Αφηρημένο

Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι ένα από τα σημαντικότερα κακοηθειών σε όλο τον κόσμο και σχετίζεται με κακή πρόγνωση λόγω των υψηλών περιστατικά μετάστασης και επανεμφάνισης του όγκου. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι η υπερέκφραση του p21-ενεργοποιημένης πρωτεΐνης κινάση 1 (ΡΑΚ1) συχνά παρατηρείται σε HCC και συνδέεται με μια πιο επιθετική συμπεριφορά όγκου, γεγονός που υποδηλώνει ότι ΡΑΚ1 είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος σε HCC. Στην παρούσα μελέτη, ένας μικρός αλλοστερικό αναστολέα μόριο ΡΑΚ1, ΙΡΑ-3, αξιολογήθηκε για το δυναμικό στην καταστολή ηπατοκαρκινογένεσης. Συνεπής με άλλες εκθέσεις, η αναστολή της ΡΑΚ1 δράση παρατηρήθηκε σε αρκετές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές HCC σε αγωγή με διάφορες δόσεις του ΙΡΑ-3. Χρησιμοποιώντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, σχηματισμό αποικιών και προσδιορισμούς ενσωμάτωσης BrdU, αποδείξαμε ότι ΙΡΑ-3 θεραπεία ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων HCC. Οι μηχανισμοί μέσω των οποίων ΙΡΑ-3 θεραπεία καταστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων HCC είναι ενίσχυση της απόπτωσης και παρεμπόδιση της ενεργοποίησης του NF-κΒ. Επιπλέον, τα δεδομένα μας πρότειναν ότι ΙΡΑ-3 δεν αναστέλλει μόνο την ανάπτυξη των κυττάρων HCC, αλλά επίσης καταστέλλει την μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων HCC. Γυμνό δοκιμασία ξενομοσχεύματος ποντικού έδειξαν ότι ΙΡΑ-3 θεραπεία μείωσε σημαντικά το ρυθμό ανάπτυξης του όγκου και μείωση του όγκου του όγκου, υποδεικνύοντας ότι ΙΡΑ-3 μπορεί να καταστείλει την

in vivo

ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων HCC. Στο σύνολό τους, επίδειξη μας των δυνατοτήτων προκλινική αποτελεσματικότητα του ΙΡΑ-3 στο HCC παρέχει τη λογική για τη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Wong LL-Υ, Lam IP-Υ, Wong TY-Ν, Lai WL, Λιου HF, Yeung LL, et al. (2013) ΙΡΑ-3 αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του ήπατος με την καταστολή ΡΑΚ1 και NF-κΒ ενεργοποίησης. PLoS ONE 8 (7): e68843. doi: 10.1371 /journal.pone.0068843

Επιμέλεια: Ρατζίβ Samant, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Φεβρουαρίου 2013? Αποδεκτές: 3 Ιούνη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 19, Ιουλίου 2013

Copyright: © 2013 Wong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ταμείο Χονγκ Κονγκ Έρευνας για τον έλεγχο των Λοιμώξεων (Νο 09080782) και το Ερευνητικό Grant Συμβούλιο του Χονγκ Κονγκ (HKU 7 /CRF /09), το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ (Small Χρηματοδότηση έργου 201109176021 σε LLY Wong και YP Ching). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Δρ. Yick-Pang Ching είναι ένα Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Δεδομένου ότι η έκτη πιο συχνή κακοήθης όγκος και η τρίτη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο σε όλο τον κόσμο, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι υπεύθυνη για περισσότερους από ένα εκατομμύριο θανάτους ετησίως [1]. HCC σχετίζεται με κακή πρόγνωση λόγω της υψηλής περιστατικά υποτροπής του όγκου και των μεταστάσεων [2]. Εκτομή ήπατος είναι μία από τις σημαντικότερες θεραπείες επί του παρόντος, αλλά παραμένει μη ικανοποιητική λόγω των υψηλών ποσοστών υποτροπής [3]. Ως εκ τούτου, απαιτείται η ανάπτυξη νέων θεραπευτικών σχημάτων για την HCC.

Η υπερέκφραση του p21-ενεργοποιημένη κινάση 1 (ΡΑΚ1) είναι συχνή σε HCC [4]. Είναι ένα καθοδικός τελεστής του μικρού Rho ΟΤΡάσης, συμπεριλαμβανομένων Rac1 και Cdc42, η οποία ρυθμίζει διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, την κυτταρική κινητικότητα, την κυτταρική πολικότητα και την απόπτωση [5]. Η ενεργοποιημένη Rho ΟΤΡάσης δεσμεύεται με ΡΑΚδ επί της συνδέσεως (CRIB) περιοχή Cdc42 /Rac διαδραστικό, προκαλώντας την ανακούφιση του autoinhibitory τομέα (AID), μετέπειτα αυτοφωσφορυλίωση της ενεργοποίησης καταλυτικής περιοχής και κινάσης [6]. Μεταξύ των πολλαπλές θέσεις αυτοφωσφορυλίωσης, θρεονίνη-423 (T423) είναι ιδιαίτερα σημαντική για την εξουδετέρωση αυτο-αναστολή και τη διατήρηση της πλήρους ενεργοποιημένη κατάσταση [7].

ΙΡΑ-3 (2,2′- διυδροξυ-1,1 ‘ dinaphthyldisuifide) είναι ένας εξαιρετικά εκλεκτικός, μη ανταγωνιστικός της ΑΤΡ αναστολέας αλλοστερική του ΡΑΚ1 οποίων η υπερκινητικότητα έχει δειχθεί ότι σχετίζεται στενά με την ογκογένεση [8]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η ΙΡΑ-3 εμπόδισε Cdc42-επαγόμενη αυτοφωσφορυλίωση ΡΑΚ1 επί T423 και αναστέλλεται σημαντικά ΡΑΚ1 καταλυτική δραστηριότητα [8], [9]. Η ανασταλτική δράση του ΙΡΑ-3 επιτυγχάνεται εν μέρει με σύνδεση ομοιοπολικά στο ρυθμιστικό πεδίο του ΡΑΚ1 οποία με τη σειρά εμπόδισε τη φυσική αλληλεπίδραση με Cdc42 ή άλλους ενεργοποιητές ΟΤΡάσης [9]. ΙΡΑ-3-στόχευση ρυθμιστικό πεδίο που είναι λιγότερο συντηρημένη εντός κινάσες, έτσι προσδίδει αξιοσημείωτα υψηλή εκλεκτικότητα σε αυτού του αναστολέα [8].

