Αφηρημένο

MAb 4C5 είναι ένα κύτταρο αδιαπέραστο, αντι-HSP90 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, αρχικά παράγονται με τη χρήση της τεχνολογίας υβριδώματος. Δείξαμε προηγουμένως ότι το mAb 4C5 αναγνωρίζει ειδικά τόσο την α- και σε μικρότερο βαθμό η β-ισομορφή της HSP90. Επιπλέον,

in vitro

και

in vivo

μελέτες αποκάλυψαν ότι με την επιλεκτική αναστολή της λειτουργίας του κυττάρου-επιφανείας HSP90, το mAb 4C5 παρεμποδίζει σημαντικά καρκινικών κυττάρων εισβολή και μετάσταση. Εδώ περιγράφουμε την ανασύσταση του mAb 4C5 σε ένα ποντικού-ανθρώπου χίμαιρα. Πιο σημαντικό να αναφέρουμε ότι το mAb 4C5 και, κατά συνέπεια, χιμαιρικό ομόλογό του είναι εντελώς άνευ βαριά αλυσίδα και αποτελείται μόνο από ένα λειτουργικό διμερές κάπα ελαφράς αλύσου. Το χιμαιρικό αντίσωμα φαίνεται να διατηρούν την εξειδίκευση και λειτουργικές ιδιότητες του αρχικού αντισώματος. Έτσι, είναι σε θέση να αναστέλλει την λειτουργία των επιφανειακών HSP90, οδηγώντας σε μειωμένη καρκινικών κυττάρων εισβολής

in vitro

. Τέλος, παρουσιάζουμε

in vivo

στοιχεία που αποδεικνύουν ότι το χιμαιρικό 4C5 αναστέλλει σημαντικά τον μεταστατικό σχηματισμό κατάθεση του MDA-MB-453 κύτταρα στους πνεύμονες των ποντικών SCID. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ένα χιμαιρικό αντίσωμα κάππα ελαφριά αλυσίδα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ενδεχομένως ως αντικαρκινικού παράγοντα, εισάγοντας έτσι ένα νέο τύπο του θραύσματος αντισώματος, με μειωμένη πιθανές δυσμενείς επιδράσεις ανοσογόνος, σε θεραπευτικές του καρκίνου

Παράθεση:. Σιδερά Κ, El Hamidieh Α, Μαμαλάκη Α, Patsavoudi Ε (2011) Το 4C5 κυττάρων αδιαπέραστο Anti-HSP90 αντισωμάτων με αντικαρκινική δραστηριότητα, αποτελείται από μια ενιαία αλυσίδα Φως Διμερές. PLoS ONE 6 (9): e23906. doi: 10.1371 /journal.pone.0023906

Επιμέλεια: Παύλος Γ Driscoll, MRC Εθνικό Ινστιτούτο Ιατρικής Έρευνας, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: May 11, 2011? Αποδεκτές: 28 Ιουλίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 1 Σεπ, 2011

Copyright: © 2011 Σιδερά et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

θερμικού σοκ πρωτεΐνη 90 (HSP90) θεωρείται πολύ ελκυστική ναρκωτικά στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου, δεδομένου ότι οι περισσότερες από τις πρωτεΐνες του πελάτη του παίζουν σημαντικό ρόλο στην απόκτηση ή /και τη συντήρηση του κακοήθους φαινοτύπου [1] – [4]. Πρόσφατα, εμείς και άλλοι έχουν εντοπίσει μια πισίνα του HSP90 στην κυτταρική επιφάνεια [5] – [8], όπου δείχθηκε να συμμετάσχει σε καρκινικές κυτταρικές εισβολή και τη μετάσταση [9] – [11]. Αύξηση στοιχεία συνεχίζουν να ενισχύσει την έννοια της ευρείας κλίμακας φαινομένου της εξωκυττάριας HSP90 συνοδό, που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου και μεταστατική εξάπλωση [12] – [16] έτσι την υποστήριξη της ανάπτυξης των αναστολέων που στοχεύουν συγκεκριμένα στην επιφάνεια των κυττάρων HSP90. MAb 4C5 είναι ένα κύτταρο αδιαπέραστο ποντικού μονοκλωνικό αντίσωμα που παράγεται με τη χρήση τεχνολογίας υβριδώματος [17], ότι αναγνωρίζει ειδικά τόσο την α και σε μικρότερο βαθμό η β ισομορφή του HSP90 [8]. MAb 4C5 αρχικά φαίνεται να αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση διεργασίες

in vitro

κατά την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος [18], [19] επηρεάζοντας κυτταροσκελετική ακτίνη αναδιάταξη και ο σχηματισμός των κινητικών δομών όπως ελασματοπόδια [8], [20]. Ακολούθως απόδειξη παρουσιάστηκε δείχνουν ότι με σύνδεση εκλεκτικώς προς την πισίνα επιφάνεια του HSP90, mAb 4C5 μειώνει σημαντικά κυττάρων μελανώματος εισβολή και μετάσταση [11]. Επιπλέον mAb 4C5 αποδείχθηκε ότι αναστέλλει την εξωκυτταρική αλληλεπίδραση μεταξύ HSP90 και του υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα ErbB-2 σε MDA-MB-453 κύτταρα καρκίνου του μαστού, που οδηγεί σε μειωμένη κατάντη σηματοδότησης και μειωμένη κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων και εισβολή [21]. Τέλος, το mAb 4C5 δείχθηκε να αναστέλλει μία λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ εκκρίνονται HSP90 και των ανενεργών μορφών μεταλλοπρωτεϊνασών 2 και 9, που απαιτούνται για την ενεργοποίηση των ενζύμων που είναι απαραίτητη για τον καρκίνο των κυττάρων εισβολή και εξαγγείωση [14]. Αυτά τα συνδυασμένα δεδομένα πρότειναν ότι η μοναδική ικανότητα του mAb 4C5 να αναστέλλουν ειδικά την εξωκυτταρική πισίνα του HSP90 χωρίς να επηρεάζεται η ευρύ φάσμα σημαντικών ενδοκυτταρικών ρόλων αυτής της συνοδού θα μπορούσαν να έχουν κλινικά οφέλη στη θεραπεία των ανθρώπινων κακοηθειών. Ωστόσο, ποντικού μονοκλωνικά αντισώματα δεν αποτελούν ιδανική θεραπευτικών παραγόντων, δεδομένου ότι οι δυνάμει ανοσογονικότητα τους συνιστά περιορισμό στην κλινική χρήση τους. Η εφαρμογή των mAb ποντικού για ανθρώπινη θεραπεία έχει καταστεί εφικτή με την έλευση των τεχνολογιών ανασυνδυασμένου DNA η οποία έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη των χιμαιρικών και εξανθρωπισμένων αντισωμάτων που παρουσιάζουν μειωμένη ανοσογονικότητα [22] χωρίς σημαντική απώλεια στη συγγένεια, ειδικά στην περίπτωση των χιμαιρικών αντισώματα [23], [24].

