Αφηρημένο

Πολύ ανευπλοειδικών όγκοι είναι κοινή σε επιθηλιακά καρκίνους των ωοθηκών (EOC). Ερευνήσαμε αν η έκφραση ΝυΜΑ συνδέθηκε με το φαινόμενο αυτό.

επίπεδα πρωτεΐνης ΝυΜΑ σε φυσιολογικών και καρκινικών ιστών, κυτταρικές σειρές ωοθηκών και πρωτογενείς καλλιέργειες των κακοηθών κυττάρων που προέρχονται από υγρά ασκίτου των ωοθηκών αναλύθηκαν με ανάλυση μικροσυστοιχιών Affymetrix, ανοσοκηλίδωση, ανοσοϊστοχημεία (IHC) και ανοσοφθορισμού (IF), με τα αποτελέσματα συσχετίζονται με τις συναφείς κλινικά δεδομένα. Η ανευπλοειδία κατάσταση σε πρωτογενείς καλλιέργειες προσδιορίσθηκε με ανάλυση FACS.

Affymetrix δεδομένα μικροσυστοιχιών έδειξαν ότι ΝυΜΑ υπερεκφράζεται σε καρκινικό ιστό, πρωτογενείς καλλιέργειες και κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό ωοθηκών. IHC αποκάλυψε χαμηλή προς ασθενή έκφραση ΝυΜΑ σε φυσιολογικούς ιστούς. Η έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά σε όγκους, με μια σημαντική συσχέτιση με το στάδιο της νόσου σε βλεννώδες EOC υποτύπους (p = 0,009), εμπλοκή λεμφαδένων (ρ = 0,03) και την ηλικία του ασθενούς (ρ = 0.04). Πρόσθετη ανάλυση ασυνεχής δεδομένων αποκάλυψε ότι τα υψηλά επίπεδα ΝυΜΑ σε όγκους μειώθηκε με βαθμό (p = 0.02), αλλά αυξήθηκε με το στάδιο της νόσου (p = 0.04) στο ορώδες ΕΓΚ. έκφραση ΝυΜΑ μειώθηκε στα τέλη της νόσου EOCs στάδιο 4 ενδομητριοειδές. Υψηλά επίπεδα ΝυΜΑ μειώθηκε με την αύξηση εισβολή όγκου σε όλους τους υποτύπους (p = 0.03). ΑΝ πρωτογενών καλλιεργειών έδειξε ότι τα υψηλά επίπεδα ΝυΜΑ σε μιτωτική πόλους της ατράκτου συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με μειωμένη αναλογία των κυττάρων σε κυτοκίνηση (p = 0.05), αυξημένη binucleation (p = 0.021) και πολυπυρήνωση (p = 0,007), και ανευπλοειδία (p = . 0.008)

ΝυΜΑ εκφράζεται έντονα σε όγκους EOC και τα υψηλά επίπεδα ΝυΜΑ συσχετίζονται με την αύξηση του μιτωτική ελαττώματα και ανευπλοειδία σε πρωτογενείς καλλιέργειες

Παράθεση:. Bruning-Richardson Α, Bond J, Alsiary R , Richardson J, Cairns DA, McCormac L, et al. (2012) ΝυΜΑ υπερέκφραση σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 7 (6): e38945. doi: 10.1371 /journal.pone.0038945

Επιμέλεια: J.Christopher Πολιτείες, το Πανεπιστήμιο του Louisville, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Ιανουαρίου 2012? Αποδεκτές: 14, Μάη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 14 Ιουν του 2012

