Αφηρημένο

Ο καρκίνος του τραχήλου κύτταρα επιδεικνύουν αυξημένη απαίτηση για την αποικοδόμηση της πρωτεΐνης ουβικιτίνης-εξαρτώμενη σχετίζεται με αυξημένο μεταβολικό ρυθμό του κύκλου εργασιών . Η ουβικιτίνη, η οποία είναι ένα μικρό, ιδιαίτερα συντηρημένη πρωτεΐνη που εκφράζεται σε όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα, μπορούν να συνδεθούν ομοιοπολικά με ορισμένες πρωτεΐνες-στόχους η σήμανσή τους για αποικοδόμηση από το σύστημα ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος. Προηγούμενες μελέτες τονίζουν τον ουσιαστικό ρόλο της ουβικιτίνης Β (UbB) και της υποβάθμισης της πρωτεΐνης UbB εξαρτώμενη πρωτεασώματος σε αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης (HDACi) επαγόμενη επιλεκτικότητα όγκου. Υποθέσαμε ότι UbB παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στη λειτουργία του καρκίνου του τραχήλου βλαστικών κυττάρων. Μετρήσαμε τα επίπεδα της ενδογενούς UbB στο mammospheres

in vitro από

πραγματικού χρόνου PCR και κηλίδωση Western. Η λειτουργία του UbB σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν εκτιμήθηκε μετά knockdown έκφρασης UbB σε παρατεταμένη Τριχοστατίνη Α-επιλεγμένα κύτταρα HeLa (HeLa /TSA) με μέτρηση

in vitro

κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την απόπτωση των κυττάρων, εισβολή, και χημειοθεραπεία αντίσταση καθώς και με τη μέτρηση

in vivo

ανάπτυξης σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Εκτιμήσαμε επίσης τη συχνότητα του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων, tumorsphere σχηματισμό, και

in vivo

ανάπτυξη του ανθρώπινου τραχήλου της μήτρας ξενομοσχευμάτων καρκίνου μετά UbB αποσιώπηση. Βρήκαμε ότι HeLa /TSA ήταν ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία, εντόνως εκφρασμένο γονίδιο UbB και τους δείκτες αρχέγονων κυττάρων Sox2, Oct4 και Nanog. Τα κύτταρα αυτά εμφανίζονται επίσης προκαλείται από ικανότητες διαφοροποίηση, συμπεριλαμβανομένων βελτιωμένες δυνατότητες μετανάστευσης /εισβολής /κακοήθεια

in vitro

και

in vivo

. Επιπλέον, μια αυξημένη έκφραση του UbB δείχθηκε στα δείγματα όγκων των ασθενών χημειοθεραπεία. Αποσιώπηση του UbB ανέστειλε tumorsphere σχηματισμός, μείωσε την έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων και μειωμένη ανάπτυξη του τραχήλου της μήτρας ξενομοσχεύματος. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι UbB ήταν σημαντικά αυξημένη σε παρατεταμένη Τριχοστατίνη Α-επιλεγμένα κύτταρα HeLa και διαδραμάτισε σημαντικό ρόλο στη διατήρηση του καρκίνου του τραχήλου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν.

Παράθεση: Tian Υ, Ding W, Wang Υ, Ji Τ, η Sun S, Μο Q, et al. (2013) Ουμπικουϊτίνη Β σε καρκίνο του τραχήλου: Κρίσιμη για την συντήρηση του καρκίνου Stem-όπως χαρακτήρες Cell. PLoS ONE 8 (12): e84457. doi: 10.1371 /journal.pone.0084457

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 Αυγούστου, 2013? Αποδεκτές: 22 Νοεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Tian et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας (Νο 81.372.806? 81.101.962? 81.101.965? 81202060). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι ο δεύτερος συχνότερος καρκίνος μεταξύ των γυναικών κάτω των 65 ετών και την πιο συχνή αιτία θανάτου από γυναικολογικών καρκίνων σε όλο τον κόσμο. τον κίνδυνο μιας γυναίκας να αναπτύξει καρκίνο του τραχήλου της μήτρας κατά 65 χρόνια ηλικιακές ομάδες από 0,69% στις ανεπτυγμένες χώρες να 1,38% στις αναπτυσσόμενες χώρες. Το 2010, περίπου 75, 000 νέες περιπτώσεις καρκίνου του τραχήλου της μήτρας διαγνώστηκαν στην Κίνα [1,2]. Επί του παρόντος, περίπου το 35% των γυναικών που διαγιγνώσκονται με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας έχουν υποτροπιάζουσα νόσο, με το 90% αυτών που βρέθηκαν εντός 3 ετών μετά την αρχική θεραπεία [3]. Λόγω της αντίστασης και επίσης πολυ-φαρμάκου αντοχή σε ακτινοθεραπεία, συμβατικές μεθόδους δεν θα είναι αποτελεσματική για επαναλαμβανόμενες περιπτώσεις. Βελτιωμένη στοχευμένες θεραπείες και χημειο /ράδιο-ευαισθητοποίηση στρατηγικές είναι απαραίτητη για τη μείωση της θνησιμότητας αυτής της καταστροφικής κακοήθειας.

