Αφηρημένο

Η πλειοψηφία των καρκινωμάτων νεφρικών κυττάρων (Συντονιστικά Κέντρα Διάσωσης) χαρακτηρίζονται από απώλεια της λειτουργίας του ογκοκατασταλτικού γονιδίου νοη Hippel Lindau (VHL), η οποία δρα ως ουβικιτίνης λιγάση για υποξία παράγοντα-1α (HIF-1α). Σε περίπτωση απουσίας του VHL, HIF-1α πρωτεΐνη σταθεροποιείται και συμβάλλει στην ογκογένεση. Πρόσφατα δεδομένα καταδεικνύουν την αντικαρκινική αποτελεσματικότητα του προαγωγού VHL στα κύτταρα RCC. Αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι η Ν-Μγο κατάντη-ρυθμιζόμενο γονίδιο 2 (NDRG2) είναι ένας πιθανός ρυθμιστής της VHL. NDRG2 εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων, επιπλέον είναι συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε νεφροκυτταρικό καρκίνωμα. Εδώ αξιολογήσαμε την επίδραση της υπερέκφρασης NDRG2 επί του πολλαπλασιασμού και της εισβολής σε ανθρώπινα νεφρικά καρκινικά κύτταρα. Η ανθρώπινη νεφρική καρκινική κυτταρική σειρά 786-O και Α498 μολύνθηκαν με Ad-NDRG2 ή Ad-LacZ. Η υπερέκφραση του NDRG2 ανέστειλε όχι μόνο την ανάπτυξη των κυττάρων, αλλά επίσης κατέστειλε την εισβολή. Περαιτέρω μελέτη έδειξε ότι το γονίδιο VHL ογκοκατασταλτικό ρυθμίστηκαν προς τα πάνω, ενώ μεταγραφικού παράγοντα HIF-1α και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) έχουν κάτω-ρυθμίζονται σε 786-O κύτταρα μολυσμένα με Ad-NDRG2. Τέλος, σε ένα μοντέλο γυμνού ποντικού, εντός του όγκου εγχύσεις Ad-NDRG2 κάθε 3 ημέρες για ένα σύνολο επτά φορές ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη και την αγγειογένεση των όγκων ξενομοσχευμένων 786-O. Συμπερασματικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι NDRG2 μπορεί να εμπλέκεται σε πολλαπλασιασμό και εισβολή από επηρεάζουν την έκφραση του VHL και HIF-1α. NDRG2 μπορεί να είναι ένας ελκυστικός θεραπευτικός στόχος για καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων.

Παράθεση: Gao L, Wu G-j, Liu Β, Shen Μ-z, Pan Τ-j, Yu C-g, et al. (2013) Up-κανονισμός του pVHL μαζί με τα κάτω ρύθμιση του HIF-1α από Έκφραση NDRG2 εξασθενεί διάδοση των πυρηνικών όπλων και εισβολή σε κύτταρα του καρκίνου των νεφρών. PLoS ONE 8 (12): e84127. doi: 10.1371 /journal.pone.0084127

Επιμέλεια: Γιώργος Γάκης, Πανεπιστήμιο Eberhard-Karls, Γερμανία

Ελήφθη: 9 του Ιουλίου 2013? Αποδεκτές: 12, Νοεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 του Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Gao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η χρηματοδότηση που προβλέπεται από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ 81230043 και Νο 81272812) και την κινεζική Εθνικό Key Βασική Έρευνα & amp? Πρόγραμμα Ανάπτυξης (2009CB521704). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Νεφρική καρκίνωμα (RCC) είναι μεταξύ των κορυφαίων 10 πιο συχνές κακοήθειες και στους άνδρες και τις γυναίκες [1]. RCC περιλαμβάνει μια διαφορετική ομάδα ιστολογικά στερεών όγκων, που προκύπτουν από διαφορετικά μέρη του νεφρού [2]. Η συντριπτική πλειοψηφία των Συντονιστικά Κέντρα Διάσωσης είναι σαφείς κύτταρο νεφρικών καρκινωμάτων (CCRCCs), που χαρακτηρίζεται από απώλεια της λειτουργίας του ογκοκατασταλτικού γονιδίου νοη Hippel Lindau (VHL). Ελαττώματα στο γονίδιο VHL είναι η πιο κοινή αιτία της οικογενούς CCRCC, και περισσότερο από το 80% των ασθενών με σποραδική CCRCC έχουν ένα ανενεργό γονίδιο VHL ή απώλεια του γονιδίου VHL [3].