Copyright: © 2012 Bruning-Richardson et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο και ο Δρ Bruning-Richardson χρηματοδοτήθηκαν από το Yorkshire Cancer Research [L328]. Το Πανεπιστήμιο του Leeds υποστηρίζει ο Δρ Bond, ο Δρ Μπερνς, ο Δρ Hall και ο Δρ Morrison. Ο Δρ Bell υποστηρίζεται από το Breast Cancer Campaign [2007NovPR53], Δρ Alsiary με υποτροφία από την Σαουδική Υπουργείο Ανώτατης Εκπαίδευσης, Δρ Cairns Αραβίας από το Ιατρικό Συμβούλιο Έρευνας του Ηνωμένου Βασιλείου [G0802416], ο Δρ McCormac από ογκολυτικά Biotech Inc, (Κάλγκαρυ, Καναδάς) και ο Δρ Wilkinson και ο Δρ Χάτσον από Λιντς Διδασκαλία Νοσοκομεία NHS Trust. Ο Δρ Bond, ο Δρ Μπερνς, ο Δρ Wilkinson, ο Δρ Morrison και ο Δρ Bell κρατήστε χρηματοδότηση από το Yorkshire Cancer Research, GDH από Cancer Research UK, και ο Δρ Μπερνς και ο Δρ Wilkinson από την ευημερία των γυναικών. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο 238 kDa πυρηνικής μιτωτικής (ΝυΜΑ) πρωτεΐνη είναι ένα συστατικό του πυρήνα ενδιάμεση και η μιτωτική άτρακτο μήτρα πόλου [1]. ΝυΜΑ έχει λειτουργίες στην άτρακτο συναρμολόγησης μέσω της σύνδεσής της με κινητήρες μικροσωληνίσκων [2], [3] και στην τοποθέτηση της ατράκτου κατά τη διάρκεια της ασύμμετρης κυτταρικής διαίρεσης [4]. Έχει προταθεί Ένα πρόσθετο μεσόφαση ρόλο ως πρωτεΐνη πυρηνικής σκαλωσιά [4] – [6]. ΝυΜΑ εκφράζεται παντού [6], [7]. Τα πυρηνικά και ατράκτου εντοπισμούς πόλο ΝυΜΑ είναι καλά χαρακτηρισμένες στην φυσιολογικό ιστό [8], [9] και σε ιστούς όγκων με ανοσοϊστοχημεία (IHC) σε ανθρώπινη πρωτεΐνη Atlas. Ο ρόλος που μπορεί να διαδραματίσει μιτωτική πρωτεΐνες, όπως ΝυΜΑ στον καρκίνο έχει γίνει πρόσφατα αντικείμενο ανανεωμένου ενδιαφέροντος όπως έχει γίνει φανερό ότι ανευπλοειδισμών είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό των όγκων που θα μπορούσαν να οδηγήσουν την εξέλιξη τους [10], [11].

ΕΓΚ είναι μια πολύπλοκη ασθένεια που είναι δύσκολο να αντιμετωπιστούν λόγω της εκπρόθεσμης υποβολής, υποτροπή της νόσου μετά τη θεραπεία και τα υψηλά ποσοστά της χημειο-αντίστασης. Η βιολογία του ΕΓΚ είναι ελάχιστα κατανοητή και βελτιώσεις στη διάγνωση και τη θεραπεία είναι ιδιαίτερα επιθυμητή [12]. Οι ωοθηκών καρκινώματα χαρακτηρίζονται συχνά από καρυότυποι με σοβαρή ανευπλοειδία λόγω χρωμοσωμική αστάθεια (CIN) και triploidization [13]. Έχει προταθεί ότι ανευπλοειδία είναι ένα χαρακτηριστικό της πρώιμης εκτροπών σε EOC [14]. Ανευπλοειδικών όγκοι ανταποκρίνονται λιγότερο ευνοϊκά στη θεραπεία από διπλοειδή όγκους, οδηγώντας σε χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης [15]. Η