Η ταυτοποίηση καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν σε στερεούς όγκους ανοίγει νέες προσεγγίσεις για τη χημειοθεραπεία? μια καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών στους οποίους βασίζεται η καρκινογένεση και η κατεργασία ανθεκτικών ιδιοτήτων του καρκίνου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν είναι απαραίτητη. Κατά τα τελευταία λίγα χρόνια, συσσωρεύοντας απόδειξη έχει προτείνει ότι το δυναμικό για την κίνηση ενός όγκου, συμπεριλαμβανομένων τραχηλικό καρκίνωμα, είναι ένα μάλλον μοναδικό χαρακτηριστικό του ένα μικρό υποσύνολο των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν ονομάζεται «βλαστικά κύτταρα του καρκίνου» (ΚΕΠ) ή «ογκογενή κύτταρα «. ΚΕΠ έχουν την αποκλειστική δυνατότητα να αυτο-ανανέωση, επεκτείνοντας έτσι την πισίνα των ΚΕΠ και επιτρέποντας ο όγκος να διαφοροποιηθούν σε ετερογενή καρκίνο μη ογκογόνων [4]. Η υπόθεση ΚΕΠ έχει συναρπαστικό κλινικές επιπτώσεις στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας: αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει την αποτυχία της θεραπείας και την υποτροπή της νόσου, ως αποτέλεσμα της αντίστασης του ΚΕΠ σε ερεθίσματα θάνατο. Πράγματι, διατηρώντας τις βιολογικές χαρακτηριστικά των βλαστικών κυττάρων των ιστών, όπως αδράνεια, η αυτο-ανανέωση και η αντίσταση σε πολλά φάρμακα, ΚΕΠ συνιστούν εγγενή πυρίμαχο πληθυσμό καρκινικών κυττάρων που είναι ανθεκτικά σε θεραπείες που αναπτύχθηκε για την εξάλειψη της ταχέως διαιρούμενα κύτταρα. Ως εκ τούτου, την ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισμό των ΚΕΠ είναι θεμελιώδους σημασίας για την πρόγνωση και τη θεραπεία του καρκινώματος του τραχήλου [5].

Σε μια προηγούμενη μελέτη, που πραγματοποιήθηκε SMART να προσδιοριστούν τα βασικά γονίδια που είναι υπεύθυνα για τον όγκο-εκλεκτική δράση των Τριχοστατίνη Α ( TSA), ένα από τα πιο εκτεταμένα μελετηθεί HDACis. Ταυτοποιήσαμε ουμπικιτίνη Β (UbB), η οποία μπορεί ομοιοπολικώς συνδεθεί με ορισμένες πρωτεΐνες-στόχους σήμανση τους για αποικοδόμηση από το σύστημα ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος (UPS), ως μεσολαβητής του καρκινικού κυττάρου απόπτωση που διεγείρεται από TSA. Η απώλεια της λειτουργίας του γονιδίου UbB ανατίθενται την ισχυρότερη αντίσταση στη θεραπεία TSA [6].

πρώτη διαπίστωση μας σε αυτή τη μελέτη ήταν ότι τα κύτταρα που επιβίωσαν TSA διαλογής έχουν κάποιες ιδιότητες των ΚΕΠ. Για την επιβεβαίωση των χαρακτηριστικών των εν λόγω καρκινικά βλαστικά κύτταρα όμοια, απομονώσαμε σχηματισμού σφαίρας κύτταρα (SFCs) με διαλογή του τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές σειρές. Χαρακτηρισμός αυτών των SFCs ορίστηκε από την CSC-όπως χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένης της τριτοβάθμιας ογκογενετικότητας από μητρικά κύτταρα HeLa? αυξημένη έκφραση του Sox2, Oct4 και Nanog? και αντοχής πολυ-φαρμάκου. Η έκφραση του UbB σε αυτά τα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν εξετάστηκε σε περαιτέρω έρευνα. Βρήκαμε ότι η διατήρηση των χαρακτηριστικών του στελέχους-όπως ο καρκίνος σχετίζεται με την έκφραση UbB και αποσιώπηση της έκφρασης UbB θα μπορούσε να αντιστρέψει τα χαρακτηριστικά του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Είκοσι δύο ασθενείς που διαγιγνώσκονται τραχηλικού καρκινώματος των πλακωδών κυττάρων και υποβλήθηκε άμεσα πρωτογενή χειρουργική επέμβαση ή μετά από έλαβε την τακτική Cisplatin χημειοθεραπεία με βάση επελέγησαν για να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη και όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση. Τα δείγματα μετεγχειρητική ιστού συλλέχθηκαν από το Τμήμα Κλινικής Παθολογίας, Tongji Νοσοκομείο, Tongji Medical College, Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας (HUST). Πληροφορίες για ιστοπαθολογική διάγνωση εξετάστηκε από δύο τουλάχιστον ειδικούς σε γυναικολογική παθολογία. Η μελέτη αυτή εξετάστηκε και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Tongji Νοσοκομείο, Tongji Medical College, HUST.

Ξενομοσχεύματος μελέτη όγκου

Αυτά τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 6 έως 8 εβδομάδων θηλυκά μη παχύσαρκους διαβητική /σοβαρή συνδυασμένη ανοσολογική ανεπάρκεια (NOD /SCID) αγοράστηκε από HFK (Πεκίνο) και στεγάζεται στο Κέντρο Πειραματικής ζώων, Tongji Medical College, HUST. Τα ποντίκια επιλέχθηκαν τυχαία για κάθε ομάδα? συνολικά έξι ποντίκια ανά ομάδα χρησιμοποιήθηκαν και στεγάστηκαν σε τρεις ανά κλωβό. HeLa και HeLa /TSA τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, μετρήθηκαν, και επανα-εναιωρήθηκαν σε 100 μΙ PBS του Dulbecco και στη συνέχεια εγχέονται υποδορίως. Οι ρυθμοί ανάπτυξης των ξενομοσχευμάτων μετρήθηκαν κάθε τρεις ημέρες, και ο όγκος υπολογίστηκε με τη χρησιμοποίηση του τύπου: L × W

2 χ 0,5. Ελήφθησαν Οι φωτογραφίες του ξενομοσχεύματα μετά ποντίκια δόθηκε μια θανατηφόρα υπερδοσολογία αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου. Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση των HUST, και η μελέτη διεξήχθη σε αυστηρή συμφωνία με τη φθάσει (Research ζώων: Αναφορά

In Vivo

Πειράματα) κατευθυντήριες γραμμές [7] {Kilkenny 2012 # 29}.

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση

κύτταρα HeLa ελήφθησαν από την ATCC και διατηρήθηκαν στο εργαστήριο μας. κύτταρα HeLa /TSA καθορίστηκαν με κατεργασία κύτταρα HeLa με 1 μΜ Τριχοστατίνη Α (TSA, Sigma) για 24 ώρες και στη συνέχεια τη διατήρηση των κυττάρων σε 200 ηΜ TSA για ένα άλλο 7 έως 10 ημέρες. Τα επιζώντα κύτταρα αφέθηκαν να αναρρώσουν για άλλες 4-7 ημέρες. Στη συνέχεια, συλλέχθηκαν και αφέθηκαν να πολλαπλασιαστούν.