στην παρούσα εργασία περιγράφουμε την κλωνοποίηση και αλληλούχιση του mAb 4C5 γονιδίων από το οποίο προέρχονται κυτταρική γραμμή υβριδώματος και την επιτυχή κατασκευή ενός λειτουργικού ποντικού-ανθρώπου χίμαιρα, η οποία είναι φαίνεται να διατηρεί τις ιδιότητες του γονικού αντισώματος. Πιο σημαντικό αναφέρουμε ότι το mAb 4C5 είναι εντελώς άνευ βαριές (Η) α-αλυσίδα και αποτελείται από μόνο ένα λειτουργικό διμερές κάππα ανοσοσφαιρίνης ελαφριάς αλυσίδας και τις ιδιότητές του μπορούν να ανακεφαλαιωθούν στο μία ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη που περιέχει μόνο αυτό το φως (L) α-αλυσίδα πολυπεπτιδίου. Τέλος, καταδεικνύουν την πιθανή θεραπευτική αποτελεσματικότητα αυτού του νέου τύπου του θραύσματος αντισώματος.

Αποτελέσματα

MAb 4C5 είναι ένα θραύσμα αντισώματος εντελώς άνευ μιας βαριάς αλύσου

Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα του mAb 4C5 που μελετήθηκαν κάτω από αναγωγικές και μη αναγωγικές SDS-PAGE αποκάλυψε ότι δεν είναι μια συμβατική μόριο IgG. Πιο συγκεκριμένα, όταν καθαρισμένο mAb 4C5 υποβλήθηκε σε αναγωγική SDS-PAGE, ακολουθούμενη από ανοσοστύπωμα με αντι-Fab, δεν παρατηρήσαμε την τυπική 25 kDa και 50 kDa ζώνες που αντιστοιχούν στο L- και Η-αλυσίδα, αντίστοιχα ενός συμβατικού αντίσωμα IgG, αλλά αντ ‘αυτού ένα μόνο ζώνη στα περίπου 25 kDa (Εικ. 1Α). Είναι ενδιαφέρον ότι ένα πανομοιότυπο ζώνη των 25 kDa ελήφθη μετά ανοσοστύπωμα με αντίσωμα αντι-κάπα αλύσου L (Εικ. 1Α). Κατά συνέπεια, μετά μη αναγωγική ηλεκτροφόρηση ανοσοκηλιδώσεως με δύο από αυτές τις τυποποιημένες-αντισώματα, δείχνει mAb 4C5 να είναι σημαντικά μικρότερη από ό, τι ένα συμβατικό μόριο IgG 1, δεδομένου ότι μετανάστευσαν σε περίπου 50 kDa. (Εικ. 1Α). Τέλος, δεν ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε μετά από ηλεκτροφόρηση του mAb 4C5 υπό αναγωγικές και μη αναγωγικές συνθήκες, ακολουθούμενη από ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας ένα αντι-Ρογ (Εικ. 1Α). Αυτά τα συνδυασμένα δεδομένα έδειξαν ότι το mAb 4C5 μπορεί είτε να στερούνται ένα μέρος της Η-αλυσίδας της, ή ότι είναι εντελώς άνευ H-αλυσίδας. Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις δυνατότητες αυτές θα εκτελούνται την επόμενη ανάλυση κηλίδος northern χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή IgG1 Η-αλυσίδας. RNA προερχόμενο από κύτταρα υβριδώματος που παράγουν ένα άθικτη ανοσοσφαιρίνη IgG1 ονομάζεται 2D10 χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Σε αντίθεση με το θετικό μάρτυρα, καθόλου ραδιενέργεια ανιχνεύθηκε μετά από υβριδισμό των RNA που προέρχονται από το mAb 4C5 υβριδιώματος και NSO κύτταρα μυελώματος (αρνητικός έλεγχος) (Εικ. 1Β), υποδεικνύοντας ότι το mAb 4C5 μπορεί να στερούνται εντελώς ένα γονίδιο H-αλυσίδας. Αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με πειράματα ενίσχυση H αλυσίδα PCR. Για την ενίσχυση του cDNA αλύσου Η του mAb 4C5, ένα πάνελ οκτώ γενικών εκκινητών ποντίκι και ένα έναυσμα πολυΑ + αντίστοιχα κατευθύνονται έναντι του 5 ‘και 3’ άκρα του mRNA, δοκιμάστηκαν σε διάφορες ξεχωριστές αντιδράσεις PCR. Σε όλες τις συνθήκες που εξετάστηκαν δεν ενίσχυση ενός συγκεκριμένου προϊόντος Η-αλυσίδας παρατηρήθηκε (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Αυτά τα συνδυασμένα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το mAb 4C5 στερείται Η-αλυσίδας και επομένως προχώρησε στην ανασυνδυασμένη έκφραση του αντισώματος μόνο του Ε-αλυσίδας, προκειμένου να διερευνήσει τις ιδιότητές του.