NUMA1

γονίδιο χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 11q13 [16], μια περιοχή που συνήθως ενισχύεται σε καρκίνο των ωοθηκών [17]. Ωστόσο, με τις γνώσεις μας δεν δημοσιεύματα έχουν συνδέσει την έκφραση ΝυΜΑ με ανευπλοειδία σε ΕΓΚ. Αναλύσαμε τα επίπεδα ΝυΜΑ σε πρωτογενείς καλλιέργειες κακοηθών κυττάρων που προέρχονται από ασκητικά υγρά των ωοθηκών, σε συνδεδεμένη ιστούς όγκων τους, σε ιστούς από μη συνδεδεμένους πρωτογενείς όγκους των ωοθηκών και σε φυσιολογικό ιστό ωοθήκης χρησιμοποιώντας ανάλυση Affymetrix συστοιχίας, κηλίδωση σχισμή, IHC και ανοσοφθορισμού (IF). έκφραση ΝυΜΑ βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε δείγματα όγκων συγκριτικά με φυσιολογικούς ελέγχους. Εάν η ανάλυση των πρωτογενών καλλιεργειών που ταυτοποιούνται σύνδεσης μεταξύ αυξημένες ποσότητες ΝυΜΑ στους πόλους της ατράκτου και τα ποσοστά των binucleation και πολυπυρήνωση, ενώ η ανάλυση FACS έδειξε θετική συσχέτιση μεταξύ της αυξημένης έκφρασης ΝυΜΑ και ανευπλοειδία. Αυτή η μελέτη αποδεικνύει για πρώτη φορά ότι η έκφραση ΝυΜΑ ρυθμίζεται αυξητικά στην EOC και ότι αυτό συνδέεται με την ανευπλοειδία δει σε αυτόν τον καρκίνο.

Αποτελέσματα

Affymetrix Microarray Analysis

Εξέταση του Affymetrix microarray στοιχείων από ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών καρκίνου ωοθηκών, πρωτογενείς καλλιέργειες και ιστοί όγκου έδειξε ότι ΝυΜΑ ήταν σταθερά πάνω-εκφράζεται σε ένα μετεγγραφικό επίπεδο σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό ωοθηκών. Μόνο δύο δείγματα ασκιτικού είχαν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με ένα εσωτερικό κανονικό έλεγχο (Ν) (Σχήμα 1Α). Αυτή η αρχική εργασία προτείνει ότι η περαιτέρω μελέτη της έκφρασης ΝυΜΑ στο EOCs ήταν δικαιολογημένη.

Α. δεδομένων Affymetrix δείχνει ΝυΜΑ υπερέκφραση σε 6 κυτταρικές σειρές των ωοθηκών (JAMA-2, ΙΟΒΕ (επιπλέον απαθανάτισε ωοθηκών επιθηλιακής κυτταρικής γραμμής), SKOV-3, TR175, OVCA-433 (εκτός) και 1847 (όλα τα γκρι μπάρες, που ορίζεται CL) , 38 δείγματα πρωτογενών κύτταρα καλλιεργημένα από ασκιτικό υγρό (μαύρες μπάρες, που ορίζεται – Α, συμπεριλαμβανομένων ορισμένων δειγμάτων με διαδοχικές συλλογές ή περάσματα) και 4 πρωτογενείς καλλιέργειες καθιερώθηκαν από ιστό του όγκου (που ορίζεται-T1 to – Τ4) Α1, Α2 και Α4 είναι. ιστό του όγκου (Τ1, Τ2, Τ4) που συνδέονται δείγματα ασκίτη. τιμές έντασης που λαμβάνονται για τα δείγματα ομαλοποιήθηκαν σε μια εσωτερική ελέγχου είναι επίπεδα (φυσιολογικά επιθηλιακά ωοθηκικού ιστού (Ν)) και την έκφραση του γονιδίου που φαίνεται ως ο λόγος των επιπέδων έντασης /έλεγχο των επιπέδων έντασης ως αξία log10. επίπεδα Β ΝυΜΑ σε λύματα κυττάρων. ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα ενός λύματα αναλύθηκαν για την έκφραση ΝυΜΑ από κηλίδα υποδοχή Μαύρο Αστερίξ δείχνει κυτταρικές σειρές των ωοθηκών (1847, TR175, JAMA-2), καφέ Αστερίξ η κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος SH- SY5Y, ροζ Αστερίξ η κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος παχέος εντέρου SW480, μπλε Αστερίξ ο καρκίνος του τραχήλου κυτταρική σειρά HeLa, και κίτρινο Αστερίξ η κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού MCF7. Όλα τα άλλα δείγματα είναι προϊόντα λύσης από πρωτογενείς καλλιέργειες ωοθηκών. Γ Ιστόγραμμα συγκρίνοντας τα επίπεδα ΝυΜΑ σε κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, ένα πρωτεύον κυτταρική σειρά που προέρχεται από καλοήθη γυναικολογική διαταραχή (1153-Α1) και πρωτογενείς καλλιέργειες μετά κανονικοποίηση έναντι α-τουμπουλίνης. Δ τμήμα της κανονικής (Ν) των ωοθηκών επιθηλιακών και στρωματικών ιστού και να συνδυαστούν καρκίνο των ωοθηκών (Ca) σε x10 και x40 μεγέθυνση μετά ΝυΜΑ ανοσοχρώση. Τα βέλη δείχνουν τα επιθηλιακά κύτταρα. Χαμηλή έως μέτρια επίπεδα χρώσης πυρηνικών ΝυΜΑ μπορεί να δει κανείς στα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα, με υψηλότερα επίπεδα χρώσης πυρηνικής ΝυΜΑ στα κύτταρα του καρκίνου επιθηλιακών ωοθηκών. Ε Ανάλυση ενός μικρού ωοθηκών TMA δείχνει ότι ΝυΜΑ ένταση χρώσης αυξάνει με το βαθμό στον ιστό του όγκου των ωοθηκών.

