Αφηρημένο

Από καιρό έχει αποδεχθεί ότι οι ανοσοσφαιρίνες (IGS) παρήχθησαν μόνο από τα κύτταρα Β λεμφικών. Πρόσφατα Igs έχουν βρεθεί να εκφράζονται σε διάφορα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου. Ανασυνδυασμός ενεργοποίησης γονίδιο 1 (RAG1) και RAG2, τα οποία είναι απαραίτητα ένζυμα για την κίνηση μεταβλητής ποικιλομορφία-συνδετικό τμήμα ανασυνδυασμού, έχουν επίσης βρεθεί να εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, ο μηχανισμός της ενεργοποίησης RAG σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα δεν έχει διευκρινιστεί. Εδώ, ερευνήσαμε το ρυθμιστικό μηχανισμό της έκφρασης RAG σε τέσσερις ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές αναλύοντας παράγοντες μεταγραφής που επάγουν την ενεργοποίηση RAG σε Β κύτταρα. Με RT-PCR, στύπωμα Western και ανοσοφθορισμό, διαπιστώσαμε ότι παράγοντες μεταγραφής Ε2Α, FOXO1 και FOXP1 εκφράστηκαν και εντοπισμένη στους πυρήνες αυτών των καρκινικών κυττάρων. Υπερ-έκφραση του Ε2Α, FOXO1 ή Foxp1 αυξημένη έκφραση RAG, ενώ παρεμβολή RNA του Ε2Α, FOXO1 ή FOXP1 μειωμένη έκφραση RAG στα καρκινικά κύτταρα. πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης έδειξαν ακετυλίωση της RAG ενισχυτή (Erag) και Ε2Α, FOXO1 ή FOXP1 ήταν υποχρεωμένη να Erag in vivo. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα η μεταγραφή παράγοντες E2A, FOXO1 και FOXP1 ρυθμίζουν την έκφραση της RAG, η οποία ξεκινά γονιδιακή αναδιάταξη Ig πολύ με τον τρόπο παρόμοιο με Β λεμφοκύτταρα

Παράθεση:. Chen Ζ, Xiao Υ, Zhang J , Λι J, Liu Υ, Zhao Y, et al. (2011) παράγοντες μεταγραφής Ε2Α, FOXO1 και FOXP1 Ρυθμίζουν ανασυνδυασμός Ενεργοποίηση Gene Expression στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 6 (5): e20475. doi: 10.1371 /journal.pone.0020475

Επιμέλεια: Sumitra Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Μάρ 2011? Αποδεκτές: 26 Απρίλη του 2011? Δημοσιεύθηκε: May 31, 2011

Copyright: © 2011 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις (81001199 έως ZC, 81030033, 30971150 για την JG, 30950110335 στην KC) από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας, και να χορηγήσει LYM10079 να ZC από το Πρόγραμμα Καινοτόμων ταλέντα της Guangdong Κολέγια και πανεπιστήμια. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Από καιρό έχει αποδεχθεί ότι οι ανοσοσφαιρίνες (IGS) μπορεί να εκφράζεται μόνο σε ώριμα Β λεμφοκύτταρα και πλασματοκύτταρα. Ωστόσο, πρόσφατα αρκετές ομάδες ανέφεραν ότι Igs μπορούσε επίσης να παραχθεί από μη λεμφοειδούς γράμμωσης κύτταρα [1], συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων [2], [3], καρκινικά κύτταρα ιστού μαλακό [4], οι νευρώνες και τα νευρογλοιακά κύτταρα του κεντρικού και περιφερικό νευρικό σύστημα [5], οφθαλμικής επιθηλιακά και γάγγλιο κυττάρων [6], όρχεων σπερματογένεσης κύτταρα ποντικού και επιδιδυμίδας επιθηλιακά κύτταρα [7] και το ποντίκι που θηλάζουν μαστικό αδένα επιθηλιακά κύτταρα [8]. Το μεγαλύτερο μέρος της έρευνας έχει μέχρι τώρα επικεντρώνεται στην Ig έκφραση σε καρκινικά κύτταρα. Ο ανασυνδυασμός ενεργοποίησης γονιδίου (RAG) έχει βρεθεί επίσης εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα, τόσο σε επίπεδο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης και υποτίθεται να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στη σύνθεση των Igs από αυτά τα καρκινικά κύτταρα [2], [3], [ ,,,0],9]. Ωστόσο, ο ρυθμιστικός μηχανισμός της έκφρασης RAG σε καρκινικά κύτταρα δεν έχει ακόμη προσδιοριστεί.