A. Ηλεκτροφορητική ανάλυση του mAb 4C5, ακολουθούμενη από ανοσοστύπωμα με ένα κάππα αλυσίδα αντι-ποντικού, ένα Fab αντι-ποντικού και ενός αντισώματος αντι-Ρογ. Άθικτη ανοσοσφαιρίνη IgG1 που παράγονται από τα κύτταρα υβριδώματος 2D10 χρησιμεύει ως θετικός έλεγχος. Υπό αναγωγικές ηλεκτροφόρηση ακολουθούμενη από στύπωμα western με αντι-Fab αντίσωμα, ένα και μόνο 25 kDa-ανοσοαντιδραστική ζώνη παρατηρείται, αντί των ζωνών 25- και 50-kDa που αντιστοιχεί στο L- και Η-αλυσίδας, αντίστοιχα, μιας ανέπαφης IgG 1 . Αυτή η ζώνη 25 kDa είναι πανομοιότυπη με την ζώνη που αντιστοιχεί στο κάππα Ε-αλυσίδας όπως δείχνεται με κηλίδα western με το αντίσωμα κάππα αλυσίδα αντι-ποντικού. Υπό-μη αναγωγική ηλεκτροφόρηση ακολουθούμενη από στύπωμα western με τόσο αντι-κάπα και αντι-Fab αντισώματα, mAb 4C5 εμφανίζεται να μεταναστεύσουν σε περίπου 50 kDa, και όχι στα 150 kDa όπως αναμένεται για ένα άθικτο μόριο IgG1. Αριθ mAb 4C5 ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύεται μετά από ηλεκτροφόρηση υπό αναγωγικές και μη αναγωγικές συνθήκες που ακολουθείται από κηλίδα western με ένα αντίσωμα αντι-Ρογ. Στην περίπτωση της ανοσοσφαιρίνης IgG1 υπό τις ίδιες συνθήκες, μια 50 kDa και μία ζώνη 150 kDa παρατηρείται, αντίστοιχα. B. αριθ ραδιενέργεια ανιχνεύεται μετά από ανάλυση κηλίδος Northern του 4C5 υβριδιώματος RNA που προέρχεται με ένα ραδιοσημασμένο ανιχνευτή H-αλυσίδας. RNA που προέρχεται από τα κύτταρα υβριδώματος 2D10 IgG1 που παράγουν και τα κύτταρα μυελώματος NSO χρησίμευσε ως θετικός και αρνητικός έλεγχος, αντίστοιχα.

Η

Κατασκευή του χιμαιρικού αντισώματος L- αλύσου

Η αρχική ενίσχυση του γονιδίου κάππα αλυσίδας mAb 4C5 από την πρώτη μήτρα cDNA κλώνου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας γενικών εκκινητών ποντικού L-αλυσίδας σύμφωνα με Barbas [25]. Το προϊόν PCR που αντιστοιχεί στο πλήρες mAb 4C5 μήκους αλύσου L, στη συνέχεια υποκλωνοποιήθηκε στο φορέα pComb3H. Η ανάλυση της αλληλουχίας του ανασυνδυασμένου ί-αλυσίδας (rec-4C5) αποκάλυψε ότι ανήκει στην υποομάδα κάπα αλυσίδα Ι [26] (Σχ. 2).

νουκλεοτιδίων και αμινοξέων αλληλουχίες της μεταβλητής περιοχής L αλυσίδας του mAb 4C5.

η

το χιμαιρικό αντίσωμα Ε-αλυσίδας (CH-4C5) κατασκευάστηκε με αντικατάσταση του περιοχή κωδικοποίησης LCκ ποντίκι με το αντίστοιχο ένθετο ανθρώπινης LCκ. Η ανάλυση αλληλουχίας αρκετών ανασυνδυασμένων κλώνων επιβεβαίωσαν την επιτυχή κατασκευή του χιμαιρικού ποντικού-ανθρώπου αντίσωμα.

Τόσο rec-4C5 και CH-4C5 εκφράστηκαν στο βακτηριακό περιπλασμικό χώρο και καθαρίστηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι ηλεκτροφορητικές motilities των καθαρισμένων αντισωμάτων δοκιμάστηκαν κάτω από αναγωγικές και μη αναγωγικές συνθήκες και βρέθηκαν να είναι παρόμοια με την αντίστοιχη κινητικότητα του αρχικού mAb 4C5 αντίσωμα (Σχ. 3Α).

A.

Αριστερό πλαίσιο:

SDS-PAGE των καθαρισμένων αντισωμάτων κάτω από αναγωγικές συνθήκες που ακολουθείται από Coomasie Brilliant Blue R-χρώση αποκάλυψε σε όλες τις περιπτώσεις μια ταινία περίπου 25 kDa που αντιστοιχεί στην L-αλυσίδα.

Δεξιό πλαίσιο:

Υπό μη αναγωγικές συνθήκες τα αντισώματα φαίνονται να μεταναστεύσουν ως ένα διμερές L αλυσίδας. Β Western blot των κυτταρολυμάτων MDA-MB-453 χρησιμοποιώντας mAb 4C5, rec-4C5, ch-4C5 και ένα εμπορικό αντίσωμα αντι-HSP90α, που χρησιμεύει ως θετικός έλεγχος. Σε όλες τις περιπτώσεις παρατηρείται μια ενιαία 90 kDa ανοσοδραστική ζώνη που αντιστοιχεί στο HSP90. Γ ανοσοκατακρήμνιση στα κυτταρολύματα MDA-MB-453 με αντι-HSP90α, ακολουθούμενη από ανοσοστύπωμα είτε με ποντικού ή ανασυνδυασμένων αντισωμάτων. Σε όλες τις περιπτώσεις παρατηρείται μια ενιαία ανοσοδραστική ζώνη. Δ Αντίστροφα πειράματα ανοσοκατακρήμνισης σε προϊόντα λύσης κυττάρου ΜϋΑ-ΜΒ-453 χρησιμοποιώντας mAb 4C5, rec-4C5 και CH-4C5, που ακολουθήθηκε από στύπωμα Western με αντι-HSP90α. Σε όλες τις περιπτώσεις, ένας μεμονωμένος ανοσοδραστική ζώνη παρατηρείται υποδεικνύοντας ότι και τα δύο ανασυνδυασμένα αντισώματα αναγνωρίζουν HSP90.