In vitro

μελέτες έδειξαν ότι η ΙΡΑ-3 θεραπεία οδήγησε σε παρόμοια αποτελέσματα, όπως siRNA αποσιώπηση ΡΑΚ1, στην οποία ΙΡΑ-3 μπλοκάρει συγκεκριμένα την μεταφορά μεμβράνη του WAVE2 και σχηματισμού ελασματοπόδια σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού [10], και ανέστειλε την ενδοκυτταρική πρόσληψη της ανθρώπινης ορότυπου αδενοϊού 35 σε διάφορες κυτταρικές σειρές [11]. Ωστόσο, η επίδραση του ΙΡΑ-3 στη θεραπευτική αγωγή του ανθρώπινου HCC είναι ακόμη πλήρως κατανοητό. Σε αυτή τη μελέτη, με στόχο να διερευνήσει τις δυνατότητες του ΙΡΑ-3 στην καταστολή του πολλαπλασιασμού και της μεταστάσεως των ανθρώπινων κυττάρων HCC μέσα από μια σειρά από

in vitro

και

in vivo

πειράματα. Δείξαμε ότι η αγωγή των ΙΡΑ-3 είχε σημαντικό αντίκτυπο στην απόπτωση, τον πολλαπλασιασμό και την κινητικότητα των κυττάρων HCC. Επιπλέον, ΙΡΑ-3 ήταν σε θέση να καταστείλει την

in vivo

ανάπτυξης όγκου σε γυμνούς ξενομοσχεύματα ποντικών. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα μας παρέχει υποστηρικτικές αποδείξεις για την πιθανή εφαρμογή του ΜΠΒ-3 στη διαχείριση ογκογένεση και τη μετάσταση του HCC.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά

2,2′- διυδροξυ-1,1′-dinaphthyldisuifide (ΙΡΑ-3) συντέθηκε και παρέχονται από το Δρ LL Yeung στο Χονγκ Κονγκ Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας. Η δομή του ΙΡΑ-3 επιβεβαιώθηκε με ανάλυση φασματομετρίας μάζας. Στοκ διάλυμα ΙΡΑ-3 (100 mM) πρόσφατα παρασκευασμένο σε DMSO. Άλλες χημικές ουσίες, εκτός εάν αναφέρεται ρητά ήταν από Sigma-Aldrich στην υψηλότερη ποιότητα.

Cell Culture

Ανθρώπινα κύτταρα HCC H2M, H2P και το ανθρώπινο μη ογκογόνων, απαθανάτισε γραμμή του ήπατος ΜΙΧΑ ήταν από τον Dr. XY Guan, Τμήμα Κλινικής Ογκολογίας, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Pokfulam, το Χονγκ Κονγκ [12]. MHCC97L και MHCC97H κύτταρα από ήπατος Ινστιτούτο Καρκίνου, Πανεπιστήμιο Fudan, Σαγκάη, Κίνα [13]. HepG2 και Hep3B κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC). SMMC-7721 και Bel-7402 ήταν δώρα από τη Σαγκάη Ινστιτούτο Βιοχημείας και Κυτταρικής Βιολογίας, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο Eagle ελάχιστο βασικό μέσο Dulbecco (DMEM) με υψηλή γλυκόζη συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορρό εμβρύου βοός (FBS), 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο και 100 U πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 θερμοκοιτίδα.

ΜΤΤ Δοκιμασία

Τέσσερις χιλιάδες κύτταρα Η2Μ ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και επωάζονται σε κανονική κατάσταση για 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις ΙΡΑ-3 για 1, και 2 ημέρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μΙ 5 mg /ml του (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) () διάλυμα Invitrogen για 4 ώρες στους 37 ° C μέχρι κρύσταλλοι ήταν που σχηματίζεται. διάλυμα ΜΤΤ απομακρύνθηκε από κάθε φρεάτιο και 100 μΐ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι. ένταση χρώματος μετρήθηκε με Microplate Reader (Bio-Rad) στα 570 nm. κάθε πείραμα αποτελούνταν από τέσσερις επαναλήψεις και τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν.

δοκιμασία Κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Η μέθοδος για την δοκιμασία πολλαπλασιασμού περιγράφηκε προηγουμένως [4]. Η καλύτερη προσαρμογή της καμπύλης ανάπτυξης και χρόνος διπλασιασμού υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 5 (GraphPad Software , Inc., San Diego, CA). Εν συντομία, H2M (1 × 10

4), H2P (1 × 10

4), HepG2 (2 × 10

4), MHCC97L (1 × 10

4) ή ΜΙΧΑ (2 χ 10

4) κύτταρα επιστρώθηκαν επί πλακών 6-φρεατίων που περιέχουν πλήρες μέσο κατά την Ημέρα 0. είτε ελέγχου οχήματος (DMSO) ή ΙΡΑ-3 (5 ή 10 μΜ) προστέθηκε σε το μέσο για την Ημέρα 1. Media με ή χωρίς ΙΡΑ-3 ανανεώνονται την Ημέρα 3 και 5. στο τριπλούν, τα κύτταρα trypsinzed και μετρήθηκαν με μετρητή κυττάρων την ημέρα 3, 4, 6 και 7 για την κατασκευή της καμπύλης ανάπτυξης.

αποικίας δοκιμασία σχηματισμού

Η δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [14]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 200 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων που περιέχουν πλήρες DMEM την Ημέρα 0. DMSO ή ΙΡΑ-3 (5 ή 10 μΜ) χορηγήθηκε στα μέσα ενημέρωσης, τα οποία ανανεώνονται δύο φορές την εβδομάδα. Την Ημέρα 14, οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με 3,7% φορμαλδεΰδη για 15 λεπτά και χρωματίστηκαν με 1% crystal violet πριν την ποσοτικοποίηση.

