Αφηρημένο

Ιστορικό

Για να διερευνηθεί η επίπτωση της ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης M2 (RRM2) στην καρκινογένεση του τραχήλου της μήτρας και τη σχέση της με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά και την πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο.

Μεθοδολογία και ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Ο αντίκτυπος των RRM2 στην βιωσιμότητα των κυττάρων διερευνήθηκε σε SiHa του τραχήλου της μήτρας καρκινικά κύτταρα μετά RRM2 knockdown και την προσθήκη της σισπλατίνης, η οποία επάγει δια- και ενδο-κλώνου διασταυρωμένες συνδέσεις DNA. RRM2 ανοσοαντιδραστικότητα εκτιμήθηκε με ημι-ποσοτική βαθμολογία H μεταξύ 29 κανονικό, 30 χαμηλού βαθμού δυσπλασία, 30 υψηλού βαθμού δυσπλασία και 103 επεμβατικές δείγματα καρκινικού ιστού του τραχήλου της μήτρας, με τη χρήση μικροσυστοιχίες ιστού. RRM2 ακολούθως συσχετίζονται με τα κλινικοπαθολογοανατομικών μεταβλητές του καρκίνου του τραχήλου και την επιβίωση των ασθενών. Ένα μεγαλύτερο τοξική επίδραση στη βιωσιμότητα του κυττάρου με τη χρήση σισπλατίνης αντικατοπτρίστηκε από τη μεγαλύτερη μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα RRM2 SiHa. Η έκφραση RRM2 σε καρκινικούς ιστούς ήταν υψηλότερη από ότι σε υψηλού βαθμού δυσπλασία, χαμηλού βαθμού δυσπλασία ή φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς. RRM2 αυξορρύθμιση συσχετίστηκε με βαθιά εισβολή στρωματικά, μεγάλοι όγκοι και parametrial εισβολή και την προβλεπόμενη κακή επιβίωση.

Συμπεράσματα

RRM2 είναι ένα νέο μοριακό δείκτη για τη διάγνωση και την κλινική έκβαση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Είναι εμπλέκονται στην καρκινογένεση του τραχήλου της μήτρας και προβλέπει κακή επιβίωση, και μπορεί να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος συμπεριλαμβανομένης της θεραπείας με σισπλατίνη

Παράθεση:. Su YF, Wu TF, Ko JL, Tsai ΗΤ, Tee ΥΤ, Chien MH, et al. (2014) Η έκφραση της αναγωγάσης ριβονουκλεοτιδίου Μ2 στην Καρκινογένεση της μήτρας τραχήλου και η σχέση της με κλινικοπαθολογοανατομικές Χαρακτηριστικά και πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο. PLoS ONE 9 (3): e91644. doi: 10.1371 /journal.pone.0091644

Επιμέλεια: Chih-Hsin Tang, η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου, Ταϊβάν

Ελήφθη: 11η Ιανουαρίου 2014? Αποδεκτές: 13 του Φλεβάρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 17 Μάρτη του 2014

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από ερευνητικές επιχορηγήσεις από Chung Shan Medical University Hospital, Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο (CSH-2013-D-001) και Ταϊβάν (NSC 102 έως 2314-B-040-014-my3). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αναγωγάση ριβονουκλεοτιδίου (RNR) είναι ένα ένζυμο που καταλύει το σχηματισμό δεοξυριβονουκλεοτίδια από ριβονουκλεοτίδια [1]. Τα δεοξυριβονουκλεοτίδια με τη σειρά του χρησιμοποιείται στη σύνθεση του δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος (DNA) και επιδιόρθωση του DNA [1], [2]. RNR αποτελείται από δύο υπομονάδες πρωτεΐνης αναφέρονται ως μεγάλα R1 (όπως ονομάζεται Μ1 σε ανθρώπους) και των μικρών [3] R2. R2 έχει ταξινομηθεί ως RRM2 (ριβονουκλεοτιδικής ρεδουκτάσης Μ2) και p53R2 υπομονάδες που σχηματίζουν ένα ενεργό ετεροδιμερικό τετραμερούς σε ανθρώπους [4], [5]. RNR έχει αναφερθεί ότι συσχετίζεται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση [6], [7], και πρέπει να συντονίζεται με την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου για να διατηρηθεί η ισορροπία μεταξύ παραγωγής και dNTP την αντιγραφή του DNA δραστικότητα RNR. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης R1 είναι σχετικά σταθερά σε ολόκληρο τον κυτταρικό κύκλο και είναι πάντα μεγαλύτερη από RRM2 [8]. Ως εκ τούτου, ο κύκλος εξαρτώμενη δραστικότητα των κυττάρων του RNR ρυθμίζεται από επίπεδα RRM2 [8].