Η

Slot Λεκιάζοντας

Ένα σύνολο από 35 δείγματα αναλύθηκαν με κηλίδωση υποδοχή. Αυτή η ομάδα αποτελείται από 7 καθιερωμένες κυτταρικές σειρές (JAMA-2, TR175, 1847, SW480, MCF-7, HeLa και SH-SY5Y), ένας καλοήθης δείγματος (1153-Α1) και 25 πρωτογενείς καλλιέργειες. συμπεριλήφθηκαν επίσης Κυτταρολύματα λήφθηκε από 2 ιστούς των ωοθηκών των όγκων που αναπτύσσονται σε καλλιέργεια ιστού (BE4163-T1 και AQ70880-Τ1). Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα μιας εικόνας στυπώματος σχισμής με μερικά από τα δείγματα που φαίνεται στο Σχήμα 1Β. Ομαλοποίηση έναντι ενός εσωτερικού α-τουμπουλίνης έλεγχος επιβεβαίωσε ότι υπήρχε διακύμανση των επιπέδων της πρωτεΐνης ΝυΜΑ μεταξύ των δειγμάτων που ελέγχθηκαν (Σχήμα 1C). Μεταξύ των κυτταρικών σειρών, 1847 είχε το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης ΝυΜΑ, ακολουθούμενη από TR175 και JAMA-2. Η καλοήθης δείγμα 1153-Α1 είχε ένα μέσο επίπεδο ΝυΜΑ ενώ υπήρχε διακύμανση μεταξύ των πρωτογενείς καλλιέργειες ασκίτη με 3 (1141-A1, 1134-Α1 και AE6792-Α1) που εκφράζουν τα υψηλότερα επίπεδα ΝυΜΑ όλων των δειγμάτων. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των αποτελεσμάτων ΝυΜΑ ανοσοαποτύπωση και τα συναφή κλινικά δεδομένα παρατηρήθηκε. Καθησυχαστικά, τα επίπεδα πρωτεΐνης ΝυΜΑ σε γενικές γραμμές αντιστοιχεί καλά με τα επίπεδα έκφρασης του RNA παρατηρείται για τις πρωτογενείς καλλιέργειες και κυτταρικές γραμμές ωοθήκης εξετάστηκε με ανάλυση Affymetrix microarray.

Ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοχρώση έδειξε ότι η έκφραση ΝυΜΑ σε ολόκληρα τμήματα του φυσιολογικού ιστού των ωοθηκών ήταν μεταβλητή, κυμαινόμενη από πολύ χαμηλά σε ασθενή επίπεδα σε στρωματικά και επιθηλιακά πυρήνες κυττάρων (η = 7) (Σχήμα 1 D). Για τους 5 περιπτώσεις του φυσιολογικού ιστού με σχετίζεται καρκινικό ιστό, ταυτοποιήθηκε μια σαφής αύξηση στην έκφραση ΝυΜΑ σε 40% (2/5) των δειγμάτων του όγκου. Έως 95% των πυρήνων σε πρωτογενείς όγκους που εμφανίζονται μεσαίου έως ισχυρή χρώση ΝυΜΑ (Σχήμα S1a-d). ΝυΜΑ παρατηρήθηκε επίσης στους πόλους της ατράκτου μιτωτικών κυττάρων όγκου (Σχήμα S1b, βέλος). Η ανάλυση ενός μικρού δημιουργείται in-house καρκίνο των ωοθηκών TMA αποκάλυψε ότι το 95% των πυρήνων των κυττάρων όγκου θετικά χρωματίστηκαν για ΝυΜΑ σε 24 από 25 πυρήνες. Εντυπωσιακά, ανάλυση των δεδομένων μετά την εφαρμογή ενός συστήματος βαθμολόγησης που υποδιαιρείται δειγμάτων σε χαμηλή ΝυΜΑ (όλα αρνητικά, πολύ αδύναμη και αδύναμη βαθμολογίες) και υψηλά επίπεδα ΝυΜΑ (μέτρια και υψηλά σκορ) έδειξαν ότι τα υψηλά επίπεδα ΝυΜΑ ανιχνεύθηκαν μόνο σε βαθμού 3 όγκους (33%? Σχήμα 1Ε). Η χρώση ενός μεγαλύτερου των ωοθηκών TMA επιβεβαίωσε χαμηλή και υψηλή έκφραση ΝυΜΑ μεταξύ των πυρήνων (Σχήμα 2). Αρχική ανάλυση των συνολικών δεδομένων, ανεξάρτητα από τον υπότυπο καρκίνου έδειξε ότι τα υψηλά επίπεδα ΝυΜΑ αυξήθηκε με το βαθμό του όγκου (από 20,3% για το βαθμό 1 όγκους σε 24,1% για το βαθμό 3 όγκους,

σ

= 0,0016) και το στάδιο της νόσου (ένα αυξηθεί από 19,6% για το στάδιο 1 να 33,3% για το στάδιο 4,

σ

= 0.0077) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ανάλυση των συνεχών δεδομένων για το βαθμό του όγκου και το στάδιο της νόσου, η οποία περιελάμβανε υποδιαίρεση στους τύπους καρκίνου για τις οποίες αρκετά δεδομένα ήταν διαθέσιμη (ορώδες, βλεννώδες και ενδομητριοειδές), έδειξε ότι η έκφραση ΝυΜΑ συσχετίζεται με την αύξηση της ποιότητας στην βλεννώδες υπότυπο (

p

= 0,009) (Σχήμα 3Α). Μια σημαντική συσχέτιση με τη συμμετοχή λεμφαδένων (

σ

= 0,03) (Σχήμα 3Β) και την ηλικία (

σ

= 0,04) (Σχήμα 3C) παρατηρήθηκε σε όλους τους υποτύπους. Περαιτέρω ανάλυση των αποτελεσμάτων, όπως ασυνεχή δεδομένα (χαμηλό ΝυΜΑ vs υψηλή ΝυΜΑ) αποκάλυψε επιπλέον στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις. Το ποσοστό των δειγμάτων με υψηλά επίπεδα ΝυΜΑ μειώθηκε με βαθμό (

σ

= 0,02) (Εικόνα 3D) και αυξήθηκαν σε όψιμο στάδιο της νόσου σε ορώδες EOC (

σ

= 0,04) (Σχήμα 3Ε) . Σε βλεννώδες EOCs, τα επίπεδα ΝυΜΑ αυξήθηκε με βαθμό (

σ

= 0,005) (Σχήμα 3F). Στα EOCs ενδομητριοειδές προχωρημένο στάδιο, έκφραση ΝυΜΑ μειώθηκαν (Σχήμα 3G) και υψηλή ΝυΜΑ μειώθηκε με την αύξηση στην κατάσταση εισβολή όγκου (

σ

= 0.03) (όλα υπότυποι) (Σχήμα 3Η). έκφραση Χαμηλή ΝυΜΑ παρατηρήθηκε σε ολόκληρο τον πληθυσμό του δείγματος, της 13ης διαυγοκυτταρικό EOCs ανεξάρτητα από το στάδιο της νόσου.