ενσωματώσεως BrdU

Η δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [15]. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με τη μέτρηση της ενσωμάτωσης BrdU κατά τη διάρκεια της σύνθεσης του DNA με κυτταρικού πολλαπλασιασμού ELISA, κιτ BrdU Colorimetric (Roche Diagnostics). Η δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με το εγχειρίδιο του κατασκευαστή. Εν συντομία, ίσο αριθμό κυττάρων Η2Μ, H2P Ο Miha, HepG2 ή MHCC97L απλώθηκε σε πλάκες 96 φρεατίων και άνευ ορού όλη τη νύκτα. ασιτία ορού συγχρονισμό κύκλου κυττάρου που διεγείρεται έτσι ώστε τα περισσότερα από τα κύτταρα παραμείνουν στο G1 /S μετάβαση λίγο πριν από την έναρξη της S φάσης. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με DMSO ή διάφορες συγκεντρώσεις του ΙΡΑ-3 (10 και 20 μΜ) για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από την αναπλήρωση και BrdU επισήμανση FBS για 2, 4 ή 8 ωρών. Το σήμα επισήμανση BrdU ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της σχετικής απορρόφησης (Abs

370 nm-Abs

492 nm). Κάθε δοκιμασία έγινε εις τριπλούν. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές ανεξάρτητα.

προσδιορισμός χρώσης αννεξίνης V-7ADD

Ανίχνευση αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το ΡΕ αννεξίνης V Apoptosis Detection Kit Ι (BD Pharmingen). Στο τριπλούν, τα κύτταρα Η2Μ απλώθηκαν σε τρυβλίο 60 mm, άνευ ορού επί μία νύκτα και έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή ΙΡΑ-3 (10 ή 20 μΜ) σε μέσο που περιέχει ορό επί 24 ώρες. Πλωτή κύτταρα πλύθηκαν μακριά, ενώ τα προσκολλημένα κύτταρα υπέστησαν κατεργασία τρυψίνης, ξεπλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης. Μετά από χρώση με αννεξίνη V-ΡΕ και 7-AAD, τα δείγματα αναλύθηκαν αμέσως με κυτταρομετρία ροής. Διέγερση: 488 nm (αννεξίνη V-ΡΕ και 7-AAD). Εκπομπής: 578 nm (αννεξίνη V-ΡΕ), 675 nm (7-AAD). Τα κύτταρα μετρήθηκαν ανά δείγμα και τα δεδομένα αναλύθηκαν με WinMDI (Έκδοση 2.8, Τζο Trotter).

Ομοεστιακή Μικροσκοπίας

Μετά από φαρμακευτική αγωγή, H2M ή H2P κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά, πλύθηκαν και κατέστησαν διαπερατά με 0,2% Triton Χ-100 σε PBS για 15 λεπτά [4], [15]. Τα πλακίδια χρωματίστηκαν με ΤΚΙΤΟφαλλοειδίνη (Invitrogen) για 10 λεπτά και απεικόνισης ανοσοφθορισμού συλλήφθηκε σε μια Carl Zeiss LSM700 μικροσκόπιο σάρωσης συνεστιακού λέιζερ.

Transwell Δοκιμασία Μετανάστευσης

δοκιμασία μετανάστευσης Transwell εκτελέστηκε όπως περιγράφεται προηγουμένως [4]. Εν συντομία, Η2Μ (1 × 10

5) κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό στο άνω διαμέρισμα και ορό μέσο συμπληρώνεται προστέθηκε στο κάτω διαμέρισμα του θαλάμου Transwell (Corning). Με την παρουσία ή απουσία ΙΡΑ-3 (10 μΜ), τα κύτταρα στερούνται ορού αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 3,7% φορμαλδεΰδη, βάφονται με 1% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκοπικό πεδίο στην μεγέθυνση του 40Χ. Τρία διαφορετικά πεδία επελέγησαν τυχαία για κάθε ένθετο.

Ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-PCR (qRT-PCR)

Ο ορός-πεινασμένο κύτταρα H2M υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ή χωρίς ΙΡΑ-3 προεπεξεργασίας (10 ή 20 μΜ, 15 λεπτά) που ακολουθείται από ΤΝΡ-α (10 ή 20 ng /ml, 24 ώρες), FBS αναπλήρωση και ολονύκτια καλλιέργεια. qRT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4]. Εν συντομία, ολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ολικό RNA μεταγράφηκε ανάστροφα σε cDNA πρώτου κλώνου χρησιμοποιώντας PrimeScript RT κιτ αντιδραστηρίου (Takara, Ιαπωνία). Σε πραγματικό χρόνο qPCR διεξήχθη με τη χρήση του συστήματος SYBR® Πράσινο Real Time (Takara, Ιαπωνία) σε ένα μου IQTM2 Real-Time Σύστημα Ανίχνευσης PCR (Bio-Rad). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος και επέτρεψε κανονικοποίηση των δειγμάτων. Οι αλληλουχίες DNA των εκκινητών PCR που παρατίθενται στον Πίνακα S1. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Western Blotting Ανάλυση

εκχύλιση πρωτεϊνών και κηλίδωση Western διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4], [15]. Ανοσοαποτύπωση έγινε για ΡΑΚ1, P-ΡΑΚ1 (T423), PARP1, παξιλλίνη, P-παξιλλίνη (S178), SAPK /JNK, P-SAPK /JNK (T183 /Y185), διασπασμένη κασπάση 3 (Cell Signaling Technology), ΝΡ κΒ (Santa Cruz Biotechnology) και β-ακτίνης (Sigma-Aldrich) που ακολουθείται από αντίστοιχη υπεροξειδάσης (HRP) συζευγμένου δευτερεύοντα αντισώματα (GE Healthcare). Σήματα στοχευμένων πρωτεϊνών ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη Chemiluminsence (GE Healthcare). Εντάσεις των ζωνών πρωτεΐνης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Adobe Photoshop CS4.