Η καταστροφή των καρκινικών κυττάρων από σισπλατίνη απαιτεί τη σύνδεση του φαρμάκου με το DNA και το σχηματισμό προϊόντων προσθήκης λευκοχρύσου-ϋΝΑ, η οποία μπορούν να θεσπίζουν δια- και ενδο-σκέλος των σταυροειδών δεσμών του DNA, αναστέλλοντας έτσι την αντιγραφή του DNA [9]. Η εγκάρσια συμπληρώσεως ομάδα 1 (ERCC1) ένζυμο επιδιόρθωσης εκτομής έχει αναφερθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην επιδιόρθωση του δια-κλώνου διασταυρωμένων συνδέσεων στο DNA [10] – [12]. Επιπλέον, η έκφραση R2 είναι κυτταρικό κύκλο εξαρτώμενη, με το υψηλότερο επίπεδο παράλληλα με την αντιγραφή του DNA [4], [8], υποδηλώνοντας ότι η επισκευή καύσιμα RRM2 DNA. προκαταρκτικό πείραμα μας έδειξαν ότι ο καρκίνος του τραχήλου SiHa κύτταρα, τα οποία έχουν μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη RRM2, παρουσιάζουν υψηλότερα βιωσιμότητα των κυττάρων από τον καρκίνο του τραχήλου Caski κύτταρα, τα οποία έχουν χαμηλότερη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη RRM2, με βάση ΜΤΤ [3- (4,5-cimethylthiazol-2 -υλ) – 2,5-διφαινυλ τετραζόλιο] δοκιμασίας μετά την αγωγή της σισπλατίνης. Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης RRM2 των καρκίνων του τραχήλου SiHa ήταν 2.3 έως 3.6 διπλώνει πάνω από εκείνες των καρκίνων του τραχήλου Caski. Μετά από 48 ώρες καλλιέργειας με την προσθήκη 5 μΜ σισπλατίνη, η κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων SiHa ήταν περίπου 80% του αρχικού SiHs κυττάρων χωρίς προσθήκη σισπλατίνης, ενώ η κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων Caski μειώθηκε στο 51% (SiHa vs. Caski: 80 % έναντι 51%,

σ

Irvine, CA 92606 USA) και β-ακτίνη (A5441, Sigma, St. Louis, ΜΟ).

ΜΤΤ [3- ( 4,5-cimethylthiazol-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο βρωμίδιο]

δοκιμασία

SiHa shRRM2 # 354, SiHa shRRM2 # 962 και SiHa shLuc κύτταρα σπάρθηκαν επί πλάκας μικροκαλλιέργειας 96-φρεατίων στα 5000 κύτταρα /φρεάτιο και αφέθηκαν να προσκολληθούν για μία νύχτα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0, 25, 50 μΜ) της cisplatin σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS και επωάστηκαν για 48 ώρες. Το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιείχε ΜΤΤ (0,2 mg /ml) και οι πλάκες επωάστηκαν για άλλες 3 ώρες. Το μέσο στη συνέχεια απομακρύνθηκε και διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) προστέθηκε για να διαλυθούν τα ΜΤΤ κρύσταλλοι φορμαζάνης. Η απορρόφηση του χρώματος μετρήθηκε στα 570 nm, και η κυτταρική βιωσιμότητα υπολογίστηκε ως το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων στο συνολικό πληθυσμό.

Τα άτομα της μελέτης και ανοσοϊστοχημική έκφραση RRM2 στον καρκίνο, υψηλής ποιότητας και χαμηλής βαθμού δυσπλασία και των φυσιολογικών ιστών χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες ιστό

