Αφηρημένο

Ο προσδιορισμός της βλαστικής σειράς παραλλαγών που προδιαθέτουν για την κληρονομική μη-πολυποειδούς ορθοκολικού καρκίνου (HNPCC) είναι ζωτικής σημασίας για την κλινική διαχείριση των μεταφορέων, αλλά πολλές εξεταζομένων παραμείνει αρνητική για τέτοιες παραλλαγές ή παραλλαγές αρκούδα αμφίβολης σημασίας (VU για). Εδώ περιγράφουμε τα αποτελέσματα της ενσωμάτωσης μοριακών αναλύσεων σε 132 ασθενείς με HNPCC παρέχουν αποδείξεις για τη βελτίωση γενετικό έλεγχο των HNPCC με παραδοσιακά ή την επόμενη μεθόδους παραγωγής. Οι ασθενείς εξετάστηκαν για: βλαστική αλληλόμορφο-ειδική έκφραση (ΧΑ), παραλλαγές νουκλεοτιδίων, ανακατατάξεις και μεθυλίωση υποκινητή των γονιδίων αναντιστοιχία επισκευή (MMR)? βλαστική

EpCam

ανακατατάξεις? αστάθεια μικροδορυφόρου όγκου (MSI) και ανοσοϊστοχημική έκφραση της πρωτεΐνης (IHC) MMR. Εξεταζομένων αρνητική για τα παθογόνα παραλλαγές του MMR γονίδια ελέγχονται για βλαστική

APC

και

MUTYH

παραλλαγές σειράς. Τα περισσότερα ελαττώματα βλαστική εντοπίστηκαν ήταν παραλλαγές αλληλουχίας και αναδιατάξεις των γονιδίων MMR. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μεταβάλλεται βλαστική Χ.Α. γονιδίων MMR ανιχνεύθηκε σε 8/22 (36,5%) εξεταζομένων ανέλυσε, μεταξύ των οποίων 3 περιπτώσεις αρνητικό σε άλλες προβολές. Επιπλέον, ΧΑ προσκόμισε αποδεικτικά στοιχεία για το παθογόνο ρόλο και να κατευθύνεται το χαρακτηρισμό ενός VU για συμμερίζονται 2 επιπλέον εξεταζομένων. Δεν βλαστική μεθυλίωση υποστηρικτής MMR γονίδιο παρατηρήθηκε και μόνο ένα

εντοπίστηκε EpCAM

αναδιάταξη. Σε αρκετές περιπτώσεις, ο όγκος IHC και MSI διέφερε από βλαστική αποτελέσματα διαλογής. Αξίζει να σημειωθεί ότι,

APC

ή διαλληλικών

MUTYH

βλαστική ελαττώματα εντοπίστηκαν στο 2/19 εξεταζομένων αρνητική για τα παθογόνα παραλλαγές των γονιδίων MMR. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ASE συμπληρώνει αναλύσεις gDNA που βασίζεται στον εντοπισμό των ελαττωμάτων MMR και στον χαρακτηρισμό των μονάδων οχήματος που επηρεάζουν γονιδιακή έκφραση, αυξάνοντας τον αριθμό των αλλαγών βλαστικής σειράς ανιχνευθεί. Ένα αξιόλογο ποσοστό των εξεταζομένων αρνητικό για γονίδιο MMR παραλλαγές λιμάνια

APC

ή

MUTYH

παραλλαγές. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η βλαστική ανάλυση και ΧΑ εξέταση για

APC

και

MUTYH

ελαττώματα πρέπει να συμπεριληφθούν στο HNPCC διαγνωστικών αλγορίθμων

Παράθεση:. De Lellis L, Aceto GM, Curia MC, Catalano Τ, Mammarella S, Veschi S, et al. (2013) Ολοκληρωμένη ανάλυση των Κληρονομική μη-πολυποειδούς Καρκίνος του παχέος εντέρου: η συμβολή των συγκεκριμένων αλληλόμορφων Έκφραση και άλλες δοκιμασίες για διαγνωστικούς αλγορίθμους. PLoS ONE 8 (11): e81194. doi: 10.1371 /journal.pone.0081194

Συντάκτης: Amanda Ewart Toland, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 Ιουνίου 2013? Αποδεκτές: 9 Οκτωβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 του Νοέμβρη του 2013