Nude Mouse Ξενομοσχεύματος

κύτταρα MHCC97L (1 × 10

6) ενέθηκαν υποδορίως στην δεξιά πλευρά της 4-εβδομάδων αρσενικό γυμνό ποντίκι. Το μέγεθος του όγκου υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4]. Ποντίκια με όγκους του μέσου μεγέθους των 100 mm

3 ομαδοποιήθηκαν σε ομάδες θεραπείας. Ένα σύνολο 15 ποντικών χρησιμοποιήθηκαν και διαιρέθηκαν σε τρεις ομάδες (5 ποντικοί ανά ομάδα): Έλεγχος (DMSO), ΙΡΑ-3 (2 mg /kg) και ΙΡΑ-3 (4 mg /kg). ΙΡΑ-3 παρασκευάστηκε σε DMSO και χορηγείται τρεις φορές την εβδομάδα (TIW) (2 mg /kg ή 4 mg /kg) με ενδοπεριτοναϊκή ένεση (ί.ρ.) κατά τη διάρκεια της μελέτης και το μέγεθος του όγκου καταγράφηκε δύο φορές την εβδομάδα. Οι μελέτες σε ζώα είχαν εγκριθεί συγκεκριμένα από Ζώων (Έλεγχος Πειραμάτων) Νόμου Κεφάλαιο 340, το Υπουργείο Υγείας, το Χονγκ Κονγκ, Ειδική Διοικητική Περιφέρεια (Ref .: (11-786) σε DH /HA & amp? P /8 /3.2 Pt. 33).

Στατιστική Ανάλυση

τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Του Student

t-test

χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση, και τα δεδομένα από περισσότερες από δύο ομάδες αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) εις GraphPad Prism 6 ακολουθούμενη από δοκιμή Dunnett. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντικά όταν

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

ΙΡΑ-3 αναστέλλει τη δραστηριότητα της ΡΑΚ1

κύτταρα HCC έχει αποδειχθεί ότι έχουν ένα υψηλό επίπεδο ενδογενούς ΡΑΚ1, ιδίως στις ιδιαίτερα μεταστατικές κυτταρικές γραμμές HCC [4], όπως Η2Μ, αλλά όχι και στο μη ογκογόνα, αθανατοποιημένα κύτταρα ήπατος, Ο Miha (Εικ. 1Α). Για να διερευνηθεί η επίδραση της ΙΡΑ-3 σχετικά με την ανάπτυξη των κυττάρων του Η2Μ, ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη. ΜΤΤ δοκιμασία έδειξε ότι ΙΡΑ-3 κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε Η2Μ χρόνου και δοσο-εξαρτώμενο τρόπους (Εικ. 1Β). Η ημιμέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) του ΙΡΑ-3 σε κύτταρα Η2Μ ήταν περίπου 28 μΜ και 21 μΜ την ημέρα 1 και 2, αντίστοιχα. Για να επιβεβαιωθεί η ανασταλτική επίδραση του ΙΡΑ-3 επί ΡΑΚ1 δραστηριότητα, τα κύτταρα Η2Μ ήταν άνευ ορού και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΙΡΑ-3 σε πλήρες μέσο επί μία νύκτα. Η ανάλυση Western blotting έδειξε ότι ΙΡΑ-3 δοσοεξαρτώμενο μείωσε το επίπεδο φωσφορυλίωσης του ΡΑΚ1 (Εικ. 1 C). Σταθερά, τα αποτελέσματα έδειξαν IPA-3 προκαλεί μια μείωση στην φωσφορυλίωση ΡΑΚ1 σε συνδυασμό με μία μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων Η2Μ. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση του κατάντη υπόστρωμα του ΡΑΚ1, c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK), μειώθηκε επίσης, υποστηρίζοντας περαιτέρω την μείωση της δραστηριότητας ΡΑΚ1 κινάσης με ΙΡΑ-3 (Εικ. 1 C). Φως μικροσκοπική εξέταση των ΙΡΑ-3-κατεργασμένων κυττάρων αποκάλυψε έντονη μορφολογικές αλλαγές. Σύκο. 1D έδειξε τις μορφολογικές μεταβολές στα κύτταρα Η2Μ μετά από επεξεργασία με ΙΡΑ-3. Σε υψηλές δόσεις των ΙΡΑ-3 (20 και 40 μΜ), ένας σημαντικός πληθυσμός κυττάρων Η2Μ έγινε γύρο-up και αποσπάται από το πιάτο.

(Α) Σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης του ΡΑΚ1 σε διάφορες κυτταρικές σειρές. Οι εντάσεις σήματος των ζωνών ποσοτικοποιήθηκαν και ομαλοποιήθηκε με τη λήψη αυτού του επιπέδου ΜΙΧΑ ως 1. (Β) ανάλυση ΜΤΤ την Ημέρα 1 και 2. κύτταρα Η2Μ (4 × 10

3) σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές δοσολογίες του ΙΡΑ-3. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από επώαση και η δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη όπως αναφέρεται στην Υλικό και Μέθοδος. Το γράφημα έδειξε το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων συναρτήσει της δοσολογίας του ΙΡΑ-3 (Γ) Western blotting ανάλυση του Ρ-ΡΑΚ1, σύνολο ΡΑΚ1, Ρ-JNK και συνολικός JNK. Στερούνται ορού κύτταρα Η2Μ υπέστησαν αγωγή είτε με DMSO ή ΙΡΑ-3 στην ενδεικνυόμενη συγκέντρωση για 15 λεπτά και ακολουθείται από FBS αναπλήρωση και ολονύκτια καλλιέργεια. (D) Κύτταρα Η2Μ ήταν άνευ ορού και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΙΡΑ-3 (10, 20 ή 40 μΜ) σε πλήρες μέσο και αφέθηκαν να αναπτυχθούν όλη τη νύκτα. Οι εικόνες μορφολογία των κυττάρων συλλήφθηκαν σε μεγέθυνση 40Χ. μπαρ κλίμακα, 0,4 mm.