χαμηλής και υψηλής χρώσης ΝυΜΑ παρατηρήθηκε σε πυρήνες από ορώδες, βλεννώδες, ενδομητρίου και σαφής καρκινώματα κυττάρων σε μεγάλη κλίμακα των ωοθηκών TMA. Μεγέθυνση x10.

Η

Α. Η στατιστική ανάλυση του μεγάλου καρκίνου των ωοθηκών TMA δείχνει έκφραση ΝυΜΑ αυξάνει με το στάδιο της νόσου στο βλεννώδες υπότυπο. έκφραση Β ΝυΜΑ συνδέεται με τη συμμετοχή λεμφαδένων (T3cN1MO) (όλοι οι υπότυποι). έκφραση C. ΝυΜΑ σχετίζεται με την ηλικία του ασθενούς (όλα υποτύπων). Δ υψηλά επίπεδα ΝυΜΑ μειώνονται με βαθμό όγκου στο ορώδες υπότυπο. Τα επίπεδα Ε Υψηλή ΝυΜΑ που σχετίζονται με το στάδιο 4 της νόσου σε ορώδες EOCs. επίπεδα ΣΤ Υψηλή ΝυΜΑ αυξάνουν με το βαθμό του όγκου σε βλεννώδες EOCs. επίπεδα Γ Υψηλή ΝυΜΑ μειώνονται με το στάδιο της νόσου σε ενδομητριοειδές ΕΓΚ. επίπεδα H. Υψηλή ΝυΜΑ μειώνεται με την κατάσταση εισβολή όγκου (Τ1 έως Τ3) (όλοι οι υπότυποι).

Η

Αναλύσεις ανοσοφθορισμού

Εάν η ανάλυση αποκάλυψε την ύπαρξη μιας ενδιάμεσης πρότυπο χρώσης πυρηνική ΝυΜΑ στο όλες οι κυτταρικές σειρές, μία πρωτογενής καλλιέργεια προσαρμόζεται ως μία κυτταρική γραμμή (GYNA0089) και 23 πρωτογενείς καλλιέργειες (Σχήμα 4Α, Β). Σε μίτωση ΝυΜΑ βρέθηκε στους πόλους της ατράκτου (Σχήμα 4C) σε όλες τις κυτταρικές σειρές και πρωτογενείς καλλιέργειες εξετάστηκαν. Επαρκείς αριθμοί των μιτωτικών κυττάρων για περαιτέρω ανάλυση προσδιορίστηκαν σε 16 πρωτογενείς καλλιέργειες. Σε αυτά τα δείγματα διαιρούμενα κύτταρα εξετάστηκαν για μιτωτική στάσης και την παρουσία ειδικών μιτωτικής ελαττώματα. Τέλος, μια έρευνα των δεικτών ενδιάμεσης ανευπλοειδισμών πραγματοποιήθηκε σε όλα τα δείγματα.

Α. Παραδείγματα μεσόφαση πυρήνων με χαμηλή (α-δ) και υψηλή (e-h) επίπεδα ΝυΜΑ, και μιτωτικών ατράκτων με χαμηλή (i-l) και υψηλή (m-p) επίπεδα ΝυΜΑ στους πόλους της ατράκτου. Πράσινο – ΝυΜΑ, κόκκινο – α-τουμπουλίνης, μπλε – DAPI. Κλίμακα bar = 5 μm. B. Ιστόγραμμα συγκρίνοντας ΝυΜΑ πυρηνικό φθορισμό εντάσεις χρώσης σε τέσσερις κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, μία κυτταρική σειρά εγκατεστημένος από μία πρωτογενή καλλιέργεια (GYNA0089) και 23 πρωτογενείς καλλιέργειες που προέρχονται από ασκιτικό υγρό. Γ Ιστόγραμμα συγκρίνοντας ΝυΜΑ εντάσεις χρώσης στους πόλους της ατράκτου στο υποσύνολο των κυτταρικών γραμμών και καλλιεργειών όπου ένας επαρκής αριθμός των μιτωτικών κυττάρων ήταν για ανάλυση.

