200). (Ε) Η φωτογραφία της μετάστασης πνεύμονα κάτω από ένα μικροσκόπιο μετά από 3 μήνες εμβολιασμό μέσω φλέβας της ουράς (η = 10). * P & lt?. 0,05 έναντι ελέγχου

Η

Νοκ ντάουν του SPARC Έκφραση από φακοϊό μεσολάβηση παρεμβολή RNA

Για να διερευνήσουν το ρόλο της SPARC στον καρκίνο των ωοθηκών, κατασκευάσαμε φορέας λεντοϊού με SPARC shRNA και μολυνθεί τα ιδιαίτερα επεμβατική κύτταρα υποκλώνο (S1 και HO8910PM). Τα παρόμοια δεδομένα επιτεύχθηκαν στο S1 και HO8910PM κύτταρα μετά από λοιμώξεις από τον ιό SPARC shRNA. Μετά ιογενής λοίμωξη, περισσότερο από το 80% των κυττάρων ήταν GFP-θετικά, υποδεικνύοντας μία υψηλή αποτελεσματικότητα της διανομής shRNA. Σε πραγματικό χρόνο Q-RT-PCR, Western Blot και IHC επιβεβαίωσε την προς τα κάτω ρύθμιση των SPARC εκφράσεις με shRNA του και στα δύο επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4.

(Α) Οι κατάντη γονιδίων στόχων του SPARC, όπως μετράται με την Q-RT-PCR. (Β) Ρ53, Ρ21, κυκλίνη D1, PCNA, Bcl-2 και την έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα Bax φακοϊό μολυσμένα όπως μετράται με κηλίδα Western. έκφραση της πρωτεΐνης (C) E-cardherin σε κύτταρα μολυσμένα με φακοϊό όπως μετρήθηκε με χρώση IHC (Μεγέθυνση χ 200). (D) MMPs δραστηριότητες μετρήθηκε με ζυμογραφία. * P & lt? 0,05 έναντι ελέγχου

Η

Νοκ ντάουν του SPARC Έκφραση Καταστολής κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών διάδοσης

Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση της SPARC νοκ ντάουν στον πολλαπλασιασμό των ιδιαίτερα μεταστατικών κυττάρων υποκλώνο (. S1 και HO8910PM). αποτελέσματα ΜΤΤ έδειξαν ότι SPARC knockdown μείωσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων των S1 και κυττάρων HO8910PM (Σχήμα 5Α). Σε προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού agar, S1 και HO8910PM κύτταρα μολυσμένα με τον ιό SPARC shRNA έδειξαν σημαντική μείωση στον σχηματισμό αποικίας (Σχήμα 5Β). Δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ του ελέγχου του ιού shRNA κύτταρα μολυσμένα και μη μολυσμένα κύτταρα.

Νοκ ντάουν του SPARC η επαγωγή της έκφρασης του κυτταρικού κύκλου σύλληψης στο G1 /G0 φάση

Για να κατανοήσουμε το μηχανισμό με τον οποίο το πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών ανεστάλη από knockdown έκφρασης SPARC, χρησιμοποιήσαμε κυτταρομετρία ροής για τον προσδιορισμό των συγκεκριμένων φάσεων του κυτταρικού κύκλου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C, S1 και τα κύτταρα μολύνθηκαν με HO8910PM SPARC shRNA περιείχαν 20~30% περισσότερα κύτταρα στη φάση G1 ή G0 (G1 /G0) (

P

& lt? 0,05) σε σύγκριση με τον έλεγχο shRNA μολυνθεί κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι knockdown έκφρασης SPARC ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών αναστέλλοντας την εξέλιξη τους από την φάση G1 /Ο0 στη φάση S κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου.

Η

εξόντωση SPARC Έκφρασης Induced καρκίνο των ωοθηκών κυτταρικής απόπτωσης

Όπως φαίνεται στο σχήμα 5D, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων που έχουν μολυνθεί με SPARC shRNA ήταν πολύ υψηλότερη από ότι στην ομάδα ελέγχου shRNA (Ρ & lt? 0,05). Δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ του ελέγχου του ιού shRNA κύτταρα μολυσμένα και μη-μολυσμένα κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι νοκ ντάουν της έκφρασης SPARC απόπτωση που επάγεται καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

Νοκ ντάουν του SPARC Έκφραση κύτταρα που αναστέλλονται καρκίνου των ωοθηκών Μετανάστευση και την εισβολή

Εξετάσαμε περαιτέρω την επίδραση της SPARC νοκ ντάουν για τη μετανάστευση και την εισβολή των υψηλά μεταστατικών κυττάρων υποκλώνος (S1 και HO8910PM). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Ε, knockdown του SPARC ανέστειλε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα εισβολή και τη μετανάστευση. Τα παρόμοια δεδομένα επιτεύχθηκαν στο S1 και HO8910PM κύτταρα μετά από λοιμώξεις από τον ιό SPARC shRNA. Η μέση εισβολή ή μεταναστεύουν αριθμός των κυττάρων των μολυσμένων κυττάρων SPARC shRNA ήταν πολύ μικρότερη από εκείνη των μολυσμένων κυττάρων ελέγχου shRNA. Δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ των μολυσμένων κυττάρων ελέγχου shRNA και μη-μολυσμένα κύτταρα.