Η

ΙΡΑ-3 καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των HCC κύτταρα

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η επίδραση του ΙΡΑ-3 για πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCC, δύο κύρια HCC κυτταρικές σειρές, HepG2 και H2P, δύο κυτταρικές σειρές μετάσταση HCC ,. Η2Μ και MHCC97L, και το μη ογκογόνο, αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά του ήπατος, Ο Miha, ξεχωριστά σε επεξεργασία με διαφορετικές δοσολογίες του ΙΡΑ-3. Στην δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού, θεραπεία ΙΡΑ-3 μείωσε σημαντικά τον αριθμό των μεταστατικών κυττάρων HCC (Η2Μ και MHCC97L) και σε μικρότερο βαθμό για τα κύτταρα πρωτογενή HCC (HepG2 και H2P), σημείωσε με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 2Α ). Σε αντίθεση, Ο Miha είχε την υψηλότερη χημειοαντίσταση να ΙΡΑ-3, προτείνοντας ότι ΙΡΑ-3 θα μπορούσε να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό ηπατώματος κυττάρων με ένα μικρό αποτέλεσμα επί κανονικών ηπατοκυττάρων. Για να επιβεβαιωθεί η επίδραση του ΙΡΑ-3, συνολικά κυτταρολύματα κυττάρων Η2Μ συλλέχθηκαν την ημέρα 7 και δοκιμάζεται για την αναστολή ΡΑΚ1 με ανάλυση Western blotting. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι ΙΡΑ-3 θεραπεία ανέστειλε αξιοσημείωτα τη φωσφορυλίωση ενεργοποίησης του ΡΑΚ1, γεγονός που υποδηλώνει ότι ΙΡΑ-3 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με τη μείωση της δραστικότητας ΡΑΚ1 (Συμπληρωματικές Εικ. S1). Σταθερά, η ταυτόχρονη μείωση της φωσφορυλίωσης της JNK, οι μεταγενέστεροι στόχοι του ΡΑΚ1, παρατηρήθηκε επίσης (Σχ. S1). Για να διαλευκανθεί αν το αντι-πολλαπλασιαστική μηχανισμός ΙΡΑ-3 σε κύτταρα HepG2, H2P, Η2Μ και MHCC97L οφειλόταν σε μείωση στην καταχώρηση του κυτταρικού κύκλου, δοκιμής επισήμανσης BrdU εκτελέστηκε. Προκειμένου να επιτευχθεί μια εξέχουσα επίδραση του ΙΡΑ-3, 10 μΜ και υψηλότερη δόση (20 μΜ) χρησιμοποιήθηκαν για την έρευνα. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι ΙΡΑ-3 θεραπεία για τα συγχρονισμένα κύτταρα Η2Μ και MHCC97L ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του ρυθμού ενσωμάτωσης BrdU, σε σύγκριση με τον μάρτυρα DMSO σε χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπους (Σχ. 2Β). Ωστόσο, ΙΡΑ-3 είχε μόνο οριακή επίδραση στο ποσοστό ενσωμάτωσης BrdU κυττάρων H2P και HepG2, εμπλέκοντας ότι ΙΡΑ-3 είναι πολύ συγκεκριμένες για τις μεταστατικό HCC κυτταρικές σειρές. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η επίδραση του ΙΡΑ-3 για την καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων HCC, δοκιμασία σχηματισμού αποικίας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μη ογκογόνων (ΜΙΧΑ), πρωτοβάθμιας (HepG2) και μεταστατικά κύτταρα (Η2Μ) HCC. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι ΙΡΑ-3 ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων HepG2 και Η2Μ, αλλά απλώς είχε μια πολύ οριακή επίδραση επί των κυττάρων ΜΙΧΑ (Σχ. 2C). Αξιοσημείωτα, κύτταρα ΜΙΧΑ, τα οποία έχουν ένα πολύ χαμηλό ενδογενές επίπεδο του ΡΑΚ1, δεν έδειξε διαφορά στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων κατά την ΙΡΑ-3 θεραπεία. Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ΙΡΑ-3 θεραπεία κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCC σε φθίνουσα σειρά προτίμησης, μεταστατικό HCC & gt? Πρωτοβάθμια HCC & gt?. Μη μετασχηματισμένα ηπατοκύτταρα, και σε ΡΑΚ1-εξαρτώμενο τρόπο

(Α ) Η επίδραση του ΙΡΑ-3 σχετικά με τα ποσοστά πολλαπλασιασμού των κυττάρων του ΜΙΧΑ (άνω, αριστερό πάνελ), HepG2 (άνω, μεσαίο πάνελ) H2P (επάνω, δεξιά πάνελ), H2M (κάτω, αριστερό πάνελ) και MHCC97L (κάτω, δεξιά πάνελ ) κύτταρα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη σύγκριση με την τιμή του DMSO ελέγχου. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 (ANOVA). δοκιμασίες επισήμανση BrdU τον Miha (άνω, αριστερό πάνελ), HepG2 (άνω, μεσαίο πλαίσιο), H2P (άνω, δεξί πάνελ), Η2Μ (κατώτερο, αριστερό πάνελ) και MHCC97L κυττάρων (κάτω, δεξιά πάνελ) (Β). *

P

& lt? 0,05 (ANOVA) σε σύγκριση με τον έλεγχο DMSO. Οι ράβδοι σφάλματος, μέση ± SD δειγμάτων εις τριπλούν. (C) Αντιπροσωπευτική πλάκες δοκιμασίας σχηματισμού αποικίας τον Miha (αριστερό πάνελ), HepG2 (μεσαίο πάνελ) και κύτταρα Η2Μ (δεξί πάνελ). Μπαρ γράφημα της ανάλυσης σχηματισμού αποικίας (κάτω πίνακας). *

P

& lt? 0.001, **

P

& lt? 0,01 (ANOVA) σε σύγκριση με τον έλεγχο DMSO. Οι μπάρες σφάλματος, μέση τιμή ± SD δειγμάτων εις τριπλούν.