Ο siRNAs (Invitrogen) επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μια shRNA lentivirus χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει κύτταρα ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

υν έκθεση των κυττάρων

Για ακτινοβολία UV, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

5 /ml και αναπτύχθηκαν μέχρις ότου επετεύχθη προσκόλληση και σχηματίστηκε μια ακόμη μονοστιβάδας. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με προθερμασμένο PBS και εκτέθηκε σε UV, ενώ σε PBS. Υπεριώδες φως δημιουργήθηκε από ένα 15-W λάμπα UVB (UVP), το οποίο εκπέμπει το μεγαλύτερο μέρος της ενέργειας εντός της περιοχής UVB 280 – 370 nm, με μια κορυφή εκπομπής στα 310 nm. Η ένταση της UVB τυποποιήθηκε από ένα μέτρο UVB και ορίζεται σε 200J /m

2. Μετά την ακτινοβόληση, προστέθηκε φρέσκο ​​μέσο.

Transwell

δοκιμασία μετανάστευσης

HeLa και HeLa /TSA κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα θάλαμο transwell επί 48 ώρες. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν μέσω της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες και στη συνέχεια εξετάστηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός.

Ταυτοποίηση SP κυττάρων

HeLa και κύτταρα HeLa /TSA θρυψινοποιήθηκαν και επωάστηκαν με 5 μg /mL Hoechst 33342 βαφές (Roche) στους 37 ° C για 90 λεπτά? η αντίδραση τερματίστηκε με επώαση σε παγωμένο νερό για 10 λεπτά. Τα δείγματα βαμμένα κυττάρων αναλύθηκαν από μια ροή FACSCalibur κυτταρόμετρο (BD) με χρήση υν διέγερση 355 nm-? Η εκπομπή φθορισμού συλλέγεται χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο διέλευσης ζώνης 450-nm για Hoechst μπλε και ένα ζωνοπερατό φίλτρο 670-nm για Hoechst κόκκινο. Η απόκτηση δεδομένων και ανάλυση έγιναν με λογισμικό CellQuest Pro (BD).

σχηματισμός αποικιών, mammosphere σχηματισμό και τον περιορισμό δοκιμασίες αραίωσης

HeLa και HeLa /κύτταρα TSA μετρήθηκαν και επιστρώθηκαν με την ίδια πυκνότητα σε μια πλάκα 6 φρεατίων για 7 ημέρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με απεσταγμένο νερό για 5 λεπτά δύο φορές και επωάστηκε με ένα διάλυμα χρώσης crystal violet 0,1% για 10 λεπτά. Τέλος, τα κύτταρα πλύθηκαν με απεσταγμένο νερό για 5 λεπτά δύο φορές ή έως ότου η περίσσεια χρωστικής απομακρύνθηκε πλήρως.

σχηματισμός Mammosphere και περιορίζοντας δοκιμασίες αραίωσης διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως από Calcagno AM [8]. Γενικώς, εκτελέσαμε αυτά τα πειράματα σε HeLa και κύτταρα HeLa /TSA να εκτιμήσει mammosphere σχηματισμός σε φρεάτια εξαιρετικά χαμηλές καλλιέργειας προσκόλλησης (Costar) σε DMEM ελεύθερο ορού μέσο /F12 συμπληρωμένο με ανασυνδυασμένο ανθρώπινο επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF, 10 ng /mL, Peprotech)? ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ανάπτυξη παράγοντα ινοβλαστών-βασικά (bFGF, 10 ng /mL, Peprotech)? ινσουλίνη (50 μg /mL, Sigma)? B27 (100 μονάδες /mL, Invitrogen), πενικιλλίνη (100 μονάδες /mL, Invitrogen) και στρεπτομυκίνη (100 μg /mL, Invitrogen). Mammospheres ταυτοποιήθηκαν όπως περιγράφεται [9] κάθε 3 ημέρες σύμφωνα με τα ποσοστά πολλαπλασιασμού αποικίας. Η δοκιμασία περιοριστικής αραίωσης διεξήχθη με επίστρωση διάφορους αριθμούς κυττάρων (500 κύτταρα σε ένα μόνο κύτταρο) ανά φρεάτιο σε τρεις πλάκες των 96 φρεατίων εξαιρετικά χαμηλή προσκόλληση. Σφαιροειδή μετρήθηκαν σε 14 ημέρες ή και αργότερα, ανάλογα με τα ποσοστά αύξησης των σφαιριδίων. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν, και οι μέσοι όροι υπολογίστηκαν παρουσιάζονται.

απομόνωση RNA, αντίστροφη μεταγραφή και ποσοτική RT-PCR ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Qiagen RNeasy σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RNA ποσοτικοποίηση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop μικρο-όγκου (Thermo Fisher), και η ακεραιότητα του mRNA επαληθεύτηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Η αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση μεταγραφής-πολυμεράσης (RT-PCR) στη συνέχεια πραγματοποιείται με τη χρήση 2 μg ολικού RNA. Ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα CFX96 Touch

TM Real-Time Σύστημα Ανίχνευσης PCR (Bio-Rad) χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρόγραμμα θερμοκυκλωτή για όλα τα γονίδια: 5 min προ-επώασης στους 95 ° C που ακολουθείται από 40 κύκλους των 15 s στους 95 ° C, 15 s στους 60 ° C, και 30 s στους 72 ° C. Οι εκκινητές όλων των γονιδίων-στόχων και του γονιδίου αναφοράς που παρατίθενται στον Πίνακα S1. Η συλλογή των δεδομένων, συμπεριλαμβανομένης της πτυχής μεταβολή στην έκφραση γονιδίου, προσδιορίσθηκε από την ίδια ποσότητα ολικού RNA.

κηλίδωση Western ανάλυση

Σύνολο κύτταρο πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν και αναλύθηκαν με 10% SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε PVDF διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες (350mA για 1 ώρα), και ανιχνεύθηκαν με αντισώματα εναντίον UbB, UBC, UbA52, UbA80, pSTAT3, βιμεντίνη, ρΑΚΤ και β-ακτίνη (Proteintech Group), MDR-1 και Oct4 (Santa Cruz), Sox2 και Nanog (Millipore). Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας υπεροξειδάση χράνου συζευγμένη δευτερογενή αντισώματα με SuperSignal West Pico χημειοφωταύγειας υπόστρωμα (Pierce) και φωτογραφήθηκαν σε XRS ChemiDoc ™ + Σύστημα με λογισμικό Image Lab ™ (Bio-Rad).

ανοσοφθορισμού mammospheres

Mammospheres συλλέχθηκαν μετά από περίπου 14 ημέρες, ανάλογα με το μέγεθος και την ανάπτυξη ποσοστά, και στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS δύο φορές και φυγοκεντρήθηκαν στα 300 g. Οι mammospheres επανεναιωρήθηκαν με βέλτιστη κοπή ένωση θερμοκρασία (O.C.T., Sakura) και τοποθετούνται σε υγρό άζωτο. Κατεψυγμένα σφαιροειδή στη συνέχεια σε φέτες σε 5-μm πάχους τομές. Ανοσοφθορισμός αυτών κατεψυγμένων τομών διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή πρωτογενούς αντισώματος. απεικόνισης φθορισμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ.

Η κυτταρομετρία ροής

HeLa και HeLa /TSA κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 48 ώρες με 1 μΜ TSA, 30 μΜ DDP (Sigma, P4393), ή 75 nM Paclitaxol ή είχαν ακτινοβοληθεί με UVB. Στη συνέχεια, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επωάστηκαν με Αννεξίνη V-FITC και ΡΙ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το ποσοστό απόπτωσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας BD κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur και το λογισμικό CellQuest Pro (BD).

Στατιστικές Μέθοδοι

Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με t τεστ unpaired Student χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism (Έκδοση 5.01) , εκτός από την σύγκριση της έκφρασης UbB σε κλινικά δείγματα καρκίνου του τραχήλου της μήτρας ιστού, η οποία αναλύθηκε μέσω της αμφίδρομης δοκιμή ANOVA. Σημασία για όλες τις δοκιμές ορίστηκε στο

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Η παρατεταμένη HDACi-επιλεγμένα κύτταρα HeLa /TSA ήταν ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία

Η επώαση των κυττάρων HeLa με TSA (500 ηΜ) σε διαφορετικά χρονικά σημεία (6, 12, 18 και 24 ώρες) προκάλεσε μια εξαρτώμενη από το χρόνο αύξηση των επιπέδων πρωτεΐνης UbB mRNA και ουβικιτίνη (Σχήμα 1Α), ενώ οι εκφράσεις των άλλων τριών ουβικουιτίνης κωδικοποίησης γονιδίων (UbA52, UbA80 και UBC) δεν επηρεάστηκαν. Ομοίως, η επώαση με διαφορετικές συγκεντρώσεις (200, 400, 600 και 800 nm) του TSA για 24 ώρες είχε επίσης ως αποτέλεσμα την αύξηση της έκφρασης των γονιδίων UbB, ενώ παρατηρήθηκε καμία μεταβολή των εκφράσεων των άλλων τριών γονιδίων ουβικιτίνης-κωδικοποίησης. χορήγηση TSA, μέσα σε ένα συγκεκριμένο εύρος συγκέντρωσης, για 24 ώρες οδήγησε σε ειδική συγκέντρωση-εξαρτώμενη διέγερση του UbB mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης (Εικόνα 1Β).

Α, κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 500 ηΜ TSA για τη συγκεκριμένη φορές και υποβλήθηκαν σε ανάλυση του επιπέδου mRNA την UBB, UBC, UbA52 και UbA80 με πραγματικού χρόνου PCR και το αντίστοιχο επίπεδο πρωτεΐνης με κηλίδωση western. Β, κύτταρα HeLa επωάστηκαν με TSA για 24 ώρες σε μια δόση που κυμαίνεται από 200 έως 800 nm και υποβλήθηκε σε ανάλυση του επιπέδου mRNA του UbB, UBC, UbA52 και UbA80 με πραγματικού χρόνου PCR και το αντίστοιχο επίπεδο της πρωτεΐνης με κηλίδωση Western. C, Άνω πάνελ: αντιπροσωπευτικά πιάτα της δοκιμασίας σχηματισμού κατά την ημέρα 7, 10 και 14. Κάτω πίνακας αποικία: οι αριθμοί των αποικιών που σχηματίζονται σε HeLa και HeLa /TSA την ημέρα 7, 10 και 14. Οι στήλες αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο τριών ξεχωριστών πειραμάτων ? μπάρες σφάλματος, SD? *,

σ

& lt? 0,05. κύτταρα D, HeLa /TSA υποβλήθηκαν σε αγωγή με TSA (1 μΜ), DDP (30 μΜ), και ΡΤΧ (75 ηΜ) για 48 ώρες ή UV, τα κύτταρα απόπτωσης προσδιορίστηκαν ποσοτικά με Annexin V /χρώση ΡΙ και την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα αντιπροσωπευτικά παραδείγματα της κυτταρομετρίας ροής αποτελέσματα φαίνονται. Ε, τα κύτταρα κατεργάστηκαν όπως περιγράφεται στο Δ, τα μέσα ποσοστά των κυττάρων απόπτωσης αναφέρθηκαν στα γραφήματα. Τιμές, η μέση ποσοστά? μπάρες σφάλματος, SD? *,

σ

& lt? 0.05 (n = 3 επαναλήψεις).