Οι μεταβλητές περιοχές των γονιδίων Ig που αποτελείται από μία μεταβλητή (V), ένα ποικιλομορφίας (D), και μία σύνδεση (J) τμήμα του γονιδίου, η διάταξη των οποίων προκύπτει από V (D) J ανασυνδυασμό [10]. RAG ενδονουκλεάση απαιτείται για την έναρξη της διάσπασης φάσης V (D) J ανασυνδυασμό [11]. RAG αποτελείται από δύο γειτονικών γονιδίων, RAG1 και RAG2, που επάγουν συνεργικά V (D) J ανασυνδυασμό [12]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα ποντίκια με ανεπάρκεια σε είτε RAG1 ή RAG2 απέτυχε να κινήσει V (D) J επαναδιάταξη [13], [14]. πρωτεΐνες RAG1 και RAG2 μαζί βρέθηκαν να είναι επαρκής για να διασπάσει τα υποστρώματα ανασυνδυασμού σε ελεύθερα συστήματα κυττάρου [15], [16]. Στο Β κυττάρων έκφρασης ανάπτυξη RAG ποντικού εμφανίζεται σε δύο κύματα και ρυθμίζεται από ένα δίκτυο των μεταγραφικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων των Ε2Α, Ίκαρος, Pax5β, Foxo1, Foxp1, και NF-κΒ [17]. Το πρώτο κύμα έχει σαν αποτέλεσμα την αναδιάταξη της βαριάς αλυσίδας ανοσοσφαιρίνης σε προ-Β κύτταρα. Και το δεύτερο κύμα της έκφρασης RAG οδηγεί στην συναρμολόγηση ελαφριάς αλυσίδας ανοσοσφαιρίνης σε προ-Β κύτταρα.

Εκτός από τις RAG1 και RAG2 υποκινητές, το γονίδιο RAG έχει επίσης άλλα ρυθμιστικά στοιχεία, όπως το εγγύς ενισχυτή (EP), το περιφερικό ενισχυτή (Ed) και ο ενισχυτής RAG (Erag) [17], [18], [19], [20], [21], [22]. Πιστεύεται ότι οι προαναφερθέντες παράγοντες μεταγραφής ρυθμίζουν την έκφραση RAG με δέσμευση σε αντίστοιχες ρυθμιστικές αλληλουχίες τους σε Β κύτταρα. Erag είναι η ισχυρότερη έκφραση RAG ενισχυτή ρύθμισης. Στοχευμένη διαγραφή του Erag στα βλαστικά κύτταρα ποντικού οδήγησε σε μείωση 5-πλάσια έως 10-πλάσια σε έκφραση RAG και ενός μερικού κυβόλιθου στο προ-Β να προ-Β μετάβαση [22]. Ε2Α, Ίκαρος, Foxo1, Foxp1 και NF-κΒ ήταν όλα δειχθεί ότι ενεργοποιούν την έκφραση RAG με σύνδεση προς Erag σε κύτταρα Β ποντικού [22], [23], [24], [25], [26]. Pax5β αναφέρθηκε για την ενεργοποίηση προαγωγέα RAG2 σε ανώριμα κύτταρα Β [27]. Είτε αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής επίσης εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα και αν έχουν ρυθμιστικές λειτουργίες στην έκφραση της RAG σε τέτοια κύτταρα είναι άξιος της έρευνας.

Στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε πρώτα τις πρωτεΐνες και τα mRNA εκφράσεις αυτών μεταγραφή παράγοντες που έχουν βρεθεί ότι είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση RAG σε Β κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των Ε2Α (Ε47 και Ε12), FOXO1, FOXP1, Ίκαρος, ΝΡ-κΒ, και PAX5β, σε τέσσερις κυτταρικές σειρές καρκίνου. Στη συνέχεια μελετήθηκε η εντόπιση ενός αριθμού από αυτούς τους παράγοντες μεταγραφής (Ε2Α, FOXP1, NF-κΒ και FOXO1) με ανοσοφθορισμό (IF). Βρήκαμε ότι Ε2Α, FOXO1 και FOXP1 εκφράστηκαν σε καρκινικά κύτταρα και εντοπισμένη στους πυρήνες αυτών των κυττάρων. Υπερ-έκφραση αυτών των τριών παραγόντων μεταγραφής αύξησε σημαντικά την έκφραση RAG. Λειτουργική απενεργοποίηση των γονιδίων οποιουδήποτε από τους τρεις αυτούς παράγοντες μεταγραφής από την RNA παρεμβολής μειωμένη έκφραση RAG. In vivo χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα ανάλυσης έδειξαν ότι η ιστόνης Η3 της Erag ακετυλιώθηκε και ότι E2A, FOXO1, FOXP1 ήταν αναγκασμένοι να Erag σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι παράγοντες μεταγραφής Ε2Α, FOXO1 και FOXP1 ενεργοποιούν την έκφραση της RAG, η οποία είναι κρίσιμη για το V (D) J ανασυνδυασμό, στον καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Εμείς δεν χρησιμοποίησε κανένα ιστούς των ανθρώπων ή των ζώων στη μελέτη μας. Έτσι, δεν είχαμε την αίσθηση ότι ήταν απαραίτητη η έγκριση της δεοντολογίας.

Κυτταρική καλλιέργεια

Το ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα γραμμή Α549, του καρκίνου του προστάτη κυτταρική σειρά PC3, ο καρκίνος του μαστού κυτταρικές σειρές MCF-7, MDA- MB-231 και λεμφώματος Burkitt κυτταρική γραμμή Raji λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Α549, PC3, MCF-7 και MDA-MB-231 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ) με 10% FBS (Hyclone /Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, ΜΑ). κύτταρα Raji καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) με 10% FBS σε 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO2.

εξαγωγή RNA και RT-PCR

Σύνολο RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα του όγκου χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RNase ελεύθερη DNase (Invitrogen) για να απομακρυνθεί γονιδιωματικό DNA. Η αντίστροφη μεταγραφή του RNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του III First Strand Synthesis System Superscript ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τον αρνητικό έλεγχο, η αντίστροφη μεταγραφάση δεν προστέθηκε στο μίγμα της αντίδρασης. Συμβατικές ή ένθετη PCR πραγματοποιήθηκε και οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη απαριθμούνται στον Πίνακα 1. Για Ίκαρος, το οποίο έχει αρκετές διαφορετικές ισομορφές, ένθετη PCR χρησιμοποιήθηκε για να αυξηθεί η ευαισθησία και για τον καλύτερο χαρακτηρισμό των ειδικών ισομορφών Ikaros [28]. Οι δύο ισομορφές της Ε2Α, Ε47 και Ε12 και οι δύο ενισχύθηκαν με PCR.