Η

CH-4C5 αναγνωρίζει ειδικά HSP90

Για να εξερευνήσετε την ειδικότητα των αντισωμάτων, western blot ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε MDA-MB-453 προϊόντα λύσης κυττάρων καρκίνου του μαστού χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-HSP90α (Chemicon International, USA), το mAb 4C5, rec-4C5 και CH-4C5. Σε όλες τις περιπτώσεις παρατηρήθηκε μία μόνο ταυτόσημα ανοσοδραστική ζώνη (Εικ. 3Β), επιβεβαιώνοντας ότι οι δύο rec-4C5 και CH-4C5 διατηρούν την ειδικότητα του mAb 4C5 πατρικής. Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με πειράματα ανοσοκαθίζησης που εκτελούνται σε προ-διαυγασμένα λύματα κυττάρων MDA-MB-453 χρησιμοποιώντας αντι-HSP90α, ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση με mAb 4C5, rec-4C5 ή CH-4C5. Σε όλες τις περιπτώσεις, ένας απλός ανοσοδραστική ζώνη παρατηρήθηκε, υποδεικνύοντας ότι το χιμαιρικό Ε-αλυσίδας ειδικώς αναγνωρίζουν HSP90 (Σχ. 3C). Το ίδιο αποτέλεσμα ελήφθη όταν ανοσοκαθίζηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας mAb 4C5, rec-4C5 και CH-4C5 που ακολουθείται από κηλίδα western με αντι-HSP90α αντίσωμα (Σχ. 3D). Σε όλα τα πειράματα μια άσχετη IgG ποντικού χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας.

CH-4C5 είναι κύτταρο-αδιαπέραστο και δεν επηρεάζει τη λειτουργία της ενδοκυτταρικής HSP90

Για να διερευνηθεί κατά πόσο CH-4C5 δεσμεύεται στην επιφάνεια HSP90, μη σταθεροποιημένα κύτταρα MDA-MB-453 επωάστηκαν είτε με rec-4C5 ή CH-4C5 ενώ σε καλλιέργεια. Έτσι, τα αντισώματα είχαν πρόσβαση μόνο στην εξωτερική επιφάνεια των κυττάρων. Μετά την επώαση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για έμμεσο ανοσοφθορισμό χρησιμοποιώντας ένα φθοριζόντως-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα. Η παρατηρούμενη τυπική ανοσοχρώση στικτή επιβεβαίωσε την επισήμανση επιφάνεια του κυττάρου (Εικ. 4Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν χρησιμοποιώντας αντι-HSP90α και mAb 4C5 (Σχ. 4Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι παρόμοια με το mAb 4C5, CH-4C5 καθώς επίσης και rec-4C5 αναγνωρίζουν επίσης την ενδοκυτταρική ομάδα του HSP90, όπως καταδεικνύεται από ανοσοφθορισμού μετά στερέωση και διαπερατοποίηση των κυττάρων MDA-MB-453 κύτταρα (Σχ. 4Β). Τέλος, η δέσμευση των αντισωμάτων να ζήσουν ΜϋΑ-ΜΒ-453 κύτταρα παρακολουθήθηκε σε διάφορα χρονικά διαστήματα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4C, παρόμοια με mAb 4C5, rec-4C5 και CH-4C5 δεν εσωτερικεύεται και παρέμεινε δεσμευμένη στην επιφάνεια των κυττάρων για μέχρι 24 ώρες σε καλλιέργεια.

Α. επισήμανση ανοσοφθορισμού των MDA-MB-453 κύτταρα χρησιμοποιώντας τόσο το rec-4C5 και CH-4C5. Η ανοσοσήμανση στικτή δείχνει την πισίνα επιφάνειας της HSP90. Οι αρνητικοί έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον της ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης β τουμπουλίνης (δεδομένα μη δεικνυόμενα). Ράβδος κλίμακας: 20 μm Β ανοσοφθορισμού ανίχνευση της ενδοκυτταρικής HSP90 σε σταθεροποιημένα κύτταρα MDA-MB-453, διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100. Ομοίως με το μυϊκό αντίσωμα, rec-4C5 και CH-4C5 αναγνωρίζουν την ενδοκυτταρική ομάδα του HSP90. Κλίμακα bar: 20 μm C. Για την ανίχνευση της εσωτερίκευσης αντισωμάτων, ζωντανά κύτταρα επωάστηκαν με τα αντισώματα για διάφορα χρονικά διαστήματα, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν, κατέστησαν διαπερατά και φθοριζόντως επισημασμένο. Αριθ εσωτερίκευση των mAb4C5, rec-4C5 και CH-4C5 παρατηρείται ακόμη και μετά από 24 ώρες επώασης. Σε αντίθεση το αντίσωμα αντι-HSP90α μπορούσε να ανιχνευθεί ενδοκυτταρικά μετά από 24 ώρες επώασης. Κλίμακα bar: 20 μm κυτταρολύματα D. MDA-MB-453, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με mAb 4C5, rec-4C5, ch-4C5 και αντι-HSP90α αναλύθηκαν με κηλίδα western χρησιμοποιώντας αντισώματα εναντίον ErbB2, Akt, cRaf και HSP90α. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Παρουσία του mAb 4C5, rec-4C5 και CH-4C5 δεν επηρέασε τα επίπεδα των κινασών σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Σε αντίθεση το διαπερατό κύτταρο αντίσωμα αντι-HSP90α μείωσε σημαντικά τα επίπεδα του ErbB2, Akt και cRaf.

Η

Η σημασία του CH-4C5 κύτταρο-αδιαπερατότητα ερευνήθηκε με παρακολούθηση των επιπέδων ενός υποσυνόλου των ενδοκυτταρικών HSP90 πρωτεΐνες πελάτη. Μέχρι σήμερα έχουν περισσότερα από 100 ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες πελάτης HSP90 έχουν ταυτοποιηθεί. Κυττάρου-διαπερατό αναστολείς της HSP90 διεγείρει την αποδόμηση αυτών των πρωτεϊνών, επειδή η σταθερότητα τους εξαρτάται από την ενδοκυτταρική λειτουργία της HSP90 [3]. Από τα δεδομένα μας πρότειναν ότι το mAb 4C5 και στη συνέχεια rec-4C5 και CH-4C5 είναι κύτταρο αδιαπέραστα, εξετάσαμε την ικανότητά τους να επηρεάσουν τη σταθερότητα των τριών καλά χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες πελάτη HSP90, Akt, cRaf και ErbB-2. Μετά την επώαση των κυττάρων MDA-MB-453 κυττάρων με διαφορετικές συγκεντρώσεις του mAb 4C5, rec-4C5 και CH-4C5, τα επίπεδα της Akt, cRaf και ErbB2 παρακολουθήθηκαν με κηλίδωση Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4D αυτά τα αντισώματα δεν επηρέασε τα επίπεδα σταθερής κατάστασης της οποιασδήποτε από τις κινάσες που μελετήθηκαν. Σε αντίθεση, όταν τα κύτταρα επωάστηκαν με το κύτταρο διαπερατό αντι-HSP90α, τα επίπεδα έκφρασης αυτών των κινασών μειώθηκαν σημαντικά (Εικ. 4D).