Η

Μέχρι την πλειονότητα των κυττάρων HeLa υπέστησαν απόπτωση μετά από αγωγή με TSA (1 μΜ για 24 ώρες και διατηρήθηκε με 200 ηΜ για 7 έως 10 ημέρες), τα κύτταρα που επιβίωσαν (HeLa /TSA) σπάρθηκαν για να σχηματίσει κλώνους. Μετά από άλλες 10 έως 14 ημέρες ανάπτυξης, χρώση κρυσταλλικού ιώδους έδειξαν ότι τα κύτταρα HeLa /TSA είχε σημαντική πολλαπλασιαστική ικανότητα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου. Ο αριθμός των αποικιών HeLa /TSA ήταν περίπου 16-φορές περισσότερο από εκείνη του ελέγχου την 14η ημέρα (

ρ

& lt? 0,01) (Σχήμα 1 C).

Για να εξετάσει περαιτέρω την ευαισθησία των κυττάρων HeLa /TSA σε TSA, που αντιμετωπίζονται HeLa /κυττάρων TSA με TSA και άλλους παράγοντες κοινή χημειοθεραπείας. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα FACS, τα κύτταρα HeLa /TSA επέδειξε αξιοσημείωτη αντοχή σε όχι μόνο TSA (μέση 9,48% έναντι 25,53%,

σ

= 0,014), αλλά και Cisplatin (DDP) (μέση τιμή 13,25% έναντι 53,76%,

σ

& lt? 0.01), Paclitaxol (ΡΤΧ) (μέσος όρος 8,69% έναντι 35,36%,

σ

& lt? 0.01), και ακόμη και το υπεριώδες φως (UV) (μέση τιμή 15,38 % έναντι 44,8%,

σ

& lt? 0,01) (Σχήμα 1 D, E). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα κύτταρα HeLa /TSA μπορεί να περιέχει ένα εμπλουτισμένο υποσύνολο κύτταρα ανθεκτικά σε κοινά χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, ακόμη και UV.

HeLa /κυττάρων TSA παρουσίασαν τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης και της αυξημένης UbB mammosphere σχηματισμός

για την περαιτέρω διερεύνηση της ανθεκτικότητας των κυττάρων HeLa /TSA στη χημειοθεραπεία και την υπεριώδη ακτινοβολία είχε σχέση με την έκφραση του UbB, η έκφραση του mRNA σε HeLa /κύτταρα TSA αξιολογήθηκε. Παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση του UbB σε κύτταρα HeLa /TSA, ενώ δεν υπάρχει εμφανής αλλαγή από τα άλλα τρία γονίδια ουβικιτίνη (Σχήμα 2Α). Ομοίως, βρήκαμε επίσης σημαντική αύξηση στο επίπεδο πρωτεΐνης του UbB, όχι τα άλλα τρία γονίδια που κωδικοποιούν ουβικιτίνης. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ρύθμιση προς τα πάνω του pSTAT3, βιμεντίνη και MDR-1, μαζί με τα κάτω ρύθμιση ρΑΚΤ σε κύτταρα HeLa /TSA σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα HeLa (Εικόνα 2Β). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι τα κύτταρα HeLa /TSA ήταν χημειο-ανθεκτικό και μπορεί να σχετίζεται με την υψηλή έκφραση του UbB. Επιπλέον, η πλειονότητα των κυττάρων HeLa /TSA ήταν σε μια αδιαφοροποίητη κατάσταση και που υφίσταται επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ). Τα ευρήματα που αναφέρονται εδώ είναι σύμφωνες με προηγούμενα αποτελέσματα μας, η οποία ανέφερε ότι UbB είναι ένα ουσιαστικό μεσολαβητή της TSA που προκαλείται από όγκο επιλεκτική θανάτωση [6].

Α, κύτταρα HeLa /TSA αναλύθηκαν για UbB, UBC, UbA52 και UbA80 mRNA επίπεδα. Οι στήλες αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο τριών ξεχωριστών πειραμάτων? μπάρες σφάλματος, SD? *,

σ

& lt? 0,05. Β, κύτταρα HeLa /TSA αναλύθηκαν για τα πρωτεϊνικά επίπεδα της Ub πρωτεϊνών, pSTAT3, βιμεντίνη, ρΑΚΤ και MDR-1, β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. C, Ποσοτική ανάλυση του δείκτη πολλαπλασιασμού καθορίζεται με την δοκιμασία CCK-8 για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται κατά μέσο όρο σε τρία ξεχωριστά πειράματα? Οι ράβδοι σφάλματος, SD. D, Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα προσδιορισμού tranwell φωτογραφήθηκαν σε 200 × μεγεθύνσεις. Ε, Themorphologic εμφάνιση ενός αντιπροσωπευτικού mammosphere για τους υποδεικνυόμενους χρόνους photograghed στα 200 × μεγεθύνσεις. F, δοκιμασίες σχηματισμού σφαιροειδείς διεξήχθησαν με οριακή αραίωση με 256 κύτταρα για να ένα κύτταρο ανά φρεάτιο ενός 96 φρεατίων Ultra-Low Προσκολλητικά πλάκα. Αυτό το πείραμα διεξήχθη για την τριπλή φορές με έξι φρεάτια ανά φρεάτιο αραίωσης. Ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκε την ημέρα 14. G, κύτταρα HeLa Mammosphere του και HeLa /TSA επανα-καλλιεργήθηκαν σε ένα συνηθισμένο προσκολλημένα πλάκα για 24 ώρες, και στη συνέχεια κατεργάζεται με TSA, DDP, και ΡΤΧ για 48 ώρες ή UV επί 5 min. Τα κύτταρα απόπτωσης ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αννεξίνη V /χρώση ΡΙ και την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Οι τιμές είναι κατά μέσο όρο και SD (ράβδοι σφάλματος) 3 ξεχωριστά πειράματα, *,

σ

& lt? 0,05. κύτταρα mammosphere Η, HeLa /TSA αναλύθηκαν για τα επίπεδα UbB, UBC, UbA52 και UbA80 mRNA. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας αναφοράς.

Η

Εξετάσαμε περαιτέρω τα βιολογικά χαρακτηριστικά των κυττάρων HeLa /TSA και παρατήρησε ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων HeLa /TSA ήταν σημαντικά υψηλότερο σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου HeLa, ιδιαίτερα σε μεγάλες -Term καλλιέργειας (Σχήμα 2C). Επιπλέον, ο ρυθμός μετανάστευσης σε κύτταρα HeLa /TSA ήταν σημαντικά αυξημένη στην Δοκιμασία Transwell Μετανάστευσης (Σχήμα 2D). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι HeLa /κύτταρα TSA παρουσίασαν υψηλό δυναμικό κακοήθειας.

Προηγουμένως δημοσιευμένες μελέτες έχουν δείξει ότι η παρατεταμένη συνεχής επιλογή των κυττάρων για αντοχή φαρμάκου εμπλουτίζει κυτταρικούς πληθυσμούς με καρκίνο χαρακτηριστικά βλαστικών κυττάρων σαν [8]. Τα δεδομένα που αναφέρονται παραπάνω κατέδειξαν ότι HeLa /κύτταρα TSA έδειξε ένα υψηλό δυναμικό κακοήθειας, η οποία μπορεί να έχουν προκύψει κάτω από την εκλεκτική πίεση της χημειοθεραπείας. Πραγματοποιήσαμε πειράματα για να ελεγχθεί αν τα κύτταρα HeLa /TSA εμπλουτίστηκαν με καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν. κύτταρα HeLa /TSA καλλιεργήθηκαν σε ένα μη-προσκολλημένα κράτος για να σχηματίσουν mammospheres. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα HeLa /TSA είχαν σημαντικά υψηλότερο δυναμικό σχηματισμό mammosphere. Οι mammospheres HeLa /TSA ήταν μεγαλύτερα και μεγάλωσε πιο γρήγορα από ό, τι τα mammospheres HeLa, τα οποία ήταν μικρές συστάδες κυττάρων που προσκολλήθηκαν στο τρυβλίο και ήταν δύσκολο να σκοράρει στην δοκιμασία περιοριστικής αραίωσης (Σχήμα 2Ε). Αν και τα κύτταρα HeLa είχε μια τάση να σχηματίζουν mammospheres, δεν ήταν σε θέση να σημειωθούν μετά τη σπορά λιγότερα από οκτώ κυττάρων, ενώ μόνο ένας HeLa /TSA κύτταρο είχε πιθανότητα 66.7% για να σχηματίσουν ένα mammosphere (Σχήμα 2F). Για να εξακριβωθεί αν τα σφαιροειδή ήταν πανομοιότυπα με προσκολλημένα καλλιεργημένα κύτταρα, είμαστε σε επεξεργασία με θρυψίνη σφαιροειδή και τους επανακαλλιεργήθηκαν σε μια προσκολλημένη κατάσταση? Αυτά τα εκ νέου προσκολλημένα κύτταρα HeLa /TSA ήταν ακόμη ανθεκτικοί στην TSA, DDP, ΡΤΧ και UV, σε αντίθεση με τα αποτελέσματα για την εκ νέου προσκολλημένα κύτταρα HeLa, τα οποία δεν ήταν ανθεκτικά (Σχήμα 2G). Επιπλέον, η έκφραση του γονιδίου UbB σε HeLa /TSA mammospheres ήταν ακόμα σημαντικά υψηλότερη από ό, τι στον έλεγχο HeLa mammosphere κύτταρα (Σχήμα 2Η).

Τα παραπάνω στοιχεία έδειξαν ότι τα κύτταρα HeLa /TSA παρουσίασαν τα πάνω ρύθμιση την UBB, pSTAT3 , βιμεντίνη, ενώ ρΑΚΤ ήταν κάτω-ρυθμίζονται. Επιπλέον, αυτά τα κύτταρα ήταν αδιαφοροποίητα και σε μια κατάσταση ηρεμίας και παρουσίασαν ένα υψηλότερο ικανότητα mammosphere σχηματισμού σε ένα μη-προσκολλημένα κατάσταση. Αυτά τα χαρακτηριστικά τονίζεται ότι τα κύτταρα HeLa /TSA μπορεί να περιέχουν καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν, και το φαινόμενο αυτό θα μπορούσε να σχετίζεται με την ρύθμιση προς τα πάνω την UBB.

κύτταρα HeLa /TSA έχουν καρκίνο ιδιότητες των βλαστικών όπως

για να εξετασθεί περαιτέρω κατά πόσον τα κύτταρα HeLa /TSA εμπλουτίστηκαν με καρκινικά βλαστικά κύτταρα όμοια, εκτελέσαμε PCR πραγματικού χρόνου για να ανιχνεύσει την έκφραση γονιδίων βλαστοκυττάρων βιοδεικτών. Βρήκαμε ότι Sox2, Oct4 και Nanog ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε HeLa κύτταρα /TSA σε σύγκριση με HeLa mammospheres (Σχήμα 3Α). Κηλίδωση Western επιβεβαίωσε ότι HeLa /TSA mammospheres υψηλής έκφρασης των βλαστικών κυττάρων βιοδείκτες. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης MDR-1 και η UBB είχαν υψηλή εκφράζονται σε HeLa /κύτταρα TSA (Σχήμα 3Β). Ομοίως, τα αποτελέσματα της ανάλυσης ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι σχεδόν όλα τα κύτταρα HeLa /TSA κατείχε τα κύρια χαρακτηριστικά των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν, δηλαδή, η έκφραση αυτών των βλαστικών κυττάρων βιοδείκτες (Σχήμα 3C).

Α, HeLa /TSA mammosphere κύτταρα αναλύθηκαν για τα επίπεδα Sox2, Oct4 και Nanog mRNA. Οι στήλες αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο τριών ξεχωριστών πειραμάτων? Οι ράβδοι σφάλματος, SD. Β, Η ποσοτική ανάλυση των επιπέδων Sox2, Oct4, Nanog, MDR-1 και πρωτεΐνη UbB με western αποτύπωση. κύτταρα mammosphere C, HeLa /TSA αναλύθηκαν με ανοσοφθορισμό για Sox2, Oct4 και Nanog. Οι αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες πάρθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (αρχική μεγέθυνση, χ 200). Οι πυρήνες παρουσιάστηκαν ως ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας

DAPI

(4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη) χρώση. Δ, Η ανάλυση του κλάσματος πλευράς πληθυσμού κυττάρων σε HeLa και καλλιέργειες κυττάρων HeLa /TSA. Αριστερό πλαίσιο: HeLa? δεξιό πίνακα: HeLa /TSA. Ε, Η ανάλυση των CD44 και CD24 έκφραση των HeLa και κύτταρα HeLa /TSA. Αριστερό πλαίσιο: HeLa? δεξιό πίνακα:. HeLa /TSA

Η

Έχει αναφερθεί ότι το ABC μεταφορέα μεσολάβηση εκροής που απασχολούνται από την χρωστική Hoechst 33342 για να απομονώσει την πλευρά πληθυσμών χρωστικής-με εξαίρεση (ΚΕΕ) είναι εμπλουτισμένο σε κύτταρα με στέλεχος του καρκίνου -όπως ιδιότητες σε μία ποικιλία όγκων [10]. Χρησιμοποιώντας διαφορική χρώση Hoechst 33342 για να διαπιστώσετε ΚΕΕ το προσκολλημένα κύτταρα, παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση της SP-θετικών κυττάρων σε κύτταρα HeLa /TSA σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα HeLa (μέσος όρος 8,3% έναντι 0,8%,

σ

& lt? 0.01, t test ζεύγη Student) (Σχήμα 3D). Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι τα ΚΕΠ του μαστού από κύτταρα mammosphere παρουσίασαν οι δείκτες επιφάνειας του CD44

+ CD24

– [9,11]. Όπως HeLa /TSA επέδειξε ένα υψηλό ποσοστό σχηματισμό σφαιροειδών, εξετάσαμε CD44 και CD24 έκφραση σε κύτταρα HeLa /TSA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το 52,4% των HeLa /TSA ήταν CD44

+ CD24

-., Η οποία ήταν παρόμοια με την προηγούμενη αναφερθεί σε CSCs μαστού (Σχήμα 3Ε)

Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η παρατεταμένη επιλογή φαρμάκου των HeLa /κυττάρων TSA προκάλεσε μια υψηλή έκφραση των βιοδεικτών βλαστικών κυττάρων και εμπλουτισμό των CD44

+ CD24

– κύτταρα. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα HeLa /TSA μπορεί να εμπλουτιστεί από τα κύτταρα τα οποία έχουν καρκίνο ιδιότητες βλαστικών παρόμοια.

UbB siRNA μπορούσε μειορυθμίζουν σχηματισμός SP και σφαιροειδή

Αντοχή των καρκινικών βλαστικών κυττάρων σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα έχει περιγραφεί προηγουμένως σε μια ποικιλία τύπων όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών [10]. Για να επιβεβαιωθεί ότι ο κακοήθης φαινότυπος και αναλογία κυττάρων υψηλής SP κυττάρων HeLa /TSA είχαν σχέση με την υψηλή έκφραση του γονιδίου UbB, χρησιμοποιήσαμε siRNA να knockdown UbB στα κύτταρα. Μετά την επιμόλυνση των κυττάρων HeLa με 3 διαφορετικά siRNAs που στοχεύουν τις CDS του γονιδίου UbB, έχουμε επιλέξει να χρησιμοποιείτε UbBsi2 επειδή έδειξε μια 77% knockdown του γονιδίου UbB σύμφωνα με πραγματικού χρόνου PCR και κηλίδωση Western αποτελέσματα (Εικόνα 4Α, Β) . Για να επιμολύνουν αποτελεσματικά τα siRNA σε σφαιροειδή, εισαγάγαμε UbBsi2 σε ένα lentivirus φορέα (LV-UbBsi). Μετά knockdown του γονιδίου UbB τόσο HeLa και HeLa /TSA σφαιροειδή χρησιμοποιώντας LV-UbBsi (Σχήμα 4C), σε πραγματικό χρόνο τα αποτελέσματα της PCR έδειξε ότι αν και το γονίδιο UbB έκφραση HeLa /σφαιροειδή TSA-LV-UbBsi ήταν ακόμη σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των σφαιροειδή HeLa-LV-UbBsi (

σ

& lt? 0,01) (Σχήμα 4D), η διαφορά μεταξύ αυτών των ομάδων ήταν μόνο 1,74 φορές, το οποίο ήταν πολύ χαμηλότερο από το 9,25 φορές η διαφορά μεταξύ της μη σιγήσει HeLa /TSA και τον έλεγχο HeLa σφαιροειδή (Σχήμα 2Η). Εν τω μεταξύ, η έκφραση του Sox2, Oct4 και Nanog σε HeLa /κύτταρα TSA μειώθηκε σημαντικά μετά τη μόλυνση LV-UbBsi (Σχήμα 4Ε, F), και το SP

+ αναλογία HeLa κύτταρα /TSA-LV-UbBsi ήταν σημαντικά μειωμένη από 2,58% σε 1,25% (

σ

& lt? 0,01) (Εικόνα 4G). Μετά την εκ νέου καλλιέργεια των UbB-σιωπηλή σφαιροειδή σε εναιώρημα, παρατηρήσαμε ότι ο αριθμός των σφαιριδίων που σχηματίζονται σε κύτταρα HeLa /TSA-LV-UbBsi μειώθηκε από μια μέση τιμή 49 έως 32 (που

σ

= 0.04) ( Εικόνα 4Η). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι φίμωση UbB μειώνεται εμφανώς όγκου ιδιότητες βλαστικών σαν κυττάρων HeLa /TSA υποδηλώνοντας ότι ο καρκίνος του μίσχου-όπως ιδιότητες των κυττάρων HeLa /TSA μπορεί να σχετίζεται με την υψηλή έκφραση του UbB.

Α, HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με 10 ηΜ UbB στόχευση siRNA, ή stealth ελέγχου RNAi, για 72 ώρες. Real-time PCR ανάλυση της σχετικής έκφρασης UbB mRNA είχε προχωρήσει. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος αναφοράς. Β, Η ποσοτική ανάλυση του επιπέδου της πρωτεΐνης UbB με western αποτύπωση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Α Βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος αναφοράς. C, HeLa και HeLa /TSA κύτταρα mammosphere μολύνθηκαν με LV-UbBsi, η οποία κλωνοποιήθηκε με UbBsi2, για 72 ώρες και υποβλήθηκε σε ανάλυση με κηλίδωση Western για επίπεδο πρωτεΐνης UbB. D, LV-UbBsi κύτταρα μολυσμένα mammosphere αναλύθηκαν για τα επίπεδα UbB, UBC, UbA52 και UbA80 mRNA. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος αναφοράς. Οι στήλες αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο τριών ξεχωριστών πειραμάτων? Οι ράβδοι σφάλματος, SD. Ε, LV-UbBsi-μολυσμένα κύτταρα HeLa mammosphere /TSA αναλύθηκαν για τα επίπεδα Sox2, Oct4 και Nanog mRNA. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος αναφοράς. Οι στήλες αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο τριών ξεχωριστών πειραμάτων? Οι ράβδοι σφάλματος, SD. ΣΤ LV-UbBsi-μολυσμένα κύτταρα HeLa mammosphere /TSA αναλύθηκαν για τα επίπεδα της πρωτεΐνης Sox2, Oct4 και Nanog. Βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος αναφοράς. G, Η ανάλυση του κλάσματος πλευρικών πληθυσμό κυττάρων σε LV-UbBsi μολυσμένα κυτταρικές καλλιέργειες HeLa /TSA HeLa και. Η, Οι δοκιμασίες σχηματισμού σφαιροειδών πραγματοποιήθηκαν σε LV-UbBsi-μολυσμένα κύτταρα.

Η

Λιγότερες κύτταρα HeLa /TSA θα μπορούσε να αποτελέσει ξενομοσχευμάτων

in vivo

Η

Για να επικυρώσετε περαιτέρω το δυναμικό στέλεχος-όπως κυττάρων HeLa /TSA, πραγματοποιήσαμε

in vivo πειράματα

με υποδόρια ένεση 100-5000 κυττάρων σε NOD ποντίκια /SCID. Εμείς δεν θα μπορούσε να ανιχνεύσει οποιαδήποτε διαφορά στην ογκογονικότητας μεταξύ των κυττάρων HeLa /TSA και HeLa κατά την ένεση περισσότερο από 1000 κύτταρα (Σχήμα 5Α, Β). Ωστόσο, όταν εμφυτεύτηκαν κάτω από 500 κύτταρα, κύτταρα HeLa /TSA παρουσίασαν δυνητικά περισσότερο ογκογονικά κατάσταση (Σχήμα 5C, D). Εκτός από τις διαφορές στο μέσο ανάπτυξης του όγκου, κύτταρα HeLa /TSA κινηθεί όγκους πιο συχνά (6/6 ενέσεις) από κύτταρα HeLa γονέα (3/6 ενέσεις) (

σ

= 0.04) σε απόκριση σε μια ένεση 500 κύτταρα (Πίνακας 1). Επιπλέον, τα κύτταρα HeLa /TSA ξεκίνησε όγκων σε 6/6 ενέσεις, ενώ τα κύτταρα HeLa δεν κίνησε όγκους (0/6 ενέσεις), όταν εμφυτεύτηκαν 100 κύτταρα. Η μεγαλύτερη ικανότητα για την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

ήταν σύμφωνη με κακοήθη ανάπτυξη σε καλλιέργεια προσκολλημένη κυττάρων. Μετά knockdown του UbB με LV-UbBsi, αν και HeLa /TSA-LV-UbBsi θα μπορούσαν να αποτελέσουν ξενομοσχεύματα με την ίδια συχνότητα σε σύγκριση με HeLa /TSA-LV-con όταν ενίεται με 500 μολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 5Ε), το μέγεθος και το βάρος των ξενομοσχεύματα ήταν σημαντικά μειωμένες (Σχήμα 5F, G, H). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι HeLa /κύτταρα TSA παρουσίασαν υψηλό ογκογόνο δυναμικό που θα μπορούσε να μειωθεί κατά φίμωση UbB.

HeLa και HeLa /TSA κύτταρα ενέθηκαν υποδορίως σε ποντίκια NOD /SCID με τέσσερις διαφορετικές πυκνότητες κυττάρων. Α-Ε, ο όγκος όγκου, έχει σχεδιασθεί ως μια συνάρτηση του χρόνου. Α, 5000 κύτταρα? Β, 1000 κύτταρα? C, 500 κύτταρα? Α, 100 κύτταρα? Ε, 500 LV-con ή LV-UbBsi-μολυσμένα κύτταρα HeLa /TSA. F, Οι φωτογραφίες της υποδορίως σχηματίζεται LV-con ή LV-UbBsi μολυσμένα HeLa /Τα TSA όγκοι εμφανίζονται. G, Το μέγεθος του όγκου μειώθηκε σε σχέση με την αναστολή UbB μετά την μόλυνση LV-UbBsi σε HeLa /TSA ξενομοσχεύματα. Οι οριζόντιες γραμμές αντιπροσωπεύουν το μέσο μέγεθος? μπαρ σφάλματος, SD?

σ

= 0,001, αμφίδρομη δοκιμασία ANOVA? 6 ποντικούς /ομάδα. Η, Τα βάρη των όγκων ξενομοσχευμάτων που περιγράφονται στο G. Οι οριζόντιες γραμμές αντιπροσωπεύουν το μέσο βάρος? μπαρ σφάλματος, SD?

σ

& lt? 0.001, αμφίδρομη δοκιμασία ANOVA? 6 ποντίκια /ομάδα.

Η γραμμή κυττάρων

No. των κυττάρων ένεση

No. όγκων /Όχι. των ποντικών

όγκου Μέγιστη όγκου (mm

3)

Μέγιστο βάρος όγκου (ζ)

Ημέρα του όγκου harvest

HeLa50006/66750.485110005/66280.41545004/66680.46571000/6☆0☆HeLa/TSA50006/68520.595110006/65730.39545006/68100.53571006/65700.3960Table