Η

Η χρώση εντάσεις διέφεραν μεταξύ των δειγμάτων (Σχήμα 4). Διαπιστώθηκε ότι ορισμένα δείγματα αποτελούνταν από κύτταρα με χρώση χαμηλό επίπεδο ΝυΜΑ σε μεσόφαση πυρήνες και στη μιτωτική πόλους της ατράκτου (Σχήμα 4Α, a-d και i-l? 4Β, C) και μερικά δείγματα αποτελούνταν από κύτταρα με υψηλή χρώση ΝυΜΑ εντάσεις (Σχήμα 4Α, e-h και m-p? Σχήμα 4Β και C). Σημειώσαμε επίσης ότι κάθε δείγμα διέφεραν σε σχέση με την αναλογία των κυττάρων σε κάθε στάδιο μιτωτική και ότι παρουσίασαν ένα ευρύ φάσμα των μιτωτικών ελαττώματα. Αυτές περιελάμβαναν ελαττώματα μετάφασης όπως τριπολικό και πολυπολικό ατράκτους (Σχήμα 5Α, a-d) και στον άξονα απόκλιση ευθυγράμμισης (Εικόνα 5Α, ε)? ελαττώματα ανάφαση όπως παρουσιάζουν χρωμοσώματα και χρωμοσωμικό γεφύρωσης (Σχήμα 5Β, a-c)? και κυτοκινητικής ελαττώματα συμπεριλαμβανομένων χρωματίδων γεφύρωσης και την παραγωγή άνισα μεγέθους θυγατρικών κυττάρων (Σχήμα 5C, a-d). Binucleation, πολυπυρήνωση και η παρουσία μικροπυρήνων ήταν κοινά ελαττώματα μεσόφαση κύτταρα (Σχήμα 5D, a-c). Τα παραδείγματα που παρουσιάζονται στο Σχήμα 5Ε ήταν τα πιο συνηθισμένα λάθη που παρατηρήθηκαν μιτωτική.

Α. Η μιτωτική ελαττώματα που παρατηρούνται σε μετάφαση περιλαμβάνονται (α) ασύμμετρη διπολική ατράκτους (β) πόλους πολλαπλές ατράκτου, (γ) τριπολικό ατράκτους, (δ) διπολική ατράκτους με πολλαπλούς πόλους της ατράκτου (ε) τα κύτταρα με άστοχες και σωστά ευθυγραμμισμένο ατράκτους (κύτταρο περιφέρεια περιγράφεται). Β Μιτωτικά ελαττώματα που παρατηρήθηκαν σε ανάφαση περιλαμβάνονται μείνει χρωμοσώματα και ανάφαση γεφύρωσης (α-γ). Γ Μιτωτικά ελαττώματα που παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια της τελόφασης και κυτταροκίνηση περιλαμβάνονται (α) μη φυσιολογική ατράκτους, (β) τη μη φυσιολογική κυτοκίνηση με σχηματισμό μικροπυρήνων, (γ), χρωματιδικές γεφύρωσης και (δ) σχηματισμός άνισα μεγέθους θυγατρικά κύτταρα. Δ Παραδείγματα (α) binucleation, (β) πολυπυρήνωση και (γ) μικροπυρήνων σε πρωτογενείς καλλιέργειες. Πράσινο – ΝυΜΑ, κόκκινο – α-τουμπουλίνης, μπλε – DAPI σε όλες τις ομάδες. Κλίμακα ράβδου στα Α και Β = 5 μm. Κλίμακα bar σε C και D = 10 μm. Ε πίτας γράφημα που απεικονίζει τη συνολική συχνότητα της μιτωτικής ελαττώματα που παρατηρήθηκαν στις πρωτογενείς καλλιέργειες.