Η

ΙΡΑ-3 επάγει την απόπτωση των HCC κύτταρα

Για να διερευνηθεί κατά πόσο ΙΡΑ-3 επηρεάζει την απόπτωση στα κύτταρα HCC, ένα αννεξίνη V-7ADD δοκιμασία χρώσης εκτελέστηκε. Από 10 μΜ ΙΡΑ-3 αναστέλλει ρυθμό πολλαπλασιασμού και μια υψηλότερη συγκέντρωση δηλ 20 μΜ προκαλεί σημαντική αποτέλεσμα στη δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU σε κύτταρα Η2Μ, 10 μΜ και 20 μΜ χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνηθεί η εξέχουσα επίδραση του ΙΡΑ-3. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι η επώαση των κυττάρων Η2Μ με 20 μΜ ΙΡΑ-3 οδήγησε σε υψηλότερο ποσοστό κυττάρων που εμφανίζουν ένα θετικό σήμα χρώσης αννεξίνης V, σε σύγκριση με τον μάρτυρα DMSO, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα κύτταρα υπέστησαν απόπτωση υπό την αγωγή με ΙΡΑ-3 ( Σχ. 3Α). Επιπλέον, η πιθανή προ-αποπτωτική δραστικότητα του ΙΡΑ-3 εξετάστηκε περαιτέρω από τη διάσπαση του PARP1 και κασπάσης 3. Κατεργασία του ΙΡΑ-3 σε κύτταρα Η2Μ είχε ως αποτέλεσμα ένα εξασθενημένο επίπεδο ΡΑΚΡ στα 20 μΜ και τη μορφή αποκοπής του PARP1 μπορούσε να ανιχνευθεί σε 40 μΜ (Εικ. 3Β). Αυτό συνοδεύτηκε με εξαρτώμενο από τη δόση μείωση των επιπέδων φωσφορυλίωσης ΡΑΚ1 του ΡΑΚ1 (Σχ. 3Β). Επιπλέον, το επίπεδο της διασπασμένης κασπάσης 3 αυξήθηκαν με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ΙΡΑ-3 προκαλεί απόπτωση μέσω αναστολής ΡΑΚ1 σε υψηλή συγκέντρωση.

(Α) Annexin δοκιμασία χρώσης V-7ADD. Τα σήματα φθορισμού του αννεξίνη V-ΡΕ και 7-AAD ανιχνεύθηκαν με ΡΕ-Α και Per-Cy5-5-A κανάλια, αντίστοιχα (άνω πάνελ). Το ποσοστό των κυττάρων που βάφονται με Η2Μ αννεξίνη V-ΡΕ μόνον υπό διαφορετικές θεραπείες δείχθηκε σε ένα γράφημα ράβδων (κάτω πίνακας). *

P

& lt? 0.001 (ANOVA) σε σύγκριση με τον έλεγχο DMSO. (Β) σε παντελή στέρηση ορού κύτταρα Η2Μ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες δόσεις του ΙΡΑ-3 μαζί με αναπλήρωση ορό για 24 ώρες. Κηλίδωση Western ανάλυση των PARP1, Ρ-ΡΑΚ1 (T423), συνολικής ΡΑΚ1 και διασπάστηκε κασπάσης 3 εκτελέστηκε.

Η

ΙΡΑ-3 Καταστέλλει HCC κυττάρων Μετανάστευση

ΡΑΚ1 έχει εξέχοντα ρόλο στην μετανάστευση κυττάρων, ιδιαίτερα στη ρύθμιση του στρες ίνες σχηματισμού και εστιακή κύκλο εργασιών συμφύσεων. Έτσι, χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη για να διερευνηθεί κατά πόσο ΙΡΑ-3 μπορούν να επηρεάσουν αυτές τις διαδικασίες. ΙΡΑ-3 βρέθηκε ότι ενισχύει τον σχηματισμό ινών στρες και τοπικές συμφύσεις στα δύο κύτταρα Η2Μ και H2P, τα οποία εμφανίζονται δια phalloidin και παξιλλίνης ανοσο-θετικά σήματα από ίνες στρες και τοπικές συμφύσεις, ενώ ο έλεγχος DMSO έδειξε ένα ασθενές και διάσπαρτα χρώση. Επιπλέον, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία του ΙΡΑ-3 ενίσχυσε σημαντικά τον αριθμό των συμπλοκών εστιακής προσκόλλησης σε κύτταρα Η2Μ και H2P όπως αποκαλύφθηκε με χρώση παξιλλίνη (Σχ. 4Α). Η φωσφορυλίωση του παξιλλίνη στη σερίνη-178 (S178) είναι σημαντική για τη μεσολάβηση ΡΑΚ1 κυτταρική μετανάστευση, η οποία έχει έδειξε να φωσφορυλιωθεί από JNK [4], [16]. Σε κύτταρα Η2Μ, φωσφορυλίωση παξιλλίνης στο S178 μειώθηκε σημαντικά μαζί με μια ολονύκτια θεραπεία του ΙΡΑ-3 (Σχ. 4Β). Έτσι, ΙΡΑ-3 αναστέλλει τη σηματοδότηση της ΡΑΚ1 /JNK /οδός παξιλλίνη. Επιπλέον, μια δοκιμασία μετανάστευσης Transwell διεξήχθη για να μελετηθεί η επίδραση της ΙΡΑ-3 επί του

in vitro

μετανάστευση ικανότητα των κυττάρων Η2Μ. Βρήκαμε ότι ΙΡΑ-3 κατέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων Η2Μ ως ο αριθμός των κυττάρων μετανάστευσαν αξιοσημείωτα μειωμένος κατά 79%, σε σύγκριση με τον μάρτυρα DMSO (Εικ. 4C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα απεικονίζονται ότι ΙΡΑ-3 μειώνει σημαντικά την ΡΑΚ1 εξαρτώμενη κυτταρική κινητικότητα των κυττάρων HCC.