Copyright: © 2013 De Lellis et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από τα ταμεία της από το Υπουργείο Παιδείας, Πανεπιστημίων και Έρευνας ιταλικά. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κληρονομική μη-πολυποειδούς ορθοκολικό καρκίνο (HNPCC), επίσης γνωστό ως σύνδρομο Lynch, είναι η πιο συχνή μορφή αυτοσωματικό κυρίαρχο προδιάθεσης για καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) [1]. Η γενετική διάγνωση της βλαστικής σειράς μεταφορέων ελάττωμα στις πληγείσες οικογένειες είναι θεμελιώδης για την αποτελεσματική κλινική επιτήρηση και επιτρέπει στοχευμένη χημειοπροφύλαξη που δείχθηκε πρόσφατα να μειωθεί ουσιαστικά συχνότητα εμφάνισης καρκίνου σε αυτούς τους ασθενείς [2]. Ωστόσο, η ταυτοποίηση των παθογόνων ελαττώματα βλαστικής σειράς σε αυτό το σύνδρομο δεν είναι ασήμαντο, όπως φαίνεται από τη μεγάλη διακύμανση του ποσοστού των γενετικών αλλοιώσεων που προσδιορίζονται σε διάφορες μελέτες και από το σχετικό αριθμό των παραλλαγών με αμφίβολης σημασίας (VU για) ανιχνεύεται [3-6] . Το κυμαινόμενο επιτόκιο των μεταβολών ανιχνεύονται αντανακλά εν μέρει τις διαφορές στην ευαισθησία των μοριακών μεθόδων που χρησιμοποιούνται και εν μέρει στο γεγονός ότι η κλινική διάγνωση δεν εντελώς αντιπροσωπεύουν την υποκείμενη γενετική ετερογένεια, ακόμα και όταν η επιλογή των εξεταζομένων γίνεται με αυστηρά κριτήρια Άμστερνταμ Ι (AC -Ι) ή Amsterdam κριτήρια II (AC-II) [7]. Η πλειονότητα των ασθενών HNPCC συνδέονται με βλαστικής γραμμής επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων (MMR) ελαττώματα και να αναπτύξουν όγκους με υψηλά επίπεδα αστάθεια μικροδορυφόρου (MSI-H), το σήμα κατατεθέν της ανεπάρκειας MMR. Βλαστικής σειράς

MLH1

ή

Οι MSH2

παραλλαγές εντοπίζονται στους περισσότερους από αυτούς τους ασθενείς, ενώ οι παραλλαγές σε άλλες MMR γονίδια ανιχνεύθηκαν σε ένα μικρότερο κλάσμα περιπτώσεις [1-6]. Αξίζει να σημειωθεί, επίσης βλαστικής σειράς διαγραφές που επηρεάζουν το 3 ‘άκρο του μορίου γονιδίου επιθηλιακών κυτταρικής προσκόλλησης (

EpCAM

) μπορεί να προκαλέσει HNPCC μέσω υπερμεθυλίωση και σίγηση του κατάντη

MSH2

προαγωγό σε ιστούς EpCAM εκφράζουν [ ,,,0],8].

EpCAM

διαγραφές αναφέρθηκαν σε σχετικά υψηλή συχνότητα (16-21%) σε διάφορες μελέτες που διεξήχθησαν σε περιπτώσεις αρνητικό για βλαστική MMR ελαττώματα [9,10]. Η υψηλότερη συχνότητα (έως 33%) του

EpCAM

αναδιατάξεις παρατηρήθηκε στην υποομάδα ασθενών MSI-H αρνητικό για βλαστικής σειράς MMR μετατροπές και δεν έχουν έκφραση όγκου MSH2 [11,12], αλλά η συνολική συχνότητα αυτών των ανακατατάξεις στη σειρά των εξεταζομένων HNPCC, μη επιλεγμένα για κατάστασης μεταλλάξεων ή MSH2 ανοσοχρώση όγκου, δεν έχει αξιολογηθεί.

Εκτός από τα γονίδια MMR και

EpCAM

, άλλα γονίδια που παίζουν ρόλο σε αυτό το γενετικά ετερογενή σύνδρομο. Ένα σχετικά υψηλό ποσοστό των οικογενειών που πληρούν AC έχει «οικογενειακό παχέος τύπο καρκίνου του Χ» (FCCTX), ένα ορθοκολικό καρκίνο συνάθροιση χωρίς ένδειξη της βλαστικής σειράς ή σχετίζονται με τον όγκο ελαττώματα MMR [4]. Για την πλειονότητα των οικογενειών αυτών, η γενετική τροποποίηση υπεύθυνη για προδιάθεση καρκίνου του παχέος εντέρου δεν είναι γνωστή, αν και ελαττώματα στο μη-MMR γονίδια, όπως

MUTYH

,

OGG1

ή

BMPR1A

, περιστασιακά ανιχνεύθηκε [13-15]. Από αυτή την άποψη, επίσης,

APC

παραλλαγές που σχετίζονται με πολύ εξασθενημένο φαινότυπο μπορεί να επικαλύπτονται με HNPCC [16], η περαιτέρω διεύρυνση του φάσματος των CRC γονίδια προδιάθεσης να προβληθεί.

