Αφηρημένο

Η ανάπτυξη των δενδριτικών κυττάρων εμβόλια που βασίζονται είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Για την επιτυχή χρήση τους σε κλινικές, ο πολλαπλασιασμός και η λειτουργικότητα των DCs είναι ζωτικής σημασίας. Εμείς νωρίτερα δημιουργήσει μια μέθοδο δύο σταδίων για την παραγωγή μεγάλης κλίμακας των DC από το αίμα του ομφάλιου λώρου που προέρχονται ΤΜΧ /CD34 + κύτταρα. Το έργο αυτό αποσκοπεί στη βελτίωση της λειτουργικότητας τους με βάση τις ακόλουθες παρατηρήσεις:

in vitro

δημιουργείται ΑΧ μπορεί να είναι λιγότερο αποτελεσματική στη μετανάστευση και άλλες λειτουργικές δραστηριότητες λόγω των χαμηλότερων εικοσανοειδών επίπεδα. Η παραγωγή εικοσανοειδών από αραχιδονικό οξύ (ΑΑ) μπορεί να παρεμποδίζεται λόγω της καταστολής του ενζύμου φωσφολιπάση Α2 από την IL-4, ένα βασικό κυτοκίνης που απαιτείται για την διαφοροποίηση των DC. Υποθέσαμε ότι η εξωγενής προσθήκη του ΑΑ στο μέσο καλλιέργειας κατά την παραγωγή συνεχούς ρεύματος μπορεί να οδηγήσει σε DCs με βελτιωμένη λειτουργικότητα. ΑΧ παράχθηκαν με και χωρίς ΑΑ. Τα δύο σύνολα DC συγκρίθηκαν με φαινοτυπική ανάλυση, μορφολογία και λειτουργικές δοκιμασίες, όπως η πρόσληψη αντιγόνου, MLR, δοκιμασία CTL και

in vitro

και

in vivo

μετανάστευσης. Αν και δεν υπήρχαν διαφορές μεταξύ των δύο τύπων των ΑΧ όσον αφορά τη μορφολογία, το φαινότυπο και την πρόσληψη αντιγόνου, AA

+ δενδριτικά κύτταρα παρουσίασαν βελτιωμένες

in vitro

και

in vivo

μετανάστευση, Τ διεγερτική ικανότητα των κυττάρων, CTL δραστικότητα και σημαντικά υψηλότερα επίπεδα μεταγραφής του COX-2. AA

+ ΑΧ δείχνουν επίσης ένα ευνοϊκό προφίλ κυτοκίνης Th1 από ΑΑ

– ΑΧ. Έτσι προσθήκη του ΑΑ στο μέσο καλλιέργειας είναι λοξές το DCS προς την έκκριση του περισσότερο IL-12 και λιγότερο από IL-10 μαζί με την αποκατάσταση των επιπέδων εικοσανοειδών σε ένα μεσολάβηση οδό COX-2 ενισχύοντας έτσι τη λειτουργικότητα αυτών των κυττάρων που θα χρησιμοποιηθούν ως ένα ισχυρό κυτταρικό εμβόλιο. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά θα είναι χρήσιμη για την καλύτερη επινόηση της DC εμβολίων που βασίζονται για την ανοσοθεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Kumar J, Gurav R, Καλέ V, Limaye L (2014) εξωγενή προσθήκη του αραχιδονικού οξέος σε Πολιτισμός Media ενισχύει τη λειτουργικότητα των δενδριτικών κυττάρων για την πιθανή χρήση τους στην ανοσοθεραπεία καρκίνου. PLoS ONE 9 (11): e111759. doi: 10.1371 /journal.pone.0111759

Επιμέλεια: Thorbald van Hall, Leiden University Medical Center, Ολλανδία

Ελήφθη: 13 του Ιουνίου, 2014? Αποδεκτές: 30 Σεπτεμβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 4 Νοεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Kumar et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι μέσα στα αρχεία υποστήριξης Πληροφορίες

Χρηματοδότηση:. Το έργο έλαβε κονδύλια από το Τμήμα Βιοτεχνολογίας (DBT), η κυβέρνηση της Ινδίας μέσω της επιχορήγησης όχι. BT /PR13565 /MED /31/89/2010. JK έλαβε υποτροφία του από του Συμβουλίου της Επιστημονικής και Βιομηχανικής Έρευνας (CSIR) Ινδία και από DBT (PR-4930/31). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα δενδριτικά κύτταρα (DCs) είναι πιο αποτελεσματική αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APC) τα οποία αναγνωρίζουν το σύμπαν των αντιγόνων και τον έλεγχο των διαφόρων τύπων των απαντήσεων [1], [2]. ΑΧ είναι ικανό να συλλάβει αντιγόνων, την επεξεργασία τους και την παρουσίασή τους με κατάλληλα μόρια συν-διέγερσης και την έναρξη ανοσολογική απόκριση [3], [4]. DCs δεν είναι κρίσιμα μόνο για την επαγωγή και των δύο πρωτογενών και δευτερογενών κυτταρικών ανοσοαποκρίσεων Τ και Β, αλλά είναι επίσης σημαντική για την επαγωγή ανοσολογικής ανοχής. ΑΧ βρίσκονται στο κέντρο του ανοσοποιητικού συστήματος και τη διαμόρφωση της ανοσοαπόκρισης είναι σημαντική στην θεραπευτική ανοσία κατά του καρκίνου [5]. Η μοναδική ικανότητα των DC σε παρουσίαση αντιγόνου και ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης τους έχει γίνει μια ελκυστική πρόσθετο σε ανοσοθεραπεία καρκίνου [6]. Οι πρόοδοι στο

in vitro

πρωτόκολλα παραγωγής DC και καλύτερη κατανόηση της βιολογίας DC έχουν οδηγήσει στη χρήση τους ως εμβόλια DC στις κλινικές. Από την πρώτη έκθεσή της το 1995, έχουν μεγάλο αριθμό κλινικών μελετών έχουν διεξαχθεί για την αξιολόγηση των εμβολίων DC-βασίζεται κατά περισσότερο από μια ντουζίνα διαφορετικά είδη όγκων [7], [8], [9]. Η κλινική χρήση των DCs απαιτεί επαναλαμβανόμενη εμβολιασμός να επάγουν σχετικά υψηλές συχνότητες του ειδικού αντιγόνου του όγκου κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTLs) και μια πλήρης απόκριση. Αυτό με τη σειρά του απαιτεί ένα μεγάλο αριθμό ΑΧ, παράγεται

ex vivo

[10].

ΑΧ μπορεί να παραχθεί από CD34

+ κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα βήμα ή ένα συστήματα καλλιέργειας δύο σταδίων . Στον πρώτο τύπο συστήματος καλλιέργειας CD34 είναι

+ κύτταρα που αναπτύσσονται με έναν συνδυασμό αυξητικών παραγόντων, όπου σε αυτές άμεσα διαφοροποιούνται ως δενδριτικά κύτταρα [11], [12], [13]. Από την άλλη πλευρά, στο σύστημα δύο σταδίων καλλιέργειας CD34 είναι

+ κύτταρα επεκτάθηκαν για πρώτη φορά σε μεγάλη κλίμακα ως πρόδρομοι DC. Αυτά επεκταθεί κύτταρα διαφοροποιούνται περαιτέρω ως δενδριτικά κύτταρα [14], [15], [16], [17]. Παρά την πλήρη κατανόηση των πολύπλοκων DC-μεσολάβηση ρύθμιση των αντιδράσεων των λευκοκυττάρων υποδοχής,

in vitro

δημιουργείται ΑΧ δεν μπορεί να αντιπροσωπεύει το ισοδύναμο των μεταναστευτικών DC

in vivo

, περιορίζοντας έτσι τη χρήση τους ως μαγικές σφαίρες για να βελτιωθεί η ακρίβεια και αποτελεσματικότητα στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Πρόσφατες πειραματικές αποδείξεις δείχνουν ότι τα ανθρώπινα προερχόμενα από μονοκύτταρα DC (MoDC) μπορεί να παρεμποδίζεται στην ικανότητά τους να μεταναστεύουν σε απόκριση σε φλεγμονώδη καθώς και ομοιοστατική χημειοταξίνες [18]. Προηγούμενες εκθέσεις δείχνουν ότι η IL-4, η οποία είναι μια σημαντική κυτοκίνη για

in vitro

DC γενιάς, αναστέλλει πολλά από τα κατάντη οδούς αραχιδονικού οξέος (ΑΑ) μεταβολισμός με αποτέλεσμα την μειωμένη παραγωγή των εικοσανοειδών και του παράγοντα ενεργοποίησης αιμοπεταλίων ( PAF). Η προσταγλανδίνη Ε

2 (PGE

2) είναι ένα μέλος της οικογένειας των εικοσανοειδών οξυγονωμένα παράγωγα ΑΑ. Το πρώτο βήμα της

2 βιοσύνθεση PGE είναι η απελευθέρωση του ΑΑ από φωσφολιπίδια της μεμβράνης μέσω φωσφολιπάσες όπως η φωσφολιπάση Α2 (PLA

2). Δεδομένου ότι τα εικοσανοειδή και ΡΑΡ γνωστό ότι παίζουν ένα σημαντικό ρόλο σε διεργασίες όπως η μετανάστευση λευκοκυττάρων, ενεργοποίηση φυσικών κυττάρων-φονιάδων, και τον τύπο διαφοροποιήσεις 2 βοηθητικών Τ κυττάρων, η ανεπάρκεια στη βιοσύνθεση αυτών των παραγόντων μπορεί να ευθύνεται για τις παρατηρούμενες μειονεκτημάτων των MoDCs [19] .

Εμείς νωρίτερα δημιούργησε ένα πλαστικό μέθοδο προσκόλληση δύο σταδίων για την παραγωγή μεγάλης κλίμακας της ΑΧ που προέρχονται τόσο από τον ομφάλιο CD34 αίματος ομφάλιου λώρου + κύτταρα [17] και ΤΜΧ (μονοπύρηνα κύτταρα) [20]. Τα δενδριτικά κύτταρα που παράγονται με τη μέθοδο μας έχουν ένα ώριμο φαινότυπο και είναι λειτουργικά ενεργό. Ωστόσο, ένα από τα κυτοκινών χρησιμοποιείται για τη δημιουργία DCs μέσω της μεθόδου μας είναι η IL-4 και όπως αναφέρθηκε παραπάνω η IL-4 μπορεί να επηρεάσει την απελευθέρωση του αραχιδονικού οξέος από το membrane.We υπέθεσαν ότι η εξωγενής προσθήκη του ΑΑ σε καλλιέργειες μας κατά τη διάρκεια του σταδίου διαφοροποίησης μπορεί να βοηθήσει στην περαιτέρω βελτίωση των λειτουργιών της ΑΧ. Το σκεπτικό για την προσθήκη εξωγενούς ΑΑ ήταν ότι μπορεί να πάρει μετατρέπεται σε προσταγλανδίνες σε ένα κυκλοοξυγενάσες-1 (COX-1) και κυκλοοξυγενάσες-2 (COX-2) εξαρτώμενο τρόπο. Για να ελέγξετε την υπόθεση αυτή, στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε την επίδραση της προσθήκης ΑΑ στο

in vitro

DC γενιά. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι πράγματι ΑΑ

+ ΑΧ είναι ανώτερες λειτουργίες, όπως η βελτιωμένη

in vitro

και

in vivo

μετανάστευση, την ικανότητα διεγερτική των Τ κυττάρων, πρόσληψη αντιγόνου, δραστηριότητα CTL, σημαντικά υψηλότερο επίπεδα μεταγραφή της COX-2 και ένα ευνοϊκό κυτοκίνη Th1 από ΑΑ

– ΑΧ. Έτσι, τα ευρήματά μας μας πάει ένα βήμα πιο κοντά προς την επίτευξη της μορφής βελτιώνουν τα εμβολίου καρκίνου DC βάση.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτοκίνες

Οι ανασυνδυασμένη ανθρώπινη κυτοκίνες που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη ήταν Fms όπως τυροσίνη κινάση 3 συνδέτη (Flt-3L), θρομβοποιητίνη (ΤΡΟ), παράγοντα βλαστοκυττάρων (SCF), ιντερλευκίνη-4 (IL-4), κοκκιοκυττάρων μονοκυττάρων -αποικία παράγοντας διέγερσης (GM-CSF), παράγοντας νέκρωσης όγκων-α (TNF-α), συνδέτη CD40 και χημειοκίνης συνδετήρα-19 (CCL-19). Όλα ανασυνδυασμένη ανθρώπινη κυτοκίνες αγοράστηκαν από Peprotech Ασία, Revohot Ισραήλ

Αντισώματα

Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για την κυτταρομετρία ροής ήταν αντι-ανθρώπου μονοκλωνικά αντισώματα ποντικιού:. CD1a, CD34, CD11c, CD40, CD8 -APC ετικέτα ? CD14, CD20, CD33, CD58, CD80, CD83, CD86, HLA-A2, CD45RA ΡΕ ετικέτα? CD3, CD54, HLA-DR, HLA-ABC-FITC ετικέτα, αντι CD ποντικού 45.1-PB ετικέτα και CCR-7 (καθαρισμένο αντιανθρώπινο mAb αρουραίου). Όλα τα μονοκλωνικά αντισώματα και τα αντίστοιχα στοιχεία ελέγχου ισοτύπου που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη αγοράσθηκαν από BD Pharmingen (San Diego, CA).

Άλλα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται

Το αραχιδονικό οξύ- (Cat. Νο είναι A3555) από Sigma Aldrich, μία καλλιέργεια ιστών δοκιμάστηκε προϊόν που προέρχεται από ήπαρ χοίρου. Η καθαρότητα του προϊόντος ήταν ≥99% όπως αναλύθηκε με τριχοειδή αεριοχρωματογραφία

Ficoll Hypaque-Histopaque (πυκνότητα 1,007 g /ml).? Ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) -σημασμένου δεξτράνης (40 kDa)? Wright Stain, χρώση Giemsa, λιποπολυσακχαρίτης, ϋΜΕΜ (Μέσο Eagle Τροποποιημένο Μέσο) και ΙΜϋΜ (Iscove Τροποποιημένο Μέσο του Dulbecco), όλα ήταν από την Sigma Aldrich? κιτ ELISA (BD OptEIA)? Η ηπαρίνη από SRL Pvt. Limited, Mumbai? Υδροξυ αιθυλο άμυλο (HES), Ροζέτα Σεπτέμβριο για την απομόνωση των Τ κυττάρων (Stem τεχνολογίες κυψελών, Βανκούβερ, Καναδάς)? [

3Η] θυμιδίνης (240 GBq /milli mole, BRIT, Navi Mumbai, Ινδία)? Διμεθυλοσουλφοξείδιο (ΜΡ βιοϊατρική, Ohio, USA)? Dynal κιτ για απομόνωση mRNA (Dynal ASA, Όσλο της Νορβηγίας).

Συλλογή και επεξεργασία των δειγμάτων αίματος του ομφάλιου λώρου

αίμα του ομφάλιου λώρου (CB) δείγματα ελήφθησαν από τα τοπικά νοσοκομεία, σύμφωνα με το διοικητικό συμβούλιο θεσμική αναθεώρηση [Θεσμική Επιτροπή Δεοντολογίας (IEC) και Θεσμικών Επιτροπή για Έρευνα των βλαστικών κυττάρων (IC-SCRT)] -approved ηθικές κατευθυντήριες γραμμές που είναι σύμφωνα με την Διακήρυξη του Ελσίνκι. Ελήφθη από ενημέρωση γραπτή συγκατάθεση της μητέρας. Η διαδικασία συναίνεσης εγκρίθηκε από IC-SCRT. Τα αντίγραφα των υπογεγραμμένων εντύπων συγκατάθεσης αριθμημένα και κατατίθεται μαζί μας. Τα δείγματα συλλέχθηκαν σε αποστειρωμένα δοχεία που περιέχουν συντηρητικά χωρίς ηπαρίνη (40 IU ηπαρίνης /ml αίματος) σε απλή IMDM. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο για παγοκύστες και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για να απομονωθούν τα μονοπύρηνα κύτταρα (ΤΜΧ).

Απομόνωση των ΤΜΧ

ΤΜΧ αίμα του ομφάλιου λώρου διαχωρίζονται με φυγοκέντρηση βαθμίδας Hypaque FICOLL-. Τα κύτταρα στη μεσόφαση συλλέχθηκαν και πλύθηκαν για να απομακρυνθεί το Ficoll-hypaque. Εμπύρηνα αριθμός των κυττάρων (χρώση κρυσταλλικού ιώδους) ελήφθη και οι πολυεθνικές χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή DC.

Η απομόνωση των Τ-κυττάρων από το περιφερικό αίμα

Περιφερικό αίμα συλλέχθηκε από υγιείς δότες, σύμφωνα με τη θεσμική αναθεώρηση επιτροπή. [Θεσμική Επιτροπή Δεοντολογίας (IEC) και Θεσμικών Επιτροπή για Έρευνα των Βλαστικών Κυττάρων (IC-SCRT)] -approved ηθικές κατευθυντήριες γραμμές που είναι σύμφωνα με την Διακήρυξη του Ελσίνκι. Ελήφθη από ενημέρωση γραπτή συγκατάθεση του υγιούς δότη. Η διαδικασία συναίνεσης εγκρίθηκε από IC-SCRT. Τα αντίγραφα των υπογεγραμμένων εντύπων συγκατάθεσης αριθμημένα και κατατίθεται μαζί μας. Τ κύτταρα που απομονώνονται από το αίμα χρησιμοποιώντας αρνητικές κιτ επιλογής (Rosette Σεπτέμβριο) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Stem τεχνολογίες κυψελών). Μετά FICOLL- κύτταρα κλίση Hypaque φυγοκέντρηση σε ενδιάμεση φάση του Ficoll και μεσαίου συλλέχθηκαν, πλένονται στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα.

In Vitro

Γενιάς και Πολιτισμού της ΑΧ

Επέκταση πολιτισμών και πλαστικά προσκόλληση.

ΤΜΧ (νωπά ή κατεψυγμένα) επεκτάθηκαν για 3 εβδομάδες, στη συνέχεια, εμπλουτισμένα για τα κύτταρα CD14 + από πλαστικό προσκόλληση και στη συνέχεια διαφοροποιούνται, όπως περιγράφεται παραπάνω [17], [20]. Εν συντομία, μετά από 21 ημέρες από την επέκταση, τα κύτταρα πλύθηκαν και σπάρθηκαν σε πυκνότητα 3 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκα έξι φρεατίων που περιέχει 2 ml IMDM συμπληρωμένο με 1% αυτόλογο πλάσμα. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν επί 1,5 ώρα στους 37 ° C σε 5% CO

2 επώασης και το μη προσκολλημένα και χαλαρώς προσκολλημένα κύτταρα απομακρύνθηκαν με πλύση με IMDM. Τα προσκολλημένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή DC

Διαφοροποίηση της ΑΧ από προδρόμους παρουσία ΑΑ (ΑΑ

+ ΑΧ) και απουσία ΑΑ (ΑΑ

– ΑΧ)..

Οι πληθυσμοί πρόδρομο κύτταρο χωρίστηκαν σε δύο ομάδες. Τα κύτταρα επάγονται προς διαφοροποίηση όπως DCs με καλλιέργεια αυτών σε GM-CSF (50 ng /ml) και IL-4 (30 ng /ml) για 3 ημέρες, κατά την ημέρα 3

ου GM-CSF (50 ng /ml) συν TNF-α (30 ng /ml) προστέθηκαν σε καλλιέργειες και περαιτέρω διατηρήθηκε για 4 ημέρες σε ΙΜϋΜ συμπληρωμένο με 5% αυτόλογο πλάσμα. Προκειμένου να εκτιμηθεί η επίδραση της ΑΑ, ένα σύνολο καλλιέργεια διατηρήθηκε με 100 μΜ ΑΑ εκτός από τις προϋποθέσεις που αναφέρθηκαν παραπάνω. Την ημέρα 7, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ωρίμανση με ένα συνδυασμό ΤΝΡ-α, λιποπολυσακχαρίτης, και CD40L, σε συγκέντρωση 100 ng /ml το καθένα, για 48 ώρες. Ο πειραματικός σχεδιασμός απεικονίζεται με τη μορφή ενός διαγράμματος ροής Σχ. S1. Σε όλα τα πειράματα ΑΧ παράγεται χωρίς AA θεωρήθηκε ως σύνολο ελέγχου και με ΑΑ θεωρήθηκε ως σύνολο ελέγχου

Μορφολογική Ανάλυση:.. Ράιτ και Giemsa χρώση

Τα προσκολλημένα κύτταρα σε τρυβλία καλλιέργειας μονιμοποιήθηκαν σε μεθανόλη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και χρωματίστηκαν με Wright Giemsa και Stain. Οι παρατηρήσεις έγιναν υπό ανεστραμμένο μικροσκόπιο και ελήφθησαν εικόνες (Όλυμπος IX70)

φαινοτυπική ανάλυση: Η κυτταρομετρία ροής

Ζευγάρι ΑΑ

+ και ΑΑ

– ΑΧ πλύθηκαν και τα αιωρούμενα.. στα 2 × 10

5 κύτταρα σε 100 μL ψυχρού αλατούχου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS) και χρώση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται σύμφωνα με την πρωτόκολλο [17], [20]. Για χρώση CCR-7, τα κύτταρα επωάστηκαν με το πρωτογενές ακολουθείται από δευτερογενή και τριτογενή αντισωμάτων για 25 λεπτά το καθένα. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές, μετά από κάθε επωάσεις αντισώματος και τελικά επαναιωρήθηκαν σε 1% παραφορμαλδεΰδη. Τα κύτταρα αναλύθηκαν σε ένα κυτταρόμετρο ροής (FACS Canto II από BD Pharmingen- San Jose, California). Τα κυτταρικά θραύσματα απομακρύνθηκαν από την ανάλυση χρησιμοποιώντας μια πύλη προς τα εμπρός και την πλευρά διασκορπίζει, και τα συνολικά κύτταρα αναλύθηκαν. Τα δεδομένα αναλύθηκαν και επικαλύψεις ιστόγραμμα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας Diva FACS λογισμικού ηλεκτρονικών υπολογιστών και Cell Quest Pro (Beckon Dickinson San Jose της Καλιφόρνια), αντίστοιχα.

Λειτουργική Χαρακτηρισμός

δοκιμασία Ενδοκυττάρωση με FITC-δεξτράνη.

ανώριμα DCs συλλέχθηκαν την ημέρα 5 επωάστηκαν με FITC-δεξτράνης (20 μg /mL), είτε στους + 4 ° C (έλεγχος εσωτερίκευση) ή στους + 37 ° C, για 30 και 60 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με ψυχρό PBS που περιέχει 0,01% αζίδιο του νατρίου και 1% BSA. Κύτταρα επανα αιωρούνται σε 1% παραφορμαλδεΰδη και αποκτήθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Canto II, BD).

χημειοταξία.

Η χημειοταξία του

in vitro

δημιουργείται ΑΧ προς CCL-19 αξιολογήθηκε σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 24 φρεατίων με BD Falcon

™ κυτταρική καλλιέργεια 0,8 μm ένθετα. 500 μL IMDM με ή χωρίς rhCCL-19 (τελική συγκέντρωση, 500 ng /mL) προστέθηκε στον κάτω θάλαμο, σύμφωνα με τον περιγράφεται πρωτόκολλο [17], [20]. Για τον έλεγχο της ειδικότητας αλληλεπίδρασης υποδοχέα χημειοκίνης (CCR), σε ορισμένα πειράματα DCs προκατεργάστηκαν με CCR-7 αντίσωμα μπλοκαρίσματος για 1 ώρα σε 1 × PBS και στη συνέχεια μελετήθηκαν μετανάστευσή τους προς CCL -19 όπως περιγράφηκε παραπάνω. Τα μεταναστεύσει κύτταρα χρωματίστηκαν με trypan μπλε χρωστική και τα βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ο μέσος αριθμός των κυττάρων που μεταναστεύουν ± τυπική απόκλιση (SD).

Mixed Leukocyte Αντίδραση (MLR).

αλλογενή Τ κύτταρα κατανεμήθηκαν σε 10

5 κύτταρα ανά καλά σε στρογγυλού πυθμένα 96 φρεατίων μικρο πλακών (Greiner Bio-One) και συνκαλλιεργήθηκαν με την παρουσία διαβαθμισμένης αριθμοί ακτινοβολημένων DCs (2500 rad, Co πηγή) σε 200 μλ μέσου που περιέχει 10% ομαδοποιημένο αίμα του ομφάλιου λώρου ΑΒ + πλάσματος. Η ενσωμάτωση θυμιδίνης μετρήθηκε την ημέρα 3 μετά από μια 18-ωρη παλμό με [

3Η] θυμιδίνη (1 μΟί /φρεάτιο) χρησιμοποιώντας τυποποιημένες διαδικασίες [17], [20].

μέτρηση κυτοκίνης.

τα υπερκείμενα από το

in vitro

δημιουργούνται καλλιέργειες DC συλλέχθηκαν σε 48 ώρες μετά την προσθήκη των ερεθισμάτων ωρίμανση και διατηρήθηκαν κατεψυγμένα στους -20 ° C. Τα υπερκείμενα στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για περιεχόμενο κυτοκίνης (IL-10 και IL-12 ρ70) με ELISA χρησιμοποιώντας ένα κιτ ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ποσό ιντερλευκίνες παρούσας στα υπερκείμενα υπολογίστηκαν με συνήθη μέθοδο καμπύλη.

In vitro

CTL (κυτταροτοξικά Τ-λεμφοκύτταρα) δοκιμασία

Παρασκευή κυτταρολύματος.

MCF-7 είναι ένα HLA-A2 περιορισμένο κυτταρική γραμμή και χρησιμοποιήθηκε ως το κύτταρο στόχος γραμμή στην δοκιμασία CTL. Η λύση των κυττάρων MCF-7 έγινε από επανειλημμένη απόψυξη πάγωμα στη συνέχεια ακολουθείται από κατεργασία με υπερήχους. Μετά εκτίμηση πρωτεΐνη αποστείρωση φίλτρου έγινε και το λύμα αποθηκεύθηκε στους -80 ° C για το αντιγόνο πάλλεται με το DCS.

Δημιουργία κυττάρων δραστών και τον ποσοτικό προσδιορισμό CTL.

HLA-A2 θετικά κορδόνι ΤΜΧ αίματος χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργηθεί ΑΧ. Τα ανώριμα DCs επωάσθηκαν με κυτταρόλυμα των MCF-7 σε τελική συγκέντρωση 100 μg /ml πρωτεΐνης μαζί με KLH (αιμοκυανίνη πεταλίδας) 25 μg /ml για 48 ώρες ως ερεθίσματα ωρίμανση στο μέσο καλλιέργειας για διασταυρούμενη παρουσίαση του αντιγόνου όγκου σε αυτόλογα αφελή Τ κύτταρα. Για την ομάδα ελέγχου των DCs, τα ερεθίσματα ωρίμανση που αποτελείται από 100 ng /ml το καθένα από LPS, CD40L και TNF-α. Τα αυτόλογα παρθένα κύτταρα Τ ελήφθησαν δια διαλογής των CD3, CD8 και CD45RA θετικά κύτταρα στο ARIA FACS (BD). Τα αφελή κύτταρα Τ συν καλλιεργήθηκαν με MCF-7 λύμα παλμικά DCs που δημιουργήθηκαν από το ίδιο δείγμα UCB με ή χωρίς ΑΑ. DC-T καλλιέργεια συν κυττάρων διατηρήθηκε για 3 εβδομάδες με την προσθήκη των κυτταροκινών IL-2 (0.1 μg /ml) και IL-7 (5 μg /ml) και εβδομαδιαία διέγερση εκ νέου με φρέσκο ​​αντιγόνο παλμικά DCs για να δημιουργήσει τελεστή Κυτταροτοξικοί Killer Cells . CTL που παράγονται έτσι από LPS παλμική και λύμα παλμικά ΑΑ

+ ΑΧ /ΑΑ

– DCs είχαν συν καλλιεργήθηκαν με τα κύτταρα-στόχους MCF-7 για 18 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με απλά μέσα και στη συνέχεια δονήθηκαν με [3Η] θυμιδίνη επί 8 ώρες. Τοις εκατό θανάτωση των MCF-7 ήταν υπολογίζονται δοκιμασία P-JAM [21], [22] χρησιμοποιώντας το τύπο-% θανάτωση = CPM [Target μόνη της – Στόχος + Killer]. Χ 100 /CPM Target Μόνος

RT PCR ανάλυση

mRNA απομονώθηκε από το ΑΑ

+ ΑΧ και ΑΑ

– ΑΧ χρησιμοποιώντας κιτ Dynabeads mRNA DIRECT σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα εκλουσθέντα mRNA μεταγράφηκαν ανάστροφα σε cDNA με τη χρήση ανάστροφης μεταγραφάσης (Sigma Aldrich) και ολιγο-dT εκκινητές (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες και PCR πραγματοποιήθηκε με ειδικούς εκκινητές. Ο θερμικός κύκλος που χρησιμοποιήθηκε ήταν (95 ° C για 2 λεπτά, 95 ° C για 45 δευτερόλεπτα, ανόπτηση (σύμφωνα με διαφορετικά γονίδια) για 45 δευτερόλεπτα, επέκταση 72 ° C για 2 λεπτά) για 35 κύκλους και μια τελική επέκταση στους 72 ° C για 5 λεπτά. Οι αλληλουχίες εκκινητή που χρησιμοποιείται περιγράφεται στο Σχ. S2.

Homing ώριμων DCs σε NOD-SCID ποντίκια

Το NOD /LtSZ-scid /scid ποντίκια ελήφθησαν από τα εργαστήρια Jackson και εκτράφηκαν στην εγκατάσταση ζώων του ινστιτούτου μας. Η μελέτη διεξήχθη ακολουθώντας τις οδηγίες του ιδρύματος για την κτηνοτροφία και έχει εγκριθεί από IAEC-NCCS /CPCSEA (Θεσμικές ζώων επιτροπή δεοντολογίας-NCCS /Επιτροπής για τον έλεγχο και την εποπτεία των Πειραμάτων σε Ζώα Αριθμός έγκρισης:. IACUC-Θεσμικών ζώων φροντίδα και Επιτροπή Χρήσης, EAF-Experimental Animal Facility /2004 /Β-71). πειραμάτων σε ζώα που περιλαμβάνουν ενδοφλέβια έγχυση πραγματοποιήθηκαν υπό αναισθησία. Ποντίκια σε 4-6 εβδομάδες της ηλικίας εκτέθηκαν σε υπο θανατηφόρα δόση 300 rads ολοσωματική ακτινοβολία από ένα

πηγή 60Co (Gamma Επιμελητήριο 5000, BRIT, Navi Mumbai, Ινδία). 10

6 ΑΑ

+ ΑΧ και ΑΑ

– ΑΧ εγχύθηκαν μέσω της φλέβας της ουράς σε επιμέρους θανάσιμα ακτινοβολημένα ποντίκια (n = 43? Έγχυση του ΑΑ

+ ΑΧ – 20 ποντίκια, το ΑΑ

– ΑΧ – 20 ποντίκια και PBS – 3 ποντίκια). Οι ποντικοί θανατώθηκαν μετά από 18 ώρες για να αξιολογήσει παλιννόστησης των ανθρώπινων DCs στο μυελό των οστών. Homed κύτταρα ταυτοποιήθηκαν ως DC με χρώση με ανθρώπινο mAb CD11c. Ποντικού CD 45.1 mAb χρησιμοποιήθηκε για να αμφισβητηθούν τα κύτταρα παρουσία της μυϊκής προέλευσης

Η στατιστική ανάλυση

Διαφορετικές μεταβλητές της ΑΑ

+ ΑΧ και ΑΑ

-. ΑΧ συγκρίθηκαν. Η στατιστική ανάλυση έγινε χρησιμοποιώντας Sigma Stat (Έκδοση-2,03) και γραφήματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Sigma Plot (Έκδοση 10) (Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA) και GraphPad Prism Software 5 (San Diego, California, USA). Οι στατιστικές αναλύσεις των διαφορών μεταξύ των δύο ομάδων διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα t τεστ. τιμή πιθανότητας: p ≤ 0,05 (*), P≤0.01 (**) & amp? P≤0.001 (***) θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

Η μορφολογική και φαινοτυπική Χαρακτηρισμός της ΑΧ

ΑΑ

+ ΑΧ και ΑΑ

– ΑΧ εμφανίζουν παρόμοια μορφολογία

Οι πρόδρομοι DC που δημιουργούνται μετά από 21 ημέρες από την επέκταση των πολυεθνικών εμπλουτίστηκαν από το πλαστικό μέθοδο τήρηση και την περαιτέρω διαφοροποιημένη ως δενδριτικά κύτταρα [20].. Υπήρχε οριακή διαφορά του απόλυτου αριθμού των DC που δημιουργούνται από τις δύο μεθόδους από ίδιο αριθμό ξεκινώντας πληθυσμού (περίπου 3 × 10

7 AA

+ ΑΧ και 2,5 × 10

7 AA

– DC ανά 10 ΤΜΧ

7 εισόδου). Η μορφολογία της ΑΑ

+ DC και ΑΑ

– ΑΧ ήταν συγκρίσιμη. Διαπιστώθηκε ότι το DCS τόσο από τα σύνολα επέδειξαν τη χαρακτηριστική μορφολογία με πέπλο και συστάδων DC? Σύκο. S3. εικόνες αντίθεσης φάσης έδειξε χαρακτηριστική προσκολλημένα ανώριμων DCs, σε αμφότερες τις σειρές [S-3 (Α)]. Μετά την προσθήκη των ερεθισμάτων ωρίμανσης παρατηρήθηκαν τα τυπικά μη προσκολλημένα συστάδες DC τόσο των καλλιεργειών [S-3 (Β)]. Wright-Giemsa χρώση των ώριμων προσκολλημένων κυττάρων δείχνει την παρουσία της ΑΧ με δενδρίτες στις δύο ομάδες [S-3 (C)]

Το ΑΑ

+ ΑΧ και ΑΑ

-. ΑΧ εμφανίζουν παρόμοια DC φαινότυπο.

In vitro

δημιουργείται ΑΧ βάφτηκαν για ένα πάνελ ειδικών και DC DC συνδέονται δείκτες και αναλύθηκαν στο κυτταρόμετρο ροής. Σύκο. 1Α απεικονίζει το προφίλ κυτταρομετρίας ροής ενός αντιπροσωπευτικού δείγματος με ποσοστό θετικών κυττάρων και τις αξίες των ΝΧΙ σε παρένθεση. AA

+ ΑΧ και ΑΑ

– ΑΧ έδειξε ένα υψηλό και ένα αντίστοιχο ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν διαφορετικές συνδιεγερτικά μόρια όπως CD40, CD80, CD86, DC-συνδέονται ιντεγκρίνης CD11c, μόρια προσκόλλησης, όπως CD54 και CD58, μόρια MHC τάξης II όπως HLA ABC και HLA DR. Σύκο. 1Β και 1Γ απεικονίζει τη φαινοτυπική προφίλ σε σχέση με την επί τοις εκατό θετικότητας και MFI αντίστοιχα, από τρία δείγματα (μέση ± SD, η = 3). Η έκφραση της μυελοειδούς σειράς CD ειδικό δείκτη 33 βρέθηκε σημαντικά υψηλότερη σε ΑΑ

+ ΑΧ (67,4%) σε σύγκριση με ΑΑ

– ΑΧ (38,7%) Εικ. 1Β. τιμές MFI του CD μορίου προσκόλλησης 58 βρέθηκε σημαντικά υψηλότερη σε ΑΑ

+ ΑΧ (1423) σε σύγκριση με ΑΑ

– ΑΧ (1048) Εικ. 1C. Στο σύνολό τους, AA

+ ΑΧ και ΑΑ

– ΑΧ εμφανίζουν παρόμοια μορφολογία και τυπική διάμεση φαινότυπο DC

(Α) FACS ιστόγραμμα προφίλ ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος.. Γεμιστά ιστογράμματα δείχνουν τον έλεγχο ισοτόπου και ανοικτή αυτά δείχνουν το συγκεκριμένο φαινότυπο με τις αντίστοιχες τιμές των ΝΧΙ σε παρένθεση. (Β) φαίνεται ότι πλήρως ώριμα δενδριτικά κύτταρα δημιουργήθηκαν και δεν υπήρχε μεγάλη διαφορά στα επίπεδα έκφρασης των διαφόρων δεικτών επιφανείας, εκτός από CD33 (μυελοειδούς σειράς) ήταν υψηλότερη σε ΑΑ

σύνολα + DC (μέσος όρος ± SD, η = 3, p ≤ 0,05 *). (C) Μπαρ γράφημα για DC συγκεκριμένες και συναφείς δείκτες από την άποψη των ΝΧΙ, για CD 58 (μόριο προσκόλλησης) βρέθηκε η διαφορά σημαντικά υψηλότερη (μέση τιμή ± SD, η = 3, p ≤ 0,05 *). (Δ) με τη μεσολάβηση υποδοχέων πρόσληψη αντιγόνου της ΑΑ

+ ΑΧ και ΑΑ

– ΑΧ: Δεξτράνη-FITC πρόσληψη από ΑΧ (n = 3, μέση τιμή ± SD). Η τιμή ελέγχου (πρόσληψη στους 4 ° C) αφαιρείται από την αντίστοιχη τιμή δοκιμής (πρόσληψη στους 37 ° C).

Η

Λειτουργική Χαρακτηρισμός της ΑΧ

Η ικανότητα ενδοκύττωσης της ΑΑ

+ ΑΧ ήταν υψηλότερο σε σύγκριση με ΑΑ

-. ΑΧ

τα ανώριμα δενδριτικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από την ικανότητα της πρόσληψης αντιγόνου που χρησιμοποιούν διαφορετικούς μηχανισμούς. Αναλύσαμε την ικανότητα των

in vitro

δημιουργείται DCs για πρόσληψη αντιγόνου τη μεσολάβηση υποδοχέα τους με μέτρηση της FITC ετικέτα πρόσληψη δεξτράνη. AA

+ ΑΧ και ΑΑ

– ΑΧ ήταν εξίσου αποτελεσματική στην πρόσληψη μεσολάβηση υποδοχέα σε 30 λεπτά και τα διαστήματα 60 λεπτών ώρα δοκιμάζεται. AA

+ ΑΧ παρουσίασαν υψηλά επίπεδα πρόσληψης και συγκρίσιμων FITC-δεξτράνη σε σύγκριση με ΑΑ

– ΑΧ Εικ. 1D (μέσος όρος ± SD, η = 3).

In vitro

δημιουργείται ΑΧ εκτίθενται περισσότερο πρόσληψη σε διάστημα 60 λεπτών σε σύγκριση με 30 λεπτά, δείχνοντας ότι είναι λειτουργικώς ενεργά και εμφανίζουν αυξημένη πρόσληψη με αύξηση του χρόνου.

Βελτιωμένη

in vitro

χημειοταξία των ΑΑ

+ ΑΧ προς CCL19.

η μετανάστευση των ΑΧ προς μια διαβάθμιση χημειοκινών είναι μια σημαντική λειτουργική ιδιότητα, διότι στα πρωτόκολλα ανοσοθεραπείας πρέπει να είναι σε θέση να τη μετάβαση από το σημείο της ένεσης προς το λεμφαδένες, όπου αλληλεπιδρούν με τα Τ κύτταρα και να ξεκινήσει η ανοσολογική απόκριση. Σύκο. 2Α δείχνει, τα κύτταρα αιωρούνται σε ΙΜϋΜ προστέθηκε στον ανώτερο θάλαμο σε καλά σε 0 ώρες. Δεν αυθόρμητη μετανάστευση παρατηρήθηκε στα φρεάτια μετά από 3 ώρες, όπου δεν προστέθηκε CCL-19 (Σχ. 2Β). Περισσότερο τον αριθμό των ΑΑ

+ ΑΧ (Σχήμα 2D.) Μετανάστευσαν προς CCL-19 σε σύγκριση με ΑΑ

– ΑΧ (Σχήμα 2C.) Και η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική (p ≤ 0,05 *, ** p≤0.01 ? η = 3? Σχ. 2Ε). Μετανάστευση προς CCL19 είναι κυρίως επειδή οι ΑΧ εκφράζουν υποδοχέα CCR7. Όταν βάφονται τα δενδριτικά κύτταρα από τα δύο σύνολα για το αντίσωμα υποδοχέα CCR-7, το ΑΑ

+ ΑΧ και ΑΑ

-. ΑΧ έδειξαν 93,25% και 91,89% θετικά κύτταρα αντίστοιχα μαζί με τις τιμές των ΝΧΙ σε παρένθεση (Σχήμα 2F ). Οι μέσες τιμές MFI των 3 δειγμάτων για ΑΑ

– ΑΧ ήταν 821 ± 156 και ΑΑ

+ ΑΧ ήταν 1089 ± 392. Έτσι, οι δύο ομάδες παρουσίασαν υψηλό και συγκρίσιμο επίπεδο έκφρασης CCR7. Η ειδικότητα της αντίδρασης συνδέτη υποδοχέα CCR7-CCL19 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με αποκλεισμό του υποδοχέα με τον CCR-7 κλείδωμα Ab και στη συνέχεια τον έλεγχο της μεταναστευτικής ικανότητας. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2G υπήρξε μια σημαντική μείωση στη μετανάστευση των κυττάρων σε προεπεξεργασία με ανασταλτικό αντίσωμα στις δύο καλλιέργειες. Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμής ήταν και πάλι σημαντικά υψηλότερη από τα κύτταρα ελέγχου. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η προσθήκη του ΑΑ κατά την διάρκεια σταδίου διαφοροποίησης των DCs βελτιώνει σημαντικά μεταναστευτικά ικανότητά τους.

Μετά από 3 ώρες (Β) αριθ αυθόρμητη μετανάστευση παρατηρήθηκε στα φρεάτια, όπου δεν προστέθηκε CCL-19. Λιγότερο όχι. ΑΑ

– ΑΧ (C) μετανάστευσαν προς CCL-19 από το ΑΑ

+ ΑΧ (D). (Ε) ΑΑ

+ ΑΧ έδειξε στατιστικά αποτελεσματική μετάβαση προς CCL-19 σε σύγκριση με το ΑΑ

– ΑΧ (n = 3, μέση τιμή ± SD). προφίλ ιστόγραμμα (F) FACS ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος που δείχνει έκφραση του CCR-7 υποδοχέα χημειοκινών μαζί με τις τιμές MFI σε παρένθεση. Γεμιστά ιστογράμματα δείχνουν τον έλεγχο ισοτόπου και ανοικτή αυτά δείχνουν το συγκεκριμένο φαινότυπο. (G) Αποκλεισμός με τον CCR-7 Ab προκαλεί σημαντική μείωση της μετανάστευσης και των δύο ΑΑ

+ ΑΧ και ΑΑ

– ΑΧ (n = 3, μέση τιμή ± SD). [P ≤ 0,05 (*), P≤0.01 (**) & amp? P≤0.001 (***)].

Η

ΑΑ

+ ΑΧ παρουσίασαν λειτουργία διεγερτική ανώτερη Τ-κυττάρων.

Τα δενδριτικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από την ικανότητά τους να διεγείρουν αλλογενή κύτταρα Τ . Αυτή η ικανότητα αξιολογήθηκε με MLR. Η MLR πραγματοποιήθηκε με ανάμειξη του ΑΑ

+ DCs και ΑΑ

– DCs με αλλογενή Τ κύτταρα από περιφερικό αίμα σε διαφορετικές αναλογίες. Τριπλών αντιγράφων ήταν που λαμβάνονται για κάθε συγκέντρωση δοκιμάστηκε. Ο πολλαπλασιασμός των Τ κυττάρων μετρήθηκε με την δοκιμασία πρόσληψης θυμιδίνης όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Δεδομένα από το Σχ. 3 (μέση τιμή ± SD, η = 3) δείχνουν ότι η ΑΑ

+ ΑΧ έχουν μεγαλύτερη αλλογενής διεγερτική ικανότητα. Οι διαφορές ήταν στατιστικώς σημαντικές σε τέσσερις από τις έξι DC: αναλογίες των Τ-κυττάρων που δοκιμάστηκαν. Σε αναλογία 1:10, θυμιδίνης σε ΑΑ

+ ήταν υψηλότερο από ό, τι AA

-. Σύνολο

ΑΑ

+ ΑΧ έδειξε καλύτερη διέγερση των Τ-κυττάρων από το ΑΑ

– DC , οι διαφορές ήταν σημαντικές σε τέσσερις από τις έξι DC: αναλογίες των Τ-κυττάρων που δοκιμάστηκαν (* p ≤ 0,05, ** P≤0.01). Αντιπροσωπευτικά δεδομένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. TdR = θυμιδίνης.

Η

κυτοκίνης Προφίλ του AA + ΑΧ είναι πιο ευνοϊκές για παθητική ανοσοθεραπεία.

IL-12 όχι μόνο σήματα για την ανάπτυξη των λειτουργιών τελεστή σε Τ κύτταρα, αλλά και τα προγράμματα τα κύτταρα για να επιβιώσουν ως λειτουργικά κύτταρα μνήμης [23].

In vitro

δημιουργείται DCs ήταν ικανά να εκκρίνουν υψηλά επίπεδα IL-12 ρ70 και ένα χαμηλό επίπεδο της IL-10. Η ΑΑ

+ ΑΧ έδειξε ένα καλύτερο προφίλ έκκρισης IL-12 ρ70 σε σύγκριση με ΑΑ

– ΑΧ (Εικ. 4). ΑΑ

– DCs επί αφετέρου είχε υψηλότερο επίπεδο της IL-10 έκκριση σε σύγκριση με εκείνη του ΑΑ

+ DCs (n = 3). Η αναλογία του IL12 /IL10 ήταν υψηλότερη από το ΑΑ

+ DCs όπως φαίνεται στο Σχ. S4. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η ΑΑ

+ ΑΧ έχουν μια καλύτερη Th1 ευνοϊκό προφίλ κυτοκίνης σε σύγκριση με ΑΑ

– ΑΧ, που τους καθιστά μια καλύτερη επιλογή για κλινική εφαρμογή

Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι δενδριτικά κύτταρα που παράγονται από τα δύο. συνθήκες καλλιέργειας ήταν ικανό για έκκριση της IL-12 ρ70 και IL-10. (Α) ΑΑ

+ ΑΧ έδειξε μια καλύτερη έκκρισης ρ70 IL-12 σε σύγκριση με το ΑΑ

– ΑΧ. (Β) Ομοίως, AA

+ ΑΧ έχουν χαμηλό επίπεδο της IL-10 προφίλ έκκρισης σε σύγκριση με ΑΑ

– ΑΧ. Τα δεδομένα των τριών ανεξάρτητων δειγμάτων που φαίνεται (η = 3, μέσος όρος ± SD). [P ≤ 0,05 (*), P≤0.01 (**) & amp? P≤0.001 (***)].

Η

ΑΑ

+ ΑΧ επιδεικνύουν υψηλότερα

in vitro

δραστηριότητα CTL

Το σχήμα 5Α απεικονίζει δεδομένα CTL από ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα. Φαίνεται σαφώς ότι η ΑΑ

+ ΑΧ είναι πιο αποτελεσματική σε τελεστική λειτουργία των Τ-κυττάρων δηλαδή επιφέρουν τη θανάτωση των κυττάρων MCF-7 στη δοκιμασία CTL σε σύγκριση με ΑΑ

– ΑΧ. Η δολοφονία είναι σημαντικά υψηλότερη σε τέσσερις αναλογίες των συγκεντρώσεων κυττάρου στόχου δράστη. Τα άλλα δύο δείγματα έδειξαν επίσης παρόμοια τάση (Εικ. S5). CTL που προέρχεται από ΑΑ

+ δενδριτικά κύτταρα παρουσίασαν βελτιωμένη λειτουργία δράστη δηλαδή αυξημένη συνολική θανάτωση σε σύγκριση με τα CTL που προέρχεται από ΑΑ

– ΑΧ. Για το αρνητικό σύνολο ελέγχου, AA

+ ΑΧ και ΑΑ

– ΑΧ σύνολα ωριμάσει με LPS, TNF-α και CD40L [20]. Η CTLs που παράγεται έτσι δεν ήταν αποτελεσματικά στην θανάτωση του κυττάρου στόχου γραμμή MCF-7. Δεν παρατηρήθηκε θανάτωση σε οποιαδήποτε από αυτά τα σύνολα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως πρόσθετο αρνητικός έλεγχος για ειδικότητα στόχου, CTLs που λαμβάνεται από MCF 7-λύματος γεμάτοι DCs χρησιμοποιήθηκαν σε CTL δοκιμασία έναντι κυτταρικής σειράς Η1299 αλλά καμία επίδραση θανάτωσης παρατηρήθηκε σε αυτά τα σύνολα, καθώς (τιμές CPM για ενσωμάτωση θυμιδίνης σε περίπτωση ελέγχου ήταν 12.649,33 ± 30.73 SD. για παλμικές και unpulsed ομάδα στο υψηλότερο στόχο να αναλογίες των Τ κυττάρων ήταν 12.405,66 ± 36.35 SD και 12.537,33 ± 27.47 SD αντίστοιχα).

(Α) δεδομένα CTL από ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα δηλαδή δολοφονία του στόχου ( MCF-7) κυττάρων από τα CTL που δημιουργείται από AA

+ ΑΧ /ΑΑ

– ΑΧ δόνηση με MCF-7 λύμα κυττάρων. CTL που προέρχεται από ΑΑ

+ δενδριτικά κύτταρα παρουσίασαν βελτιωμένη λειτουργία δράστη δηλαδή αυξημένη συνολική θανάτωση σε σύγκριση με τα CTL που προέρχεται από ΑΑ

– ΑΧ. Η δολοφονία είναι σημαντικά υψηλότερη σε τέσσερις αναλογίες των συγκεντρώσεων κυττάρου στόχου δράστη. (* P ≤ 0,05, ** P≤0.01, *** P≤0.001). προφίλ (Β) Η γονιδιακή έκφραση των τριών βασικών ένζυμα που σχετίζονται με μονοπάτι ΑΑ μαζί με το γονίδιο οικοκυρική GAPDH. Υπάρχει μια σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση του επιπέδου μεταγραφής των βασικών ένζυμο COX-2 στις ΑΧ καλλιεργήθηκαν παρουσία της ΑΑ.

Η

Τα επίπεδα mRNA των βασικών ενζύμων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό του ΑΑ είναι υψηλότερα σε ΑΑ

+ DCs

Τα επίπεδα μεταγραφής από τρία ένζυμα που σχετίζονται με μονοπάτι αραχιδονικού οξέος, όπως COX-1, COX-2, PLA

2, ανιχνεύθηκαν με RT-PCR διεξάγεται όπως ανά πρότυπες μεθόδους. Σύκο.