CH-4C5 αναστέλλει καρκινικό κύτταρο εισβολή

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το mAb 4C5 αναστέλλει MDA-MB-453 καρκίνου του μαστού και Β16 F10 εισβολή κυττάρων μελανώματος σε προσδιορισμό επούλωσης τραυμάτων [11], [21]. Για να επιβεβαιωθεί ότι CH-4C5 παρουσιάζει την ίδια λειτουργική ιδιότητα, πραγματοποιήσαμε

in vitro

επούλωσης πληγών δοκιμασίες χρησιμοποιώντας MDA-MB-453 και τα καρκινικά κύτταρα Β16 F10. Καλλιέργειες ελέγχου αναπτύχθηκαν είτε σε μέσο καλλιέργειας μόνο ή σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει 200 ​​μg /ml του άσχετο αντίσωμα ΒΜ88. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε μεταξύ των δύο τύπων των ελέγχων που χρησιμοποιείται. Η μέση τιμή των δύο τύπων ελέγχου θεωρήθηκε ως 100% του κλεισίματος του τραύματος. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, Β η παρουσία του ch-4C5 στο μέσο καλλιέργειας μείωσε σημαντικά την έκταση του MDA-MB-453 εισβολή καρκινικών κυττάρων εντός του διακένου μετανάστευση μετά από 24 ώρες, σε σύγκριση με τις καλλιέργειες ελέγχου. Πιο συγκεκριμένα, η παρουσία του ch-4C5 είχε ως αποτέλεσμα μια αναστολή 46% του κλεισίματος του τραύματος, η οποία ήταν παρόμοια με αυτή που λαμβάνεται όταν ο αντι-HSP90α, καθώς και mAb 4C5 και rec-4C5 συμπεριλήφθηκαν στο μέσο καλλιέργειας (Σχ. 5Α ,ΣΙ). Οι ράβδοι στο σχ. 5Β αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± SEM. Μέσα σε ένα μόνο πείραμα, κάθε κατάσταση εξετάστηκε εις τριπλούν. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με τη χρήση κυττάρων μελανώματος Β16 F10 και αυξανόμενες συγκεντρώσεις CH-4C5 που απέδωσε ένα δοσοεξαρτώμενη αναστολή του κυτταρικού εισβολής (Εικ. 5C, D). Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι στην πληγή επούλωση δοκιμασία το αποτέλεσμα του CH-4C5 κατευθύνεται προς κύτταρο εισβολή και όχι πολλαπλασιασμού κυττάρων όπως κρίνεται από μία ανεξάρτητη δοκιμασία ΜΤΤ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό είναι σύμφωνα με τα προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η παρουσία του mAb 4C5 στο μέσο καλλιέργειας του Β16 F10 [11] και MDA-MB-453 [21], δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, δεδομένου ότι χαμηλή ενσωμάτωσης BrdU παρατηρήθηκε με μη εμφανή διαφορές στην απουσία ή την παρουσία του αντισώματος.

A. Πληγή δοκιμασία επούλωσης. Οι φωτογραφίες αντιπροσωπεύουν εικόνες αντίθεσης φάσης που ελήφθη σε χρόνο μηδέν (αριστερό πάνελ) και στις 24 ώρες (δεξί πάνελ) μετά το σχηματισμό μηδέν, δείχνοντας την κυτταρική μετανάστευση MDA-MB-453 είτε σε καλλιέργειες ελέγχου ή καλλιέργειες συμπεριλαμβανομένων των αντι-HSP90α, mAb 4C5, REC- 4C5 ή CH-4C5. μπαρ κλίμακας: 200 μm. B. Η ποσοτική επίδραση των αντισωμάτων για το κλείσιμο του τραύματος. Η προσθήκη 200 μg /ml του αντι-HSP90α και mAb 4C5 στο μέσο καλλιέργειας είχε ως αποτέλεσμα μια 48% και 55% μείωση του κλεισίματος του τραύματος, αντίστοιχα, σε σύγκριση με καλλιέργειες ελέγχου που θεωρήθηκαν ως αποτέλεσμα την κλείσιμο του τραύματος 100%. Η προσθήκη 200 μg /ml rec-4C5 και CH-4C5 στο μέσο καλλιέργειας είχε ως αποτέλεσμα μια 46% και 46% αναστολή του κλεισίματος του τραύματος, αντίστοιχα. Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών εκτιμήθηκε με το t τεστ Student. Η παρουσία των αντι-HSP90α, mAb 4C5, rec-4C5 ή CH-4C5 είχε στατιστικά σημαντική επίδραση σχετικά με το κλείσιμο του τραύματος (ρ & lt? 0,01 σε κάθε περίπτωση). εικόνες Γ Φάση αντίθεσης ελήφθη σε χρόνο μηδέν (αριστερό πάνελ) και στις 24 ώρες μετά το σχηματισμό μηδέν (δεξιός πίνακας), που δείχνει Β16 F10 εισβολή των κυττάρων του μελανώματος σε ένα τραύμα δοκιμασία επούλωσης με την παρουσία 200 μg /ml του ch-4C5. μπαρ κλίμακας: 200 μm. Δ ποσοτική επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων CH-4C5 στο επίπεδο εισβολή Β16 κύτταρα μελανώματος F10. Παρουσία 50 μg /ml CH-4C5 είχε ως αποτέλεσμα 15% αναστολή της εισβολής, ενώ προσθήκη 100 μg /ml και 200 ​​μg /ml ch 4C5 είχε ως αποτέλεσμα 21% και 43% αναστολή της μετανάστευσης, αντίστοιχα, σε σύγκριση με καλλιέργειες ελέγχου που ήταν θεωρείται ότι οδηγούν σε κλείσιμο των πληγών 100%. Ε Οπτικοποίηση των νεκρών κυττάρων, χρησιμοποιώντας trypan μπλε χρωστική. Σε ch 4C5-καλλιέργειες που κατεργάζονται, η συχνότητα εμφάνισης κυτταρικού θανάτου είναι παρόμοια με αυτή που παρατηρείται σε καλλιέργειες ελέγχου. Αντίθετα, στις καλλιέργειες που έλαβαν θεραπεία με το αντίσωμα αντι-HSP90α, ένας πολύ μεγαλύτερος αριθμός κυττάρων βάφονται με Trypan blue, υποδεικνύοντας αυξημένη συχνότητα Ράβδος κλίμακας κυτταρικού θανάτου, 30 μm. F. Έλεγχος και CH-4C5 επεξεργασμένα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν διαπερατά και υπέστησαν χρώση με επισημασμένο με φθορισμό φαλλοϊδίνη. Γραμμή κλίμακας 40 μm Γ Μεγαλύτερη μεγέθυνση δείχνει χρώση phalloidin (F-ακτίνη). Ch-4C5 αναστέλλει αποτελεσματικά την εξάπλωση του ελασματοπόδια. Ράβδος κλίμακας: 16 μm