Με βάση τις ανωτέρω εκτιμήσεις, παραδοσιακό γενετικό έλεγχο σε HNPCC επικεντρώθηκε στην ανάλυση των γονιδίων MMR και αρκετές διαγνωστικές αλγόριθμοι προτάθηκαν για τη βελτιστοποίηση αυτού του ελέγχου [17-21]. Ωστόσο, αυτοί οι αλγόριθμοι μπορεί να περιορίσει την ευαισθησία των γενετικών αναλύσεων, υποτιμώντας φορείς παθογόνων παραλλαγών στο MMR γονίδια. Πρόσφατα, μία δοκιμασία υψηλής επεξεργαστικό gDNA (ColoSeq, University of Washington, Seattle, WA) με βάση την στοχευμένη σύλληψη και αλληλούχιση επόμενης γενιάς (NGS) έχει σχεδιαστεί για να αναλύσει ταυτόχρονα MMR που σχετίζονται και -unrelated γονίδια σε HNPCC [22]. NGS-based δοκιμή μπορεί να ξεπεράσει ορισμένα από τα όρια των μεθόδων χαμηλής απόδοσης, αλλά ακόμη και αυτή η προσέγγιση έχει ορισμένα μειονεκτήματα. Για παράδειγμα, NGS δεν προσφέρουν πληροφορίες για την παθογόνο ρόλο των μονάδων οχήματος που είναι πιο πιθανό να ανιχνευθούν με αυτές τις άκρως επεξεργαστικό μεθόδους. Επιπλέον, οι γονιδιωματικής που βασίζονται σε προσεγγίσεις που δεν είναι σχεδιασμένα για να καθορίσει το παθογόνο δυναμικό του

cis

– παραλλαγές και trans δράσης που επηρεάζουν τη γονιδιακή έκφραση. Οι περιορισμοί αυτοί μπορεί να είναι εν μέρει ξεπεραστεί με προσδιορισμούς cDNA με βάση, όπως είναι η ανάλυση του αλληλόμορφου-ειδική έκφραση (ASE) που έχει τη δυνατότητα να αποκαλύψει ελαττώματα βλαστικής σειράς που προδιαθέτουν για καρκίνο του παχέος εντέρου, ακόμη και όταν ένας παθογόνος παραλλαγή δεν έχει εξακριβωθεί ή τον ρόλο της οι παραλλαγές που ανιχνεύεται είναι ασαφές [23-27].

στην παρούσα μελέτη, απεικονίζουν τα αποτελέσματα της ενσωμάτωσης των αναλύσεων που πραγματοποιούνται σε μια σειρά 132 ασθενών ιταλική HNPCC χρησιμοποιώντας προηγουμένως αναπτυχθεί και νέες δοκιμασίες για τον έλεγχο της βλαστικής σειράς και ελαττώματα του όγκου. Θα δείξουμε ότι η ανάλυση βλαστική ΧΑ συμπληρώνει δοκιμασίες gDNA που βασίζεται στην ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισμό των ελαττωμάτων που προδιαθέτουν για CRC. ολοκληρωμένη προσέγγιση μας δείχνει επίσης ότι η ένταξη της

MUTYH

και

APC

στον έλεγχο αυξάνει τον αριθμό των παθογόνων παραλλαγών ανιχνευθεί. Λαμβάνοντας υπόψη τον αριθμό των ασθενών που αναλύθηκαν, το πάνελ των γονιδίων σε διαλογή και το εύρος των μεθόδων που χρησιμοποιούνται, αυτή η μελέτη παρέχει ενδείξεις για την κλινική μετάφραση του HNPCC γενετικών αναλύσεων που μπορούν να εφαρμοστούν σε παραδοσιακά ή NGS προσεγγίσεις. Πιο συγκεκριμένα, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την ένταξη της ανάλυσης του Χ.Α. και τον έλεγχο των γονιδίων πολυποδίαση σε αλγόριθμους για τη γενετική διάγνωση HNPCC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και ολοκληρωμένη στρατηγική ελέγχου

μελετήσαμε 132 ασθενείς άσχετες AC-Ι ή AC-ΙΙ προηγουμένως προσληφθεί σε διάφορα ιταλικά ιδρύματα. DNA και RNA εκχυλίσθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν γραπτή συγκατάθεση μετά από λεκτική παροχή συμβουλών και η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Chieti. Όγκου MSI και IHC αναλύσεις έγιναν σε εξεταζομένων με τα διαθέσιμα δείγματα όγκων. Όλοι οι ασθενείς, ανεξάρτητα από τα αποτελέσματα του όγκου MSI και IHC αναλύσεις, υποβλήθηκε σε διαλογή για υποκαταστάσεις νουκλεοτιδίων βλαστικής γραμμής σε MMR γονίδια, όπως περιγράφεται παρακάτω. Probands αρνητικά για παθογόνους νουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις εξετάστηκαν περαιτέρω για παρατείνεται αναδιατάξεων βλαστικής σειράς σε

MSH2

,

MLH1

και

EpCAM

, που ακολουθείται από διαλογή για βλαστικής γραμμής

MSH2

και

MLH1

μεθυλίωση του υποκινητή. ASE αναλύσεις MMR γονίδια διεξήχθησαν σε ασθενείς με διαθέσιμα RNA και ετερόζυγα για τουλάχιστον ένα δείκτη αλληλικές, ανεξάρτητα από τα αποτελέσματα των παραπάνω προβολών. Ασθενείς αρνητικά στις παραπάνω αναλύσεις δοκιμάστηκαν για

APC

και

MUTYH

παραλλαγές αλληλουχίας όπως περιγράφεται παρακάτω. Τα στοιχεία διακύμανσης που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη υποβλήθηκαν στη Διεθνή Εταιρεία του γαστρεντερικού Κληρονομική Όγκοι (Insight, https://www.insight-group.org/variants/database/) της βάσης δεδομένων.

