Αφηρημένο

Το embelin φυσικό προϊόν έχει αποδειχθεί ότι διαθέτει ένα ευρύ φάσμα των θεραπευτικών ιδιότητες, ωστόσο, οι μηχανισμοί με τους οποίους ασκεί αντικαρκινικά αποτελέσματα δεν είναι ακόμη σαφής. Με την παρακολούθηση των μοριακών αλλαγών που συνδέονται κατά την πρώιμη αποπτωτικών φάση, έχουμε εντοπίσει τον κρίσιμο ρόλο του οξειδωτικού στρες που προκαλείται σηματοδότησης ΜΑΡ κινάσης ως κυρίαρχο μηχανισμό αντικαρκινικές επιδράσεις του. Θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα Α549 κυττάρων με embelin είχε ως αποτέλεσμα την ενίσχυση της φωσφο-ρ38 και τα επίπεδα φωσφο-ΙΝΚ συντομότερο 4h. Προκατεργασία των κυττάρων με ειδικούς αναστολείς της ρ38 (PD169316) και ΙΝΚ (SP600125) κατήργησε embelin επαγόμενη κασπάσης-3 ενεργοποίησης. Μελέτες που χρησιμοποιούν embelin παρουσία ή απουσία συγκεκριμένων αναστολέων κινάσης ΜΑΡ έδειξε ότι οι παρατηρούμενες μεταβολές στα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ρ38, JNK και ERK 1/2 οφείλονται αποκλειστικά σε embelin και όχι λόγω του cross-talk μεταξύ ΜΑΡ κινάσες. Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), παίζουν καθοριστικό ρόλο στην επαγόμενη embelin μεταβολές στην φωσφορυλίωση της κινάσης ΜΑΡ και απόπτωση ως προεπεξεργασία των κυττάρων με FeTMPyP μετριαστεί αυτό το αποτέλεσμα. Οι παρατηρούμενες αλλαγές δεν οφείλονται στην ανασταλτική δράση της embelin επί ΧΙΑΡ ως κύτταρα επεξεργασμένα με SMAC-Ν7-Αντ πεπτίδιο, ένας ειδικός αναστολέας της περιοχής BIR3 ΧΙΑΡ δεν έκαναν μιμούνται embelin επάγεται αποπτωτικά αποτελέσματα. Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης δείχνουν σαφώς τον κρίσιμο ρόλο της p38 και JNK πορείες στην επαγόμενη απόπτωση embelin και μας παρέχουν νέες ενδείξεις για τη βελτίωση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας της

Παράθεση:. Avisetti DR, Babu KS, Kalivendi SV (2014 ) Η ενεργοποίηση της p38 /JNK οδός είναι Υπεύθυνος για Embelin επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα: Μεταβατική ρόλος των δραστικών μορφών οξυγόνου. PLoS ONE 9 (1): e87050. doi: 10.1371 /journal.pone.0087050

Επιμέλεια: Shrikant Anant, Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρική Σχολή, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 Σεπτεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 17 Δεκ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Avisetti et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το χαμόγελο του έργου από CSIR, Ινδία. Senior Research Fellowship στο DRA από UGC, την Ινδία, αναγνωρίζεται με ευγνωμοσύνη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Embelin, ένα ενεργό συστατικό των φρούτων

Embelia Ribes,

έχει καταδειχθεί ότι διαθέτουν ένα ευρύ φάσμα θεραπευτικών ιδιοτήτων όπως αντικαρκινικά, αντιφλεγμονώδη, αντι-διαβήτη, κατά της παχυσαρκίας, αναλγητικό, αντι-γονιμότητας και αντι-ελμινθικές [1] – [5]. Η αρχική ανακάλυψη του embelin ως αναστολέας της ΧΙΑΡ λόγω της αλληλεπίδρασης της με τον τομέα BIR3 και παρατηρήθηκε η επιλεκτικότητα της προς τα καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα μας ενέπνευσε να το θεωρήσουμε ως ένωση μολύβδου για περαιτέρω μελέτες κατά του καρκίνου [6]. Καθώς πολλές από τις καρκίνων εκφράζουν υψηλά επίπεδα ΧΙΑΡ και να γίνει ανθεκτικοί στην απόπτωση, η θεραπεία με embelin ή σε συνδυασμό με άλλα γνωστά αντικαρκινικά φάρμακα βρέθηκε να ευαισθητοποιηθούν προς απόπτωση [6], [7]. μελέτες που βασίζονται μηχανισμό δείχνουν ότι embelin αδρανοποιεί NF-kB αναστέλλοντας την πυρηνική μεταφορά του p65 και φαίνεται επίσης να αναστέλλουν φωσφορυλίωση STAT3 επάγοντας την έκφραση της ΡΤΕΝ [8], [9].

Ειδικές προσπάθειες για τον εντοπισμό της ακριβούς μοριακής στόχος του embelin ως αποτέλεσμα την ταυτοποίηση του embelin ως αναστολέα έναντι τομέα BIR3 ΧΙΑΡ [6]. Επιπλέον, embelin αποδείχθηκε επίσης να είναι ένας αναστολέας της 5-λιποξυγενάσης και μικροσωμικές προσταγλανδίνης Ε2 συνθάσης-1 (mPGES) -1? αναστολέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου-1 (ΡΑΙ-1) και P300 /CBP σχετιζόμενους παράγοντες (pCAF) [10] – [12]. Επιπλέον, embelin έχει δειχθεί ότι παρεμποδίζουν την οξειδωτική φωσφορυλίωση των μιτοχονδρίων και μπορεί να υποστεί και τις δύο οξειδοαναγωγικές και μη οξειδοαναγωγής μεσολάβηση μηχανισμών [13], [14].