Η

SDS-PAGE και στύπωμα

κυτταρολύματα Western παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA. Περίπου 40 μg ολικής κυτταρικής πρωτεΐνης διαχωρίστηκε σε 5% έως 10% γέλη SDS-PAGE. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν περιλάμβαναν RAG1 (Κ-20), RAG2 (D-20), GAPDH (0411), Ε2Α (Yae), FOXP1 (D35D10), NF-κΒ ρ65 (F-6), και FOXO1 (H-128 ). αντισώματος FOXP1 λήφθηκε από Τεχνολογία Σηματοδότησης Κυττάρου και τα άλλα αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology. Μετά την επώαση με τα δευτερογενή αντισώματα (αντι-ποντικού IgG-HRP ή κατσίκας αντι-κουνελιού IgG-HRP, Santa Cruz), τα ανοσοστυπώματα εμφανίστηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Σούπερ ECL Plus ανίχνευσης (Applygen Technologies, Πεκίνο) και εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων-Χ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

ανοσοφθορισμού

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλακίδια σε τρυβλία 6 φρεατίων και σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια τα πλακίδια επωάστηκαν με 0,5% Triton Χ-100 για 10 λεπτά, και μπλοκάρει για 1 ώρα σε PBS που περιέχει 4% λευκωματίνη βόειου ορού (BSA). Τα πρωτογενή αντισώματα που περιλαμβάνονται Ε2Α (Yae), FOXP1 (D35D10), NF-κΒ ρ65 (F-6) και FOXO1 (H-128). Οι λεπτομερείς πληροφορίες για αυτά τα αντισώματα φαίνονται στον πίνακα 2. Οι έλεγχοι ισοτύπου διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας φυσιολογικό ποντίκι ή IgG κουνελιού στην ίδια συγκέντρωση όπως τα πρωτεύοντα αντισώματα. Μετά από επώαση στους 4 ° C όλη τη νύκτα και πλύσιμο, τα πλακίδια επωάστηκαν με το δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG-FITC (πράσινο σήμα) ή κατσίκας αντι-κουνελιού IgG-TRITC (κόκκινο σήμα) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Μετά από μία τελική πλύση, τα πλακίδια τοποθετούνται με την τοποθέτηση των μέσων ενημέρωσης με DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) και εξετάζεται κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss).

Η

Πλασμίδια κατασκευή και επιμόλυνση

Τα ανθρώπινα θραύσματα Ε47 και Ε12 κλωνοποιήθηκαν σε ένα πλασμίδιο pIRES2-EGFP με ένζυμο περιορισμού BgIII και ΕοοΚΙ από τα πλασμίδια MigR1-hE47 και MigR1-hE12, αντίστοιχα, τα οποία ήταν ευγενικό δώρα από το Δρ Μπάρμπαρα Kee του Πανεπιστημίου του Σικάγο. Το πλασμίδιο pcDNAI /NEO-5’HA-Foxp1A που κωδικοποιείται πρωτεΐνη Foxp1A ποντικού γενναιόδωρα από τον Dr. Philip Tucker του Πανεπιστημίου του Τέξας στο Όστιν [29]. Η πρωτεΐνη FOXP1 ήταν πολύ διατηρημένη μεταξύ ανθρώπου και ποντικού είδη (περισσότερο από 90% ταυτότητα), έτσι χρησιμοποιήσαμε αυτό το πλασμίδιο για τη μελέτη μας. Η pcDNA3-GFP-FOXO1? Πλασμίδιο ΑΑΑ ελήφθη από Addgene και παρασκευάστηκε στο εργαστήριο του Dr. William Sellers ‘όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Αυτό το πλασμίδιο περιείχε μία μετάλλαξη του phosphosite FOXO1, που ως αποτέλεσμα του παρόντος δεν ήταν πλέον φωσφορυλιώθηκαν από Akt και θα μπορούσε ακόμη να εντοπίζουν προς τον πυρήνα και να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή σε επιμολυσμένα κύτταρα [31]. Παροδική διαμόλυνση δοκιμασίες Α549 και MCF-7 καρκινικά κύτταρα έγιναν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο επιμόλυνσης Fugene HD (Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

παρεμβολή RNA

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) που κατευθύνονται έναντι FOXO1 [32], FOXP1, Ε2Α και μη ειδική ελέγχου siRNA (GenePharma, Σαγκάη, Κίνα) επιμολύνθηκαν σε Α549 και MCF-7 καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι αλληλουχίες siRNA εισήχθησαν στον Πίνακα 1.