Έλεγχος για νουκλεοτιδίων βλαστική υποκαταστάσεις στα γονίδια MMR

οι ασθενείς υποβλήθηκαν αρχικά σε διαλογή για την ακολουθία παραλλαγές στο

MSH2

και

MLH1

χρήση ανάλυσης διαμόρφωσης του ενός κλώνου πολυμορφισμού (SSCP) ή μετουσίωσης ηλεκτροφόρηση γέλης κλίσης (DGGE) . Όλες οι περιπτώσεις αρνητική σε SSCP ή DGGE υποβλήθηκαν σε περαιτέρω διαλογή για παραλλαγές στο

MSH2

,

MLH1

και

MSH6

από μετουσίωση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (DHPLC) και αυτοματοποιημένη αλληλούχιση, η οποία ανιχνεύεται μερικές πρόσθετες μεταλλάξεις διέφυγε στην αρχική διαλογή (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για την πρόβλεψη πιθανών επιβλαβείς επιπτώσεις των νέων μονάδων οχήματος που χρησιμοποιείται ο ακόλουθος

in silico

εργαλεία: PolyPhen-2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), SIFT (http: //κοσκινίσει. jcvi.org/), HSF (https://www.umd.be/HSF/), δροσόφιλα (https://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html), Mutation Δοκιμαστής (http: //www. mutationtaster.org/), Alamut (https://www.interactive-biosoftware.com). Χρησιμοποιήσαμε επίσης ΠΠΣΑ-MMR (https://mappmmr.blueankh.com/) και PON-MMR (https://bioinf.uta.fi/PON-MMR/) αλγόριθμοι πρόβλεψης που επικυρώθηκαν ειδικά για παραλλαγές εσφαλμένου νοήματος στην MMR γονίδια .

Ανάλυση επεκταθεί ανακατατάξεις βλαστικής σειράς στο

MSH2, MLH1

και

EpCam

Η

Γονιδιωματική

MSH2

και

MLH1

ανακατατάξεις σαρώθηκαν με πολλαπλή ενίσχυση καθετήρα απολίνωση-εξαρτώμενη (MLPA) σε 78 ασθενείς με αρνητικά κατά την αρχική ανάλυση για παθογόνους παραλλαγές σειράς ή με τις VU. Επιβεβαίωση της αναδιατάξεων ελήφθη με μη φθορίζουσα πολλαπλή PCR συζευγμένο με HPLC (ΕΔΦΔ-HPLC) ή με lab-on-a-chip τεχνολογίας για την ανάλυση του αριθμού αντιγράφων παραλλαγών (LOC-CNV), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28,29] . Δεδομένου ότι η αρχική έκδοση του

MSH2 /MLH1

κιτ MLPA (SALSA P003, MRC-Ολλανδία, Άμστερνταμ, Ολλανδία) που χρησιμοποιείται δεν περιλαμβάνουν ανιχνευτές που αντιστοιχούν στο

EpCAM

, έχουμε αναπτύξει 3 μυθιστόρημα ΕΔΦΔ -ΗΡΙΧ δοκιμασίες για τον έλεγχο και την επιβεβαίωση της γονιδιωματικής αναδιατάξεων που επηρεάζουν το 3 ‘άκρο του

EpCAM

και η διαγονιδιακή

MSH2

–

EpCAM

περιοχή (Πίνακας S1). Αυτές οι δοκιμασίες διεξήχθησαν σε ένα υποσύνολο των 33 περιπτώσεων με τις VU ή αρνητικό σε προηγούμενες προβολές και για τους οποίους το DNA δεν είχαν χρησιμοποιηθεί σε προηγούμενες αναλύσεις. Σημείο διακοπής ανάλυση έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28,29].

βλαστικής σειράς

MSH2

και

MLH1

μεθυλίωση υποστηρικτής

μετατροπή όξινο θειώδες DNA πραγματοποιήθηκε στο 44 περιπτώσεις αρνητικός κατά την αρχική διαλογή για παθογόνους παραλλαγές αλληλουχίας και γονιδιωματική αναδιατάξεις χρησιμοποιώντας το κιτ τροποποίησης Αποτύπωση DNA (SIGMA, Saint Louis, ΜΟ), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Διαλογή για βλαστικής γραμμής

MLH1

μεθυλίωση προαγωγού διεξήχθη με μεθυλίωση-ειδική PCR (MSP) χρησιμοποιώντας εκφυλισμένα και μεθυλίωσης-ειδικό εναρκτήρα που σχεδιάστηκε από Suter et al [30]. Επιπλέον, σχεδιάσαμε ένα στοιχείο ελέγχου PCR στην οποία το εκφυλισμένο έναυσμα που χρησιμοποιήθηκε για MSP ζευγαρώθηκε με ένα εκκινητή ειδικό για μη μεθυλιωμένο DNA (Πίνακας S2). DNA από την κυτταρική γραμμή SW48 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός

MLH1

ελέγχου μεθυλίωση προαγωγού. Διαλογή για βλαστικής γραμμής

MSH2

μεθυλίωση προαγωγού διεξήχθη με MSP, χρησιμοποιώντας εναρκτήρες ειδικούς για μεθυλιωμένο και μη μεθυλιωμένων αλληλίων, όπως περιγράφεται από τους Chan et al [31]. Οι θετικοί μάρτυρες για

MSH2

μεθυλίωση υποστηρικτής ελήφθησαν με τη χρήση ΟΝΑ ελέγχου που είχαν καθολικά μεθυλιώνεται χρησιμοποιώντας S-αδενοσυλομεθειονίνη (SAM) και M.SssI CpG methyltrasferase (New England BioLabs, Ίπσουιτς, ΜΑ).

ΧΑ ανάλυση

ΧΑ αναλύσεις

MSH2

,

MLH1

ή

MSH6

έγιναν από επέκταση του εκκινητή σε ασθενείς με διαθέσιμα RNA και ετερόζυγο για τουλάχιστον ένα δείκτη αλληλομόρφων, ανεξάρτητα από το καθεστώς τους μεταλλάξεων. ASE αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως χρησιμοποιώντας είτε

32Ρ-επισημασμένο ή μη εκκινητές συζευγμένο με ανάλυση με Μοριακή Imager (Bio Rad Laboratories, Hercules, CA) ή με DHPLC (Transgenomic, Omaha, ΝΕ), αντίστοιχα [23,25 ]. Τρεις δοκιμασίες ASE διεξήχθησαν τόσο με

32Ρ-σημασμένο εκκινητές και με τη μέθοδο που βασίζεται DHPLC, η οποία απέδωσε συγκρίσιμα αποτελέσματα (Πίνακας S3). Για κάθε δοκιμασία του ΧΑ, η μέση αναλογία που λαμβάνεται με gDNA πρότυπα χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση των δεδομένων που παράγονται σε πειράματα επέκτασης εκκινητή διεξάγεται χρησιμοποιώντας πρότυπα cDNA. Αυτές οι κανονικοποιημένες αναλογίες cDNA /gDNA χαρακτηρίστηκαν ως αξίες του ΧΑ. Με βάση τις προηγούμενες μελέτες, μόνο σοβαρές ανισορροπίες στη σχετική έκφραση αλληλόμορφο που αντιστοιχεί στο διπλασιασμού των ανισορροπιών στην αλληλομόρφων αναλογίες ( [(Glu466del)]313#1381IMSSn.a.342#2803IMSSn.i.365#2192IIMSSn.a.368#2506IMSSn.i.369#2169IMSSn.a.370#3105IMSSn.i.

APC

c.1100_1101delCT (p.Ser367Cysfs*10)633#3114IMSSn.i.728#2509IMSSn.i.818#2543IMSSn.i.933#R14IMSSn.a.1165#3159IMSSn.i.1193#3187IMSSn.i.SV0001IMSI-Ln.a.TO9913In.a.MLH1705#3035In.a.MLH1

MLH1

c.1367C GLCH-10In.a.n.i.LCH-16In.a.n.a.LCH-51In.a.n.a.LCH-53In.a.n.a.54#982In.a.n.i.314#1200In.a.n.i.353#1114In.a.n.a.455#2186In.a.n.a.1082#2982In.a.n.a.F435In.a.n.a.GE0002In.a.n.a.Table . 1. Επισκόπηση της MSI, IHC και κατάστασης μεταλλάξεων σε 132 άσχετες ασθενείς HNPCC συνάντηση AC

na, τα δεδομένα δεν είναι διαθέσιμα? ni, IHC δεν informative.aNovel παραλλαγές είναι με έντονα γράμματα. Βλαστικής σειράς MMR ελαττώματα γονίδιο για ορισμένους ασθενείς έχουν αναφερθεί στο παρελθόν (βλέπε Πίνακα 2 και Πίνακες S3, S5, S6 και S7). Διαπιστώσαμε επίσης αρκετές παραλλαγές προηγουμένως αναφερθεί ως μη παθογόνα (βλέπε Πίνακα S5) .bASE αξία & lt? 0.5 ή & gt? 2. CSV Λήψη CSV

Πραγματοποιήσαμε

in silico

αναλύσεις να συναχθεί το λειτουργικό αποτέλεσμα των 4 παραλλαγές (3 εσφαλμένου νοήματος και 1 ιντρονικές) για τις οποίες δεν υπάρχουν τέτοια στοιχεία ήταν διαθέσιμα από προηγούμενες εκθέσεις. Για το 3 μυθιστόρημα παρερμηνεύσιμη παραλλαγές με επιβλαβή επίδραση στη λειτουργία της πρωτεΐνης είχε προβλεφθεί από

in silico

εργαλεία συμπεριλαμβανομένων PON-MMR και ΠΠΣΑ-MMR (Πίνακας S5).

Στο silico

εργαλεία έδειξε μια δυνητική επίδραση στο μάτισμα για το μυθιστόρημα ιντρονική παραλλαγή (

MLH1

c.1731 + 4AG) (βλέπε παρακάτω) (Πίνακας S5). Μια πρόσθετη παραλλαγή, η νέα

MSH2

εντός πλαισίου διαγραφή (c.2519_2530del12, p.Val840_Cys843del), θεωρήθηκε δυνητικά παθογόνων διότι αφαιρεί 4 κατάλοιπα αμινοξέων εντόνως διατηρημένες σε άλλα είδη και βρίσκεται στο πεδίο ΑΤΡάσης της πρωτεΐνης MSH2, όπου παραλλαγές είχαν προηγουμένως αναφερθεί ότι προκαλεί βλάβες σε αναντιστοιχία δεσμευτική ή απελευθέρωση [45,46].

Ένας ασθενής (814 # /DGR) βρέθηκε να μεταφέρει δύο αντικαταστάσεις παρερμηνεύσιμη στο

MSH2

(c.376GA και c.2251GC) προβλέπεται να είναι παθογόνα (βλέπε πίνακα S5). Δυστυχώς, δεν υπάρχουν συγγενείς αυτού του ασθενούς ήταν διαθέσιμα για έλεγχο των γονιδίων και η φάση των δύο παραλλαγές δεν μπορούσε να εξακριβωθεί.

Συνολικά, ο έλεγχος για παραλλαγές αλληλουχίας σε γονίδια που σχετίζονται HNPCC επέτρεψε την ανίχνευση των 56 διαφορετικές υποκαταστάσεις με ένα καθορισμένο ή δυνητική παθογόνο σημασία σε 72 ασθενείς, συμπεριλαμβανομένων 26 στην

MLH1

(46,5%), 28 στο

MSH2

(50%) και 2 στο

MSH6

(3,5%) (Πίνακας 1 και Πίνακας S5).

Γονιδιωματική αναδιατάξεις των MSH2, MLH1 και EpCAM

Προβολή της

MLH1

και

MSH2

από MLPA, ακολουθούμενη από επιβεβαιωτικές δοκιμές χρησιμοποιώντας LOC-CNV ή /και ΕΔΦΔ-HPLC, έδειξε την παρουσία της γονιδιωματικής αναδιατάξεις (συμπεριλαμβανομένων και 14 διαγραφές και 1 επικαλύψεων) σε 15 από τους 78 ασθενείς που αναλύθηκαν (19%) (Πίνακας 1 και Πίνακας S6). Το γονίδιο που επηρεάζονται από την αναδιάταξη ήταν

MSH2

σε 10 probands (13%) και

MLH1

σε 5 probands (6,5%).

EpCAM

ανακατατάξεις σαρώθηκαν με ΕΔΦΔ-HPLC σε ασθενείς χωρίς ανιχνεύσιμα παθογόνα παραλλαγές ή με τις VU. Επιπλέον,

EpCAM

ανακατατάξεις αξιολογήθηκαν σε 3 ασθενείς (476 # R26, 459 # 2809 και 412 # 3342) που βασίζεται σε MLPA και τον έλεγχο ΕΔΦΔ-HPLC είχαν ένδειξη

MSH2

διαγραφές που αφορούν το πρώτο εξόνιο του γονιδίου (Πίνακας S6). Ένας από αυτούς τους ασθενείς (476 # R26) είχε μια διαγραφή του

MSH2

εξώνια 1-6 και αναλύσεις EpCAM ΕΔΦΔ-HPLC που βασίζεται έδειξε ότι η αναδιάταξη δεν είχε επεκταθεί στο

EpCAM-MSH2

διαγονιδιακή περιοχή (Πίνακας S6). Σε μία άλλη ασθενής (459 # 2809), έχουν αναφερθεί στο παρελθόν να έχει μια διαγραφή που καλύπτει τα εξόνια 1-8 του

MSH2

[28], προσδιορισμούς EpCAM έδειξε ότι η διαγραφή περιελάμβανε την ανάντη

MSH2

5 ‘ περιοχή, αλλά γλίτωσε το 3 ‘άκρο του

EpCAM

(Σχήμα S1). Στην τρίτη ασθενής (412 # 3342) η διαγραφή που όλα

EpCAM

εξόνια που περιλαμβάνονται στους προσδιορισμούς EpCAM (εξόνια 3, 8 και 9) (Σχήμα S1). Η διαγραφή αυτή επεκτείνεται μέχρι το εξώνιο 7 του

MSH2

, όπως υποδεικνύεται από MLPA και ΕΔΦΔ-HPLC (Πίνακας S6). Όχι

EpCAM

αναδιατάξεις ανιχνεύτηκαν στους άλλους ασθενείς που αναλύθηκαν. Όλα

MLH1, MSH2

και

EpCAM

ανακατατάξεις επιβεβαιώθηκαν από τουλάχιστον 2 ανεξάρτητες αναλύσεις βασίζονται σε MLPA, ΕΔΦΔ-HPLC ή LOC-CNV. Σε 9 περιπτώσεις επιβεβαίωση των αναδιατάξεων μπορούσε επίσης να ληφθεί με σημείο διακοπής ανάλυση ή RT-PCR (Πίνακας S6), όπως έχει ήδη αναφερθεί [28,29].

υποκινητή βλαστικής σειράς μεθυλίωση

βλαστικής σειράς MMR γονίδιο μεθυλίωση προαγωγού αναλύθηκε σε περιπτώσεις αρνητικής κατά την αρχική εξέταση για παθογόνους παραλλαγές νουκλεοτιδίων και γονιδιωματική αναδιατάξεις. μεθυλίωση προαγωγού CpG παρατηρήθηκε μόνο με θετικά DNAs ελέγχου (κυτταρική γραμμή SW48 για

MLH1

και καθολικά μεθυλιωμένου DNA ελέγχου για

MSH2

, αντίστοιχα – τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

βλαστικής σειράς ΧΑ ανάλυση

Ανάμεσα στους 22 ασθενείς που θα μπορούσαν να αναλυθούν, παρατηρήσαμε μεταβληθεί βλαστική Χ.Α.

MLH1

σε 6 ασθενείς και

MSH2

στην 2 ασθενείς (Πίνακας 2 και Πίνακας S7). Από αυτούς τους ασθενείς, 2 έδειξε μο- νοαλληλική έκφραση

MLH1

(GDLV-52 # ΙΙ-2 και 83 # 3103) και 6 είχαν σημαντικά μη ισορροπημένη έκφραση

MLH1

(360 # 2916, GDLG- 20 # ΙΙ-1, GDLG-31 # ΙΙΙ-11 και LCH-27, μέση Χ.Α. τιμές 4.7, 2.01, 2.24 και 2.64, αντίστοιχα) ή

MSH2

(GDLM-9 # ΙΙ-2 και 334 # 1170, η μέση Χ.Α. τιμές 3,58 και 9,20, αντίστοιχα). Οι υπόλοιποι ασθενείς είχαν μέτρια ισορροπημένη ή ισορροπημένη ΧΑ (Πίνακας 2 και Πίνακας S7). Οι τιμές του Χ.Α. παρατηρούνται στις 22 εξεταζομένων που απεικονίζονται στο Σχήμα 1. Για αναφορά, το σχήμα απεικονίζει επίσης τις αξίες που έχουμε μετρήσει στο παρελθόν σε άτομα ελέγχου ετερόζυγο για τη συχνή παραλλαγή c.655AG (rs1799977) του

MLH1

[ ,,,0],25].

ασθενείς

μια

η παθογόνων παραλλαγών βλαστική

Χ.Α. ανάλυση

η Gene

δείκτη ASE

Συνέπεια

κανονικοποιημένη τιμή ΧΑ (SE)

β

Η GDLM-2 # ΙΙΙ-1

MSH2

c.942 + 3AT

MLH1

γ. 655AGp.Ile219Val1.00 (0.07) LCH-8

MSH2

c.984CTp. (=) 1,09 (0,07)

MLH1

c.655AGp.Ile219Val0.97 (0.16) GDLG -18 # ΙΙΙ-19

MSH2

Del εξόνιο 3

MLH1

c.655AGp.Ile219Val0.91 (0.10) LCH-27

MLH1

c.655AGp.Ile219Val2. 64 (0.38) GDLG-31 # ΙΙΙ-11

MLH1

c.954delC (p.His318Glnfs * 49)

MLH1

c.655AGp.Ile219Val2.24 (0.07) LCH-51

MLH1

c.655AGp.Ile219Val0.84 (0.10) LCH-59

MLH1

c.1679delT (p.Phe560Serfs * 31)

MLH1

γ. 655AGp.Ile219Val0.97 (0.11) GE9804

MSH2

c.1705_1706delGA (p.Glu569Ilefs * 2)

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.09 (0.05) 96 # 1636

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.17 (0.06) 334 # 1170

MSH2

c.278_279delTT (p.Leu93Profs * 6)

MSH2

c.278_279delTTp.Leu93Profs * 69.20 (3.97) 359 # 2578

MLH1

c.1639_1643dupTTATA (p.Leu549Tyrfs * 44)

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.33 (0.04) 314 # 1200

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.01 (0.03) 1082 # 2982

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.07 (0,02)

MSH6

c.540TCp. (=) 1.10 ( 0.12) 83 # 3103

γ

MLH1

Del εξόνιο 1

MLH1

c.655AGp.Ile219ValLoss του G alleleTable 2. Αποτελέσματα της επέκτασης του εκκινητή ΧΑ αναλύσεων που διενεργούνται σε αυτή τη μελέτη.

Ain Πίνακας S7 συνοψίζουμε τα αποτελέσματα του Χ.Α. αναλύσεις για επιπλέον 8 ασθενείς που περιλαμβάνονται στην παρούσα μελέτη, τα αποτελέσματα της οποίας ΧΑ είχε αναφερθεί στο παρελθόν [23,25] .bMarkedly ισορροπημένη αξίες του ΧΑ είναι με έντονα γράμματα .cFor αυτή η ανάλυση PE ασθενής που πραγματοποιούνται στην παρούσα μελέτη επιβεβαίωσε την απώλεια της έκφρασης για το αλληλόμορφο G δείχθηκε προηγουμένως με αλληλούχιση cDNA [28]. CSV Λήψη CSV

αξιών του ΧΑ μεταξύ των 2 διακεκομμένες γραμμές αντιστοιχούν σε λιγότερο από το διπλάσιο των ανισορροπιών στην αλληλομόρφων αναλογίες (βλέπε Μέθοδοι).

Η

Τρεις ασθενείς με διαταραγμένη βλαστική ASE (GDLG-31 # ΙΙΙ-11, 83 # 3103 και 334 # 1170) ήταν γνωστοί φορείς του

MLH1

ή

MSH2

διαγραφές. Αντίθετα, σε 2 ασθενείς με μη ισορροπημένη ΧΑ αρχική εξέταση για παθογόνους παραλλαγές από SSCP ή DGGE ήταν αρνητική, αλλά οι επόμενες εκ νέου ανάλυση από DHPLC και αλληλουχίας προσδιόρισε πλαισίου του

MSH2

(υπόθεση GDLM-9 # ΙΙ-2) και μια ιντρονική

MLH1

παραλλαγή με μια πιθανή επίδραση στην μάτισμα (υπόθεση 360 # 2916, βλέπε παρακάτω) (Πίνακας 1 και Πίνακας S7). Συνολικά, οι παραλλαγές με σαφή ή δυνητική παθογόνο ρόλο ανιχνεύθηκαν σε 5 από τους 8 ασθενείς με μη ισορροπημένη ΧΑ (Πίνακας 1 και Πίνακας S7), ενώ σε 3 ασθενείς (GDLG-20 # ΙΙ-1, LCH-27 και GDLV-52 # ΙΙ-2) μεταβληθεί ΧΑ ήταν η μόνη βλαστική βλάβη ανιχνεύεται [23,25].

ανάλυση ενός νέου υποθετικού παραλλαγή ματίσματος

Στο silico

ανάλυσης από διαφορετικές πρόβλεψη ματίσματος εργαλεία λογισμικού (βλέπε Μέθοδοι) έδειξε ότι η επίδραση του μυθιστορήματος

MLH1

c.1731 + 4AG παραλλαγή συμμερίζονται 2 εξεταζομένων (360 # 2916 και 986 # 3487) ήταν αβέβαιο. Ωστόσο, πρότειναν ότι αυτή η αλλαγή μπορεί να επηρεάσει το μάτισμα μειώνοντας την αντοχή της θέσεως δότη (μέση μείωση 13%, εύρος 7,4 έως 22%). Η διαθεσιμότητα των cDNA σε ασθενή 360 # 2916 μας επέτρεψε να ελέγξετε αν η παραλλαγή c.1731 + 4AG συνδέθηκε με ένα ελάττωμα μάτισμα. Αυτή η αλλαγή ήταν ασαφείς κατά την αρχική δοκιμή RT-PCR ενισχυμένο cDNA επειδή μόνο οι μεταγραφές άγριου τύπου αποκαλύφθηκαν με άμεση αλληλούχιση ή με ηλεκτροφορητική ανάλυση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, με βάση τα αποτελέσματα της ανάλυσης ASE που δείχνει μια αξιοσημείωτη ανισορροπία στην έκφραση αλληλόμορφη (αναλογία μέσο κανονικό αλληλικές 4.7, που προέρχεται από τα ραδιενεργά και DHPLC με βάση προσδιορισμούς, Πίνακας S3), υποθέσαμε ότι μια αλλοιωμένη ματίσματος ενδέχεται να αποκαλυφθούν με DHPLC. Όπως είχε προβλεφθεί, τόσο πιο ευαίσθητη ανάλυση DHPLC επέτρεψε την ανίχνευση ενός κύρια κορυφή με ένα χρόνο συγκράτησης που αντιστοιχεί στο μεταγράφημα αγρίου τύπου και από μία ελάσσων κορυφή που αντιστοιχεί σε λιγότερο εκφρασμένη μεταγραφή μικρότερη. Αλληλουχίας επιβεβαίωσε ότι το λιγότερο που εκφράζεται

MLH1

μεταγραφή πραγματοποιείται ένα out-of-πλαισίου εξόνιο 15 παράκαμψη (Εικόνα S2).