Η

Σε αυτό το σημείο θα πρέπει να σημειωθεί ότι η ανασταλτική επίδραση του αντισώματος αντι-HSP90α σχετικά με το ποσοστό εισβολή MDA-MB-453 ήταν σε μεγάλο μέρος οφείλεται σε αυξημένο κυτταρικό θάνατο. όπως κρίνεται από χρώση trypan blue, τα οποία επιλεκτικά χρώματα νεκρά κύτταρα (Σχ. 5Ε). Αντίθετα, όταν οι καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε αγωγή με mAb 4C5 και CH-4C5, η επίπτωση του θανάτου των κυττάρων ήταν παρόμοια με εκείνη που παρατηρήθηκε στις καλλιέργειες ελέγχου (Σχ. 5Ε). Αυτό το αποτέλεσμα υποστηρίζει περαιτέρω ότι CH-4C5, σε αντίθεση με την κυτταρική διαπερατό αντι-HSP90α αντίσωμα, είναι κύτταρο αδιαπέραστο και δεν επηρεάζει την ενδοκυτταρική ομάδα του HSP90, η οποία είναι σημαντική για την επιβίωση των κυττάρων.

Τέλος αυτοί καλλιέργειες εξετάσθηκαν σε σχέση προς ακτίνη δυναμική αναδιάταξη χρησιμοποιώντας σημασμένο με φθορισμό φαλλοειδίνη. MDA-MB-453 κύτταρα εκτίθενται σε CH-4C5 ήταν λιγότερο εξάπλωση σε σύγκριση με κύτταρα σε καλλιέργειες ελέγχου, και η μορφολογία τους ήταν ενδεικτική της μη κινητήριος κύτταρα. Επιπλέον, όταν οπτικοποιείται σε μια μεγαλύτερη μεγέθυνση, η ελασματοπόδια σε αγωγή καλλιέργειες ήταν λιγότερο ανεπτυγμένες και λιγότερο απλώνονται σε σύγκριση με ελασματοπόδια σε καλλιέργειες ελέγχου (Σχ. 5 F, G). Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα σχετικά με την επίδραση του mAb 4C5 σε ακτίνη αναδιάταξη και ανάπτυξη ελασματοπόδια [21].

CH-4C5 μειώνει τον μεταστατικό απόθεση MDA-MB-453 εντός των πνευμόνων του SCID ποντίκια

Είμαστε δίπλα προσπάθησε να διερευνήσει το

in vivo

επίδραση του ch-4C5 για τη μεταστατική συμπεριφορά των MDA-MB-453 κυττάρων καρκίνου. Για το σκοπό αυτό, MDA-MB-453 κύτταρα προ-κατεργασμένα ή μη με 200 μg /ml CH-4C5 και στη συνέχεια επισημαίνονται με τη φθορίζουσα χρωστική Δίωνα και από ενίεται ενδοφλεβίως σε ποντίκια SCID μέσω της φλέβας της ουράς. Δώδεκα ώρες μετά την ένεση, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι μεταστατικές αποθέσεις των κυττάρων MDA-MB-453 κύτταρα εντοπίστηκαν και αξιολογήθηκαν στους πνεύμονες τόσο του ελέγχου και το CH-4C5-αγωγή ομάδες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, μια σημαντική μείωση στην απόθεση των κυττάρων MDA-MB-453 κύτταρα ανιχνεύθηκε στο CH-4C5 ποντικούς που υπέστησαν αγωγή σε σύγκριση με τα ζώα ελέγχου. Πιο συγκεκριμένα, την ποσοτικοποίηση του σχηματισμού μεταστατικού κατάθεση έδειξε μια αναστολή 38% στο CH-4C5 ποντικούς που υπέστησαν αγωγή σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου (Εικ. 6Β).

Control ή CH-4C5 αγωγή MDA-MB-453 κύτταρα σημάνθηκαν με την φθορίζουσα χρωστική Δίωνα και από ένεση σε ποντίκια SCID, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Αξιολόγηση των μεταστατικών καταθέσεων διεξήχθη αρκετές ώρες αργότερα. Α Εκπρόσωπος κρυοτομές των πνευμόνων του ελέγχου και CH-4C5 ποντίκια με αγωγή. Τα βέλη δείχνουν MDA-MB-453 κύτταρα βάφονται με τον Dio που υπάρχουν στον ιστό του πνεύμονα. Μια σημαντική μείωση στην απόθεση των καρκινικών κυττάρων παρατηρήθηκε στους πνεύμονες των ποντικών που υπέστησαν αγωγή ch-4C5. Ράβδος κλίμακας: 100 μm Β ποσοτική επίδραση του ch-4C5 στην μεταστατική απόθεση του MDA-MB-453 κύτταρα μέσα στους πνεύμονες, έδειξε μια αναστολή 38% σε σύγκριση με τα ζώα ελέγχου. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο δύο ανεξάρτητων πειραμάτων ± SEM. Η στατιστική σημασία των διαφορών ελέγχθηκε με δοκιμή t του Student (ρ & lt? 0,01).