ChIP

χρωματίνης διασταύρωσης και ανοσοκαθίζηση έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Χρησιμοποιήθηκε η αντι-ακετυλο-ιστόνης Η3 (06-599, Upstate Biotechnology), Ε2Α (Yae), Ε47 (Ν-649), FOXP1 (D35D10) ή FOXO1 (H-128). Τόσο η Ε2Α (Yae) και Ε47 (Ν-649) αντίσωμα χρησιμοποιήθηκαν σε ChIP για Ε2Α. Κανονική IgG κουνελιού (SC-2027, Santa Cruz) ή φυσιολογικό IgG ποντικού (SC-2025, Santa Cruz) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. Ανοσοκαταβυθισμένες ακολουθίες DNA αναλύθηκαν με PCR και οι εκκινητές παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Αποτελέσματα

Ε2Α, FOXO1, FOXP1 και NF-κΒ εκφράστηκαν σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του

RT-PCR αποτελέσματα έδειξαν ότι FOXO1, FOXP1, ΝΡ-κΒ ρ65 υπομονάδα και τα δύο από τα δύο ισομορφές του Ε2Α (Ε47 και Ε12), εκφράστηκαν στο Α549 καρκινικά κύτταρα, PC3, MCF-7 και MDA-MB-231 (Σχήμα 1). Ωστόσο, ούτε Ίκαρος ούτε PAX5β ανιχνεύθηκε σε αυτά τα καρκινικές κυτταρικές σειρές, ενώ θα μπορούσαν και οι δύο να ενισχυθούν από κύτταρα Raji. Στο επίπεδο πρωτεΐνης, Ε2Α, FOXO1, FOXP1 και ρ65 υπομονάδα του ΝΡ-κΒ ήταν όλα ανιχνεύθηκαν στα καρκινικά κύτταρα με δοκιμασία κηλίδας Western (Εικόνα 2). Με βάση το μοριακό βάρος, το πλήρους μήκους FOXP1 βρέθηκε να είναι η κύρια ισομορφή του FOXP1 εκφράζεται στα καρκινικά κύτταρα. Επιβεβαιώσαμε επίσης την έκφραση του RAG1 και RAG2 σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου (Σχήμα 2).

18S χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Raji χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. ΫΝάση RNA αντιμετωπίζεται χωρίς την προσθήκη αντίστροφης μεταγραφάσης χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος.

Η

Raji κύτταρο χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

Ε2Α, FOXO1 και FOXP1 ήταν εντοπισμένα στους πυρήνες των κυττάρων του καρκίνου

Για να μελετηθεί η εντόπιση της Ε2Α, FOXO1, FOXP1 και NF-κΒ σε καρκινικά κύτταρα, ΕΑΝ διεξήχθη με τη χρήση των αντίστοιχων αντισωμάτων για τις τέσσερις κυτταρικές σειρές καρκίνου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι E2A και FOXP1 ήταν κυρίως εντοπισμένη στον πυρήνα, ενώ NF-κΒ ήταν αποκλειστικά εντοπισμένη στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 3). FOXO1 βρέθηκε να μετατοπίζεται μεταξύ του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος, με τη θέση ανάλογα με τις συνθήκες καλλιέργειας και την ανάπτυξη. Όταν έγιναν συρρέοντα κύτταρα, FOXO1 ήταν κυρίως βρίσκονται στον πυρήνα, ενώ ήταν κυρίως παρούσα στο κυτταρόπλασμα όταν τα κύτταρα ήταν αραιή. Από τους παράγοντες μεταγραφής θα πρέπει να εντοπίζεται στον πυρήνα, προκειμένου να ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση, εμείς απλά επικεντρώθηκε στην E2A, FOXO1 και FOXP1 στο δεύτερο μέρος της μελέτης μας.