Αν και η συγγένεια του embelin έναντι ορισμένων από τις μοριακούς στόχους και οι μηχανισμοί κυτταρικής σηματοδότησης έχουν αναγνωριστεί, ο πρωταρχικός ενδοκυτταρική στόχος υπεύθυνος για την ιδιοκτησία αντικαρκινικές της δεν είναι ακόμη σαφής, καθώς πολλές από τις προηγούμενες μελέτες έχουν διεξαχθεί σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία όπου το καταρράκτη μεταγωγής σήματος γίνεται πολύπλοκο λόγω της cross-talk μεταξύ πολλαπλών μηχανισμών κυτταρικής σηματοδότησης [8], [15], [16], [17]. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, επιδιώξαμε να προσδιορίσει τα μεταβολές στις οδούς υπεύθυνες για την αντικαρκινική ιδιότητα του embelin κατά την πρώιμη φάση αποπτωτικών σηματοδότησης. Η παρούσα μελέτη εντόπισε για πρώτη φορά, τον κεντρικό ρόλο του μονοπατιού ΜΑΡ κινάσης, ιδιαίτερα p38 και JNK, σε embelin απόπτωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Embelin ήταν καθαρίζεται από τους καρπούς του

Embelia Ribes

όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18], [19]. Ελάχιστο Βασικό Μέσο (ΜΕΜ), μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM), αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό Dulbecco (DPBS), πενικιλλίνη, στρεπτομυκίνη, σουλφοροδαμίνης Β (SRB), Ac-DEVD-7-AFC, Ac-LEHD-7-AFC, PD169316 , SP600125, Ν-ακετυλο-L-κυστεΐνη (NAC), ρυθμιστικό ραδιοανοσοποσοτικού κατακρήμνιση δοκιμασίας (RIPA) και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich, Γερμανία. U0126 και FeTMPyP αγοράστηκαν από την Calbiochem. SMAC-Ν7-Αντ πεπτίδιο (AVPIAQK-Ρ-RQIKIWFQNRRMKWKK) συντέθηκε από GenPro Biotech, Noida, Ινδία. κιτ προσδιορισμού αννεξίνης-ν αγοράστηκε από Clontech Inc, ΗΠΑ. Όλες οι χημικές ουσίες για την προετοιμασία ρυθμιστικό και πρόστιμο χημικές ουσίες αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich, Γερμανία.

Cell Culture και των πειραματικών συνθηκών

Όλες οι κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από την ATCC, USA. Α549, DU145, MCF-7 και WPMY-1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ΜΕΜ (συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μονάδες /ml στρεπτομυκίνη), ενώ H9c2 και τα κύτταρα MRC-5 αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ (συμπληρωμένο με 10 % FBS, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μονάδες /ml στρεπτομυκίνη). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO2 στους 37 ° C. Δώδεκα ώρες πριν τις θεραπείες, το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με αντίστοιχα μέσα που περιέχουν 2% FBS, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Σε μελέτες παρέμβασης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με τις αντίστοιχες αναστολείς κινάσης ΜΑΡ ή αντιοξειδωτικά για 1 ώρα πριν από την προσθήκη του embelin (15 μΜ). Για πειράματα που περιλαμβάνουν SMAC-Ν7-Αντ πεπτίδιο, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μΜ πεπτίδιο για μια περίοδο 8 ωρών.

κυτταροτοξικότητας Δοκιμασία

Η επίδραση της embelin στη βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με σουλφοροδαμίνης Β ( SRB) δοκιμασία όπως περιγράφεται προηγουμένως [20]. SRB είναι μια χρωστική aminoxanthene που δεσμεύεται με βασικά κατάλοιπα αμινοξέων των κυττάρων (σταθερό σε πλάκες καλλιέργειας ιστού με τριχλωροοξικό οξύ) υπό ήπιες όξινες συνθήκες [20]. Εν συντομία, τα κύτταρα (σε πλάκες 24 φρεατίων, ~ 80% συρροή) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις embelin για 48 ώρες σε μέσο συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Μετά τον τερματισμό της επώασης, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με την προσθήκη 30% τριχλωροοξικού οξέος στο μέσο στους 4 ° C για 1 ώρα. Αργότερα, τα κύτταρα πλύθηκαν με απιονισμένο νερό και ξηραίνεται στον αέρα. SRB (0,04%, ν /ν) προστέθηκε στα κύτταρα και επωάστηκαν περαιτέρω για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, τα κύτταρα πλύθηκαν με 1% οξικό οξύ (τρεις φορές) και ξηραίνεται στον αέρα. SRB δεσμευθεί με τα κύτταρα διαλυτοποιήθηκαν σε 10 mM Tris-base και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 565 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας EnSpire πολύτροπη (Perkin Elmer).

κασπάσης 3 και 9 Δοκιμασία

Μετά τον τερματισμό της επώασης, η κυτταρική κασπάσης-3 και -9- δραστηριότητες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας AFC υποστρώματα συζευγμένου τετραπεπτιδίου όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο DPBS και λύθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM HEPES ρΗ 7,4, 5 mM CHAPS και 5 mM DTT) [22]. Κυτταρολύματα σφαιροποιήθηκαν κάτω σε 12.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν. Στα προϊόντα λύσης ίσους όγκους ρυθμιστικού δοκιμασίας (40 mM HEPES ρΗ7.4, 0.2% CHAPS, 10 mM DTT, 4 mM EDTA) που περιέχει είτε κασπάσης-3 υπόστρωμα (Ac-DEVD-7- AFC, 40 μΜ) ή κασπάσης-9 υπόστρωμα (Ac-LEHD-7-AFC, 40 μΜ) προστέθηκε και επωάστηκε στους 37 ° C. Αύξηση των αναγνώσεων φθορισμού λόγω της απελευθέρωσης του AFC παρακολουθείτο για κάθε διάστημα 5 min σε λεχ 400 nm και λem 505 nm για 1 ώρα χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλάκας πολύτροπη EnSpire (Perkin Elmer). εκτίμηση πρωτεΐνης διεξήχθη με τη μέθοδο Bradford και οι μονάδες φθορισμού κανονικοποιήθηκαν προς την ολική πρωτεΐνη στο μίγμα επώασης.