εξόντωση SPARC Έκφρασης ανέστειλε την ανάπτυξη όγκων και μετάσταση στους πνεύμονες σε γυμνούς ποντικούς

σχηματισμός όγκου εκτελέστηκε σε S1 υποκλώνο μολυνθεί από ιός SPARC shRNA σε άτριχα ποντίκια. Τα κύτταρα εμβολιάστηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς και η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε μετά από 3 μήνες. Όπως φαίνεται στο σχήμα 6Α και Β, knockdown του SPARC έδειξε μία μείωση στο μέγεθος των όγκων συγκρίνουν με τον ομόλογό του ελέγχου της. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των μολυσμένων κυττάρων ελέγχου shRNA και μη μολυσμένα κύτταρα στον σχηματισμό όγκου γυμνών ποντικών. Οι όγκοι ανατμήθηκαν, στερεωμένο με φορμαλίνη και εγκλείστηκαν με παραφίνη, τότε τα πειράματα IHC έγιναν, ο όγκος που σχηματίζεται από τα μολυσμένα κύτταρα SPARC shRNA έδειξε χαμηλότερη έκφραση SPARC (Σχήμα 6C), ενώ ο όγκος που σχηματίζεται από τα μολυσμένα κύτταρα ελέγχου shRNA έδειξαν υψηλότερη έκφραση SPARC ( Σχήμα 6D). Επιπλέον, το Σχήμα 6Ε δείχνει την μετάσταση πνεύμονα κάτω από ένα μικροσκόπιο μετά από έγχυση ελέγχου μολυσμένων κυττάρων shRNA και μη μολυσμένα κύτταρα μέσω των φλεβών της ουράς γυμνών ποντικών. Περίπου το 50% της μεταστάσεως του πνεύμονα αποτελέσματα μετά από 3 μήνες στους γυμνούς ποντικούς εγχύθηκαν με μολυσμένα κύτταρα ελέγχου shRNA και μη μολυσμένα κύτταρα, ενώ δεν μετάσταση πνεύμονα βρέθηκε μετά την ένεση με τα μολυσμένα κύτταρα SPARC shRNA σε γυμνά ποντίκια.

Η κατάντη γονιδίων στόχων της SPARC στην Επηρεάζουν τον καρκίνο των ωοθηκών πολλαπλασιασμό των κυττάρων, απόπτωση και εισβολή

για να κατανοήσουμε το μηχανισμό της SPARC στη ωοθηκών πολλαπλασιασμό του καρκίνου, την απόπτωση και την εισβολή, πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των διαφορετικών εκφράσεων Ε-καδερίνης, β-κατενίνης, άλφα-κατενίνη, β3 ιντεγρίνη, β1 ιντεγκρίνη, ILK, ΡΑΚ, Ρ53, Ρ21, κυκλίνη D1, PCNA, Bcl-2, Βαχ, υ-ΡΑ, uPAR, ΡΑΙ-1, ΜΜΡ2, ΜΜΡ9, TIMP1 και Timp2 μεταξύ SPARC shRNA μολυσμένα κύτταρα υποκλώνο S1 και ελέγχου shRNA μολυσμένα κύτταρα υποκλώνο S1. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 7Α, η κυκλίνη D1, PCNA, Bcl-2, ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω σε μολυσμένα κύτταρα SPARC shRNA. Εκτός αυτού, τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης της Ε-καδερίνης, Ρ53, Ρ21 και Bax βρέθηκε σε κύτταρα μολυσμένα SPARC shRNA. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στις εκφράσεις του β-κατενίνης, α-κατενίνης, Ιντεγκρίνης β3, Ιντεγκρίνης β1, ILK, FAK, υ-ΡΑ, ΡΑΙ-1, uPAR, TIMP1 και Timp2 μεταξύ μολυσμένων κυττάρων SPARC shRNA και ελέγχου μολυσμένα κύτταρα shRNA . Τα αποτελέσματα της κυτταρομετρίας ροής ανάλυση (Πίνακας 4) και στύπωμα Western (Σχήμα 7Β) επιβεβαίωσε ότι Ε-καδερίνης Ρ53, Ρ21 και Bax ρυθμίστηκαν προς τα πάνω και Κυκλίνη D1, PCNA και Bcl-2 ρυθμισμένα προς τα κάτω σε μολυσμένα κύτταρα SPARC shRNA. Πειράματα IHC αποκάλυψε ότι η έκφραση της Ε-καδερίνης αυξηθεί στην cytomembrane μολυσμένων κυττάρων SPARC shRNA (Σχήμα 7C). αποτελέσματα ζυμογραφία έδειξε ότι οι δραστηριότητες MMPs ήταν σημαντικά μειωμένη σε SPARC shRNA μολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 7D).

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιώντας γονιδιώματος σε επίπεδο μεταγραφικού προφίλ, εντοπίσαμε ότι SPARC ήταν υπερεκφράζεται στην ιδιαίτερα επεμβατική SKOV3 υποκλώνο σύγκριση με το χαμηλό επεμβατική υποκλώνο. Περαιτέρω ανάλυση της έκφρασης SPARC σε 140 ανθρώπινους ιστούς των ωοθηκών αποκάλυψε ότι SPARC ήταν υπερεκφράζεται σε κακοήθεις όγκους των ωοθηκών και σχετίζονται με την κακή κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι SPARC μπορεί να παίξει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών. Με το αντίσωμα ΑΟΝ-5031, παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε 8 κανονική ωοθηκών ιστούς και 24 ανθρώπινης διηθητικού καρκίνου των ωοθηκών [13], και 14 φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών και 48 καρκίνους των ωοθηκών [14]. Όλοι διαπίστωσαν ότι SPARC ήταν ρυθμισμένη σε αντιδραστικά στρώμα που συνδέεται με διηθητικό καρκίνο των ωοθηκών. Στη μελέτη μας, με το αντίσωμα AF941 και BS-1133R, βρήκαμε ότι η ανοσοαντιδραστικότητα του SPARC ήταν αυξημένη όχι μόνο στην στρώμα αλλά επίσης και στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Σε αντίθεση, με την LF-54 αντίσωμα, μια άλλη μελέτη έδειξε ότι η έκφραση SPARC ρυθμίζεται προς τα κάτω στον καρκίνο των ωοθηκών? εξωγενή SPARC ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [21]. Αλλά στη μελέτη μας, από φακοϊό μεσολάβηση παρεμβολή RNA, βρήκαμε ότι knockdown έκφρασης SPARC κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, που προκαλείται από την κυτταρική απόπτωση, και ανέστειλε την εισβολή κυττάρων και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν επίσης σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα [26], κύτταρα γλοιώματος [27] και τα κύτταρα μελανώματος [28], με παρεμβολή RNA. Στην έρευνά μας βρήκαμε ότι SPARC όχι μόνον εκκρίνονται από το στρώμα, αλλά και εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και μπορεί να ασκήσει σημαντική ενδοκυτταρική επιδράσεις επί αυτών των κυττάρων. Νοκ ντάουν του SPARC μπορεί να εμποδίσει την ανάπτυξη καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων και εισβολή. Βρήκαμε ότι SPARC διαχέεται από το στρώμα για τα πεδία του καρκίνου. Σε αυτή τη διαδικασία, SPARC μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην προώθηση της εισβολής και της μετάστασης του καρκίνου των ωοθηκών. Τα αντιφατικά αποτελέσματα σχετικά με την έκφραση SPARC στη ωοθηκών ιστούς μπορεί να οφείλεται στα διαφορετικά αντισώματα SPARC που χρησιμοποιούνται σε αυτές τις έρευνες. Εν κατακλείδι, οι λειτουργίες του SPARC στον καρκίνο των ωοθηκών χρειάζονται περαιτέρω μελέτες.

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιώντας δοκιμασία ΜΤΤ και προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού άγαρ, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι νοκ ντάουν του SPARC κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Κυτταρόμετρο ροής έδειξε ότι knockdown του SPARC μείωσε τον αριθμό των κυττάρων σε S-φάση, ενώ η αύξηση του αριθμού των κυττάρων σε G1 /Ο0-φάση, υποδεικνύοντας G1 /Ο0 σύλληψης. Για να κατανοήσουμε το μηχανισμό της SPARC στον πολλαπλασιασμό του καρκίνου των ωοθηκών, εντοπίσαμε τις διαφορετικές εκφράσεις της κυκλίνης D1, PCNA, Ρ53 και Ρ21 μεταξύ των μολυσμένων κυττάρων SPARC shRNA και ελέγχου μολυσμένα κύτταρα shRNA.

Η κυκλίνη D1, μέλος της κυκλίνες G1 , και PCNA (πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων) συνήθως χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων [29], [30]. Ρ53, ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο, και Ρ21 (αναστολέας κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη), κύριος μεσολαβητής της ρ53, μπορεί να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G1 σημείο ελέγχου-S [31], [32].