Α, κανονική IgG ποντικού χρησιμοποιήθηκε αντί του πρωτογενές αντίσωμα. Β, το πρωτογενές αντίσωμα ήταν αντι-ποντικού E2A. C, το πρωτογενές αντίσωμα ήταν αντι-ΝΡ-κΒ ρ65 ποντικού. Α έως Γ, το δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG-FITC. D, η κανονική IgG κουνελιού χρησιμοποιήθηκε αντί του πρωτογενούς αντισώματος. E, το πρωτογενές αντίσωμα ήταν κουνελιού αντι-FOXO1. F, το πρωτογενές αντίσωμα ήταν κουνελιού αντι-FOXP1. D έως F, το δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG-TRITC. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για το Α549, PC3 και κυτταρικές γραμμές MDA-MB-231 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

Η υπερέκφραση του Ε2Α, FOXO1 ή Foxp1 up-ρυθμιζόμενη έκφραση RAG

για να διερευνήσει την επίδραση της παραγόντων μεταγραφής Ε2Α, FOXO1 και FOXP1 στην έκφραση RAG, Α549 και MCF-7 κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον φορέα έκφρασης για E47, Ε12, Foxp1A ή FOXO1. Ο κενός φορέας χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται για την ανάλυση του Ε2Α, FOXP1, FOXO1 και έκφραση RAG με δοκιμασία κηλίδος Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επιμόλυνση με τον φορέα έκφρασης για E47, Ε12, Foxp1A ή FOXO1 αυξήθηκε τόσο RAG1 και εκφράσεις RAG2 (Σχήμα 4). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η υπερέκφραση του Ε2Α, FOXO1 ή Foxp1 επάνω ρυθμισμένη την έκφραση RAG1 και RAG2 σε κύτταρα MCF-7. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με τη χρήση της Α549 κυτταρικής σειράς (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

MCF-7 κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον κενό φορέα έκφρασης φορέα ή παράγοντα μεταγραφής pIRES2-EGFP-hE47, pIRES2-EGFP-hE12, pcDNA3- GFP-FOXO1? ΑΑΑ ή pcDNAI /NEO-5’HA-Foxp1A. 48 ώρες αργότερα συνολικής πρωτεΐνης από κύτταρα MCF-7 συλλέχθηκε και αναλύθηκε με στύπωση Western. GAPDH δείχθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για το Α549 κυτταρική σειρά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

παρεμβολή RNA του Ε2Α, FOXO1 ή FOXP1 κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση RAG

Για να μελετήσει περαιτέρω τη ρυθμιστική λειτουργία του Ε2Α, FOXO1 και FOXP1 για την έκφραση της RAG, οι αλληλουχίες siRNA για Ε2Α, FOXO1 ή FOXP1 επιμολύνθηκαν σε Α549 και MCF-7 κύτταρα. Η μη ειδική siRNA χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται για την ανάλυση των Ε2Α, FOXP1, FOXO1 και έκφραση RAG με δοκιμασία κηλίδος Western. Η επιμόλυνση με αλληλουχία siRNA για Ε2Α, FOXP1 ή FOXO1 βρέθηκε να μειώνει τις εκφράσεις των δύο RAG1 και RAG2 (Σχήμα 5), γεγονός που υποδηλώνει ότι φίμωση Ε2Α, FOXO1 ή γονίδια FOXP1 ρυθμίζει προς τα κάτω RAG1 και RAG2 εκφράσεις σε κύτταρα MCF-7. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν κατά τη χρήση της Α549 κυτταρικής σειράς (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

κύτταρα MCF-7 διαμολύνθηκαν με μη ειδική siRNA ελέγχου ή αλληλουχία siRNA για Ε2Α, FOXO1 ή FOXP1. 48 ώρες αργότερα συνολικής πρωτεΐνης από κύτταρα MCF-7 συλλέχθηκε και αναλύθηκε με στύπωση Western. GAPDH δείχθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για το Α549 κυτταρική σειρά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

E2A, FOXO1 και FOXP1 δεσμεύεται να Erag in vivo

Σε ποντικού μεταγραφή κύτταρα Β παράγοντες E2A, Foxo1 και Foxp1 ρυθμίζουν την έκφραση της RAG μέσω της σύνδεσης με Erag, τον ενισχυτή ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης RAG. Για να διερευνηθεί κατά πόσο αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής συμπεριφέρονται παρομοίως σε καρκινικά κύτταρα, Chip διεξήχθη επί Α549 και MCF-7 κύτταρα. Η περιοχή Erag 1 περιέχει τρεις θέσεις πρόσδεσης για E2A και μία θέση δέσμευσης για FOXO1 ή FOXP1, ενώ η περιοχή Erag 3 δεν περιέχει θέση δέσμευσης για E2A και μία θέση δέσμευσης για FOXO1 ή FOXP1 [25]. αποτελέσματα ChIP έδειξαν ότι ιστονών Η3 και των δύο Erag περιοχή 1 και 3 ακετυλιώθηκε, υποδεικνύοντας ότι Erag ήταν σε ανοιχτό ή ενεργοποιημένη κατάσταση. Επιπλέον, παράγοντες μεταγραφής Ε2Α, FOXO1 και FOXP1 καταδείχθηκαν ότι δεσμεύεται Erag περιοχή 1 αλλά όχι με την περιοχή 3 (Σχήμα 6). Και για τις δύο κυτταρικές σειρές ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα.

Α, διασυνδεδεμένη χρωματίνη που απομονώνεται από κύτταρα MCF-7 ανοσοκαταβυθίστηκε είτε με ισοτυπικό έλεγχο IgG ή αντι-ακετυλο-ιστόνης Η3 αντίσωμα. Οι σχετικές DNA θραύσματα χρωμοσωμικού ενισχύθηκαν με εκκινητές για Erag περιοχή 1 και 3. Β, το αντίσωμα για την ανοσοκαταβύθιση ήταν αντι-Ε2Α, FOXO1 ή FOXP1. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για Α549 κυτταρική γραμμή (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

Η

Συζήτηση

Πρόσφατα διάφορες ερευνητικές ομάδες ανέφεραν ότι V (D) J ανασυνδυασμό και έκφραση RAG εμφανίστηκαν σε καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, ο μηχανισμός που ελέγχει τα φαινόμενα αυτά σε επιθηλιακά κύτταρα είναι προς το παρόν άγνωστη. Σε αυτή τη μελέτη, κατ ‘αναλογία με το μοριακό μηχανισμό της έκφρασης RAG σε Β κύτταρα, διερευνήσαμε το ρυθμιστικό μηχανισμό της έκφρασης RAG σε καρκινικά κύτταρα, αναλύοντας τους παράγοντες μεταγραφής Ε2Α, Ίκαρος, PAX5β, FOXO1, FOXP1 και NF-κΒ. Παρόμοια με το ρόλο τους στην ενεργοποίηση της έκφρασης RAG σε κύτταρα Β, βρήκαμε ότι Ε2Α, FOXO1 και FOXP1 ρυθμιζόμενη έκφραση RAG σε καρκινικά κύτταρα με σύνδεση προς Erag.

Ε2Α ανήκει στην κλάση Ι έλικας-βρόχου-έλικας (HLH) πρωτεΐνες, επίσης γνωστή ως Ε πρωτεϊνών λόγω της ικανότητας τους να συνδέονται με σχετική υψηλή συνάφεια προς την παλινδρομική ακολουθία DNA CANNTG, που αναφέρεται ως μία θέση Ε κουτί [33], [34]. Το γονίδιο Ε2Α κωδικοποιεί για δύο πρωτεΐνες Ε, Ε12 και Ε47, οι οποίες προκύπτουν μέσω εναλλακτικό μάτισμα του εξονίου που κωδικοποιεί για τον τομέα HLH [35]. Ε12 και Ε47 είναι πρωτεύοντα ενεργοποιητές της μεταγραφής που λειτουργούν, εν μέρει, από την πρόσληψη του συν-ενεργοποιητή πρωτεΐνης ρ300 /ΟΒΡ, η οποία με τη σειρά της στρατολογεί ακετυλτρανσφεράσες ιστόνης και RNA πολυμεράση II προς τον προαγωγό ή ενισχυτές των γονιδίων στόχων [36], [37]. E2A πιστεύεται ότι είναι ένα βασικό ρυθμιστή της διαφοροποίησης των κυττάρων Β με την ενεργοποίηση της έκφρασης της RAG και άλλων Β λεμφοειδών γονιδίων [34]. Υπερ-έκφραση του Ε47 έχει προηγουμένως βρεθεί να ενεργοποιούν έκφραση RAG1 και μεταγραφή IgH βλαστικής σειράς σε ινοβλάστες [38]. Η έκτοπη έκφραση του Ε2Α, μαζί με RAG1 και RAG2 προωθείται τόσο IgH και IgL αναδιατάξεις γονιδίων σε ένα μη-λεμφοειδή σειρά εμβρυϊκού νεφρού [39], [40]. Το εύρημά μας ότι και οι δύο πρωτεΐνες RAG και Ε2Α εκφράστηκαν σε καρκινικά κύτταρα συμβάλλει στην κατανόηση του μηχανισμού του V (D) J ανασυνδυασμό σε νεοπλασματικά κύτταρα.

FOXO1 και FOXP1 ανήκουν στην οικογένεια των πρωτεϊνών κουτί Forkhead, η οποία περιέχουν ένα κοινό δεσμευτικό DNA-πεδίου (DBD) ονομάζεται το πλαίσιο forkhead ή φτερωτό τομέα έλικας [41]. FOXO1 μπορεί να μετατοπίσει από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, αφού φωσφορυλιωθεί από Akt. Ποντικού Foxp1 έχει τέσσερα εναλλακτικά συγκολλημένα ισομορφές, Foxp1A-Foxp1D [29]. Απορρύθμιση των FOXO1 και FOXP1 είχε δείξει σε πολλούς τύπους καρκίνου [41], [42]. Πρόσφατα δύο μελέτες έδειξαν ότι Foxo1 και Foxp1 ρυθμίζεται η έκφραση της RAG σε μυϊκά κύτταρα Β [24], [25]. Εδώ έχουμε δείξει ότι FOXO1 και FOXP1 έχουν επίσης ρυθμιστική λειτουργία στην έκφραση RAG σε καρκινικά κύτταρα.

Σε αυτή τη μελέτη, επικεντρωθήκαμε σε ένα επιλεγμένο αριθμό των μεταγραφικών παραγόντων και διαπίστωσε ότι E2A, FOXO1 και FOXP1 έκφραση ρυθμιζόμενη RAG σε τα καρκινικά κύτταρα. Εάν υπάρχουν πρόσθετοι παράγοντες μεταγραφής που εμπλέκονται στην έκφραση RAG μένει να διερευνηθεί. Επιπλέον, εάν υπάρχουν περισσότερες ομοιότητες στην γονιδιακή έκφραση μεταξύ Β κυττάρων και καρκινικών κυττάρων θα μπορούσε να βρεθεί χρησιμοποιώντας τεχνικές υψηλής απόδοσης. Προηγουμένως, είχε αναφερθεί ότι η έκφραση Ig προωθηθεί η ανάπτυξη του όγκου και προόδου [2], [43], [44]. Εν όψει των αποτελεσμάτων μας σε ρυθμιστικούς παράγοντες ενεργοποίησης της έκφρασης RAG, Ig έκφραση σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να ελεγχθεί με τη στοχοθέτηση των ανάντη μεταγραφικοί παράγοντες για την πρόληψη τελικά την εξέλιξη του όγκου.

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τον Δρ Φίλιπ Tucker για την παροχή του πλασμιδίου pcDNAI /NEO-5’HA-Foxp1A, Δρ Μπάρμπαρα Kee για τα MigR1-hE47 και MigR1-hE12 πλασμίδια, και ο Δρ William Πωλητές για το pcDNA3-GFP-FOXO1? πλασμίδιο ΑΑΑ.