Annexin-V /FITC Ανάλυση για απόπτωση

Α549 κύτταρα αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων σε 6- φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με embelin για 4 ώρες. Μετά τη θεραπεία, καλυπτρίδες πλύθηκαν δύο φορές με PBS που ακολουθείται από ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης 1Χ. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ανεξίνη-ν /FITC αντίσωμα με επώαση στο σκοτάδι για 30 λεπτά και πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης 1Χ για να απομακρυνθεί οποιοδήποτε μη συνδεδεμένο αντίσωμα σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Clontech Inc, USA). Φορμαλδεΰδης (2%) προστέθηκε σε στερέωση των κυττάρων στο τέλος της επώασης. Ο φθορισμός παρακολουθείται χρησιμοποιώντας ένα Olympus-IX71inverted μικροσκόπιο εφοδιασμένο με FITC και ροδαμίνη ρυθμίσεις φίλτρου. Έκφραση

γονιδιακής χρησιμοποιώντας Microarray

κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με embelin για 4 ώρες. Μετά τις θεραπείες, RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας κιτ Qiagen είναι σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση και η καθαρότητα του RNA που εκχυλίζεται αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την Nanodrop Φασματοφωτόμετρο (Thermo Scientific). Η ακεραιότητα του εκχυλισμένου RNA αναλύθηκε στο Bioanalyzer (Agilent). Το RNA θεωρείται ότι είναι καλής ποιότητας με βάση τις 260/280 αξίες, rRNA 28S /18S αναλογίες και τον αριθμό ακεραιότητα του RNA (RIN). Τα δείγματα σημάνθηκαν χρησιμοποιώντας Agilent Quick Amp Kit. 500 ng του συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας ολιγο-άΤ εκκινητή tagged με την αλληλουχία προαγωγού Τ7. cDNA που ελήφθη έτσι μετατράπηκε σε δίκλωνο cDNA στην ίδια αντίδραση. Περαιτέρω το cDNA μετατράπηκε σε cRNA στο

in vitro

βήμα μεταγραφή χρησιμοποιώντας ένζυμο πολυμεράσης RNA Τ7 και βαφή Cy3 προστέθηκε στο μίγμα της αντίδρασης. cRNA που ελήφθη καθαριστεί χρησιμοποιώντας στήλες RNeasy (Qiagen Inc) και η συγκέντρωση και το ποσό της χρωστικής που ενσωματώνεται προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Nanodrop. Η ειδική δραστικότητα για όλα τα δείγματα μεγαλύτερη από 8 pmol χρωστικής /μα cRNA θεωρήθηκαν ιδανικό για υβριδισμό. Σημασμένο cRNA (600 ng) υποβλήθηκε σε υβριδισμό στη συστοιχία (Προσαρμοσμένο ολόκληρο το γονιδίωμα του Ανθρώπου 8 × 60k σχεδιάστηκε από Γονοτυπικός Technology Private Limited AMADID: 027114) χρησιμοποιώντας το Gene Expression κιτ υβριδισμός στο Σίγουρα Επιμελητήρια υβριδισμού (Agilent) στους 65 ° C για 16 ώρες. Οι υβριδοποιημένες πλάκες πλύθηκαν χρησιμοποιώντας Γονιδιακής Έκφρασης ρυθμιστικά πλύσης. Οι υβριδοποιήθηκαν, πλύθηκαν slides μικροσυστοιχιών στη συνέχεια σαρώθηκαν σε ένα σαρωτή μικροσυστοιχία (G2505C, Agilent Technologies). εξαγωγή δεδομένων από τις εικόνες έγινε με τη χρήση του λογισμικού Feature Εξόρυξη και εικόνες ποσοτικά (έκδοση 10.7 του Agilent). Χαρακτηριστικό εκχυλίζεται ακατέργαστα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας GeneSpring GX Έκδοση 11.5 λογισμικού από Agilent. Κανονικοποίηση των δεδομένων έγινε σε GeneSpring GX με τη χρήση του 75

ου βάρδια εκατοστημόριο. Σημαντικές γονίδια πάνω και κάτω ρυθμίζονται δείχνει δύο φορές και πάνω στα δείγματα σε σχέση με τον έλεγχο δείγματος εντοπίστηκαν. Στατιστική

t-test

p-αξία υπολογίστηκε με βάση Φοιτητών

t-test

Αλγόριθμος. Γονίδια ταξινομήθηκαν με βάση την λειτουργική κατηγορία και πορείες χρησιμοποιώντας GeneSpring GX και γονοτυπική Biointerpreter-Βιολογική Analysis Software. Τα δεδομένα των μικροσυστοιχιών έχει υποβληθεί στην βάση δεδομένων GEO με αριθμό πρόσβασης GSE50545.

Η ενδοκυτταρική ROS Μέτρηση

Αέργου μορφών οξυγόνου στα κύτταρα προσδιορίστηκε με καρβοξυ-H2-DCFDA (Molecular Probes) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Μετά τον τερματισμό των θεραπειών, μέσα αναρροφήθηκαν και τα κύτταρα σε πλάκες 12-φρεατίων πλύθηκαν δύο φορές με DPBS. Άνευ ορού μέσο που περιέχει 10 μΜ καρβοξυ-Η2-DCFDA προστέθηκε σε κύτταρα και επωάστηκαν περαιτέρω στους 37 ° C για 20 λεπτά. Τέλος, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με DPBS πριν από την προσθήκη μέσου καλλιέργειας. Ενδοκυτταρικό φθορισμό παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Olympus-IX71inverted μικροσκόπιο εφοδιασμένο με FITC ρύθμιση φίλτρου.

Ανάλυση Western Blot

Μετά τις θεραπείες, τα κύτταρα πλύθηκαν με DPBS, απαλά ξύνεται και συλλέχθηκαν με σύντομη φυγοκέντρηση (300 g για 3 λεπτά) και επαναιωρείται σε 100 μΙ RIPA που περιέχει κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και ορθο-βαναδικό νάτριο, 10 mM (Sigma). Το προκύπτον κυτταρικό εναιώρημα περνά μέσα από μία βελόνα 26 gauge 10 φορές για να εξασφαλιστεί η πλήρης λύση. Το προϊόν λύσης φυγοκεντρήθηκε στα 12.000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C και το διαυγές υπερκείμενα συλλέχθηκαν σε ξεχωριστούς σωλήνες. Δεδομένου ότι όλα τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται είναι μονοκλωνικά, αντί απογύμνωση και της ανιχνεύσεως τα ανοσοστυπώματα για ολική και φωσφο-ειδικές πρωτεΐνες, έχουμε πραγματοποιήσει ανοσοκηλίδωση χωριστά, προκειμένου να αποφευχθεί οποιαδήποτε σήματα φόντου. Μετά εκτίμηση πρωτεΐνης με τη μέθοδο του Μπράντφορντ, πρωτεΐνες (25 μg) αναλύθηκαν σε 10% SDS-PAGE και στυπώθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν με μονοκλωνικά αντισώματα που εγείρονται έναντι συνολικού και φωσφο ειδικών αντισωμάτων για ERK 1/2, ρ38, JNK (Cell Signaling Technology)? και τουμπουλίνης (Sigma-Aldrich). Αντι-κουνελιού Ig-G συζευγμένο με HRP (GE Life Sciences) και IgG αντι-ποντικού συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση (Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκαν ως οι δευτερογενή αντισώματα για την κινάση ΜΑΡ και αντισώματα τουμπουλίνης αντίστοιχα. Συγκροτήματα αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας ECL Prime κηλίδωση Western αντιδραστήριο (GE, Life Sciences) ή αντιδραστήριο ΒΟΙΡ /ΝΒΤ για τουμπουλίνη (Sigma-Aldrich) και οι εντάσεις ζώνης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό GeneTools (Syngene σύστημα τεκμηρίωσης γέλης).

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε μέσω του Student

t

δοκιμή με τη χρήση του λογισμικού SIGMAPLOT.

Αποτελέσματα

Embelin Εκθέματα ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα

Η αντι-πολλαπλασιαστική δραστηριότητα των embelin συγκρίθηκαν με δοκιμασία SRB σε επιλεγμένο καρκίνο και φυσιολογικό κυτταρικές σειρές (Σχ. 1). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις embelin (2,5, 5, 10 και 25 μΜ) για 48 ώρες. Μεταξύ των καρκινικών κυττάρων, embelin βρέθηκε να είναι περισσότερο τοξικό για τα κύτταρα Α549 με IC

50 τιμή του 4,4 μΜ ακολουθούμενη από DU145 και MCF7 με 6,31 και 10,66 μΜ αντίστοιχα. Ωστόσο, η παρατηρούμενη IC

50 τιμές ήταν συγκριτικά λιγότερες από τις κανονικές κυτταρικές σειρές δηλ., MRC5, WPMY-1 και H9c2 που επέδειξε IC

50 αξίας 24,4, 10,9 και 23,4 μΜ, αντίστοιχα. Η διαφορά μεταξύ του παρατηρούμενου IC

50 τιμές του καρκίνου του πνεύμονα και φυσιολογικά κύτταρα (4,44 ± 0,76 και 24,44 ± 5,32 μΜ) φαίνεται να είναι πιο σημαντική. Καθώς τα κύτταρα Α549 παρουσίασαν αυξημένη ευαισθησία προς embelin, όλες οι περαιτέρω μελέτες έχουν διεξαχθεί χρησιμοποιώντας αυτήν την κυτταρική γραμμή για την κατανόηση του τρόπου δράσης του embelin να αποκτήσουν νέες γνώσεις για τη στόχευση επιλεκτικά καρκινικά κύτταρα πνεύμονα σε σύγκριση με την κανονική ομόλογό κυττάρων τους. Ως εκ τούτου, προκειμένου να εντοπίσει την πρώιμη αποπτωτική φάση, έχουμε αναλύσει την εξαρτημένη ώρα επίδραση της embelin επί της δραστικότητας της κυτταρικής κασπάσης-3 σε κύτταρα Α549 (Εικ. 2Α). Embelin (15 μΜ) προκάλεσε σχεδόν 2-πλάσια αύξηση στην δραστικότητα της κασπάσης-3 ήδη από 4h χρονικό διάστημα το οποίο αυξάνεται περαιτέρω μέχρι 6 φορές με 8h (Εικ. 2Α). Annexin-V /FITC χρώση των κυττάρων σε επεξεργασία με embelin (4h) δείχνει σαφώς την πρώιμη αποπτωτική στάδιο των κυττάρων, δεδομένου ότι μόνο βάφτηκαν με αννεξίνη-ν, αλλά όχι με ιωδιούχο προπίδιο (Εικ. 2Β). Ωστόσο, σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία, δηλαδή, 18 και 24 ώρες, η κασπάση-3 δραστηριότητες μειώθηκαν σχεδόν σε 4 και 2 φορές αντίστοιχα δεικνύοντας ότι τα αποπτωτικά κύτταρα μπορεί να έχουν εντελώς πέθαναν πριν από το τέλος του 18 ή 24 ώρες ή θα μπορούσε επίσης να υπάρχει δυνατότητα πολλαπλών μηχανισμοί κυτταρικού θανάτου λόγω της cross-talk μεταξύ των διαφόρων μηχανισμών σηματοδότησης.

(Α) Δομή του embelin (Β) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με embelin για 48 ώρες και μετά την περάτωση της επώασης, η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με σουλφοροδαμίνης Β δοκιμασία και IC

50 τιμές υπολογίστηκαν ήταν όπως αναφέρεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι». Τα δεδομένα που δεικνύονται είναι μέση τιμή ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα. * Υποδηλώνει ρ & lt? 0.01as σύγκριση με τους μάρτυρες

Η

(Α) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 15 μΜ embelin για διαφορετικά χρονικά διαστήματα.. Μετά τον τερματισμό των θεραπειών, δράση της κασπάσης-3 μετρήθηκε όπως υποδεικνύεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι». (Β) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 15 μΜ embelin για 4 ώρες και χρωματίστηκαν με αννεξίνη-ν /FITC και ιωδιούχο προπίδιο όπως περιγράφεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι». εικόνες φθορισμού συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Olympus-IX71 ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού εξοπλισμένο με FITC και ροδαμίνη ρυθμίσεις του φίλτρου. Αντιπροσωπευτικά εικόνες από τρία διαφορετικά πεδία του άποψη φαίνεται. (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με έναν αναστολέα ΧΙΑΡ, SMAC-Ν7-Αντ πεπτιδίου (100 μΜ) για 8 ώρες. Αργότερα, κασπάσης-3 και -9- δραστηριότητες μετρήθηκαν με τη χρήση των τετρα-πεπτιδικά υποστρώματα, όπως περιγράφεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι». Τόσο για την (Α) και (Γ) δεδομένα που παρουσιάζονται είναι η μέση τιμή ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα. ** Υποδεικνύει ρ & lt? 0,01 και * υποδηλώνει ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τους μάρτυρες

Η

Όπως embelin είναι γνωστό ότι αναστέλλει ΧΙΑΡ με σύνδεση προς τον τομέα BIR3 παρόμοια με εκείνη του SMAC, έχουμε την επόμενη εξετάστηκε αν η. παρατηρούμενες επιπτώσεις των embelin στην κυτταρική απόπτωση μπορεί να αποδειχθεί με ένα κύτταρο διαπερατό SMAC-Ν7-Αντ πεπτίδιο (που αποτελείται από αμινο τερματικό πεπτίδιο 7 αμινοξέων ώριμης SMAC του – AVPIAQK δεσμευμένη Ant πεπτίδιο -RQIKIWFQNRRMKWKK, για την διαπερατότητα των κυττάρων με ένα συνδετήρα προλίνη) η οποία είναι που είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρούν ειδικά με BIR3 περιοχή του ΧΙΑΡ [24], [25]. Τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η θεραπεία των κυττάρων Α549 με SMAC-Ν7-Αντ πεπτίδιο (100 μΜ για 8h) αυξημένη δραστικότητα κυτταρικής κασπάσης-9 σε σχεδόν δύο φορές σε σχέση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα, ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στην δραστικότητα της κασπάσης-3 ( Σχ. 2C). Αν και οι παρατηρούμενες επιδράσεις της SMAC-Ν7-Αντ πεπτίδιο είναι σύμφωνα με προηγούμενη έκθεση [24], η έλλειψη της κασπάσης-3 ενεργοποίησης με SMAC-Ν7-Αντ πεπτίδιο, αλλά όχι με embelin, μας ώθησε να διερευνήσει τα υπεύθυνα μονοπάτια που μεσολαβούν embelin Induced απόπτωση για την απόκτηση νέων γνώσεις σχετικά με το μηχανισμό δράσης του.

μεταβολή στη γονιδιακή έκφραση προφίλ από embelin

για να προσδιοριστούν τα μονοπάτια υπεύθυνος που προκαλείται embelin απόπτωση, έχουμε αναλύσει το προφίλ έκφρασης μεταλλαγμένου γονιδίου σε κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με embelin (15 μΜ για 4 ώρες). Ένα σύνολο 215 ρυθμίζεται προς τα πάνω και 80 ρυθμίζεται προς τα κάτω γονίδια εντοπίστηκαν τα οποία έδειξαν τουλάχιστον δύο φορές τη διαφορά πάνω από τους ελέγχους με τη σημασία της P & lt?. 0.05

Η κατάταξη αυτών των γονιδίων με βάση την λειτουργική κατηγορία και πορείες χρησιμοποιώντας GeneSpring GX και Γονοτυπικός Biointerpreter-Βιολογική λογισμικό ανάλυσης έδειξε ότι τα αυξητικά γονίδια majorly ανήκουν σε πέντε διαφορετικές οδούς (με τουλάχιστον 4 τροποποιημένα γονίδια σε κάθε οδό) και τον αριθμό των γονιδίων μεταβάλλεται είναι της τάξης του Wnt (4 γονίδια) & lt? Focal πρόσφυσης (5 γονίδια ) & lt? ρ53 (8 γονίδια) & lt? κυτοκίνης κυτοκίνης αλληλεπίδραση υποδοχέα (11 γονίδια) & lt? ΜΑΡ κινάσης (16 γονίδια) (Σχήμα 3 Α-C).. Μεταξύ των μειωτικά γονίδια με τουλάχιστον τρία γονίδια σε κάθε μονοπάτι διαθέτει ένα 2-φορές αλλαγή με σημασία ρ & lt?. 0.05 ανήκε στον υποδοχέα κυτοκίνης-κυτοκίνης και διαδρομή ΜΑΡ κινάσης (Εικ. 3Α και Β)

Α549 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με embelin (15 μΜ) για 4 ώρες. ανάλυση μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο «Υλικά και Μέθοδοι». Γονίδια που έδειξαν διαφορική ρύθμιση κατά τουλάχιστον 2 φορές με p & lt? 0,05 ταξινομήθηκαν με βάση την λειτουργική κατηγορία και πορείες χρησιμοποιώντας GeneSpring GX και γονοτυπική Biointerpreter-Βιολογική Analysis Software. Πορείες που έδειξε κυρίως διαφορική έκφραση ήταν οδού (Α) ΜΑΡ κινάση, (Β) Cytokine-κυτοκίνης αλληλεπίδραση υποδοχέα και (C) ρ53 μονοπάτι. Τα δεδομένα έχουν υποβληθεί στη βάση δεδομένων GEO με αριθμό ένταξης GSE50545.

Η

Με μια ματιά, τα αποτελέσματα που προέκυψαν δείχνουν ότι μεταξύ των αλλαγμένη μονοπάτια, οδός σηματοδότησης ΜΑΡ κινάσης φαίνεται να είναι πιο κυρίαρχο και επηρέασε σημαντικά με σχεδόν 16 τροποποιημένα γονίδια και πολλά από τα γονίδια είναι είτε ανοδικά ή καθοδικά προς ρ38 /JNK /ΕΚΚ μονοπάτι όπως ρ53 ή ρυθμιστές αυτών οδού (Εικ. 3Α). Από λειτουργική άποψη, η κατάσταση φωσφορυλίωσης των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών (όπως, DUSPs, GADD45A /B, ρ53 κλπ), αλλά όχι μόνο τα επίπεδα μεταγραφής τους υπαγορεύουν την κυτταρική μοίρα. Παρ ‘όλα αυτά, τα αποτελέσματα που προέκυψαν έδειξε τον ουσιαστικό ρόλο της σηματοδότησης ΜΑΡ κινάσης και μας ενέπνευσε να εστιάσουμε στη συμμετοχή του μονοπατιού της ΜΑΡ κινάσης σε embelin απόπτωση.

Embelin Induced ενεργοποίηση της p38 και JNK Pathway

με βάση τις αρχικές ενδείξεις που λαμβάνονται από μελέτες μικροσυστοιχιών για το δυναμικό ρόλο της οδού της ΜΑΡ κινάσης σε επαγόμενη embelin απόπτωση, επιδιώξαμε την περαιτέρω διερεύνηση για τη συμμετοχή της ΜΑΡΚ σηματοδότησης και παρακολουθείται προκαλούμενη embelin μεταβολές στην κατάσταση φωσφορυλίωσης της ERK, πρωτεϊνών p38 και JNK ( Σχ. 4). Τα αποτελέσματα, όπως φαίνεται στο σχήμα-3 υποδεικνύουν ότι embelin (15 μΜ) προκάλεσε τη φωσφορυλίωση της ρ38 σε σχεδόν 2,5 και 3 φορές με 4 και 8 ώρες αντίστοιχα. Φωσφο-ΙΝΚ 1/2 επίπεδα αυξήθηκαν επίσης σε 1,2 και 1,9 φορές αντίστοιχα από 8 ώρες. Ωστόσο, κάτω από παρόμοιες συνθήκες θεραπείας υπήρξε μία σημαντική μείωση στην κατάσταση φωσφορυλίωσης του ERK 1/2 (ρ42 και ρ44) και οι τιμές βρέθηκαν να είναι 0,3 και 0,2 φορές μικρότερη από εκείνη των ελέγχων (εικ. 4Α και Β). Για να καταλάβουμε αν οι αλλαγές στην κατάσταση φωσφορυλίωσης αυτών των πρωτεϊνών κινάσης ΜΑΡ έχει καμία σημασία στην παρατηρούμενη απόπτωση, έχουμε προεπεξεργασία κυττάρων για 1 ώρα ατομικά με ειδικούς αναστολείς για ρ38 (PD169316), JNK (SP600125) και ΜΕΚ (U0126) εις 5 μΜ συγκέντρωση που ακολουθείται από embelin (15 μΜ) για 4 ώρες. Embelin επαγόμενη δραστικότητα κασπάσης-3 ανεστάλη σημαντικά τόσο από ρ38 και αναστολείς ΙΝΚ σε σχεδόν τιμές ελέγχου (Εικ. 4C). Ωστόσο, υπό παρόμοιες πειραματικές συνθήκες αναστολέα ΜΕΚ (U0126) δεν εμφανίζουν κανένα προστατευτικό αποτέλεσμα κατά της επαγόμενης embelin απόπτωση και επίσης καμία σημαντική αύξηση στην δραστικότητα της κασπάσης-3 παρατηρήθηκε σε κύτταρα επεξεργασμένα με τους αναστολείς μόνο (Σχ. 4C). Οι παρατηρούμενες αλλαγές δείχνουν σαφώς ότι οι μεταβολές στην κατάσταση φωσφορυλίωσης τόσο του p38 και JNK φαίνεται να είναι ζωτικής σημασίας για την επαγόμενη embelin απόπτωση.

(Α) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 15 μΜ embelin για 4 και 8 ώρες. Σύνολο καθώς φωσφορυλιωμένο ERK 1/2, ρ38, JNK και ένα δεύτερο τουμπουλίνης (έλεγχος φόρτωσης) επίπεδα μετρήθηκαν με κηλίδα Western, όπως περιγράφεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι» ενότητα. (Β) Κανονικοποιημένη τιμές των εντάσεων ζώνης που λαμβάνονται με πυκνομετρική ανάλυση των δεδομένων από το (Α). (C) Κασπάση-3 δραστικότητα σε κύτταρα προεπεξεργασμένα με ή χωρίς U0126 (5 μΜ), PD169316 (5 μΜ), SP600125 (5 μΜ) για 1 ώρα που ακολουθείται από embelin (15 μΜ) για 4 ώρες. Οι τιμές ελέγχου κανονικοποιούνται στο 1 και τα στοιχεία που αναφέρονται είναι ο μέσος όρος ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα. * Υποδηλώνει ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο και την # δεικνύει ρ & lt?. 0.05 σε σύγκριση με κύτταρα που κατεργάζονται embelin

Η

Για να προσδιοριστεί αν οι παρατηρούμενες μεταβολές στην φωσφορυλίωση ΜΑΡΚ είναι, λόγω της θεραπείας embelin μόνα ή λόγω της ρυθμιστικής επίδρασης ενός ΜΑΡ κινάσης πάνω στο άλλο ΜΑΡΚ, έχουμε κατεργασία των κυττάρων μεμονωμένα με embelin (15 μΜ) υπό την παρουσία και απουσία του αναστολέα ΜΕΚ (U0126, 5 μΜ) ή αναστολέα ρ38 (PD169316, 5 μΜ) ή αναστολέα JNK (SP600125, 5 μΜ) για 4 ώρες και αναλύθηκαν τα επίπεδα φωσφορυλίωσης και των τριών κινασών ΜΑΡ (Εικ. 5). Το U0126 αναστολέα ΜΕΚ παρεμποδίζει καθοδικά ERK στόχο του. αναστολέα ρ38, PD169316 και αναστολέα JNK, SP600125 ειδικά αναστέλλουν ρ38 και δραστικότητα JNK αντίστοιχα με σύνδεση ανταγωνιστικώς προς τους θύλακες σύνδεσης ΑΤΡ πρόληψη της φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών καθοδικά, αλλά, ως τέτοια δεν έχει ως αποτέλεσμα τα μειωμένα επίπεδα φωσφορυλίωσης είτε ρ38 ή JNK [26 ], [27]. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η θεραπεία των κυττάρων με τον αναστολέα ΜΕΚ (U0126) ανέστειλαν φωσφο-ΕΚΚ 1/2, αλλά δεν μετέβαλε τα επίπεδα της επαγόμενης embelin φωσφο-ρ38 και τα επίπεδα φωσφο-ΙΝΚ. Παρομοίως, κατεργασία των κυττάρων με τον αναστολέα ρ38 (PD169316) δεν επηρέασε τα επίπεδα της φωσφο-ΙΝΚ και φωσφο-ΕΚΚ προκαλούνται από embelin. Επίσης, η επεξεργασία των κυττάρων με αναστολέα JNK (SP600125) δεν επηρέασε τα επίπεδα της φωσφο-ρ38 και φωσφο-ΕΚΚ παρουσία ή απουσία embelin (Εικ. 5). Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι οι παρατηρούμενες αλλαγές στα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ρ38, JNK και ERK φαίνεται να διαμεσολαβείται άμεσα από embelin θεραπεία, αλλά όχι λόγω της cross-talk μεταξύ των κινασών ΜΑΡ.

Α549 κύτταρα προ κατεργασμένους με ή χωρίς U0126 (5 μΜ), PD169316 (5 μΜ), SP600125 (5 μΜ) για 1 ώρα που ακολουθείται από embelin (15 μΜ) για 4 ώρες. Σύνολο και φωσφορυλιωμένη επίπεδα της ERK 1/2, p38, JNK 1/2 και τουμπουλίνης (έλεγχος φόρτωσης) ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western όπως περιγράφεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι» ενότητα.

Η

ROS Μεσολαβεί ΧΑΡΤΗΣ κινάσης κανονισμού με Embelin

πρωτεϊνών ΜΑΡΚ είναι γνωστό ότι ρυθμίζεται από το οξειδωτικό στρες [28]. Επιπλέον, η δομή του βενζοκινόνη embelin έχει αποδειχθεί για να σχηματίσουν ημικινόνης ρίζα με μηχανισμό οξειδοαναγωγής η οποία τελικά οδηγεί στην παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου [13], [29]. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν έναν σημαντικό ρόλο για ROS σε επαγόμενη embelin απόπτωση. Για την αξιολόγηση των προ-οξειδωτικές ιδιότητες των embelin, μελετήσαμε τα αποτελέσματά της για τη δημιουργία του οξειδωτικού στρες στα κύτταρα Α549. Οι ενδοκυτταρικές ROS που δημιουργούνται από embelin ανιχνεύθηκε με μία ενίσχυση στην ενδοκυτταρική φθορισμού του DCF (Εικ. 6). Embelin (15 μΜ) προκάλεσε παραγωγή ROS σε χρόνο εξαρτώμενο τρόπο με σχεδόν 5 και 10-πλάσια αύξηση πάνω από χωρίς θεραπεία ελέγχους μέχρι το τέλος του 2 και 4 ώρες αντίστοιχα (Εικ. 6). Προκατεργασία των κυττάρων με το αντιοξειδωτικό, FeTMPyP (10 μΜ) ή Ν-ακετυλο-L-κυστεΐνη (NAC) (10 mM) αναστέλλει σημαντικά την επαγόμενη embelin DCF χρώση με εκείνη του τιμές ελέγχου (Εικ. 6).

(Α) κύτταρα Α549 προκατεργάστηκαν με ή χωρίς FeTMPyP (10 μΜ) ή NAC (10 mM) για 1 ώρα που ακολουθείται από embelin (15 μΜ) για 4 ώρες και παραγωγή ROS ανιχνεύθηκε με χρώση DCF, όπως περιγράφεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι» τμήμα. Κυτταρικού φθορισμού συνελήφθη χρησιμοποιώντας ένα Olympus-IX71 ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού εξοπλισμένο με FITC ρυθμίσεις του φίλτρου. (Β) Η μέση ένταση φθορισμού από τρία διαφορετικά πεδία άποψη ελήφθησαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ. * Υποδηλώνει ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο και την # δεικνύει ρ & lt?. 0.05 σε σύγκριση με κύτταρα που κατεργάζονται embelin

Η

αξιολόγησε περαιτέρω την επίδραση της embelin επαγόμενης ROS για σηματοδότηση ΜΑΡΚ με την παρουσία και απουσία του το αντιοξειδωτικό, FeTMPyP (Εικ. 7). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι embelin επάγεται ROS είναι υπεύθυνη για την παρατηρούμενη μεταβολές στα επίπεδα φωσφο-πρωτεΐνης ρ38, JNK και ERK 1/2 ως προεπεξεργασία των κυττάρων με FeTMPyP καταλυθεί αυτό το αποτέλεσμα (Σχ. 7Α). Σύμφωνα με τα παραπάνω αποτελέσματα, η προκατεργασία των κυττάρων με FeTMPyP (10 μΜ) ανέστειλε επίσης τα αποπτωτικά αποτελέσματα του embelin υποδεικνύοντας ότι αλλαγμένη ΜΑΡ κινάσης σηματοδότηση λόγω της ενισχυμένης ROS διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην embelin επαγόμενη απόπτωση (Σχ. 7Β).

Α549 κύτταρα προεπεξεργασμένα με ή χωρίς το αντιοξειδωτικό FeTMPyP (10 μΜ) για 1 ώρα που ακολουθείται από embelin (15 μΜ) αγωγή για 4 ώρες. (Α) Κυτταρική επίπεδα της ολικής και φωσφορυλιωμένης ERK 1/2, p38, JNK 1/2 και τουμπουλίνης ανιχνεύθηκαν με κηλίδα Western που ακολουθείται από ανίχνευση χημειοφωταύγειας όπως περιγράφεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι». (Β) Κάτω από παρόμοιες πειραματικές συνθήκες, όπως (Α), δραστηριότητα κυτταρική κασπάσης-3 μετρήθηκε όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι» ενότητα. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι η μέση τιμή ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα. * Υποδηλώνει p & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο και # υποδεικνύει ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με embelin επεξεργασμένα κύτταρα

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι το οξειδωτικό στρες που προκαλείται ΜΑΡΚ. σηματοδότηση διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο στην επαγόμενη embelin απόπτωση. Ανάλυση των προφίλ γονιδιακής έκφρασης με μελέτες μικροσυστοιχίας έδειξαν την πιθανή εμπλοκή του μονοπατιού της ΜΑΡ κινάσης σε κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με embelin για 4 ώρες. Προκατεργασία των κυττάρων με ειδικούς αναστολείς της ρ38 είτε ή JNK ανέστειλε σημαντικά embelin επαγόμενη ενεργοποίηση της κασπάσης-3, καθώς και εξουδετερώνονται embelin επαγόμενη μεταβολές στα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ρ38, JNK και ERK κινασών 1/2 ΜΑΡ. Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) φαίνεται να παίζει καθοριστικό ρόλο μεταξύ embelin και διαδρομή ΜΑΡ κινάσης. Όλες οι παρατηρούμενες επιδράσεις του embelin δεν οφείλονται στην αναστολή της ΧΙΑΡ ως θεραπεία των κυττάρων με κύτταρο διαπερατό SMAC-Ν7-Αντ πεπτίδιο, το οποίο συνδέεται με τον τομέα του BIR3 ΧΙΑΡ δεν επηρέασε την ενεργοποίηση κυτταρικών κασπάσης-3.

Το φυσικό προϊόν, embelin, έχει δοθεί μεγαλύτερη προσοχή τα τελευταία χρόνια για αντικαρκινικές ιδιότητες του. Ακόμη πιο σημαντικό, έχει καταδειχθεί ότι έχουν περισσότερα εκλεκτικότητα προς τα καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα (6). Ακόμα και στην παρούσα εργασία, παρατηρήσαμε μια παρόμοια τάση και μια σημαντική διαφορά στην IC

50 αξίες της embelin ήταν εμφανής μεταξύ του καρκίνου του πνεύμονα και κανονικό κυτταρικές σειρές (Εικ. 1). Αν και embelin αρχικά ταυτοποιήθηκε ότι είναι ένας αναστολέας του ΧΙΑΡ μέσω της αλληλεπίδρασης της σε πεδίο BIR3, μεταγενέστερες μελέτες απέδειξαν τις άμεσες

in vitro

επιδράσεις του embelin στην οξειδωτική φωσφορυλίωση των μιτοχονδρίων, η αναστολή της 5-λιποξυγενάσης (5 -lo) και μικροσωματικής προσταγλανδίνης Ε2 συνθάσης-1 (mPGES) -1 και αδρανοποίηση του αναστολέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου-1 (ΡΑΙ-1) [10], [11]. Ωστόσο, ο προσδιορισμός της πρωτογενούς ενδοκυτταρικό στόχο που είναι υπεύθυνη για την αντικαρκινική ιδιότητα του embelin μπορεί τελικά να βοηθήσει στη διαρθρωτική βελτίωση της embelin για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας και της επιλεκτικότητας του.

Πρόσφατα, διάφορες μελέτες έχουν διεξαχθεί για να κατανοήσουν το τρόπος δράσης των embelin και έχει αποδειχθεί ότι έχει ένα ρόλο στην απενεργοποίηση του NF-kB, η αναστολή της STAT3 σηματοδότησης μέσω φωσφατάσης τυροσίνης πρωτεΐνης ΡΤΕΝ, λυσοσωμική αποσταθεροποίησης και ΑΚΤ και οδούς mTOR [8], [9], [15] , [30], [31]. Ωστόσο, αν όλα τα παρατηρούμενα αποτελέσματα είναι αλληλοεξαρτώμενες ή ανεξάρτητες μεταξύ τους δεν είναι ακόμη σαφής, καθώς πολλοί από τους αναφέρθηκαν πειράματα διεξήχθησαν σε μία καθορισμένη διάρκεια είτε 24 ή 48 ώρες [8], [10], [16], [17 ].

τα δεδομένα από τις μελέτες μικροσυστοιχίας κατά τα πρώτα στάδια του embelin απόπτωση που επάγεται από εμάς επεσήμανε τις αλλαγές στη ρύθμιση των παραγόντων μεταγραφής καθοδικά προς ΜΑΡΚ πρωτεΐνες (Εικ. 3). Στην παρούσα μελέτη, έχουμε ταυτοποιήσει έναν εξέχοντα ρόλο του μονοπατιού κινάσης ΜΑΡ, (αυξημένα επίπεδα φωσφο-ρ38 και φωσφο-ΙΝΚ) σε embelin επαγόμενη απόπτωση.