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, περιγράφουμε την κλωνοποίηση και αλληλούχιση ενός μονοκλωνικού αντισώματος αντι-ποντικού HSP90 , που ονομάστηκε mAb 4C5. Το πιο σημαντικό, έχουμε αποδείξει ότι το mAb 4C5 δεν είναι ένα συμβατικό μόριο IgG, αλλά, αντίθετα, είναι εντελώς άνευ μιας Η-αλυσίδας και μόνο αποτελείται από ένα διμερές ελαφράς αλύσου κ. Το εύρημα αυτό υποστηρίζεται αρχικά με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE υπό μετουσιωτικές και μη μετουσιωτικές συνθήκες, αποδεικνύοντας ότι το mAb 4C5 μεταναστεύει αντισυμβατικά σε περίπου 26- και 50-kDa, αντίστοιχα. Επιπλέον, όταν το ολικό RNA απομονώθηκε από το mAb 4C5 που παράγει κυτταρική γραμμή υβριδώματος υποβλήθηκε σε υβριδοποίηση αποτυπώματος βόρειο χρησιμοποιώντας ένα IgG1 cDNA αλύσου Η ραδιο-σημασμένο ανιχνευτή, δεν μπορούσε να ανιχνευθεί ραδιενέργεια. Σε συμφωνία με τα ανωτέρω αποτελέσματα, όταν προσπαθήσαμε να ενισχυθεί το cDNA της αλύσου Η χρήση γενικών εκκινητών της αλύσου Η ποντικού δεν θα μπορούσαμε να απομονώσουμε ένα προϊόν Η-αλυσίδας σε όλες τις συνθήκες που δοκιμάστηκαν. Τέλος, η ασυνήθιστη φύση του mAb 4C5 επιβεβαιώθηκε πέρα ​​από κάθε αμφιβολία, αφού το ανασυνδυασμένο κάπα L-αλυσίδα που εκφράζεται σε βακτήρια έδειξε να διατηρήσει όλες τις ιδιότητες του πατρικού αντισώματος, συμπεριλαμβανομένης της σύνδεσης αντιγόνου και

in vitro αναστολή της

καρκινικών κυττάρων εισβολής.

Αυτό το μονοκλωνικό αντίσωμα έχει παραχθεί αρχικά με ανοσοποίηση ποντικών με ένα κλάσμα μεμβράνης εγκεφάλου προερχόμενο από 15 έμβρυα ημερών αρουραίου [17], και δείχθηκε να αναγνωρίζει ειδικώς και αναστέλλουν την λειτουργία του επιφανειακά HSP90 κατά τις διεργασίες κυτταρικής μετανάστευσης [8]. Επιπλέον, το mAb 4C5 είχε αποδειχθεί ότι μειώνει σημαντικά το ποσοστό της εισβολής και της μετάστασης των καρκινικών κυττάρων. Ειδικότερα, αποδείχθηκε ότι αυτό το αντίσωμα αναστέλλει κυττάρων μελανώματος εισβολή και μετάσταση [11], καθώς και την αλληλεπίδραση της επιφάνειας HSP90 με τον εξωκυτταρικό τομέα του ErbB-2, που οδηγεί σε μειωμένη κατάντη σηματοδότησης και ακολούθως μειωμένο ποσοστό

in vitro

των καρκινικών κυττάρων του μαστού εισβολή [21]. Ακόμη πιο πρόσφατα, σανίδες et al. [14] υπό την προϋπόθεση

in vitro

και

in vivo

στοιχεία που δείχνουν ότι το mAb 4C5 αναστέλλει έμμεσα την ενεργοποίηση του προ-ζελατινασών ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, είναι αναγκαίο για τον καρκίνο των κυττάρων εισβολή, εξαγγείωση και μετάσταση. Αυτά τα συνδυασμένα δεδομένα υποστηρίζονται περαιτέρω την ιδέα ότι το mAb 4C5 θα μπορούσε να είναι χρήσιμη ως θεραπευτικό του καρκίνου και προσανατολισμένες μελέτες μας προς τον προσδιορισμό της αλληλουχίας αμινοξέων και ανασυνδυασμένη έκφραση αυτού του αντισώματος.

Είναι γνωστό ότι αντισώματα ποντικού έχουν περιορισμένη χρησιμοποιήσετε για

in vivo

θεραπεία σε ανθρώπους λόγω της ανοσογονικότητα τους. Σε πολλές εμφανίσεις αυτό το πρόβλημα έχει ξεπεραστεί με τη χρήση της γενετικής μηχανικής προσεγγίσεις για την παραγωγή χιμαιρικών ποντικού-ανθρώπου και πλήρως εξανθρωπισμένα αντισώματα. Λαμβάνοντας υπόψη την μη συμβατική φύση του mAb 4C5 σε συνδυασμό με το γεγονός ότι κατά τη διάρκεια της διαδικασίας εξανθρωπισμού η συγγένεια αντισώματος συχνά μειώνεται, έχουμε την επόμενη ανασυσταθεί το mAb ποντικού 4C5 σε ένα λειτουργικό χιμαιρικό εκδοχή ποντικού-ανθρώπου που, όπως ο πατρικός αντίσωμα, συνδέεται με επιφάνεια HSP90, είναι κύτταρο αδιαπέραστο και αναστέλλει καρκινικών κυττάρων εισβολή. Το χιμαιρικό αντίσωμα που κατασκευάστηκε με αντικατάσταση της περιοχής Cκ- του πατρικού αντισώματος ποντικού με την αντίστοιχη ανθρώπινη Οκ-περιοχή δείχθηκε να διατηρούν την εξειδίκευση και συγγένεια του πατρικού αντισώματος ποντικού.