VHL είναι ένα κλασικό αναστέλλοντας την έναρξη της νεφρικής όγκου [4-6] κηδεμόνα. Η VHL πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο VHL, είναι ένα συστατικό ενός συμπλόκου Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης που περιλαμβάνει elongin-Β, elongin-C, και cullin-2 [7,8]. Μεταξύ των καλά τεκμηριωμένες υποστρώματα της pVHL είναι η υποξία παράγοντα (HIF-1α), το οποίο είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που ελέγχει την έκφραση της υποξίας που επάγεται παράγοντες όπως κινάση πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης (PDK) -1, αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και ούτω καθεξής [9,10]. Αυτά τα γονίδια στόχους έχουν επίδραση στο μεταβολισμό της ενέργειας, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και τη μετάσταση των CCRCC [11]. Υπό κανονικές οξυγόνο, HIF-1α δεσμεύει pVHL μέσω υδροξυλιωμένο υπολείμματα προλίνης του και polyubiquitinated από pVHL, η οποία τελικά οδηγεί στην αποδόμηση του HIF-1α μέσω του πρωτεασώματος. Κατά τη διάρκεια της υποξίας, HIF-1α δεν είναι υδροξυλιωμένη και δραπετεύει από pVHL μεσολάβηση της υποβάθμισης. Το ασταθές HIF-1α σχηματίζει τότε λειτουργικό παράγοντα μεταγραφής συσχετίζοντας με την εκφράζουν συντακτικά HIF-1β υπομονάδα [12]. Μαζί, αυτό το συγκρότημα συνδέεται με μοτίβα DNA αναφέρεται ως στοιχεία απόκρισης υποξίας να ρυθμίζει την έκφραση ενός αριθμού γονιδίων που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη μετάσταση και την αγγειογένεση. Ως εκ τούτου, με την προώθηση της αποικοδόμησης του HIF-1α, pVHL μπορεί να καταστείλει HIF-1α διεγείρεται μεταγραφή και λειτουργία ως βασικό καταστολέας όγκου [13]. απώλεια pVHL είναι ένα κοινό συμβάν σε CCRCC, οδηγώντας σε σταθεροποίηση HIF-1α και η αυξητική ρύθμιση των γονιδίων στόχων του. Έχει δειχθεί ότι η έκφραση του VEGF συχνά αυξημένα μαζί με HIF-1α προς τα πάνω ρύθμιση σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους [14]. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι pVHL είναι σε θέση να ενισχύσει την έκφραση και τη δραστηριότητα του άλλου γνωστό ογκοκατασταλτικό ρ53 [14]. Ωστόσο, το πώς η ίδια pVHL ρυθμίζεται έχει σπάνια αναφερθεί. Πρόσφατα δεδομένα έδειξαν την αντικαρκινική αποτελεσματικότητα ενός υποκινητή pVHL στη Συντονιστικά Κέντρα Διάσωσης [15].

N-myc μεταγενέστεροι Ρυθμιζόμενη Gene 2 (NDRG2), είναι ένα μέλος της οικογένειας NDRG, είναι ένα πρόσφατα εντοπίστηκαν ογκοκατασταλτικό. Έχει αναφερθεί ότι η έκφραση NDRG2 ρυθμίζεται μειωτικά σε μια ποικιλία καρκινωμάτων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του ήπατος, καρκίνο του παγκρέατος, μηνιγγίωμα και καρκίνο του προστάτη. Μελέτες από το εργαστήριο μας και άλλοι έχουν δείξει ότι NDRG2 εμπλέκεται ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης, τη διαφοροποίηση και την αντίδραση στο στρες [16-21]. Αξίζει να σημειωθεί ότι προηγούμενη μελέτη μας υπονοείται ότι NDRG2 ρυθμίζεται προς τα πάνω τις εκφράσεις της ρ53 και pVHL ενώ ρυθμίζει προς τα κάτω τις εκφράσεις του VEGF και HIF-1α σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού [22]. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι NDRG2 ρυθμίζεται μειωτικά σε ιστούς CCRCC σε σύγκριση με παρακείμενες μη νεοπλασματικών ιστών [23]. Επιπλέον, η αναγκαστική έκφραση NDRG2 αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων σαφής RCC (CCRCC) κυτταρικές σειρές και επάγει την απόπτωση των κυττάρων [24]. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι NDRG2 παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση του CCRCC. Ωστόσο, ο ακριβής ρόλος της NDRG2 στο CCRCC δεν είναι πλήρως κατανοητός.

Σε αυτή τη μελέτη, προσπαθήσαμε να διερευνήσει αν υπάρχει ρυθμιστική σχέση μεταξύ NDRG2 και pVHL. Εξετάσαμε την πρώτη συσχέτιση της έκφρασης μεταξύ NDRG2 και pVHL σε καρκινικούς ιστούς από ασθενείς CCRCC. Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε

in vitro

και

in vivo

πειράματα για να διερευνηθεί η επίδραση της υπερέκφρασης NDRG2 στη συμπεριφορά των κυττάρων, καθώς και στην έκφραση των pVHL και κατάντη επενεργητές του, HIF-1α και VEGF .

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Ανθρώπινα δείγματα ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς με τη γραπτή συγκατάθεση. Τόσο η γραπτή συγκατάθεση και η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Νοσοκομείου Xijing, τέταρτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Τα ποντίκια που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή την έρευνα ελήφθησαν από την τέταρτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο και διατηρήθηκαν σε συνθήκες χωρίς παθογόνα. Όλες οι διαδικασίες έγιναν σύμφωνα με πρωτόκολλα που εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Institutional Review του Xijing Νοσοκομείου, τέταρτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο και ήταν σύμφωνα με τις οδηγίες του ΝΙΗ για την ηθική χρήση των ζώων.

συλλογή ιστών και ανοσοϊστοχημεία

Ένα σύνολο 130 σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη δείγματα πρωτογενών σαφές καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων και των παρακείμενων φυσιολογικό νεφρό ιστοί τους συλλέχθηκαν στο Τμήμα Παθολογίας του Νοσοκομείου Xijing, Xi’an, Κίνα. Όλα τα δείγματα ελήφθησαν από ασθενείς οι οποίοι έδωσαν πληροφορημένη συναίνεση για να χρησιμοποιήσουν το πλεόνασμα παθολογικά δείγματα για ερευνητικούς σκοπούς. Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση. Η χρήση ανθρώπινων ιστών στην παρούσα μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της τέταρτης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο και διεξήχθη σύμφωνα με τις διεθνείς κατευθυντήριες γραμμές για τη χρήση ανθρώπινων ιστών. Anti-NDRG2 (αραίωση 1: 500) αντισώματα αγοράστηκαν από BD Corporation (BD, NY, USA). Anti-HIF-1α (1: 500 αραίωση) και αντι-VEGF: αντισώματα (1 αραίωση 1000) ήταν από την Santa Cruz Technology (Santa Cruz, CA, USA). Αντι-VHL αντίσωμα (αραίωση 1: 500) ήταν από NeoMarkers Corporation (Ταϊπέι, την Κίνα). Αντι-β-ακτίνης αντίσωμα (αραίωση 1: 2000) ήταν από την Sigma (Sigma, USA). Το κιτ ανοσοϊστοχημείας αγοράστηκε από την Boster Εταιρείας (Wuhan, CHN).

Η χρώση ανοσοϊστοχημείας εκτελέσθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τόσο η ένταση και η έκταση της ανοσολογικής χρώσης αναλύθηκαν ημι-ποσοτικά. Τμήματα χωρίς επισήμανση ή με λιγότερες από 5% σημασμένα κύτταρα βαθμολογήθηκαν ως 0. Τμήματα βαθμολογήθηκαν ως 1 εάν 5-25% των κυττάρων σημάνθηκαν, ως ένα 2 εάν 25-50% των κυττάρων σημάνθηκαν και ως 3 αν σημάνθηκαν 50-75% των κυττάρων. Τέλος, η επισήμανση των ≥75% των κυττάρων βαθμολογήθηκε ως 4. Η ένταση χρώσης βαθμολογήθηκε παρομοίως, με 0 που χρησιμοποιείται για αρνητική χρώση, 1 για ασθενώς θετικά, 2 για μέτρια θετικά και 3 για ισχυρώς θετικά. Οι βαθμολογίες για το ποσοστό των θετικών κυττάρων και για την ένταση χρώσης πολλαπλασιάστηκαν για να παράγει ένα ανοσοαντιδραστικό βαθμολογία για κάθε δείγμα. Το προϊόν των βαθμολογιών ποσότητα και την ένταση υπολογίστηκαν έτσι ώστε ένα τελικό σκορ 0 δεν έδειξε έκφραση, 1-4 υποδεικνύεται ασθενή έκφραση, 5-8 υποδεικνύεται μέτρια έκφραση και 9-12 υποδεικνύεται ισχυρή έκφραση. Οι φωτογραφίες που συλλέγονται μέσω μικροσκοπία φωτός (Olympus, Japan).

Οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

Ανθρώπινο νεφρικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών 786-O και Α498 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, ΗΠΑ). Οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσον RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2. Για τη θεραπεία υποξίας, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες υποξίας (1% O

2, 5% CO

2 και 94% Ν

2) και συλλέχθηκαν στις 24 ώρες μετά τη μόλυνση.

Κυττάρων ανάπτυξη δοκιμασία

τα κύτταρα σπάρθηκαν (5 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο) εις τριπλούν σε πλάκες των 96 φρεατίων. Μετά την απομάκρυνση του μέσου, 40 ΜΟΙ αδενοϊό που εκφράζει NDRG2 [24] ή προστέθηκε σε RPMI 1640 χωρίς ορό το αρνητικό γονίδιο ελέγχου LacZ (Ad-LacZ), επωάστηκαν για 2 ώρες, αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν για 0, 24, 48, και 72 ώρες. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) 3- και ανάγνωση της απορρόφησης στα 490 nm. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± τυπική απόκλιση για τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Μετανάστευση και την εισβολή δοκιμασίες

Η μετανάστευση των κυττάρων και δοκιμασίες εισβολής έγιναν ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. δοκιμασία Εισβολή με μία δοκιμασία Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνη και μετανάστευση με Matrigel-μη επικαλυμμένο μεμβράνη διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα θάλαμο 24 φρεατίων (Βϋ Biosciences, Bedford, ΜΑ), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και σπάρθηκαν στον άνω θάλαμο σε 2,5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε μέσο χωρίς ορό. Ο φορέας που φέρει LacZ ή NDRG2, σε μια πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 40, προστέθηκε αμέσως μετά κύτταρο επιμετάλλωσης. Μέσο συμπληρωμένο με 5% FBS (που χρησιμοποιείται ως χημειο-προσέλκυσης) τοποθετήθηκε στον πυθμένα καλά. Η επώαση διεξήχθη για 24 ώρες στους 37 ° C σε υγροποιημένο αέρα με 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν μέσω μιας πορώδους, Matrigel-επικαλυμμένα ή μη επικαλυμμένα μεμβράνη (BD Biosciences). Μετά την επώαση, οι θάλαμοι αφαιρέθηκαν, και εισβάλλοντα κύτταρα στην κάτω πλευρά της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με Gimsa. Ο αριθμός των εισβάλλοντα κύτταρα ή κύτταρα που μεταναστεύουν προσδιορίστηκε μετρώντας πέντε πεδία υψηλής ισχύος (× 400) σε κάθε μεμβράνη και που υπολογίζεται ως ο μέσος αριθμός κυττάρων ανά πεδίο. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± τυπική απόκλιση για τρία ανεξάρτητα πειράματα.

κηλίδωση Western ανάλυση

Τα κύτταρα σπάρθηκαν (5 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο) εις τριπλούν σε πλάκες 24 φρεατίων . Μετά την απομάκρυνση του μέσου, 40 ΜΟΙ Ad-NDRG2 ή Ad-LacZ προστέθηκε σε RPMI 1640 χωρίς ορό, επωάστηκε για 2 ώρες, αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. Μετά την καλλιέργεια για 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS και αμέσως λύονται σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [1% Triton Χ-100 150 mmol /L NaCl, 100 mmol /L ΚΟΙ, 20 mmol /L HEPES, 10 mmol /L EDTA, 1 mmol /L ορθοβαναδικό νάτριο, 10 μg /ml απρωτινίνη, 10 μg /ml λευπεπτίνη, και 1 mmol /L φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο] επί πάγου. Ανάλυση Western κηλίδωση διεξήχθη σύμφωνα με τις τυποποιημένες μεμβράνες νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας πρωτόκολλο (Bio-Rad). Για ανοσοστύπωση, οι μεμβράνες επωάστηκαν με τα πρωτογενή αντισωμάτων για μία νύχτα σε 4 ° C, που ακολουθείται από 2 ώρες επώαση με αραίωση 1: 2000 του horseradish υπεροξειδάση (HRP) δευτερογενές αντίσωμα. Τέλος, οι ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν από το σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας.

ανοσοφθορισμού δοκιμασία

786-Ο κύτταρα σπάρθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες. Μετά την απομάκρυνση του μέσου, 40 ΜΟΙ Ad-NDRG2 ή Ad-LacZ προστέθηκε σε RPMI 1640 χωρίς ορό, επωάστηκε για 2 ώρες, αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω για 24 ώρες. Μετά διαπερατότητας (0,5% Triton Χ-100), στερέωση (4% φορμαλδεΰδη) και αποκλεισμού (10% φυσιολογικό ορό κατσίκας και 0.5% Triton Χ-100), το ποντίκι αντι- NDRG2, VHL, HIF-1α και μονοκλωνικού αντισώματος VEGF ήταν προστίθεται στα κύτταρα για μία νύχτα σε 4 ° C αντίστοιχα. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-ποντικού συζευγμένο με FITC ή Cy3-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας στους 37 ° C για 2 ώρες στο σκοτάδι. Η ένταση χρώσης φθορισμού στη συνέχεια εξετάστηκαν με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού.

ELISA

Τα κύτταρα σπάρθηκαν (5 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο) εις τριπλούν σε πλάκες 24 φρεατίων. Μετά την απομάκρυνση του μέσου, 40 ΜΟΙ Ad-NDRG2 ή Ad-LacZ προστέθηκε σε RPMI 1640 χωρίς ορό, επωάστηκε για 2 ώρες, αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. Προσαρμοσμένα μέσα από τις κυτταρικές καλλιέργειες 24 ώρες αναλύθηκαν για VEGF χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ ELISA σάντουιτς (Endogen, Woburn, ΜΑ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε δείγμα ελέγχθηκε εις διπλούν. Τα δεδομένα εκφράστηκαν σε VEGF (pg /ml).

δοκιμασίες αναστολής ανάπτυξης

in vivo

Η

Ο BALB /C αθυμικά (ηυ /ηυ) ποντικούς έξι εβδομάδων δόθηκαν από το Πειραματικό Κέντρο ζώων του τέταρτου Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Xi’an, Κίνα). Όλα τα πρωτόκολλα έχουν εγκριθεί από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης των Ζώων κατά την τέταρτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο και εκτελέστηκαν σύμφωνα με τους κανόνες φροντίδα των ζώων που ορίζονται από το πανεπιστήμιο (αριθμός άδειας: 10001). Όλα έγιναν προσπάθειες για τη μείωση του αριθμού των ζώων που χρησιμοποιήθηκαν και για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία τους. 786-Ο κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε στείρο PBS. κύτταρα 786-O (5 × 10

6 κύτταρα) σε 0,2 ml εγχύθηκαν υποδορίως μέσα στα αριστερά πλευρά των 6-εβδομάδων γυμνούς ποντικούς. Όταν το μέσο μέγεθος των όγκων έφθασε τα 200 mm

3, όλοι οι ποντικοί χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες τυχαίως (Ad-NDRG2, Ad-LacZ και PBS ελέγχου ομάδων, η = 10 ανά ομάδα). Η ενδονεοπλασματική ενέσεις αδενοϊού (1 × 10

9 pfu σε 100 μΙ PBS) έγιναν κάθε 3 ημέρες για συνολικά επτά φορές. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν με βάση τις μετρήσεις καλίμπρας του μήκους (α) και το πλάτος (b) των βλαβών χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: V = ab

2/2. Η καμπύλη ανάπτυξης ακολούθως προέρχονται από αυτά τα δεδομένα. Οι συνθήκες των ποντικών παρακολουθήθηκαν καθημερινά, και επιβιώσεις ποντικού καταγράφηκαν καθ ‘όλη την πειραματική περίοδο. Το ποντίκι θυσιάστηκε με αυχενική εξάρθρωση, όταν εμφανίστηκε καχεξία, η οποία χαρακτηρίστηκε ως μια συνολική κατάσταση της ασθένειας, συνοδεύεται από απώλεια της άλιπης μάζας σώματος και λιπώδους μάζας, αδυναμία, κόπωση, νωθρότητα, μειώθηκαν απότομα πρόσληψη τροφής, ασκίτη και ανορεξία [25]. Όλες οι θυσίες έγιναν κάτω από αναισθησία (κεταμίνη 130 mg /8.8 mg ξυλαζίνης /kg σωματικού βάρους). Στη συνέχεια, τα δείγματα όγκου αφαιρέθηκαν για την προετοιμασία τομών παραφίνης για ιστολογική χρώση. Τα επίπεδα έκφρασης του NDRG2, pVHL, HIF-1α, πρωτεΐνη VEGF στα εμβολιασμένα όγκους ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ιστολογία και ανοσοϊστοχημεία όπως περιγράφηκε παραπάνω.

Η στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS έκδοση 19.0. Συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων έγιναν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση ANOVA και ακριβές τεστ του Fisher. Kaplan-Meier καμπύλες και log-rank τεστ χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση επιβίωσης.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Η έκφραση της NDRG2, pVHL και HIF-1α σε φυσιολογική νεφρική ιστούς και τους ιστούς CCRCC

Για να προσδιορίσετε αν ο κανονισμός μεταξύ NDRG2 και pVHL υπάρχει σε CCRCC, μπορούμε κατ ‘αρχάς να ανιχνεύεται η έκφραση του NDRG2 και εκείνων της pVHL και HIF-1α σε 130 δείγματα CCRCC και τα ζεύγη φυσιολογικούς ιστούς. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1 και στο Σχήμα 1, ο ρυθμός του NDRG2 θετική έκφραση σε δείγματα ιστών CCRCC ήταν 30,0% (Σχήμα 1Α και 1Β), η οποία ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι στην φυσιολογική νεφρική ιστό 60,0% (Σχήμα 1 G και 1 Η) (

P

= 4.40 × 10

-9). Και το ποσοστό των pVHL θετική έκφραση σε δείγματα CCRCC ιστό (Εικόνα 1Γ και 1Δ) ήταν επίσης σημαντικά χαμηλότερη από ότι στη φυσιολογική νεφρική ιστό (Εικόνα 1Ι και 1J) (26,9% έναντι 66,2%,

P

= 3,02 × 10

-10). Αντιθέτως, ο ρυθμός του HIF-1α θετική έκφραση σε δείγματα CCRCC ιστού (Εικόνα 1 Ε και 1 F) ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε φυσιολογικό νεφρικό ιστό (Σχήμα 1Κ και 1L) (55,4% έναντι 33,7%,

P

= 0.006). Επιπλέον, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 Μ και 1 Ν, τα επίπεδα έκφρασης του NDRG2 σχετίστηκαν θετικά με εκείνες των pVHL σε δείγματα ιστών CCRCC (

r = 0,749

,

P

= 3.25 × 10

-5), ενώ τα επίπεδα έκφρασης των NDRG2 είχαν αρνητική συσχέτιση με εκείνα του HIF-1α σε δείγματα ιστών CCRCC (

r

= -0,331,

P

= 1.85 × 10

-3).

Ομάδα

υποομάδας

Αρνητική (%)

Θετική (%)

χ

2

P

αξία

NDRG2 CCRCC tissue91 (70,0) 39 (30,0) 23.64

P

= 4.40 × 10

-9normal νεφρική tissue52 (40,0) 78 (60,0) pVHLCCRCC tissue95 (73,1) 35 (26,9) 40.21

P

= 3,02 × 10

-10normal νεφρική tissue44 (33,8) 86 (66,2) HIF-1αCCRCC tissue58 (44,6) 72 (55,4) 8,18

P

= 0,006 φυσιολογική νεφρική tissue81 (62,3) 49 (37,7) Πίνακας 1. Έκφραση της NDRG2, pVHL και HIF-1α σε φυσιολογική νεφρική ιστούς και τους ιστούς CCRCC.

CSV Λήψη CSV

Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες ανοσοϊστοχημική χρώση για NDRG2, pVHL και HIF-1αin κανονική νεφρικούς ιστούς και τους ιστούς CCRCC. (Α και Β) έκφραση NDRG2 σε ιστούς CCRCC (200 × μεγέθυνση). έκφρασης (C και D) pVHL σε ιστούς CCRCC (200 × μεγέθυνση). (Ε και F) έκφραση του HIF-1α σε ιστούς CCRCC (200 × μεγέθυνση). (G και Η) έκφραση NDRG2 σε φυσιολογικό νεφρό σωληνάρια (200 × μεγέθυνση). (Ι και J) pVHL έκφραση σε φυσιολογικό νεφρό σωληνάρια (200 × μεγέθυνση). (Κ και L) HIF-1αexpression σε φυσιολογικό νεφρό σωληνάρια (200 × μεγέθυνση). (Μ) Τα επίπεδα έκφρασης του NDRG2 συσχετίζεται θετικά με εκείνες του pVHL. (Ν) Τα επίπεδα έκφρασης του NDRG2 συσχετίζονται αρνητικά με εκείνες του HIF-1α. Ο αριθμός των δείγματος εμφανίζονται ως «κλίμακα». Οι ανισότητες μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Pearson συντελεστής συσχέτισης και το γράφημα δημιουργήθηκε από το λογισμικό SPSS19.0.

Η

NDRG2 υπερέκφραση αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων νεφρικών κυττάρων καρκίνου

in vitro

Η

για να διερευνηθούν οι επιδράσεις του NDRG2 υπερέκφρασης στην ανάπτυξη των ανθρώπινων νεφρικών καρκινικών κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε Ad-LacZ ή Ad-NDRG2 να μολύνει 786-Ο κύτταρα και κύτταρα Α498. Μετά τη μόλυνση για 24 ώρες, ισχυρή έκφραση της πρωτεΐνης NDRG2 σε 786-Ο κύτταρα (Σχήμα 2Α) και κύτταρα Α498 (Εικόνα 2Β) επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι NDRG2. Η αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετρήθηκε με τη ΜΤΤ δοκιμασία 12, 24, 36, 48, 60 και 72 ώρες μετά τη μόλυνση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Γ και 2Δ, Ad-LacZ δεν είχε σημαντική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων είτε σε κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

P

αξία στα 24, 36, 48, 60 και 72 h είναι 0,55, 0,61 , 0,96, 0,98 και 0,60 αντίστοιχα σε 786-Ο κύτταρα?

P

τιμή είναι 0,60, 0,68, 0,60, 0,15 και 0,60 αντίστοιχα σε κύτταρα Α498). Ωστόσο, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ανεστάλη σημαντικά σε Ad-NDRG2 μολυσμένα 786-Ο κύτταρα (

P

αξία στα 24, 36, 48, 60 και 72 h είναι 048, 1.54 χ 10

-4, 2,01 × 10

-4, 2,15 × 10

-4 και 4,32 × 10

-6 αντίστοιχα σε κύτταρα 786-O) και Ad-NDRG2-μολυσμένα κύτταρα Α498 (

P

αξία είναι 0,47, 0,43, 2,20 × 10

-4, 4,08 × 10

-4 και 1,70 × 10

-6 αντίστοιχα στα κύτταρα Α498), αντίστοιχα, σε σύγκριση με την ομάδα Ad-LacZ.

(Α και Β) τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης σε NDRG2 Ad-NDRG2 μολυσμένα 786-O και Ad-NDRG2-μολυσμένα κύτταρα Α498 αντιστοίχως εξετάστηκαν με κηλίδωση Western. (Γ και Δ) Η ανάπτυξη των κυττάρων 786-O και Α498 αναστάλθηκε από την υπερέκφραση του NDRG2 μετά από 72 ώρες επώασης. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με τη χρήση μονόδρομης ANOVA. *** Δεικνύει

P

& lt? 0.001, σε σύγκριση με την ομάδα Ad-LacZ.

Η

NDRG2 υπερέκφραση αναστέλλει την εισβολή και τη μετανάστευση των ανθρώπινων νεφρικών κυττάρων καρκίνου

in vitro

Η

Για την περαιτέρω αξιολόγηση της επίδρασης της NDRG2 υπερέκφραση σε μεταστατική δραστηριότητα, πραγματοποιήσαμε

in vitro

Matrigel επικαλυμμένα προσδιορισμούς εισβολής transwell καθώς και δοκιμασίες μετανάστευσης με δύο διαφορετικές ανθρώπινες νεφρικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών, 786-O και Α498. Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα λήφθηκαν από την κάτω επιφάνεια του φίλτρου transwell και τα κύτταρα που εισέβαλαν ή μετανάστευσαν βάφτηκαν με Gimsa. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α και 3Β, η επεμβατική δυναμικό, το οποίο καθορίζεται από την ικανότητα των κυττάρων να εισβάλλουν ένα φράγμα Matrigel, ήταν σημαντικά καταστέλλεται από μόλυνση Ad-NDRG2 σε 786-Ο κύτταρα (

P

= 1,46 × 10

-5

vs

ομάδα Ad-LacZ) και Α498 κύτταρα (

P

= 2.23 × 10

-5

vs

Ad-ομάδα LacZ) . Ωστόσο, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ της ομάδας Ad-LacZ και ομάδα ελέγχου και στις δύο κύτταρα 786-O (

P

= 0,79) και τα κύτταρα Α498 (

P

= 0,58). Επιπλέον, η υπερέκφραση του NDRG2 σε αυτές τις κυτταρικές σειρές κατέστειλε σημαντικά την μετανάστευσή τους μέσω της transwell σε σύγκριση με λοίμωξη Ad-LacZ (

P

= 1,19 × 10

-5 για 786-Ο κύτταρα και

P

= 1,09 × 10

-3 για τα κύτταρα Α498, αντίστοιχα) (Σχήμα 3C και 3D). Αλλά δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των Ad-LacZ και ομάδες ελέγχου και στις δύο κυτταρικές σειρές (

P

= 0,73 για 786-Ο κύτταρα και

P

= 0.94 για τα κύτταρα Α498)

(Α και Β) Η ικανότητα εισβολής εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας Transwell επικαλυμμένα με Matrigel. Η ποσότητα εισέβαλαν κυττάρων υπολογίσθηκε σε πέντε τυχαία πεδία υψηλής ισχύος (400 × μεγέθυνση). Το ιστόγραμμα αντιπροσωπεύει την ποσοτικοποίηση των κυττάρων που εισέβαλε. (Γ και Δ) Η δυνατότητα μετανάστευση εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας Transwell μη επικαλυμμένα με Matrigel. Η ποσότητα του μετανάστευσαν κυττάρων υπολογίσθηκε σε πέντε τυχαία πεδία υψηλής ισχύος (400 × μεγέθυνση). Το ιστόγραμμα αντιπροσωπεύει την ποσοτικοποίηση των κυττάρων που μετανάστευσαν. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) για τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με τη χρήση μονόδρομης ANOVA. ** Ή *** υποδεικνύει

P

& lt? 0,01 ή

P

& lt? 0.001, αντίστοιχα, σε σύγκριση με την ομάδα Ad-LacZ.

Η

Ρύθμιση της έκφρασης των pVHL, HIF-1α και VEGF από τα πάνω ρύθμιση των NDRG2 σε 786-Ο κύτταρα

για να κατανοήσουμε τον μοριακό μηχανισμό μέσω του οποίου NDRG2 αναστέλλει 786-O κύτταρα πολλαπλασιασμού και της εισβολής, αναλύσαμε την επίδραση του NDRG2 στην έκφραση του pVHL, HIF-1α και VEGF-στόχο του, τα οποία παίζουν σημαντικούς ρόλους στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και εισβολή σε καρκίνο του νεφρού . Εμείς μολυσμένα τα 786-Ο κυττάρων με Ad-NDGR2 και εξετάστηκαν pVHL, HIF-1α και η έκφραση του VEGF με ανάλυση κηλίδος Western. Ως αποτέλεσμα, αποκαλύψαμε την αυξημένη έκφραση pVHL και μειωμένη HIF-1α και VEGF σε σύγκριση με εκείνη της ομάδας ελέγχου και της ομάδας κύτταρα 786-Ο Ad-LacZ (Σχήμα 4Α). Εν τω μεταξύ, χρησιμοποιήσαμε δοκιμασία ανοσοφθορισμού να επιβεβαιώσει περαιτέρω ρύθμιση της έκφρασης του pVHL, HIF-1α και VEGF με υπερέκφραση του NDRG2. Έμμεση επισήμανση ανοσοφθορισμού έδειξαν αδύναμα σήματα της NDRG2 και pVHL στην ομάδα ελέγχου και την ομάδα κύτταρα Ad-LacZ 786-O, ενώ υπήρξε ισχυρότερη χρώση NDRG2 και pVHL σε Ad-NDRG2 μολυσμένα 786-Ο κύτταρα. Επιπλέον, τα σήματα του HIF-1α και VEGF στον έλεγχο και την ομάδα Ad-LacZ ήταν ισχυρότερες από εκείνες στην ομάδα Ad-NDRG2 (Εικόνα 4Β).

(Α) 786-O, Ad-LacZ-786-O και Ad-NDRG2-786-Ο κύτταρα επωάστηκαν υπό φυσιολογική οξυγόνωση και υποξία για 24 ώρες. Μετά την επώαση, τα κύτταρα αναλύθηκαν με δοκιμασία κηλίδος Western. β-ακτίνη επίπεδα πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) μετά τη μόλυνση των 786-Ο κυττάρων με 40 ΜΟΙ Ad-NDRG2 υπό φυσιολογική οξυγόνωση για 24 ώρες, τα επίπεδα της πρωτεΐνης του NDRG2, pVHL, HIF-1α και VEGF στα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία ανοσοφθορισμού (400 × μεγέθυνση).

παραγωγή VEGF αναστέλλεται από NDRG2 υπερέκφραση

για να ελέγξετε αν η έκφραση NDRG2 επηρεάζει την παραγωγή VEGF σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε Ad-NDRG2 να μολύνει 786-O και Α498 κύτταρα και να μετρηθεί η επίπεδα VEGF σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας υπό ορθοξικές ή υποξικές συνθήκες. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας ELISA έδειξε ότι η ομάδα Ad-NDRG2 786-Ο κύτταρα, σε σύγκριση με το Ad-LacZ εμφάνισαν σημαντικά μειωμένη έκκριση VEGF είτε υπό ορθοξικές (Εικόνα 5Α) (

P

= 7.32 × 10

-8) ή συνθήκες υποξίας (Εικόνα 5Β) (

P

= 9.95 × 10

-8). Εν τω μεταξύ, η έκκριση του VEGF από τα κύτταρα Α498 ήταν, επίσης, μειώθηκε σημαντικά στο πλαίσιο NDRG2 κατάσταση υπερέκφραση ανεξάρτητα από τη φυσιολογική οξυγόνωση (Σχήμα 5C) (

P

= 6,12 × 10

-7) και υποξία (Σχήμα 5D) (

P

= 0,005). Αλλά μόλυνση Ad-LacZ δεν έχει καμία επίδραση στην παραγωγή VEGF σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου είτε σε νορμοξία (

P

= 0,55 για 786 O κύτταρα?

P

= 0,91 για τα κύτταρα Α498) ή σε υποξία (

P

= 0,94 για 786 O κύτταρα?

P

= 0,90 για τα κύτταρα Α498)

(Α και Β) 786-O, Ad-LacZ-786-O. και τα κύτταρα Ad-NDRG2-786-O επωάστηκαν υπό φυσιολογική οξυγόνωση και υποξία για 24 ώρες. Μετά την επώαση, τα μέσα αναλύθηκαν για τα επίπεδα VEGF με δοκιμασία ELISA. (Γ και Δ) Α498, Ad-LacZ- Α498 και Ad-NDRG2- κύτταρα Α498 επωάστηκαν υπό φυσιολογική οξυγόνωση και υποξία για 24 ώρες. Μετά την επώαση, τα μέσα αναλύθηκαν για τα επίπεδα VEGF με δοκιμασία ELISA. Τα δεδομένα ήταν η μέση ± τυπική απόκλιση (SD) για τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με μονόδρομη ANOVA. ** Ή *** υποδεικνύει

P

& lt? 0,01 ή

P

& lt? 0.001, αντίστοιχα, σε σύγκριση με την ομάδα Ad-LacZ.

Η

Η καταστολή της ανάπτυξης του όγκου σε ένα γυμνό μοντέλο ποντικού με ένεση εντός του όγκου Ad-NDRG2

Για να διερευνήσουν τις επιπτώσεις της διαφήμισης -NDRG2 στην αύξηση του όγκου

in vivo

, ενέθηκε αδενοϊό (1 χ 10

9 pfu σε 100 μΙ PBS) Ad-NDRG2, Ad-LacZ ή PBS κάθε 3 ημέρες σε προ-καθιερωμένη ανθρώπινη 786- O όγκους νεφρικού καρκίνου (περίπου 200 mm

3) αναπτύχθηκαν σε γυμνούς ποντικούς. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, το Ad-NDRG2 ομάδα πέτυχε μια σταθερή και σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου σε σύγκριση με την ομάδα Ad-LacZ (

P

τιμή είναι 0,002, 1,54 × 10

-6, 1,77 × 10

-6, 9,7 × 10

-11, 8,69 × 10

-12 και 1.35 × 10

-9 στην 6η Ημέρα, 9, 12, 15, 18 και ημέρας 21 αντίστοιχα). ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Merier έδειξαν ότι εντός του όγκου έγχυση του Ad-NDRG2 παρέτεινε σημαντικά τους χρόνους επιβίωσης ποντικών (

χ

2 = 11,75,

P

= 0,003) (Εικόνα 6Β). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ομάδας Ad-LacZ (

χ

2 = 4,67,

P

= 0.122), και τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με αυτά της

in vitro

δοκιμασίες. Μετά θυσιάστηκαν τα ποντίκια, οι όγκοι αφαιρέθηκαν για ανάλυση της έκφρασης του NDRG2, pVHL, HIF-1α και VEGF. Ανοσοσήμανση για τον VEGF και HIF-1α ήταν χαμηλότερες σε όγκους με εκτομή από ποντίκια στην Ad-NDRG2 ομάδα. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης NDRG2 και pVHL στην Ad-NDRG2 ομάδας είχαν αυξηθεί δραματικά, ενώ τα επίπεδα HIF-1α και VEGF μειώθηκε σε σύγκριση με την ομάδα Ad-LacZ (NDRG2,

P

= 6.47 × 10

-8 ? pVHL,

P

= 1,55 × 10

-8? HIF-1α,

P

= 0,0001? VEGF,

P

= 6,07 × 10

-7). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων ελέγχου και Ad-LacZ (NDRG2,

P

= 0,98? pVHL,

P

= 0,94? HIF-1α,

P

= 0.78? VEGF,

P

= 0,69) (Σχήμα 7Α και 7Β).

(Α) καμπύλη ανάπτυξης όγκου. Η ανάπτυξη του όγκου εκτιμήθηκε κάθε 3 ημέρες μέχρι την Ημέρα 21 της θεραπείας με μέτρηση δύο κάθετες διαμέτρους και υπολογισμό του όγκου σε mm

3. Η στατιστική ανάλυση αξιολογήθηκε με μονόδρομη ANOVA. ** Ή *** υποδεικνύει P & lt? 0,01 ή P & lt? 0.001 σε σύγκριση με την ομάδα Ad-LacZ. καμπύλη (Β) Kaplan-Meier παρουσιάστηκε στην Ελέγχου, Ad-LacZ και Ad-NDRG2 ομάδες, με κάθε ομάδα που αποτελείται από δέκα ποντίκια. Υπήρξε μια σημαντική διαφορά μεταξύ του Ad-NDRG2 και θεραπείες Ad-LacZ. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τεστ log-rank. ** Υποδεικνύει

P

& lt? 0.01 σε σύγκριση με την ομάδα Ad-LacZ.

Η

(Α) Η ενδονεοπλασματική εκδήλωσης NDRG2, pVHL, HIF-1a και VEGF αξιολογήθηκαν με ανοσοϊστοχημεία (200 × μεγέθυνση) επί εμπεδωθεί με παραφίνη 786-O τμήματα των καρκινικών κυττάρων. Αντιπροσωπευτικά εικόνες. (Β) Ολοκληρωμένη οπτική πυκνότητα (IOD) τιμές του NDRG2, pVHL, HIF-1α και πρωτεΐνη VEGF έκφραση των όγκων αξιολογήθηκαν. λογισμικό ImagePro Plus χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν οι τιμές IOD των θετικών περιοχών ανοσοϊστοχημική χρώση, και τα προκύπτοντα ιστογράμματα φαίνονται. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μονόδρομης ANOVA. Τα αποτελέσματα φαίνονται ως μέση τιμή ± SD. *** P & lt? 0.001.

Η

Συζήτηση

Αν και η χειρουργική εκτομή και επικουρική θεραπεία συνήθως χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία ασθενών με καρκίνο του νεφρού, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης για καρκίνο του νεφρού απαιτεί βελτίωση. Είναι γνωστό ότι RCC είναι ανθεκτικό σε ακτινοθεραπεία, hormono-, και χημειοθεραπεία [26]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη βιολογικών θεραπειών για καρκίνο του νεφρού χρειάζεται επειγόντως. Η εμφάνιση και η ανάπτυξη του καρκίνου του νεφρού εξαρτάται από την έκφραση αρκετών σχετικών γονιδίων, όπως HIF-1α, ΡϋΚ1, VEGF και ούτω καθεξής [27].

Πολλαπλές μελέτες έχουν αποδείξει τώρα ότι HIF-1α up-ρυθμίζει την έκφραση του VEGF ΡϋΚ1 και [28]. Επιπλέον, ΡϋΚ1 και έκφραση του VEGF είναι αυξημένες σε RCC [29,30]. ΡϋΚ1 είναι γνωστό ότι φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν ορισμένες πρωτεϊνικές κινάσες που ανήκουν στην οικογένεια AGC των πρωτεϊνικών κινασών. Μία από τις πρωτεΐνες κινάσες είναι πρωτεϊνικής κινάσης Β (ΡΚΒ, επίσης γνωστή ως Akt). ΡϋΚ1 ενεργοποιεί Akt με φωσφορυλίωση ενός υπολείμματος Ser /Thr στο βρόχο ενεργοποίησης. μονοπάτι Akt είναι έκτροπα δραστηριοποιείται στην CCRCC και εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση [31]. Και VEGF είναι ο στυλοβάτης εν μέσω όλων των αγγειογενετικών παραγόντων και προωθεί τόσο την ογκογένεση και την εισβολή του RCC [32]. HIF-1α είναι επίσης συχνά υπερεκφράζεται σε καρκίνο του νεφρού, οι οποίες συσχετίζονται με την κακή κλινική πρόγνωση [33]. Δεδομένου ότι η αυξημένη έκφραση του HIF-1α up-ρυθμίζει την έκφραση ΡϋΚ1 και VEGF, η οποία προωθεί την εξέλιξη του όγκου.