Κατασκευάσαμε δύο, εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό μικροσυστοιχίες (πυρήνες ιστού MaxArray, Zymed, South San Francisco, California) μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη, που αποτελείται από 29 κανονικά, 30 χαμηλού βαθμού δυσπλασία, 30 υψηλού βαθμού δυσπλασία και 103 επεμβατικές δείγματα καρκινικού ιστού του τραχήλου της μήτρας. Αυτά τα δείγματα ιστών συλλέχθηκαν από ιστοπαθολογικές μπλοκ παραφίνης των Παθολογίας Τμημάτων στην Chung Shan Medical University. Ένα σύνολο 103 ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας είχαν προσληφθεί διαδοχικά μεταξύ Μαρτίου 1999 και Μαρτίου του 2006. Είχαν ανεβεί, σύμφωνα με τη Διεθνή Ομοσπονδία Γυναικολογίας και Μαιευτικής 2009 (FIGO) Ταξινόμηση [13] και έλαβε τυποποιημένα πρωτόκολλα θεραπείας στο Τμήμα Μαιευτικής και Γυναικολογίας , Chung Shan Medical University Hospital, Ταϊβάν. Τριάντα ασθενείς με υψηλού βαθμού δυσπλασία είχε λάβει μεγάλες εκτομές θηλιά της ζώνης του μετασχηματισμού, η συνολική κοιλιακή υστερεκτομή (TAH), ή ολική κολπική υστερεκτομή (TVH). Η παθολογική διάγνωση αυτών των δειγμάτων έδειξε μέτρια, σοβαρή δυσπλασία, ή πλακώδες καρκίνωμα (SCC) in situ. Τριάντα ασθενείς είχαν χαμηλού βαθμού δυσπλασία, για τα οποία έλαβαν κολποσκόπηση-κατευθυνόμενη βιοψία γροθιά, όλα βρέθηκαν να έχουν ήπια δυσπλασία από παθολογικές μελέτες. Είκοσι εννέα δείγματα φυσιολογικού ιστού του τραχήλου της μήτρας συλλέχθηκαν από ασθενείς που λάμβαναν ΤΑΗ ή TVH για καλοήθη νόσο της μήτρας χωρίς τραχηλικών βλαβών. Τομές ιστού μικροσυστοιχία (MaxArray με 96 πυρήνες ιστού σε κάθε μικροσυστοιχία ιστό, Zymed Laboratories Inc.) επωάστηκαν με αντισώματα αντι-RRM2 (ab57653, Abcam Inc. ΜΑ, USA). Μια ημι-ποσοτική βαθμολογία H του RRM2 ανοσοαντιδραστικότητα καθορίστηκε με πολλαπλασιασμό του αναλογικού βαθμολογία των χρωματισμένων κυττάρων με ένταση ανοσοαντιδραστικότητα τους [14], [15]. Το πρωτεύον τελικό σημείο ήταν η κλινική να συσχετίσει την έκφραση RRM2 με την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Chung Shan Medical University Hospital Institutional Review Board (CSMUH IRB? CS12218 και CS12242) και ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή. Ακολουθήσαμε τις συστάσεις ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ για καρκινικούς δείκτες σε αυτή τη μελέτη [16].

Η στατιστική ανάλυση

Η μέθοδος Kruskal-Wallis H χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν οι διαφορές στην έκφραση RRM2 μεταξύ του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, υψηλή -grade δυσπλασία, χαμηλού βαθμού δυσπλασία και δείγματα φυσιολογικού ιστού. Η δοκιμασία Mann-Whitney χρησιμοποιήθηκε για την post-hoc ανάλυση. Σε απάντηση σε πολλαπλές αναλύσεις, η μέθοδος Hommel χρησιμοποιήθηκε για να ρυθμίσετε τις

σ τιμές

χρησιμοποιώντας το λογισμικό WinPepi, έκδοση 10.0.

Εμείς που συνδέονται τις εκφράσεις του RRM2 με κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας χρησιμοποιώντας chi-τετράγωνο ή ακριβές εξετάσεις του Fisher.

P

τιμές και αναλογίες πιθανοτήτων αναλύθηκαν από WinPepi Λογισμικού, έκδοση 10.0. Καμπύλες Kaplan-Meier απεικονίσθηκαν για τους ασθενείς καρκίνου του τραχήλου με βάση την έκφραση RRM2 για την πιθανότητα υποτροπής ή τη συνολική επιβίωση μεταξύ πρωτογενών χειρουργείο και θανάτου ή την επανάληψη ή τη λήξη της μελέτης (31 Μαΐου, 2012). Μέση (διάμεσος) φορές την επιβίωση και τα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών εκτιμήθηκε με τη μέθοδο όριο προϊόν Kaplan-Meier. Η πολυπαραγοντική και μονομεταβλητών μοντέλα παλινδρόμησης κατά Cox χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η προγνωστική αξία των βιολογικών και κλινικών παραμέτρων με ή χωρίς διόρθωση για την έκφραση RRM2 και κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS στατιστικού λογισμικού (έκδοση 11.0? SPSS, Inc., Chicago, IL). Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων και ένα

σ

τιμή μικρότερη του 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Όταν το γονίδιο RRM2 χτυπήθηκε κάτω στο SiHa καρκίνου του τραχήλου κύτταρα χρησιμοποιώντας shRRM2 # 354 και # 962 RRM2, το επίπεδο της πρωτεΐνης RRM2 μειώθηκε περισσότερο σημαντικά στο SiHa shRRM2 # 354 σε σχέση με τις κυτταρικές γραμμές # 962 (Σχήμα 1Α). Όταν 25 μΜ cisplatin προστέθηκε στο SiHa shRRM2 # 962 και # 354 κυτταρικές σειρές, η κυτταρική βιωσιμότητα δεν μειώθηκε στα κύτταρα # 962 αλλά ήταν σημαντικά μειωμένη στα κύτταρα (# 354

ρ

& lt? 0.001 ) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου SiHa shLuc, στα οποία ο φορέας ελέγχου shLuc επιμολύνθηκε στον τραχηλικό καρκινικά κύτταρα SiHa (Σχήμα 1Β). Όταν 50 μΜ cisplatin προστέθηκε στο SiHa shRRM2 # 962 και # 354 κυτταρικές σειρές, η κυτταρική βιωσιμότητα μειώθηκε τόσο # 962 (

ρ

& lt? 0.001) και # 354 κύτταρα (

ρ

& lt?. 0.001) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου SiHa shLuc (Εικόνα 1Β)

(Α) ανιχνεύθηκαν επίπεδα πρωτεΐνης των RRM2 στην αυχενική καρκινικά κύτταρα SiHa με shRRM2 # 354 ή # 962 χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι σχετικές εκφράσεις της RRM2 /β-ακτίνη έδειξε. Η επίδραση του γονιδίου knockdown RRM2 ήταν ισχυρότερη στα κύτταρα SiHa με shRRM2 # 354 σε σύγκριση με εκείνους με shRRM2 # 962. (Β) Ένα μεγαλύτερο τοξική επίδραση στη βιωσιμότητα του κυττάρου με τη χρήση σισπλατίνης βρέθηκε στα κύτταρα SiHa με shRRM2 # 354 σε σχέση με εκείνους με shRRM2 # 962 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου SiHa shLuc, στην οποία shLuc διαμολύνθηκε σε κύτταρα SiHa. βιωσιμότητες κυττάρου ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας 3- (4,5-cimethylthiazol-2-υλ) 2,5- διφαινυλο τετραζόλιο βρωμίδιο δοκιμασίας. RRM2, ριβονουκλεοτιδική αναγωγάση Μ2? ***

σ

& lt?. 0.001

Η

Η χρώση των RRM2 ήταν πυρηνική και το πρότυπο έκφρασης των RRM2 πρωτεΐνης σε ιστούς όγκων ήταν σε πυρήνες όγκου σε τραχήλου της μήτρας μικροσυστοιχίες καρκινικού ιστού. (Σχήμα 2). Η διάμεση τιμή όλων των βαθμολογιών H των κυττάρων του όγκου στα 103 τραχήλου πυρήνες καρκίνος ήταν 1,0. Οι μέσες βαθμολογίες H του 29 κανονικό, 30 χαμηλού βαθμού δυσπλασία και 30 ιστών υψηλού βαθμού δυσπλασία ήταν 0,5, 0,5 και 0,5, αντίστοιχα. Η έκφραση RRM2 ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, υψηλού βαθμού δυσπλασία, χαμηλού βαθμού δυσπλασία και φυσιολογικούς ιστούς (

σ

& lt? 0,001, Kruskal-Wallis μέθοδος Η). Η έκφραση RRM2 στους καρκινικούς ιστούς ήταν υψηλότερη από ότι σε υψηλού βαθμού δυσπλασία (Μέσος όρος Η: 1,0 έναντι 0,5? Προσαρμοστεί

σ

& lt Hommel είναι? 0.001), χαμηλού βαθμού δυσπλασία (Μέσος όρος Η: 1.0 έναντι 0,5? Hommel αναπροσαρμόστηκαν

σ

= 0,002) ή κανονικό (μέση βαθμολογία Η: 1,0 έναντι 0,5? προσαρμοστεί

σ

& lt Hommel είναι? 0.001) ιστούς. Όταν οι βαθμολογίες των H RRM2 στην αυχενική καρκινικούς ιστούς ήταν μια διάμεση τιμή 1 ή μεγαλύτερη, ανοσοϊστοχημική εκφράσεις τους θεωρήθηκαν ως υψηλή (θετική)? Αλλιώς, είχαν θεωρηθεί ως χαμηλή (αρνητική).

(Α) ανοσοχρώση υψηλής RRM2 (αριστερά) και χαμηλή ανοσοχρώση RRM2 (δεξιά) στην αυχενική καρκινικούς ιστούς. (Β) Υψηλή RRM2 ανοσοχρώση (αριστερά) και χαμηλή ανοσοχρώση RRM2 (δεξιά) στην αυχενική δυσπλασία υψηλού βαθμού. (C) Υψηλή RRM2 ανοσοχρώση (αριστερά) και χαμηλή ανοσοχρώση RRM2 (δεξιά) στην αυχενική χαμηλού βαθμού δυσπλασία. (D) Υψηλή RRM2 ανοσοχρώση (αριστερά) και χαμηλή ανοσοχρώση RRM2 (δεξιά) σε φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς. Μεγέθυνση: 200 ×? RRM2, ριβονουκλεοτιδική αναγωγάση Μ2.

Η

Η μέση ηλικία των ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ήταν 51,4 ± 11,8 χρόνια. Οι ασθενείς με διηθητικό καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ήταν κλινικά οργάνωσαν με βάση την ΦΥΓΩ ταξινόμηση 2009, και 68 ασθενείς είχαν ανεβεί Ι, 32 οργάνωσαν II, 2 οργάνωσαν ΙΙΙ και 1 ανέβασε IV. Ο μέσος χρόνος παρακολούθησης μετά την επέμβαση ήταν 61,0 μήνες και ο μέσος χρόνος επιβίωσης ήταν 103 μήνες. Το ποσοστό επιβίωσης 5-ετών ήταν 80,6%. Δύο ασθενείς χάθηκαν κατά την παρακολούθηση, 25 ασθενείς πέθαναν και 16 ασθενείς υποτροπίασαν. Η χρώση για RRM2 ήταν ισχυρότερη στους ασθενείς μεγαλύτερης ηλικίας [& gt? 50 χρόνια?

σ

= 0.004, ποσοστό πιθανοτήτων (OR): 4.97], τα άτομα με προχωρημένο στάδιο της νόσου (≥stage II?

σ

= 0027? Ή: 4,01), βαθιά εισβολή στρωματικά (

σ

& lt? 0.001? ή: 12.46), μεγάλους όγκους (

σ

= 0.001? ή: & gt? 2.62), μέτρια ή κακή διαφοροποίηση των κυττάρων (

σ

& lt? 0.001 ? Ή: 15.98), parametrial εισβολή (

σ

= 0,022? Ή: 7,97), και έτεινε να είναι ισχυρότερη στους ασθενείς με μετάσταση στους λεμφαδένες (

σ

= 0,066? Ή: 6.10) (Πίνακας 1)

η

η μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι οι ασθενείς με καρκινικούς ιστούς που παρουσιάζουν θετική ανοσολογική αντίδραση RRM2 είχε φτωχότερες επιβίωσης από εκείνους με τους ιστούς του καρκίνου που εμφανίζουν αρνητικά RRM2 ανοσολογική [ποσοστό επιβίωσης 5 ετών:. 76.4 vs . 95,5%? αναλογία κινδύνου (HR): 7,94, 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI): 1,07 – 58,82?

σ

= 0,016] (Πίνακας 2). Άλλοι σημαντικοί παράγοντες για την κακή επιβίωση περιλαμβάνονται βαθιά εισβολή στρωματικά, μεγάλης διαμέτρου του όγκου, parametrial εισβολή και πυελική μετάσταση λεμφαδένα (Πίνακας 2). Ωστόσο, πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι η κακή επιβίωση βρέθηκε μόνο σε ασθενείς των οποίων ο καρκίνος ιστοί εκτίθενται βαθιά στρωματικά εισβολή. (HR: 6,25, 95% CI: 1,43 – 27,03,

σ

= 0,015) (Πίνακας 2)

καμπύλες κατά Kaplan-Meier χαράχθηκαν για την πιθανότητα υποτροπής και της επιβίωσης, σύμφωνα με τις εκφράσεις της RRM2 (Σχήμα 3). Βρήκαμε ότι οι ασθενείς με θετική έκφραση RRM2 έτειναν να έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα υποτροπής (

σ

= 0,094) (Εικόνα 3Α). Επιπλέον, οι ασθενείς με θετική έκφραση RRM2 είχαν σημαντικά φτωχότερη επιβίωση από αυτούς με μια αρνητική έκφραση RRM2. (

σ

= 0,016? Σχήμα 3Β)

(Α) Οι ασθενείς με θετικό RRM2 έτειναν για να έχουν μια μεγαλύτερη πιθανότητα υποτροπής (Ν = 99,

σ

= 0,094), σε σύγκριση με τους ασθενείς με αρνητικό RRM2. (Β) Οι ασθενείς με θετικό RRM2 είχαν σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης (Ν = 101,

σ

= 0,016), σε σύγκριση με τους ασθενείς με αρνητικό RRM2. RRM2, ριβονουκλεοτιδική αναγωγάση Μ2.

Η

Τέλος, παρατηρήσαμε ότι οι τραχήλου της μήτρας ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με σισπλατίνη σχετίζονται με καρκίνο ιστούς παρουσίασαν θετική RRM2 ανοσολογική είχαν χειρότερη πρόγνωση. Τριάντα ένας ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας έλαβαν ταυτόχρονη χημειοακτινοθεραπεία (CCRT) με σισπλατίνη ή επικουρική χημειοθεραπεία που περιέχει σισπλατίνη. Των 28 ασθενών που είχαν καρκινικούς ιστούς θετικό για RRM2, 14 είχαν υποτροπή ή λήξει. Ωστόσο, σε 3 ασθενείς που είχαν καρκινικούς ιστούς αρνητικό για RRM2, κανένα από αυτά δεν έδειξε υποτροπή ή λήξει.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι οι κυτταροτοξικές επιδράσεις της σισπλατίνης αυξήθηκαν σε κύτταρα με μεγαλύτερη μείωση της έκφρασης RRM2 (shRRM2 # 354) σε σύγκριση με τα κύτταρα με λιγότερη μείωση της έκφρασης RRM2 (shRRM2 # 962). Επειδή RRM2 ενδέχεται να τροφοδοτήσει την επιδιόρθωση του DNA, και επειδή ο κύκλος εξαρτώμενη δραστικότητα των κυττάρων του RNR ρυθμίζεται από επίπεδα RRM2 [8], RRM2 σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Ως εκ τούτου, εάν το γονίδιο RRM2 καταρριφθεί στο SiHa του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μπορεί να επηρεαστεί. Αυτό υποστηρίζεται από το εύρημα ότι knockdown του RRM2 πρωτεΐνης αξιοσημείωτα ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων του UM-UC-3 καρκινικών κυττάρων κύστης [17]. RRM2 αυξορρύθμιση έχει αποδειχθεί ότι αυξάνουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τον κακοήθη δυναμικό ορισμένων τύπων καρκίνων, και ότι η αναστολή της RRM2 μειωμένη πολλαπλασιασμού των κυττάρων in vitro και in vivo [18], [19]. Lin et al. υποτεθεί ότι τα σταθερά knockdown της υπομονάδας R2 οδηγεί σε μειωμένη σισπλατίνη που προκαλείται από πλήρωσης κενού σύνθεση σε νουκλεοτίδιο επιδιόρθωση εκτομής και ένα μειωμένο επίπεδο dATP στο G

2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου, και ότι αυτό παρεμβαίνει με την επισκευή του μονόκλωνης κενά που κατά τα άλλα μετατρέπονται σε δίκλωνα σπασίματα στην επόμενη φάση S σε HCT-116 ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα [20]. Αν και το γονίδιο RRM2 χτυπήθηκε κάτω και τα επίπεδα έκφρασης των RRM2 μειώθηκαν, η SiHa shRRM2 # 354 και # 962 κυτταρικές σειρές είχε ακόμη αρκετά επίπεδα έκφρασης της RRM2 να διατηρήσει απρόθυμα κυττάρων βιωσιμότητες τους μετά από 48 ώρες καλλιέργειας στην παρούσα μελέτη (τα δεδομένα δεν έδειξε). Ως εκ τούτου, οι κυτταρικές βιωσιμότητες των SiHa shRRM2 κυτταρικών γραμμών # 354 και # 962 δεν μειώθηκαν σε στατιστικές έννοιες, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου SiHa shLuc στη μελέτη μας. Η φίμωση RRM2 μόνο του δεν είχε επίδραση αρκετά ισχυρή για να μειώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων με στατιστική σημαντικότητα. Η σισπλατίνη δεσμεύεται με DNA και προάγει τον σχηματισμό προϊόντων προσθήκης λευκοχρύσου-ϋΝΑ, που μπορούν να καθορίζουν δια- και ενδο-κλώνου DNA διασταυρούμενων συνδέσεων και, στη συνέχεια, αναστέλλει την αντιγραφή του DNA [9]. RRM2 δεν ανέστειλε τοξικότητα σισπλατίνης ειδικά. Μετά την προσθήκη του σισπλατίνη, ο επιδεινώσει επίδραση της μειωμένης πολλαπλασιασμό των κυττάρων που προκύπτουν από δια- και ενδο-κλώνου DNA διασταυρωμένες συνδέσεις από σισπλατίνη και από μειωμένη συμπλήρωμα DNA με RRM2 knockdown οδήγησε σε μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητες με στατιστική σημασίες σε # 354 και # 962 κυτταρικές σειρές. Η σίγηση της έκφρασης RRM2 σε SiHa # 354 και # 962 κυττάρων κύτταρα επαυξημένης τοξικότητα σισπλατίνης.

Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι η ανοσοαντιδραστικότητα RRM2 σε καρκινικούς ιστούς είναι υψηλότερη από ότι σε υψηλού βαθμού δυσπλασία, χαμηλού βαθμού δυσπλασία και κανονική ιστούς του τραχήλου της μήτρας. RRM2 υπερέκφραση έχει συσχετιστεί με καρκίνο του τραχήλου καρκινογένεση. Fan et al. κατέδειξε ότι η πρωτεΐνη R2 δεν είναι μόνο ένα συστατικό περιορισμού του ρυθμού για τη μείωση ριβονουκλεοτίδιο, αλλά είναι επίσης ικανή να συνεργάζεται με μια ποικιλία από ογκογονίδια στους μηχανισμούς του κυτταρικού μετασχηματισμού και ογκογένεση [21]. RRM2 υπερέκφραση υπομονάδας έχει επίσης παρατηρηθεί σε καρκίνο του στομάχου και της ουροδόχου κύστης καρκινικών όγκων [17], [22]. Σε αντίθεση με τα ευρήματα της Morikawa et al. [17] στην οποία αποδείχθηκε θετική χρώση καρκίνωμα in situ ιστούς της ουροδόχου κύστης, RRM2 προς τα πάνω ρύθμιση δεν βρέθηκε στα υψηλής ποιότητας ιστούς δυσπλασία του τραχήλου της μήτρας στην παρούσα μελέτη. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στις διαφορετικές συνεργαζόμενους ογκογονιδίων που μετασχηματίζουν κύτταρα με διαφορετικούς μηχανισμούς. Ογκογόνο στρες έχει αναφερθεί ότι παράγουν ανεπάρκεια dNTP και την επακόλουθη στρες αντιγραφής του DNA τυπικό της πρόωρης ογκογόνο περίπτωση [23]. RRM2 έχει αναφερθεί ότι ρυθμίζεται μεταγραφικά από τον κύκλο-σχετιζόμενους παράγοντες κυττάρων όπως E2F [24]. Επιπλέον, Liu et al. πρότεινε ότι μια αυξημένη έκφραση hRRM2 προκαλεί το οξειδωτικό στρες και ενεργοποιεί τον /Raf /σηματοδοτικό μονοπάτι ΜΑΡΚ Ras [25]. Η χρώση του RRM2 βρέθηκε να είναι η πυρηνική σε αυτή τη μελέτη. Niida και Zhang διαπίστωσε ότι RRM2 προσλαμβάνεται στον πυρήνα για να εξασφαλιστεί η τοπική διαθεσιμότητα dNTPs για την αποτελεσματική σύνθεση επιδιόρθωσης του DNA σε απόκριση σε βλάβη του DNA [26], [27]. D’Angiolella et al. Διαπιστώθηκε ότι σε απόκριση προς γενοτοξικό στρες, RRM2 συσσωρεύεται στους πυρήνες των HeLa τραχήλου καρκινικών κυττάρων [2]. Απέδειξαν επίσης ότι η χρονική στιγμή της συσσώρευσης RRM2 μετά από βλάβη του DNA είναι παράλληλη με το χρονοδιάγραμμα της επιδιόρθωσης του DNA.

Η μελέτη μας έδειξε ότι μια θετική έκφραση RRM2 συσχετίζεται με κακή κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά όπως ηλικία, προχωρημένο στάδιο, εκτός από το στάδιο Ι , βαθιά εισβολή στρωματικά, μεγάλους όγκους, υψηλής ποιότητας όγκους και θετική parametrial εισβολή. RRM2 έτειναν να εκφράζεται έντονα στους ασθενείς με θετικό πυέλου μετάσταση λεμφαδένα σε χειρουργική επέμβαση. Σε ορισμένους τύπους καρκίνου, ένα υψηλό επίπεδο έκφρασης RRM2 έχει αναφερθεί ότι συσχετίζεται με την κυτταρική διεισδυτικότητα [28], αγγειογένεση όγκου [19], μετάσταση [25] και την κακή έκβαση των ασθενών [29]. Η υπερέκφραση του RRM2 έχει καταδειχθεί ότι συσχετίζεται με μια αύξηση στην επιθετική πιθανότητα κύτταρο σε ένα ανθρώπινο ΚΒ στοματοφαρυγγικής κυτταρική γραμμή καρκινώματος [3]. RRM2 μπορεί να αλληλεπιδράσει με μια ποικιλία των ογκογονιδίων που προωθούν την εξέλιξη του όγκου και να ενισχύσει την ικανότητα εισβολής των καρκινικών κυττάρων [30]. Morikawa et al. έδειξαν ότι RRM2 υπερέκφραση συνδέεται μόνο σημαντικά με propria μυϊκό εισβολή, αλλά δεν έδειξε σημαντική συσχέτιση με άλλες παραμέτρους, όπως μετάσταση λεμφαδένα [17]. Wang et al. έδειξε ότι οι ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών με την κλινική ΦΥΓΩ στάδια ΙΙΙ-IV παρουσιάζουν υψηλότερα γονίδιο RRM2 εκφράσεις από αυτούς με κλινικές ΦΥΓΩ φάσεις Ι-ΙΙ [31].

Στην παρούσα μελέτη, μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι οι ασθενείς καρκίνου του τραχήλου με βαθύ εισβολή στρωματικά, μεγάλης διαμέτρου του όγκου, parametrial εισβολή, και πυελική μετάσταση λεμφαδένα, καθώς και θετική έκφραση RRM2 έχουν κακή μέση και διάμεση επιβίωση, χαμηλό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών, και ένα υψηλό HR του θανάτου. Οι ασθενείς με θετικά εκφράσεις RRM2 βρέθηκαν να έχουν σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης και μεγαλύτερη πιθανότητα υποτροπής. Rosty et al. χρησιμοποίησε μια Affymetrix HG-U133A ολιγονουκλεοτίδιο μικροσυστοιχιών για να δείξει ότι η έκφραση του HPV Ε6 /Ε7 παίζει βασικό ρόλο στην πρόοδο του διηθητικού καρκίνου του τραχήλου της μήτρας μέσω της απορρύθμισης των γονιδίων του συμπλέγματος πολλαπλασιασμού καρκίνου του τραχήλου με αυξημένο μέσο επίπεδο έκφρασης του 123 μοναδικά γνωστά γονίδια, συμπεριλαμβανομένων RRM2 [ ,,,0],32]. Τα μέσα επίπεδα έκφρασης αυτών των γονιδίων ήταν υψηλότερα σε τραχήλου καρκινικούς όγκους με πρώιμη υποτροπή από ό, τι σε όγκους με ένα ευνοϊκό πορεία. RRM2 έχει επίσης αναφερθεί ότι είναι ένας προγνωστικός βιοδείκτη σε καρκίνους του παχέος [33]. Wang et al. Βρέθηκε ότι η επιβίωση των ασθενών με χαμηλό επίπεδο RRM2 mRNA είναι σημαντικά ανώτερη σε ασθενείς με υψηλά επίπεδα σε καρκίνο των ωοθηκών [31]. Με Cox ανάλυση αναλογικό μοντέλο κινδύνου, ο κίνδυνος θνησιμότητας για τους ασθενείς με υψηλά επίπεδα έκφρασης του mRNA RRM2 ήταν 2.553 φορές μεγαλύτερη από ό, τι για εκείνους με χαμηλή εκφράσεις. Ωστόσο, μόνο βαθιά εισβολή στρωματικών είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας χρησιμοποιώντας πολυμεταβλητή ανάλυση στην παρούσα μελέτη. Πολλές μελέτες έχουν υποστηρίξει ότι τα στρωματικά εισβολή είναι ένας ισχυρός ανεξάρτητος προγνωστικός της συνολικής επιβίωσης για τους ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [34] – [39].

Σε ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με σισπλατίνη που περιέχουν, εκείνες των οποίων ο καρκίνος ιστούς παρουσίασε θετική RRM2 έκφραση φάνηκε να έχουν χειρότερη πρόγνωση από εκείνους με αρνητική έκφραση RRM2. Τα καρκινικά κύτταρα είναι πιο ευαίσθητα στην κυτταροτοξική δράση της αναστολής RNR από τα φυσιολογικά κύτταρα, λόγω της αυξημένης ανάγκης για dNTPs για πολλαπλασιασμό και μειωμένη προσαρμοστικότητα και τα χαμηλά αποκρισιμότητα σε ρυθμιστικά σήματα. Έτσι, αυτό το ένζυμο έχει από καιρό θεωρείται ότι είναι ένα εξαιρετικό στόχο για τον καρκίνο του χημειοθεραπεία [3], [40]. Επειδή ο κύκλος εξαρτώμενη δραστικότητα των κυττάρων του RNR ρυθμίζεται από το επίπεδο του RRM2 [8], [21], ο ρόλος του RRM2 είναι πολύ σημαντική.

Υπάρχουν διάφοροι περιορισμοί σε αυτήν την μελέτη. Το μέγεθος του δείγματος των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη σε CCRT ή επικουρική πρωτόκολλα χημειοθεραπείας ήταν πολύ μικρή. Οι περισσότεροι από τους ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας είχαν σταδίου Ι ή ΙΙ, και ως εκ τούτου μόνο λίγες ασθενείς έλαβαν θεραπεία που περιέχουν σισπλατίνη. Μόνο 3 ασθενείς με αρνητικές εκφράσεις RRM2 λάβει επικουρική θεραπεία με σισπλατίνη σχετίζονται και όλοι είχαν καλύτερη πρόγνωση. Αυτό συνεπάγεται επίσης ότι οι ασθενείς καρκίνου του τραχήλου των οποίων ο καρκίνος ιστούς παρουσίασαν μια αρνητική έκφραση RRM2 είχαν καλύτερη πρόγνωση, και ως εκ τούτου ο αριθμός αυτών των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη περιέχουν ήταν πολύ περιορισμένη. Επιπλέον, πολλοί παράγοντες που δημιουργούν σύγχυση θα πρέπει να προσαρμοστούν, συμπεριλαμβανομένου του βάθους στρωματικά εισβολή, βαθμός όγκου, το μέγεθος του όγκου, κολπική ή parametrial εισβολή, μετάσταση λεμφαδένα και πρωτόκολλα χημειοθεραπείας. Εμείς δεν θα μπορούσε να αναλύσει την επίδραση της έκφρασης RRM2 στις ασθενείς που έλαβαν σισπλατίνη με στατιστική σημαντικότητα. Περαιτέρω μελέτες δικαιολογείται να καθοριστεί η επίδραση της RRM2 για την ακριβή επίδραση της σισπλατίνης.

Μέχρι σήμερα, λίγες μελέτες έχουν διερευνήσει την επίπτωση των RRM2 στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι RRM2 μπορούσε να είναι ένα νέο μοριακό δείκτη για τη διάγνωση και την κλινική έκβαση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Συμμετέχει στην τραχηλική καρκινογένεση και προβλέπει κακή επιβίωση, και μπορεί να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος συμπεριλαμβανομένης σισπλατίνης θεραπεία.