Έχει μια γενικά αποδεκτή έννοια ότι το μόριο του αντισώματος απαιτεί τόσο την Η- και Ε-αλυσίδων για την πλήρη δραστικότητα του [27]. Επιπλέον, η Η-αλυσίδα πιστεύεται ότι είναι η κυρίαρχη συνεισφέρων στην ελεύθερη ενέργεια της πρόσδεσης ενώ η συμβολή του Ε-αλυσίδας υποτίθεται αντιγόνο πρέπει να περιορίζεται [28], [29]. Η τελευταία ιδέα υποστηρίζεται περαιτέρω από το γεγονός ότι διαθέτει μια cameloids τάξη πλήρως λειτουργικών αντισωμάτων που στερούνται εντελώς L-αλυσίδες και αποτελούνται από διμερή Η-αλυσίδας [30], [31]. Στο πλαίσιο αυτών των ευρημάτων, Η-αλυσίδες μόνες δείχθηκε να αλληλεπιδρά με μία ποικιλία αντιγόνων με ειδικό τρόπο (αν και με χαμηλότερη συγγένεια από την ακέραια αντισώματα), η οποία έχει οδηγήσει στην εφαρμογή των αντισωμάτων μονήρους θέσης που προέρχονται από τα H-αλυσίδες [32] στην έρευνα, η βιοτεχνολογία καθώς και ανθρώπινα θεραπευτικά. Στο παρελθόν, υπήρξαν σποραδικές αναφορές σύνδεσης αντιγόνου από την L-αλυσίδων. Τα πρώτα δείγματα της ελεύθερης αφορούσε τις λεγόμενες πρωτεΐνες Bence-Jones φως inmmunoglobulin αλυσίδες. Αυτές αναφέρθηκαν ως διμερή L-αλυσίδα που εκφράζεται από πολλαπλούς κύτταρα μυελώματος, τα οποία συλλέγονται από τα ούρα των ασθενών ανθρώπων [33]. Επιπλέον, μεγάλες ποσότητες L-αλυσίδες βρέθηκαν να συσσωρεύονται στα εξωκυττάρια υγρά και τους ιστούς των ασθενών με όγκους που εκκρίνουν L-αλυσίδα [34]. Ένα διμερές κάπα ελαφράς αλύσου με εξειδίκευση αντιγόνου CD4 που προέρχεται από μία κυτταρική γραμμή υβριδώματος περιγράφηκε το 1987 από τον Ledbetter et al. [35] και το 1994 Mei Sun et al [36] ανέφεραν ότι ένα καθαρισμένο Ε-αλυσίδας από ένα μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι αγγειοδραστικό εντερικό πολυπεπτίδιο (VIP) εμφανίζεται αλληλουχία-ειδικά και πρόσδεση σε VIP υψηλής συγγένειας. Κατά συνέπεια, Nishimura et al. [37] ανέφεραν την παραγωγή ενός ανασυνδυασμένου λ ελαφριά αλυσίδα εμφανίζουν σημαντικά υψηλότερη δραστικότητα σύνδεσης προς το αντιγόνο σε σύγκριση με το άθικτο αντίσωμα. Επιπλέον, οι συγγραφείς παρουσίασαν στοιχεία ότι αυτή η ανασυνδυασμένη ελαφριά αλυσίδα θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ένα δυνητικά χρήσιμο όχημα για κλινική χρήση, όπως ραδιο-ανοσοεικόνισης και ράδιο-ανοσοθεραπεία των καρκίνων του πνεύμονα. Έχει επίσης αναφερθεί ότι διμερή αντίσωμα Ε-αλυσίδας που παράγεται από ένα υβρίδωμα ποντικού αντιδρούν με τους ανθρώπινους ιστούς μελανώματος [38]. Το 1998, Pereira et al. [39] έδειξε ότι μια ενιαία L-αλύσου μεταβλητή αλληλουχία περιέχει όλα τα απαραίτητα για την καρδιολιπίνη δέσμευσης, με μια συγγένεια παρόμοια με εκείνη του ακέραιου αντισώματος καθοριστικούς παράγοντες. Πιο πρόσφατα, Dubnovitsky et al. [40] ανέφεραν ότι το ανασυνδυασμένο V

Ε-περιοχή ενός μονοκλωνικού αντισώματος έναντι της φερριτίνης διατηρημένα λειτουργία του δέσμευσης αντιγόνου με συγγένεια συγκρίσιμη με εκείνη του γονικού αντισώματος πλήρους μήκους.

Στην παρούσα εργασία έχουν αποδείξει ότι CH-4C5 είναι εντελώς άνευ βαριάς αλυσίδας και αποτελείται από ένα διμερές L αλυσίδας. CH-4C5 έχει υψηλή ειδική δραστικότητα, όπως καταδεικνύεται από ανοσοστύπωμα και ανοσοφθορισμού πειράματα χρησιμοποιώντας κύτταρα καρκίνου του μαστού. Επιπλέον, και παρόμοια με το πατρικό αντίσωμα CH-4C5 εκθέματα λειτουργία αποκλεισμού ιδιότητες όπως κρίνεται από το

in vitro

πληγή δοκιμασία επούλωσης. Τέλος, χρησιμοποιώντας ένα

in vivo δοκιμασία

δείξαμε ότι CH-4C5 μειώνει την μεταστατική εναπόθεση των κυττάρων MDA-MB-453 κύτταρα καρκίνου του μαστού στους πνεύμονες των ποντικών SCID.

Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν μια νέα προοπτική για την κλινική εφαρμογή αντισωμάτων L-αλυσίδας σε θεραπευτικά του καρκίνου. Ανασυνδυασμένα αντισώματα Ε-αλυσίδας έχουν ένα αριθμό πλεονεκτημάτων έναντι άθικτα αντισώματα και V

αντισώματα H όταν προορίζονται για ανθρώπινη θεραπευτική, δηλαδή σχετικά εύκολη και επαναλήψιμη παραγωγή, τις διαδικασίες ελέγχου ποιότητας, και ταχύτερη κάθαρση από την κυκλοφορία. Τέλος από μια κλινική άποψη, επιφάνεια HSP90 παρέχει μια νέα και πολλά υποσχόμενη εξωκυτταρικό στόχο φαρμάκου για την αποτελεσματική αγωγή του μεταστατικού καρκίνου. Σε αυτό το πλαίσιο, η ικανότητα των CH-4C5 να αναστέλλει επιλεκτικά τη λειτουργία της πισίνας επιφάνειας της HSP90, όπως υποδεικνύεται από το

in vitro

και

in vivo

στοιχεία που παρουσιάζονται στην παρούσα εργασία, χωρίς να παρεμβαίνει με την HSP90 ενδοκυτταρική λειτουργία, καθιστά αυτό το τμήμα αντισώματος μια πιθανή καρκίνο θεραπευτική.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλες οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με την εθνική και διεθνή κατευθυντήριες γραμμές και ειδική έγκριση από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ (άδεια No: Κ /533, Διεύθυνση κτηνιατρικής Περιφέρειας Αττικής). SCID ποντίκια είχαν αρχικά αγοράστηκαν από Jackson Laboratory, που εκτρέφονται και διατηρούνται υπό συγκεκριμένες συνθήκες χωρίς παθογόνα στη Μονάδα Ζώων Πειραματική του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ.