Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ανομοιογενές και αποτελείται από διάφορους υποτύπους που βρίσκονται σε διαφορετικές διαφορικό στάδια. Τα πρόσφατα ταυτοποιημένα ιντεγκρίνης πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν Kindlin-1 και Kindlin-2 είναι οι ενεργοποιητές των ιντεγκρινών διαμεμβρανικού υποδοχέα που παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου. Στην έκθεση αυτή παρουσιάζονται τα προφίλ έκφρασης των Kindlin-1 και Kindlin-2 σε καρκίνους του πνεύμονα, χρησιμοποιώντας δείγματα ασθενών και καθιέρωσε την αντιστοιχία τους με την εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα. Βρήκαμε ότι Kindlin-1 εκφράστηκε σε καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου επιθήλια προερχόμενο, ιδιαίτερα σε καρκίνο πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα, αλλά εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα σε πτωχά διαφοροποιημένο καρκίνο του πνεύμονα μεγάλου κυττάρου. Ωστόσο, Kindlin-2 εντόνως εκφρασμένο σε μεγάλες καρκίνο του πνεύμονα. Τόσο Kindlin-1 και Kindlin-2 διαπιστώθηκε ότι δεν εκφράζεται ή εκφράζεται σε πολύ χαμηλά επίπεδα σε καρκίνο του πνεύμονα μικρών κυττάρων νευροενδοκρινικών προέλευσης. Είναι σημαντικό ότι, το επίπεδο έκφρασης Kindlin-1 συσχετίζεται θετικά με τη διαφοροποίηση του πλακώδους καρκίνου του πνεύμονα. Αναπάντεχα, βρήκαμε ότι οι πολύ ομόλογες πρωτεΐνες οικογένειας Kindlin, Kindlin-1 και Kindlin-2, εμφάνισε εξουδετέρωση λειτουργικούς ρόλους στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. Η έκτοπη έκφραση του Kindlin-1 σε μη-μικρού κυττάρου καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων αναστέλλεται

in vitro

κυτταρική μετανάστευση και

in vivo

ανάπτυξης του όγκου, ενώ Kindlin-2 προωθείται αυτές τις λειτουργίες. Μηχανιστικά, Kindlin-1 απαγορεύεται epithelail να μεσεγχυματικά μετάβαση σε μη μικρού κυττάρου καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα, ενώ Kindlin-2 ενισχυμένο epithelail να μεσεγχυματικά μετάβαση σε αυτά τα κύτταρα. Στο σύνολό τους, αποδείξαμε ότι Kindlin-1 και Kindlin-2 ρυθμίζουν διαφορικά την πρόοδο του κυτταρικού καρκίνου των πνευμόνων. Περαιτέρω, τα επίπεδα έκφρασης του Kindlin-1 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί δυνητικώς ως δείκτης για τη διαφοροποίηση του πνεύμονα καρκίνου και στόχευση Kindlin-2 θα μπορούσε να εμποδίσει την επεμβατική ανάπτυξη των μεγάλων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Zhan J, Zhu Χ, Guo Υ, Wang Υ, Wang Υ, Qiang G, et al. (2012) Ο ρόλος της Απέναντι Kindlin-1 και Kindlin-2 σε καρκίνους του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (11): e50313. doi: 10.1371 /journal.pone.0050313

Συντάκτης: Vladimir V. Kalinichenko, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Ιούλη του 2012? Αποδεκτές: 18 του Οκτ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 29 Νοεμβρίου του 2012

Copyright: © 2012 Zhan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (NSFC) βασικό έργο 30830048, το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας 2010CB912203 και 2010CB529402, NSFC31170711, το 111 έργο του Υπουργείου Παιδείας και το Πεκίνο Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών 7.120.002 σε Hz και επίσης, από την καταβολή επιχορήγησης στο Staffan Stromblad από το Κέντρο για Βιοεπιστημών στο Ινστιτούτο Καρολίνσκα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή καρκίνος

πνεύμονα είναι μία πολύπλοκη ασθένεια που μπορεί να ταξινομηθεί ιστολογικά σε μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα (SCLC), η οποία αντιπροσωπεύει περίπου το 20% του καρκίνου του πνεύμονα, και το μεγαλύτερο μέρος είναι μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του β-κυττάρου του πνεύμονα (NSCLC), η οποία αντιπροσωπεύει περισσότερο από το 80% του καρκίνου του πνεύμονα [1]. NSCLC περιλαμβάνουν πλακώδες καρκίνωμα (SCC), αδενοκαρκίνωμα (AC), και μεγάλο καρκίνωμα (LCC) [2]. Ιδιαίτερα διαφοροποιημένη, μέτρια διαφοροποιημένο και κακώς διαφοροποιημένο καρκίνωμα μπορεί να δει κανείς στην SCC και AC. Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι αρκετά ετερογενής στην ανάπτυξη του όγκου, εισβολή και μετάσταση, καθώς και στα αποτελέσματα μετά τη θεραπεία. Ο καρκίνος του πνεύμονα σε διαφορετικό καθεστώς διαφοροποίησης εμφανίζεται ασυμφωνία σε κακοήθεια, π.χ., χαμηλή διαφοροποιημένα καρκινώματα του πνεύμονα είναι πιο κακοήθεις καρκίνους από υψηλής διαφοροποιούνται, η οποία είναι ταχέως αναπτυσσόμενη και άκρως μεταστατική.

Fermitin μέλος της οικογένειας 1 (FERMT1) που κωδικοποιεί Kindlin -1 είναι μια FERM (4,1-Ezrin-Radixin- μοεσίνη) που περιέχει πρωτεΐνη που ανήκει στην οικογένεια Kindlin. Kindlins είναι integrin- αλληλεπιδρούν πρωτεΐνες που ρυθμίζουν την ενεργοποίηση της ιντεγκρίνης μέσω αλληλεπίδρασης με το ιντεγκρίνης β υπομονάδα κυτταροπλασματική περιοχή [3], [4]. Kindlin-2 που κωδικοποιείται από FERMT2 βρέθηκε να ελέγχει ένα αμφίδρομο σηματοδότηση μέσω ιντεγκρίνης [5]. Kindlin ορίστηκε από το σύνδρομο Kindler που επινοήθηκε το 1954 χαρακτηρίστηκε από ένα συνδυασμό της επιδερμικής ατροφίας, διευρύνθηκε τριχοειδή αγγεία και στίγματα δερματική μελάγχρωση [6]. Μεταλλάξεις του Kindlin-1 είχε αναγνωριστεί ως η αιτία του συνδρόμου Kindler [7], [8]. Μέχρι πρόσφατα Kindlin μέλος της οικογένειας έχουν συνδεθεί με την εξέλιξη των όγκων [9]. Kindlin-2 έχει δειχθεί ότι εκφράζεται σε κακόηθες μεσοθηλίωμα και ρυθμίζει την προσκόλληση και τη μετανάστευση [10], και το επίπεδο έκφρασης της Kindlin-2 σχετίζεται με την ευαισθησία των κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε κυτταρικό θάνατο σισπλατίνη που προκαλείται από [11]. έκφραση Kindlin-2 βρέθηκε συσχετίζεται με την εισβολή όγκου, μετάσταση λεμφικό κόμβο, και τα αποτελέσματα των ασθενών σε καρκίνο του στομάχου [12]. Kindlin-1 έχει βρεθεί υπερεκφράζεται σε 60% του καρκίνου του πνεύμονα και το 70% του καρκίνου του παχέος εντέρου, όπως εξετάζεται από τα επίπεδα έκφρασης του RNA από τους δέκα ασθενείς [9]. Πολύ πρόσφατα, Sin et al κατέδειξαν ότι Kindlin-1 παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού και του πνεύμονα μετάσταση [13]. Εκτός από την έκφραση σε κύτταρα όγκου, Kindlin-2 βρέθηκε επίσης ότι εκφράζεται υψηλά στο στρώμα του όγκου σε καρκίνους της ουροδόχου κύστης [14]. Ωστόσο, ενώ Kindlin-1 και Kindlin-2 σχετίζονται με την πρόοδο του καρκίνου, Kindlin-3 είναι ανταποδοτικού στα αιμοποιητικών διαταραχών [15] – [19]. Kindlin-2 εκφράζονται ευρέως σε ενδοθηλιακά και φυσαλιδώδη λείων μυών [3], [20] και αποτελεί βασική συνιστώσα των παρεμβαλλόμενες δίσκους που απαιτείται για σπονδυλωτά καρδιακή δομή και τη λειτουργία [21]. Ωστόσο, μέχρι στιγμής λίγα είναι γνωστά σχετικά με τους ρόλους των Kindlin-1 και Kindlin-2 στην εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα.

Στην παρούσα μελέτη στοχεύουμε να απαντήσουμε, πρώτον, ότι, αν Kindlin-1 και Kindlin-2 παίζουν ρόλο στην πνεύμονα εξέλιξης του καρκίνου. Λόγω της υψηλής ετερογένεια του καρκίνου του πνεύμονα θέλουμε επίσης να απαντήσει ότι αν Kindlin-1 και Kindlin-2 εκφράζεται διαφορικά σε διαφόρους τύπους καρκίνου του πνεύμονα και των λειτουργιών ευδιάκριτα σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Για το σκοπό αυτό, ερευνήσαμε την έκφραση της Kindlin-1 και Kindlin-2 σε ένα πάνελ από δείγματα ιστού καρκίνου του πνεύμονα και δοθεί προσοχή στη σύγκριση των επιπέδων έκφρασης του Kindlin-1 και Kindlin-2 στον ίδιο ασθενή. Περιέργως, ταυτοποιήσαμε μια αμοιβαία ρόλος του Kindlin-1 και Kindlin-2 στην ρύθμιση της προόδου του όγκου και στα δύο κύτταρα και ζώα. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας παρέχουν μια νέα κατανόηση της Kindlin-1 και Kindlin-2 στην εξέλιξη των πνευμόνων των καρκινικών κυττάρων και μπορεί να βοηθήσει για το μελλοντικό σχεδιασμό φαρμάκων στην θεραπευτική του καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική

Η επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Πεκίνου Κέντρο Επιστημών Υγείας έχει εγκρίνει την παρούσα μελέτη για τα πειράματα του ποντικιού (Αριθμός άδειας: LA2011-73). Η Επιτροπή Δεοντολογίας της Κίνας-Ιαπωνίας Νοσοκομείο Φιλίας έχει εγκρίνει την παρούσα μελέτη, χρησιμοποιώντας τον καρκίνο του πνεύμονα ιστούς όγκων του ασθενούς για ερευνητικούς σκοπούς (Αριθμός Άδειας: ZRLW-5) .Οι διαδικασίες για το χειρισμό ποντίκια και τα ανθρώπινα υλικά που ήταν σύμφωνα με την ηθική πρότυπο του Ελσίνκι Δήλωση του 1975, και η αναθεωρημένη το 1983.

οι φορείς έκφρασης, καλλιέργεια των κυττάρων και σταθερές κυτταρικές σειρές διαμόλυνση

Kindlin-1 cDNA πλήρους μήκους κλωνοποιήθηκε από μία βιβλιοθήκη cDNA ανθρώπινου πλακούντα χρησιμοποιώντας εκκινητές: CAGAATCCATGCTGTCATCCACTGACTTTAC (προς τα εμπρός αστάρι) και GATCTAGATCAATCCTGACCGCCGGTCAA (αντίστροφου εκκινητή). προϊόν PCR κλωνοποιήθηκε σε φορέα ρΟΚΙΙ, και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε περαιτέρω σε φορέα pCMV10-3 × Flag (Sigma) χρησιμοποιώντας θέσεις HindIII-EcoRI. U1752, Η1299, κυτταρικές γραμμές Α549 και U1810 αγοράστηκαν από την ATCC στις ΗΠΑ ή κύτταρο Συλλογή Κέντρο Ένωσης Ιατρικής Σχολής του Πεκίνου στην Κίνα και καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI1640 (Invitrogen) με 10% FBS και 50 μg /ml γενταμυκίνη. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 75 εκατοστά

2 φιαλών καλλιέργειας ή πιάτα 60 mm στους 37 ° C σε υγρασία με 5% (v /v) CO

2. Τα μέσα αλλάζονται κάθε δύο ημέρες. Για καθιέρωση σταθερών κλώνων που εξέφραζαν Kindlin-1 και Kindlin-2 χωριστά, κύτταρα Η1299 επιμολύνθηκαν με Flag-Kindlin-1, Flag-Kindlin-2 και κενό φορέα χρησιμοποιώντας Lipofectamine. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν και G418 προστέθηκε σε τελική συγκέντρωση 1200 μg /ml. Ενιαία κλώνοι που εκφράζονται Kindlin-1 ή Kindlin-2 συνενώθηκαν για να αποφευχθεί η κλωνική αποτελέσματα. Συγκεντρωμένα κύτταρα που εκφράζουν Kindlin-1 ή Kindlin-2 χρησιμοποιήθηκαν για λειτουργικές μελέτες, όπως αναφέρεται στο κείμενο.

ιστούς όγκων

πνεύμονα δείγματα καρκινικού ιστού ελήφθησαν από το Τμήμα Θωρακικής Χειρουργικής Κίνας-Ιαπωνίας Νοσοκομείο φιλίας, το Πεκίνο της Κίνας, και κόπηκαν στο Τμήμα Παθολογίας Υγείας Science Center Πανεπιστήμιο του Πεκίνου, το Πεκίνο της Κίνας. Μεταξύ των 140 τμήματα ιστού όγκου που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις, 65 είναι SCC, 43 είναι AC, 12 είναι LCC και 20 είναι SCLC (Πίνακας 1). Όλα αυτά τα δείγματα υποβλήθηκαν σε Kindlin-1 και χρώση Kindlin-2. Επιπλέον, 7 φρέσκο ​​καρκίνο του πνεύμονα ιστούς με τα ζεύγη των ιστών πέριξ του όγκου περιλαμβάνουν 3 SCC, 3 AC και 1 LCLC. Αυτοί οι ιστοί χρησιμοποιήθηκαν για την εκχύλιση mRNA για ανίχνευση qPCR του Kindlin-1 έκφρασης.

Η

Western ανάλυση κηλίδος

PBSTDS ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως με την παρουσία του αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (Roche Diagnostics, GmbH) χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση σύνολο κυτταρολύματα. 80% των κυτταρολυμάτων προστέθηκε σε 20% των 5 × SDS ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης, τότε επιλύονται με 10% SDS-PAGE πηκτή και στυπώθηκαν σε μεμβράνες PVDF (μέγεθος πόρων 0,45 μm). Τα πρωτογενή αντισώματα αντι-Kindlin-1 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (1:500 αραίωση? Clone 4A5.14, Milipore, USA), αντι-Kindlin-2 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (1:1000 αραίωση? Κλώνος 3Α3, Milipore, USA), αντι -Vimentin μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (1: 2000 αραίωση? Epitomics, USA), αντι-Ecadherin μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (1: 3000 αραίωση? Epitomics, USA), αντι-Ν-καντερίνης μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (1: 10.000 αραίωση? Epitomics, USA ), αντι-Flag-μονοκλωνικό αντίσωμα (αραίωση 1:10000? Clone Μ2, Sigma, USA) και αντι-β-ακτίνης μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (1:1000 αραίωση? Clone C4, Santa Cruz, USA) επωάστηκαν με τις μεμβράνες χωριστά υπό περιστροφή. Μετά από διεξοδική πλύση, οι μεμβράνες επωάστηκαν περαιτέρω με αντίστοιχη δευτεροταγή αντισώματα που αναγνωρίζουν είτε κουνέλι ή ποντίκι Ig (Jackson Laboratories, USA). Τέλος, οι ζώνες κατέστησαν ορατές με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Pierce).

ποσοτική PCR

Ποσοτική PCR (qPCR) δοκιμασίες διεξήχθησαν για την ανίχνευση της έκφρασης του Kindlin-1 mRNA σε ιστούς όγκου πνεύμονα. Εν συντομία, οι φυσιολογικό ιστό και όγκου πνεύμονα σύνολο mRNAs απομονώθηκαν με ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), και 2 μg ολικού RNA μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (Promega, CA, USA). Τότε PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Taq PCR βασικού μείγματος (TIANGEN, Κίνα) με τις ρυθμίσεις ως: 94 ° C 2 λεπτά? 94 ° C 30 δευτερόλεπτα, 60 ° C 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C 30 δευτερόλεπτα, για 30 κύκλους? 72 ° C 5 λεπτά. Οι αλληλουχίες εκκινητών ήταν ως εξής: για την ανθρώπινη Kindlin-1, προς τα εμπρός: TCATGTTGGAGGAGTGATGC, αντίστροφη: AAGCCAGCAATGCTTCTGTT? για ακτίνη, προς τα εμπρός: CTGAGCGTGGCTACTCCTTC, αντίστροφη: GCCATCTCGTTCTCGAAGTC. Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2.5% με την παρουσία βρωμιούχου αιθιδίου για την οπτικοποίηση. Ποσοτική PCR χρησιμοποιήθηκε επίσης για τον προσδιορισμό των μεταβολών του επιπέδου MMPs mRNA που προκαλείται από Kindlin-1 και Kindlin-2 στην κυτταρική σειρά Η1299. MMP-2 προς τα εμπρός: AGCTCCCGGAAAAGATTGAT, αντίστροφη: GGTGCTGGCTGAGTAG- ATCC? MMP-7 προς τα εμπρός: GTCTCGGAGGAGATGCTCAC? αντίστροφη: TACCCAAA-GAATGGCCAAGT? MMP-9 προς τα εμπρός: TCTTCCCTGGAGACCTGAGA? αντίστροφη: ATTTCGACTCTCCACGCATC. Σχετική αλλαγές φορές σε qPCR προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο ΔΔCt.

δοκιμασίες κυτταρική κινητικότητα

Transwell θαλάμους (Costar) με μέγεθος πόρων 8 μm χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση του προσδιορισμού κυτταρικής μετανάστευσης. Πρώτον, το κολλαγόνο τύπου Ι χρησιμοποιήθηκαν για την επικάλυψη της κάτω επιφάνειας του Transwell μεμβράνες για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, Η1299 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με Flag-ΒΑΡ (βακτηριακή αλκαλική φωσφατάση), Flag-Kindlin-1 και Flag-Kindlin-2 σπάρθηκαν επί της άνω επιφανείας του Transwell. Μετά από 6 ώρες επώαση σε ρυθμιστικό μετανάστευσης (RPMI1640, 2 mM ΟαΟ

2, 1 mM MgCl

2, 0,2 mM ΜηΟΙ

2, και 0,5% BSA) στους 37 ° C σε υγροποιημένο 5% CO

2, οι μεμβράνες Transwell μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη για 15 λεπτά και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες επί 10 λεπτά. Επιτέλους, 6 μικροσκοπικά πεδία επελέγησαν τυχαία για καταμέτρηση των μετανάστευσαν κύτταρα.

Για κυττάρων επούλωσης πληγών πείραμα, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα μονοστοιβάδας ήταν γδαρμένο χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο ρύγχος πιπέτας 100 μl. Οι τραυματίες μονοστιβάδες πλύθηκαν δύο φορές για να απομακρυνθούν τα μη προσκολλημένα κύτταρα με 0.1 Μ PBS (ρΗ 7,2). Δώδεκα ώρες αργότερα η πληγή παρατηρήθηκε με στόχο 20 × (Nikon, Ιαπωνία) και μετρήθηκαν για το πλάτος των πληγών κυττάρου. Έξι μικροσκοπικά πεδία για κάθε πιάτο παρατηρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν.

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC)

διαφάνειες των όγκων του πνεύμονα που λαμβάνονται από Κίνας-Ιαπωνίας Νοσοκομείο Φιλίας ήταν όλα φορμόλη-σταθερές και paraffinembeded. Αποπαραφίνωση και ενυδάτωση διεξήχθησαν και ακολούθησε καταργώντας ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης χρησιμοποιώντας 0,3% υπεροξείδιο του υδρογόνου για 30 λεπτά και μικροκυμάτων για ανάκτηση αντιγόνου σε 10 mM ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού νατρίου (ρΗ 6,0) για 20 λεπτά. Χρησιμοποιήσαμε πολυκλωνικό αντι-Kindlin-1 (PKU Animal Facility) καθαρισμένο με συγγένεια αντίσωμα στα 2 μg /ml και μονοκλωνικά αντι-Kindlin-2 (Milipore, USA) στα 2 μg /ml για την εκτέλεση αυτών των πειραμάτων. Το πρωτογενές αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια PV9000 2-βήμα συν Poly-HRP αντι-ποντικού /εφαρμόστηκε κουνέλι IgG Σύστημα Ανίχνευσης (Zhong Shan Jin Qiao). Η μέθοδος στρεπταβιδίνης-υπεροξειδάσης βιοτίνης χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση και διαμινοβενζιδίνη εφαρμόστηκε για υπόστρωμα (ChemMate Detection Kit, ϋΑΚΟ). Αιματοξυλίνη χρησιμοποιήθηκε για επίχρωση. Οι αρνητικοί έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν παραλείποντας τη χρήση του πρωτογενούς αντισώματος.

Αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημείας

Δύο ανεξάρτητες παθολόγους αξιολόγησε όλα τα ανοσοκηλιδώσεις και συναίνεση αιτιολόγηση βασίζεται σε συζήτηση καταγράφηκε. Η εκτίμηση αυτή κατατάσσονται σε 4 κατηγορίες: καμία αντίδραση σημειώνεται ως 0, αμυδρή αντιδραστικότητα ως 1+, μέτρια αντιδραστικότητα όπως 2+, και ισχυρή δραστικότητα ως 3+

In vivo

ανάπτυξη του όγκου ξένου μοσχεύματος. πειραματιστεί

Balb /c γυμνά ποντίκια εμφυτεύθηκαν υποδορίως στο πλευρό με 1 χ 10

6 κύτταρα τα οποία υπερεκφράζουν σταθερά Kindlin-1, Kindlin-2 και του φορέα ελέγχου ξεχωριστά. Οι όγκοι μετρήθηκαν για τα μεγέθη τους σε δεκαοκτώ ημέρες και να συνεχίζει να καταγράφει για τον προκαθορισμένο χρόνο. Οι ποντικοί θανατώθηκαν με τη χρήση ευθανασία όταν η ανάπτυξη του όγκου σε 1 cm σε διάμετρο. Οι όγκοι αφαιρέθηκαν και σταθμίζονται.

Η στατιστική ανάλυση

Στατιστικές αναλύσεις για τα υλικά των ασθενών πραγματοποιήθηκαν με τεστ Kruskal-Wallis και Στατιστικές αναλύσεις για ζεύγη δειγμάτων που χρησιμοποιούνται δοκιμασία t του Student. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις με τη χρήση SPSS version14.0. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε επίπεδο

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Kindlin-1 εκφράζεται σε φυσιολογικό ιστό πνεύμονα και διάφορους υποτύπους του καρκίνου του πνεύμονα

Kindlin-1 έκφραση στον καρκίνο του πνεύμονα έχει προκαταρκτικά προταθεί

9,13. Ωστόσο, τίποτα δεν είναι γνωστό με λεπτομέρειες για Kindlin-1 έκφραση σε διάφορους υποτύπους των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Για να κατανοήσουμε την posible involement της Kindlin-1 και Kindlin-2 στην εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα, εξετάσαμε για πρώτη φορά την έκφραση της Kindlin-1 σε καρκίνο του πνεύμονα ιστούς του ασθενούς χρησιμοποιώντας immnohistochemistry (IHC) με ένα πολυκλωνικό συγγένεια καθαρισμένο Kindlin-1 αντισώματος, με φυσιολογική πνεύμονα ιστούς ως έλεγχος. Βρήκαμε ότι Kindlin-1 δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε φυσιολογικό πνευμονικό κυψελίδες και ασθενές σήμα σε φυσιολογικά αγγεία των πνευμόνων αίμα παρατηρήθηκε (Εικ. 1a-Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, Kindlin-1 βρέθηκε εκφράζεται υψηλά στο κυτταρόπλασμα και πυρήνες των κυττάρων κωνικού σχήματος και ατρακτοειδή κύτταρα διανέμονται σε στήλες επιθήλια (Εικ. 1 Α-Β). Ωστόσο, Kindlin-1 βρέθηκε ασθενώς εκφράζεται στα κύτταρα colummar, καλυκοειδή κύτταρα και όχι εκφράζεται στο υπόγειο memberane. Σε ιστούς όγκων του πνεύμονα, Kindlin-1 βρέθηκε εκφράζεται υψηλά στο κυτταρόπλασμα καθώς μεμβράνη του SCC (Εικ. 1a-C). Επιπλέον, Kindlin-1 βρέθηκε μέτρια εκφράζονται στο κυτταρόπλασμα των νεοπλασματικών αδενικού επιθηλίου σε AC (Σχ. 1α-D) και εκφράζεται ασθενώς σε LCC (Εικ. 1a-Ε). Αναπάντεχα, δεν παρατηρήθηκε έκφραση του Kindlin-1 καθόλου σε SCLC (Εικ. 1a-F) (Πίνακας 2).

α. Kindlin-1 έκφρασης σε ιστούς από την κανονική και διαφορετικούς υποτύπους του καρκίνου του πνεύμονα εξετάστηκαν με IHC. Φωτογραφίες που εμφανίζονται είναι φυσιολογικό πνεύμονα (Α), Ψευδο-στρωματοποιημένη κροσσωτό επιθήλιο στήλης (Β), SCC (C), AC (D), LCC (Ε), και μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (F). σι. Ο προσδιορισμός των επιπέδων mRNA του Kindlin-1 στο φρέσκο ​​κλινικά δείγματα μετρήθηκε με qPCR. ντο. Re-αναλύσεις Kindlin-1 έκφρασης σε Oncomine βάση δεδομένων. Αριστερά: Kindlin-1 έκφραση εξάγεται στο Χου πνεύμονα σύνολο δεδομένων? Δεξιά: Kindlin-1 έκφραση εξάγεται στο Garber πνεύμονα σύνολο δεδομένων. Στατιστικές αναλύσεις μεταξύ των διαφόρων ομάδων ασθενών εξετάστηκαν από

t

test του Student. ** Αντιπροσωπεύει για

σ

& lt?. 0.01

Η

Επίσης, εξετάσαμε την έκφραση του mRNA Kindlin-1, ακόμη και φρεσκομαγειρεμένα ιστούς όγκων από SCC, AC και SCLC του πνεύμονα ασθενείς με καρκίνο. Βρήκαμε ότι η SCC έδειξε υψηλότερα επίπεδα Kindlin-1 έκφρασης από AC, και SCLC εμφανίζεται η χαμηλότερη έκφραση του Kindlin-1 μεταξύ των διαφόρων τύπων των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα που εξετάστηκαν (Εικ. 1β).

Είναι ενθαρρυντικό ότι, το παραπάνω Kindlin -1 προφίλ έκφρασης όπως προσδιορίζεται είτε με ανοσοϊστοχημεία ή qPCR υποστηρίχθηκε περαιτέρω από την εκ νέου analizing Kindlin-1 προφίλ έκφρασης mRNA σε σύνολα δεδομένων ασθενούς από Oncomine Database (www.oncomine.com). Μετά την ανάλυση Affymetrix σύνολα δεδομένων του καρκίνου του ασθενούς Χου και Garber πνεύμονα, βρήκαμε ότι Kindlin-1 έκφραση σε διαφορετικούς τύπους των NSCLC σε επίπεδο mRNA έγινε significanly αυξήθηκε (Εικ. 1γ), η οποία είναι σε συμφωνία με τα παραπάνω IHC αποτελέσματα. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι Kindlin-1 είναι πράγματι πολύ expessed σε SCC από την εξέταση των διαφορετικών ασθενών συν-Horts.

Kindlin-1 έκφραση συσχετίζεται με τη διαφοροποίηση των κυττάρων σε SCC, αλλά όχι στο AC

Οι ανωτέρω ευρήματα έδειξαν ότι ακόμη και μέσα SCC, Kindlin-1 έκφραση είναι ετερογενής. Αυτό υποδηλώνει ότι Kindlin-1 έκφραση μπορεί να ποικίλει με την αλλαγή της διαφοροποίησης των κυττάρων στον καρκίνο του πνεύμονα. Για το σκοπό αυτό, αναλύσαμε την έκφραση Kindlin-1 σε SCC με διαφορετικά στάδια της κυτταρικής διαφοροποίησης. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι Kindlin-1 εκφράζεται έντονα στο καλά διαφοροποιημένη SCC από τη μέτρια διαφοροποιημένο SCC (Σχήμα 2-Α και -Β.)? και η μέτρια διαφοροποιείται SCC εξέφρασε υψηλότερο Kindlin-1 από την κακώς διαφοροποιημένο SCC (Εικ. 2-Β και -C). Ωστόσο, αυτή η τάση του Kindlin-1 έκφραση βρέθηκε σε SCC δεν μπορούσε να εφαρμοστεί σε AC (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το υψηλότερο στάδιο διαφοροποίησης ανταποκρίνεται στην υψηλότερη έκφραση του Kindlin-1 σε SCC (Πίνακας 2).

Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες που αντικατοπτρίζει την έκφραση Kindlin-1 σε SCC έχουν επιλεγεί και στατιστικές αναλύσεις μπορεί να είναι που βρέθηκαν στον πίνακα 2. Α, καλά διαφοροποιημένο SCC. Β, Μέτρια διαφοροποιημένο SCC. C, χαμηλής διαφοροποίησης SCC.

Η

Kindlin-1 και Kindlin-2 εκφράζονται διαφορετικά σε διαφορετικούς υποτύπους του καρκίνου του πνεύμονα

Μέχρι τώρα δεν υπάρχει καμία αναφορά στην έκφραση Kindlin-2 σε πνεύμονες καρκινικές κυτταρικές σειρές όπως επίσης και σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Είναι ενδιαφέρον να γνωρίζουμε αν τα δύο Kindlin-1 και Kindlin-2 εκφράζονται σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Για το σκοπό αυτό, εξετάσαμε την έκφραση Kindlin-2 στο ίδιο πάνελ δείγματα ασθενών προαναφερθέντων. Ενώ Kindlin-2 βρέθηκε εκφράζεται στα αιμοφόρα αγγεία των φυσιολογικών ιστών των πνευμόνων (Εικ. 3a-Α), Kindlin-2 βρέθηκε εντόνως εκφρασμένο στο κυτταρόπλασμα και πυρήνες των κυττάρων κωνικού σχήματος (Σχ. 3α-Β) παρόμοια με ο Kindlin-1 χρώσης όπως φαίνεται στο Σχ. 1 Α-Β. Αυτό δείχνει ότι και οι δύο Kindlin-1 και Kindlin-2 εκφράζονται στην κανονική epithilium βρόγχους. Είναι ενδιαφέρον ότι, Kindlin-2 πρότυπο έκφρασης είναι αρκετά διαφορετική από εκείνη των Kindlin-1 σε SCC. Αντί να εκφράζεται σε SCC και AC, Kindlin-2 βρέθηκε hihgly εκφράζεται στο στρώμα του όγκου (Σχ. 3a-C και D), οι οποίες έρχονται σε αντίθεση με το πρότυπο έκφρασης του Kindlin-1 σε αυτούς τους τύπους καρκίνου του πνεύμονα. Επιπλέον, Kindlin-2 βρέθηκε εντόνως εκφρασμένο σε LCC στην κυτταρική μεμβράνη και τον περιβάλλοντα στρώματος του όγκου σε σύγκριση με την αδύναμη έκφραση του Kindlin-1 σε LCC (Σχ. 3α-Ε). Επιπλέον, η χαμηλή ή καθόλου θετική χρώση Kindlin-2 παρατηρήθηκε σε SCLC (Εικ. 3a-F), η οποία είναι παρόμοια με την χρώση Kindlin-1 στο ίδιο κύτταρο τύπου (Εικ. 1a-F). Αυτά τα αποτελέσματα IHC ενισχύθηκαν περαιτέρω από τις επαναληπτικές αναλύσεις της έκφρασης mRNA Kindlin-2 σε Oncomine βάσεις δεδομένων Χου πνεύμονα και Garber πνεύμονα (Εικ. 3β). Στη σειρά των τομών ιστού SCC ασθενούς, Kindlin-1 εκφράζεται ισχυρά στα κύτταρα του όγκου, ενώ Kindlin-2 βρέθηκε εκφράζεται κυρίως στο στρώμα του όγκου (Σχ. 3c-Α, -Β). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι Kindlin-1 και Kindlin-2 εκφράζονται διαφορικά σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

α. έκφραση Kindlin-2 σε ιστούς από φυσιολογικούς και καρκινικούς ιστούς πνεύμονα εξετάστηκαν με IHC. Φωτογραφίες που εμφανίζονται είναι φυσιολογικό πνεύμονα (Α), Ψευδο-στρωματοποιημένη κροσσωτό επιθήλιο στήλης (Β), SCC (C), AC (D), LCC (Ε), και μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (F). σι. Re-αναλύσεις της έκφρασης Kindlin-2 σε Oncomine βάση δεδομένων. Αριστερά: Kindlin-2 έκφρασης που προέρχονται από το ΕΑΠ πνεύμονα σύνολο δεδομένων? Δεξιά: Kindlin-2 έκφρασης που προέρχονται από Garber πνεύμονα σύνολο δεδομένων. Στατιστικές αναλύσεις μεταξύ των διαφόρων ομάδων ασθενών εξετάστηκαν από

t

test του Student. ** Αντιπροσωπεύει για

σ

& lt? 0,01. ντο. Σύγκριση των εκφράσεων του Kindlin-1 και Kindlin-2 σε SCC από τον ίδιο ασθενή. Όπως εμφανίζεται Kindlin-2 εκφράζεται έντονα σε στρώματος του όγκου, αλλά όχι σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Η

Πίνακας 2 συνοψίζονται την έκφραση του Kindlin-1 και Kindlin-2 στους όγκους των διαφόρων ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Kindlin-1 έκφραση ήταν θετική σε 84% των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Για τους διάφορους υποτύπους όγκου, τόσο Kindlin-1 και Kindlin-2 έδειξε υψηλό θετικό ρυθμό σε NSCLC από ό, τι σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (

σ

& lt? 0,0001). Είναι ενδιαφέρον ότι, στο πλαίσιο NSCLC Kindlin-1 εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα σε LCC, μέτρια σε AC, και η υψηλότερη έκφραση της Kindlin-1was βρέθηκαν σε SCC (

σ

& lt? 0,0001). Ωστόσο, Kindlin-2 έχει την αμοιβαία προφίλ έκφρασης: το επίπεδο έκφρασης της Kindlin-2 είναι χαμηλή σε SCC, μέτρια σε AC και την υψηλότερη έκφραση του Kindlin-2 παρατηρήθηκε σε LCC (

ρ

& lt? 0,0001) . Περιέργως, η έκφραση Kindlin-1 βρέθηκε συσχετίζεται με τη διαφοροποίηση των όγκων. SCC, αποτελείται από πλακώδη επιθήλια και AC αποτελείται από αδενικό επιθήλιο εκτέθηκαν υψηλότερη Kindlin-1 έκφρασης από LCC που έχει ταξινομηθεί ως αδιαφοροποίητο καρκίνωμα (

σ

& lt? 0,0001). Επιπλέον, καλά διαφοροποιημένο SCC έχει υψηλότερο Kindlin-1 έκφρασης από ελάχιστα διαφοροποιημένες SCC (

σ

= 0,0024). Σε σύγκριση, καμία συσχέτιση εντοπίστηκε για Kindlin-1 έκφρασης με διαφοροποίηση για τους AC (

σ

= 0,8523). Ομοίως, η έκφραση Kindlin-2 δεν βρέθηκε να συσχετίζεται με τη διαφοροποίηση των διαφορετικών υποτύπων του καρκίνου του πνεύμονα (

σ

= 0,1759).

Kindlin-1 και Kindlin-2 ρυθμίζει αντίθετα καρκίνο του πνεύμονα πρόοδο του κυτταρικού

in vitro

η

Δεδομένου ότι Kindlin-1 και Kindlin-2 εκφράζονται διαφορικά σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα, είναι δελεαστικό να καταλάβουμε αν Kindlin-1 και Kindlin-2 επίσης λειτουργούν διαφορετικά σε ρυθμίζουν πνεύμονα εξέλιξης του καρκίνου των κυττάρων. Έχουμε ήδη διαπιστώσει ότι Kindlin-2 εκφράζεται έντονα σε όγκο επεμβατική μπροστά σε κακόηθες μεσοθηλίωμα [10]. Για το σκοπό αυτό, εξετάσαμε την έκφραση του Kindlin-1 και Kindlin-2 στο

de novo

SCC που εντοπίζονται στις δευτερεύουσες θέσεις από τη διάδοση ενδο-πνεύμονα ενός ασθενούς SCC. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4α-Α, Kindlin-1 εκφράζεται ισχυρά στη μάζα του όγκου του

de novo

SCC αλλά ασθενώς εκφράζεται στον όγκο επεμβατική μέτωπο. Ωστόσο, η χρώση Kindlin-1 συγκεντρώνεται στους πυρήνες των κυττάρων σε καρκινικά επεμβατική μπροστά από το

de novo

SCC, γεγονός που υποδηλώνει μια κυτταρόπλασμα στον πυρήνα μετάβασης μπορεί να υπάρχουν για Kindlin-1 (Σχ. 4α-A.Arrowed) . Σε αντίθεση, Kindlin-2 δεν βρέθηκε εκφράζεται με παρόμοιο τύπο δομής από τον ίδιο ασθενή (Εικ. 4a.B). Είναι ενδιαφέρον ότι, μια κυτταρόπλασμα στον πυρήνα μετάβαση από Kindlin-2 βρέθηκε επίσης στον όγκο επεμβατική εμπρός (Σχ. 4α-B.Arrowed). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι Kindlin-1 αλλά όχι Kindlin-2 εμπλέκεται στη ρύθμιση του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων αποικισμός σε SCC. Ως εκ τούτου, συνεχίσαμε να χαρακτηρίσει το διαφορικό ρόλο των Kindlin-1 και Kindlin-2 στην ρύθμιση της εξέλιξης του καρκίνου του πνεύμονα. Διαπιστώσαμε πρώτα τις εκφράσεις του Kindlin-1 και Kindlin-2, καθώς και τα επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση (ΕΜΤ) Συσκευές Ε-καδερίνης και βιμεντίνης σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα που προέρχονται από SCC, AC και LCC και διαπίστωσε ότι Kindlin-1 και Kindlin- 2 εκφράστηκαν διαφορικά σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα (Εικ. 4β). Στη συνέχεια ιδρύθηκε Η1299 κύτταρα που σταθερά υπερεκφράζεται Kindlin-1. Βρήκαμε ότι οι δείκτες ΕΜΤ Ν-καντερίνης και βιμεντίνης ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα Η1299 που υπερεκφράζουν σταθερά Kindlin-1 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που εκφράζουν Flag-ΒΑΡ (Εικ. 4γ), γεγονός που υποδηλώνει ένα ρόλο του Kindlin-1 σε αναστολή της πρόγραμμα ΕΜΤ σε κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα. Επιπλέον, για τον έλεγχο της διαφορικής ρόλος του Kindlin-1 και Kindlin-2 στην ρύθμιση του καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικής κινητικότητας, εκτελέσαμε την δοκιμασία hepatotactic μετανάστευση σε κολλαγόνο τύπου Ι που μεσολαβεί β1 ιντεγκρίνης που σχετίζονται με την κυτταρική μετανάστευση. Βρήκαμε ότι Kindlin-1 ανέστειλε ενώ Kindlin-2 προωθείται κυτταρική μετανάστευση Η1299 σε προσδιορισμό Transwell (Εικ. 4d). Εν τω μεταξύ, ο διακριτός ρόλος του Kindlin-1 και Kindlin-2 στην ρύθμιση της εισβολής καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα εξετάστηκε με προσδιορισμό της έκφρασης των μεταλλοπρωτεϊνάσες συμπεριλαμβανομένων ΜΜΡ7, ΜΜΡ9 και ΜΜΡ13. ΜΜΡ7 και ΜΜΡ9 βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα κάτω με την έκτοπη έκφραση της Kindlin-1, ενώ ΜΜΡ7 και ΜΜΡ13 είχαν απορυθμίζεται με την έκτοπη έκφραση της Kindlin-2 (Σχ. 4e). Σε μια παροδική διαμόλυνση, η υπερέκφραση του Kindlin-1 οδήγησε σε αρνητική ρύθμιση του Ν-καδερίνης (Εικ. 4f αριστερό πλαίσιο), γεγονός που υποδηλώνει ένα ανασταλτικό ρόλο του Kindlin-1 επί EMT περιστατικό. Ωστόσο, knockdown του ενδογενούς Kindlin-2 μείωσε το επίπεδο Ν-cadherin (Σχ. 4f αριστερό πλαίσιο), μια επίδραση που είναι ισοδύναμη με την υπερέκφραση του Kindlin-1. Επιπλέον, εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης του Kindlin-2 σε πρωτογενή και δευτερογενή LCC και διαπίστωσε ότι Kindlin-2 ήταν έντονα εκφρασμένη σε λεμφαδένες μετάσταση LCC (Σχ. 4g-Β, με βέλη) σε σύγκριση με τον πρωτογενή όγκο από τον ίδιο ασθενή ( Σχ. 4G-Α). Αυτό το εύρημα πρότεινε ότι υψηλό επίπεδο έκφρασης Kindlin-2 μπορεί να αντιστοιχεί σε ένα υψηλό δυναμικό των LCC εισβολής. Στο σύνολό τους, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η διαφορική έκφραση των Kindlin-1 και Kindlin-2 σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα αντιστοιχούν σε αντίθετη ρύθμιση σχετικά με τη μετανάστευση των κυττάρων, καθώς και για την επεμβατική ικανότητα των κυττάρων.

α. Έκφραση Kindlin-1 και Kindlin-2 στην δευτερογενή

de novo

SCC από επεμβατικής SCC ασθενή. Α Kindlin-1 έκφραση στο

de novo

SCC. Β έκφραση Kindlin-2 στο

de novo

SCC από τον ίδιο ασθενή όπως στο Α β. Αριστερό πλαίσιο: Η διαφορική έκφραση του Kindlin-1, Kindlin-2, Ε-καδερίνης και βιμεντίνης σε διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα που ελέγχεται από ακτίνης για φόρτωση. Δεξιό πλαίσιο: Ποσοτικοποίηση των σχετικών επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης. ντο. Αριστερό πλαίσιο: Σταθερή έκφραση Kindlin-1 σε κύτταρα Η1299. Ενδείκνυται αναμιγνύονται σταθερούς κλώνους που εκφράζουν Σημαία-Kindlin-1. Δεξιό πλαίσιο: Ποσοτικοποίηση των σχετικών επιπέδων πρωτεΐνης για Kindlin-1 ρυθμιζόμενη Ν-καντερίνης και βιμεντίνης. ρε. Kindlin-1 και Kindlin-2 ρυθμίζει διαφορετικά τη μετανάστευση στην Η1299 κύτταρα. Που εμφανίζεται είναι η ποσοτικοποίηση και την πλοκή ως μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Στατιστικές αναλύσεις μεταξύ των διαφόρων ομάδων κυττάρων εξετάστηκαν από

t

test του Student. ** Αντιπροσωπεύει για

σ

& lt? 0,01. μι. Kindlin-1 και Kindlin-2 διαφορικά ρυθμίζουν τα επίπεδα του mRNA των ΜΜΡ αναλύονται με qPCR σε Η1299 κύτταρα εκφράζουν σταθερά Kindlin-1 και Kindlin-2. Εισαγωγή δείχνει την έκφραση του Kindlin-1 και Kindlin-2 στις σταθερές μικτές κλώνους εφαρμοστεί qPCR. φά. Αριστερό πάνελ: Έκφραση Kindlin-1 ρυθμίζει προς τα κάτω Ν-καντερίνης και εξόντωση Kindlin-2 ρυθμίζει προς τα κάτω Ν-καδερίνης. Δεξιά πλαίσια: Ποσοτικοποίηση των σχετικών επιπέδων πρωτεΐνης για Kindlin-1- και Kindlin-2-ρυθμιζόμενη Ν-καδερίνης. Στατιστικές αναλύσεις μεταξύ των διαφόρων ομάδων κυττάρων εξετάστηκαν από

t

test του Student. ** Αντιπροσωπεύει για

σ

& lt? 0,01. σολ. Έκφραση Kindlin-2 σε λεμφαδένα μετάσταση μεγάλο ασθενή με καρκίνο του πνεύμονα. Α Δημοτικό μεγάλες καρκίνο του πνεύμονα? B. λεμφαδένων μετάσταση μεγάλων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα από τον ίδιο ασθενή.

Η

Kindlin-1 και Kindlin-2 ρυθμίζει αντίθετα κυτταρική ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα σε ένα

in vivo

μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού

με βάση την παραπάνω διαπίστωση που Kindlin-1 και Kindlin-2 διαφορικά εκφρασμένο σε δείγματα ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα, και αντίθετα ρυθμιζόμενη μετανάστευση καρκίνο του πνεύμονα

in vitro

, ήμασταν πρόθυμοι να μάθω αν Kindlin -1 και Kindlin-2 παίζουν ένα διακριτό ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξης του όγκου

in vivo

. Για το σκοπό αυτό, οι ξενομοσχεύματα όγκου ποντικού με Kindlin-1 υπερέκφραση αυξήθηκαν πιο αργά και τα μεγέθη των όγκων ήταν μικρότερη από εκείνη του ελέγχου (Σχ. 5α και β). Ωστόσο, οι όγκοι με Kindlin-2 υπερέκφραση αυξήθηκαν πολύ γρηγορότερα και τα μεγέθη των όγκων ήταν πολύ μεγαλύτερη από εκείνη του ελέγχου (Σχ. 5α και β). Είναι ενδιαφέρον, ιστούς όγκων που ανακτώνται από τα ξενομοσχεύματα του ποντικιού εμφανίζεται επίσης αυξημένη Ν-cadherin και την έκφραση βιμεντίνης στα όγκων που υπερεκφράζουν Kindlin-2, χωρίς αλλαγές για N-cadherin και βιμεντίνης σε Kindlin-1 υπερεκφράζεται ή των όγκων ελέγχου (Εικ. 5c). Αυτά τα δεδομένα κατέδειξαν σαφώς ότι Kindlin-1 και Kindlin-2 δεν είναι μόνο αντίθετα οργανωμένη ανάπτυξη του όγκου αλλά και ο όγκος επεμβατική δυναμικό στο

in vivo

μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού.

α. καμπύλη ανάπτυξης του όγκου. Ο όγκος του όγκου Η1299-Flag-Kindlin-1 ομάδα είναι σημαντικά μικρότερη από τη σημαία-BAP ομάδα (

σ

& lt? 0,01, όπως αναλύθηκαν από το

t

δοκιμασία Student) κατά την ημέρα 22 και εν τω μεταξύ ο όγκος της ομάδας Σημαία-Kindlin-2 είναι προφανώς μεγαλύτερο από το Flag-BAP ομάδα (

σ

& lt? 0,01, όπως αναλύθηκαν από

t

test του Student). σι. Οι όγκοι που ανακτώνται από ποντικούς κατά την ημέρα 27. Γ. Αριστερό πλαίσιο: Προσδιορισμός της εκδήλωσης Ν-καντερίνης και βιμεντίνης από ξενομοσχεύματα όγκου εκφράζουν σταθερά Kindlin-1, Kindlin-2 και η ΒΑΡ ελέγχου από αναλύσεις κηλίδος Western. Δεξιό πλαίσιο: Ποσοτικοποίηση των σχετικών επιπέδων πρωτεΐνης για Kindlin-1- και Kindlin-2-ρυθμιζόμενη Ν-καδερίνης και βιμεντίνης. Στατιστικές αναλύσεις μεταξύ των διαφόρων ομάδων των όγκων εξετάστηκαν από

t

test του Student.