(Α) έκφραση πρωτεΐνης παξιλλίνη ανιχνεύθηκε με ανάλυση ανοσοφθορισμού υπό ΙΡΑ-3 θεραπεία. Η2Μ και H2P (άνω πάνελ) κύτταρα ήταν άνευ ορού επί μία νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία είτε με έλεγχο DMSO ή ΙΡΑ-3 (20 μΜ) για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από FBS αναπλήρωσης για 10 λεπτά. σήματα ανοσοφθορισμού των phalloidin (Κόκκινο), παξιλλίνη (πράσινο) και DAPI (μπλε) αντιπροσωπεύουν ίνες στρες, εστιακή πρόσφυση και πυρήνα, αντίστοιχα (μεγέθυνση 40Χ). Ο αριθμός των εστιακών πρόσφυσης (παξιλλίνη) μετρήθηκαν σε Η2Μ (κάτω, αριστερό πάνελ) και H2P (κάτω, δεξιά πάνελ), και εκπροσωπείται στο ιστόγραμμα. Οι ράβδοι σφάλματος, μέση ± SD δειγμάτων εις τριπλούν. *

P

& lt? 0,01 (

t-test

) σε σύγκριση με τον έλεγχο του DMSO. (Β) κηλίδωση Western ανάλυση σχετικά με τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ΡΑΚ1 και παξιλλίνη. κύτταρα στερούνται ορού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του ΙΡΑ-3 όπως υποδεικνύεται για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από FBS αναπλήρωσης για 10 λεπτά. (C) Εκπρόσωπος εικόνες της δοκιμασίας μετανάστευσης Transwell των κυττάρων Η2Μ. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με είτε DMSO ή 10 μΜ ΙΡΑ-3, και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 24 ώρες. Εικόνες δείχνουν τα κύτταρα που έχουν μεταναστεύσει στην κάτω θάλαμο (άνω πάνελ). Ο αριθμός των μεταναστεύσει κύτταρα μετρήθηκαν και εκπροσωπούνται στο ιστόγραμμα (κάτω πίνακας). Οι ράβδοι σφάλματος, μέση ± SD δειγμάτων εις τριπλούν. *

P

& lt?. 0.01 (

t-test

) σε σύγκριση με τον έλεγχο DMSO

Η

ΙΡΑ-3 Καταστέλλει NF-κΒ Πυρηνική Μετατόπιση

Προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν ότι ΡΑΚ1 διεγείρει τη δραστηριότητα και υποκυτταρικά μετατόπιση πυρηνικού παράγοντα βελτιωτή ελαφριάς αλυσίδας των ενεργοποιημένων Β κυττάρων (ΝΡ-κΒ), και προωθεί την κυτταρική επιβίωση [17], [18]. Έτσι, εξετάστηκε εάν ΙΡΑ-3 είναι σε θέση να αναστέλλουν την δραστικότητα του ΝΡ-κΒ. Η2Μ με υψηλό ενδογενές επίπεδο έκφρασης του ΡΑΚ1 και αθανατοποιημένα ηπατοκύτταρα, τα κύτταρα ΜΙΧΑ υποβλήθηκαν σε παντελή στέρηση ορού και στη συνέχεια χωριστά σε επεξεργασία με ΙΡΑ-3 που ακολουθείται από παράγοντα νέκρωσης όγκου-άλφα (TNF-α). Όπως έδειξε στο Σχ. 5Α, NF-κΒ θετική χρώση ήταν κυρίως ανιχνεύθηκε στο κυτταρόπλασμα του ελέγχου DMSO, ενώ χρώση ΝΡ-κΒ συσσωρεύτηκε στον πυρήνα μετά την επαγωγή ΤΝΡ-α. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν Η2Μ με ΙΡΑ-3 είχε ως αποτέλεσμα μια κυτταροπλασματική χρώση του ΝΡ-κΒ, υποδεικνύοντας ότι ΙΡΑ-3 κατέστειλε την TNF-α επαγόμενης πυρηνική στόχευση του ΝΡ-κΒ. Σε αντίθεση με τα κύτταρα Η2Μ, ΙΡΑ-3 δεν καταστέλλει ΤΝΡ-α επαγόμενη ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ σε κύτταρα ΜΙΧΑ, τα οποία στερούνται την ενδογενή ΡΑΚ1. Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι η αναστολή της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ από το ΙΡΑ-3 είναι εξαρτώμενη από ΡΑΚ1. Για να διερευνηθεί περαιτέρω αν η αδρανοποίηση ΡΑΚ1 εμπλέκεται στην ΙΡΑ-3-επαγόμενη καταστολή του NF-κΒ μετατόπιση, φωσφορυλίωση ΡΑΚ1 προσδιορίστηκε (Σχ. 5Β). Συνεπής με προγενέστερη μελέτη που έδειξε ότι ΡΑΚ1 ήταν αμέσως ενεργοποιήθηκε με ΤΝΡ-α σε διάφορες κυτταρικές σειρές [19], το επίπεδο φωσφο-ΡΑΚ1 ανυψώθηκε σε κύτταρα διεγερμένα με ΤΝΡ-α (20 ng /ml). Το επίπεδο φωσφορυλίωσης ήταν υψηλότερη κατά 0,5 ώρες και στη συνέχεια μειώνεται σταδιακά στη συνέχεια. Από την άλλη πλευρά, η φωσφορυλίωση του ΡΑΚ1 είχε κατασταλεί πλήρως σε ΙΡΑ-3 προεπεξεργασμένων κυττάρων. Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι ΙΡΑ-3 είναι σε θέση να καταργήσει την ενεργοποίηση ΡΑΚ1 επάγεται από τον TNF-α, η οποία συσχετίζεται καλά με την ΙΡΑ-3 αναστολή επί του TNF-α επαγόμενης ΝΡ-κΒ μετατόπισης. Η επαγωγή της μεταλλοπρωτεϊνάσης (ΜΜΡ) -9 από TNF-α απεδείχθη ότι μεσολαβείται από ΡΑΚ1 [19]. Για να αποσαφηνιστεί η επίδραση του ΙΡΑ-3 επί του TNF-α επαγόμενης δραστικότητας της ΜΜΡ-9 και COX-2, οι οποίες βρίσκονται στα κατάντη στόχοι του ΝΡ-κΒ [20], [21], εκτελέσαμε qRT-PCR για την ποσοτικοποίηση το mRNA παραγωγή της ΜΜΡ-9 και COX-2. Μετά από εξομάλυνση με β-ακτίνης, τα κύτταρα Η2Μ ανταποκρίθηκε σε ΤΝΡ-α με την αύξηση της παραγωγής mRNA της ΜΜΡ-9 και COX-2 (Σχ. 5C). Ωστόσο, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία του ΙΡΑ-3 κατέστειλε σημαντικά την έκφραση της ΜΜΡ-9 και COX-2 μεταγραφές κατά τρόπο εξαρτώμενο από τη δόση.

(Α) Επίδραση της ΙΡΑ-3 επί υποκυτταρικό εντοπισμό του ΝΡ κΒ αξιολογήθηκε με χρώση ανοσοφθορισμού. Μετά από ολονύκτια στέρηση ορού, Η2Μ (αριστερό πάνελ) και ΜΙΧΑ (δεξί πάνελ) κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με είτε DMSO ή ΙΡΑ-3 (20 μΜ, 15 λεπτά) και ακολούθησε προσθήκη του ΤΝΡ-α (20 ng /ml, 15 λεπτά) . ΝΡ-κΒ ανιχνεύθηκε με ένα ειδικό αντίσωμα (Green) και πυρήνας χρωματίστηκε με ϋΑΡΙ (Μπλε). (Β) Κηλίδωση Western ανάλυση των Ρ-ΡΑΚ1 (T423) και η συνολική ΡΑΚ1 ανιχνεύθηκαν στα κύτταρα Η2Μ διεγείρεται από ΤΝΡ-α (20 ng /ml) με ή χωρίς ΙΡΑ-3 προεπεξεργασίας (20 μΜ, 15 λεπτά). TNF-α συμπεριλήφθηκε στο μέσο καλλιέργειας για 0, 0,5, 1, 2 ή 4 ώρες. (C) Έκφραση ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη για ανάλυση του επιπέδου mRNA της ΜΜΡ-9 (αριστερό πάνελ) και COX-2 (δεξί πάνελ). Στερούνται ορού κύτταρα Η2Μ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς ΙΡΑ-3 προεπεξεργασίας (10 ή 20 μΜ, 15 λεπτά) που ακολουθείται από ΤΝΡ-α (10 ή 20 ng /ml, 24 ώρες). Ποσοτικά αποτελέσματα των ΜΜΡ-9 και COX-2 mRNA επίπεδα κανονικοποιήθηκαν σε β-ακτίνη. Οι τιμές αντιπροσώπευε την μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. *

P

& lt? 0.001 (ANOVA), ***

P

& lt?. 0.05 (ANOVA) σε σύγκριση με τον TNF-α ελέγχου

Η

IPA- 3 Καταστέλλει Ογκογένεση σε nude Mouse μοντέλο ξενομοσχεύματος

Το εύρος της ΙΡΑ-3 αντικαρκινική δράση

in vivo

αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Δεδομένου ότι η κυτταρική γραμμή Η2Μ ήταν σε θέση να αναπτύξουν στερεών όγκων σε γυμνά ποντίκια, χρησιμοποιήθηκε μια άλλη ανθρώπινη γραμμή HCC MHCC97L με παρόμοιο επίπεδο ΡΑΚ1 (Εικ. 1Α). Μετά εγκατάσταση όγκου (100 mm

3), πέντε ποντικοί ανά ομάδες υποβλήθηκαν σε αγωγή με είτε DMSO ή διάφορες δόσεις ΙΡΑ-3 (2 mg /kg και 4 mg /kg) TIW με ε.π. ένεση. Ενώ η θεραπεία ήταν καλά ανεκτή όπως αποδεικνύεται από μη σημαντική απώλεια βάρους, ΙΡΑ-3 κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου (Σχ. 6Α) και είχε ως αποτέλεσμα χαμηλότερα βάρη των όγκων (Σχ. 6Β). Επιπλέον, ανάλυση Western blotting έδειξε ότι ΙΡΑ-3 μείωσε την φωσφορυλίωση του ΡΑΚ1 και προς τα κάτω στόχος του JNK (Εικ. 6C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ΙΡΑ-3 μπορεί να καταστείλει καρκινογένεση

in vivo

με τη μείωση της δραστηριότητας ΡΑΚ1.

(Α) κύτταρα MHCC97L χρησιμοποιήθηκαν για το μοντέλο ξενομοσχεύματος. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία τρεις φορές την εβδομάδα είτε με DMSO ή ΙΡΑ-3 (2 mg /kg ή 4 mg /kg, ε.π.). *

P

& lt? 0.001 (ANOVA) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου DMSO. (Β) Τα βάρη των όγκων μετρήθηκαν στο τέλος της μελέτης. *

P

& lt? 0.001, **

P

& lt? 0,01, (ANOVA) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου DMSO. (Γ) Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα της ανάλυσης Western blotting. P-ΡΑΚ1 (T423), συνολικής ΡΑΚ1, P-JNK και συνολική JNK ανιχνεύτηκαν. ***

P

& lt? 0,05 (ANOVA) σε σύγκριση με τον έλεγχο DMSO. Οι μπάρες σφάλματος, μέση τιμή ± SD από 5 ζώα ανά ομάδα.

Η

Συζήτηση

ΡΑΚ1 εμπλέκεται σε ένα δίκτυο μεταγωγής συμπλόκου σηματοδότησης που συνδέεται με διάφορες κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της μοντελοποίησης κυτταροσκελετού, κελί κινητικότητα, την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό, και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου [5]. Απορυθμισμένη ή υπερ-ενεργοποιείται ΡΑΚ1 συνήθως συνδέεται με HCC [19]. Έτσι, ΡΑΚ1 έχει γίνει ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για τον έλεγχο ογκογένεση και τη μετάσταση του HCC [22]. ΙΡΑ-3 έχει ταυτοποιηθεί ότι είναι ένας μικρός αλλοστερικό αναστολέα μόριο του ΡΑΚ1 [8]. Με λίγη ή λιγότερο αναφορές ΙΡΑ-3 στη θεραπεία της ανθρώπινης HCC, χρησιμοποιήσαμε διάφορα

in vitro

και

in vivo

πειράματα για να διερευνηθεί η αντι-ογκογόνο ικανότητα του ΙΡΑ-3 μεταχείριση ανθρώπινες κυτταρικές σειρές HCC.

στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι ΙΡΑ-3 θα μπορούσε να αναστείλει τον ρυθμό πολλαπλασιασμού των HepG2, H2P, κύτταρα H2M, και MHCC97L στη δόση και το χρόνο που εξαρτάται από τρόπους.