Η

Μια σύγκριση των προφίλ χρώσης ΝυΜΑ σε μιτωτικά δεδομένων έγινε. Υψηλά επίπεδα ΝυΜΑ στο ενδιάμεσης πυρήνες συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με ένα μικρό ποσοστό των κυττάρων σε τελόφασης (

σ

= 0.012) και ένα υψηλό ποσοστό των κυττάρων που εμφανίζουν μια χαλαρή πλάκα μετάφαση (

p = 0,032

) (Σχήμα 6Α και Β). Τα υψηλά επίπεδα ΝυΜΑ σε μιτωτικής ατράκτου πόλους συσχετίζεται σημαντικά με υψηλά ποσοστά binucleation (

p = 0,021

) και πολυπυρήνωση (

p =

0,007) (Εικόνα 6C και D) και πάλι με χαλαρά μετάφαση πλάκες (

p =

0,041) (Σχήμα 6Ε). Χαμηλά επίπεδα ΝυΜΑ στους πόλους της ατράκτου συσχετίζεται σημαντικά με μια υψηλή αναλογία κυττάρων σε κυτοκίνηση (

ρ =

0,05) (Σχήμα 6F). Είναι ενδιαφέρον, ενδιάμεσα επίπεδα ΝυΜΑ στους πόλους της ατράκτου συσχετίζεται σημαντικά με χαμηλά ποσοστά σφάλματος στην κυτοκίνηση. (

p =

0,01) (Σχήμα 6G). Για την επαλήθευση των δεδομένων που παρατηρήθηκαν σε ανάλυση ανοσοφθορισμού μας των πρωτογενών καλλιεργειών που ανοσοχρώση ολόκληρα τμήματα του στερεού ιστού του όγκου από τις 23 ασθενείς των οποίων ασκητικά υγρά χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία των καλλιεργειών. Αυτό επιβεβαίωσε ότι συμπαγείς όγκοι εμφανίζουν υψηλά επίπεδα χρώσης ΝυΜΑ δημιουργούνται πρωτογενείς καλλιέργειες ασκητικό όπου τα κύτταρα εμφανίζονται τα επίπεδα έκφρασης υψηλού ΝυΜΑ (Σχήμα S1 α-δ). Για να επιβεβαιωθεί ότι η παρατηρούμενη μεσόφαση και μιτωτική ελαττώματα ήταν επίσης ένα κοινό χαρακτηριστικό των ιστών του όγκου αναλύσαμε 23 τμήματα όγκου στη διάθεσή μας από τον Numa ανοσοχρώση και H & amp? Χρώση Ε IHC. Σημειώσαμε ότι οι ίδιες μεσόφαση και μιτωτική ελαττώματα υπήρχαν σε αυτούς τους όγκους, όπως στα δείγματα ασκίτη. Αντιπροσωπευτικές εικόνες και μια περίληψη των ελαττωμάτων που παρατηρούνται μεταξύ των δειγμάτων που φαίνεται στο Σχήμα S2A-D. Περαιτέρω, κυτταρικές καλλιέργειες με υψηλό μιτωτικό δείκτη βρέθηκαν να εμφανίζουν υψηλή μιτωτική δραστηριότητα στη συνδεδεμένη ιστό του όγκου (Σχήμα S3). Τέλος, διερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης ΝυΜΑ σε πρωτογενείς καλλιέργειες και την επιβίωση των ασθενών. Αυτό πρότεινε ότι οι ασθενείς με μέτρια έως έντονη ανοσοχρώση ΝυΜΑ στους πόλους της ατράκτου σε πρωτογενείς καλλιέργειες έχουν χαμηλότερο ποσοστό επιβίωσης από τους ασθενείς με αδύναμο ανοσοχρώση ΝυΜΑ, αν και αυτό προκαταρκτικά στοιχεία δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Σχήμα S4), ίσως λόγω μικρού μεγέθους του δείγματος.

η ισχυρή έκφραση της πυρηνικής ΝυΜΑ που σχετίζονται με (Α) το χαμηλότερο ποσοστό των κυττάρων τελόφασης και (Β) το μεγαλύτερο ποσοστό των κυττάρων με διάχυτη πλάκα μετάφασης. Ισχυρή επισήμανση πόλο ΝυΜΑ άξονα συσχετίστηκε με υψηλά ποσοστά (C) binucleation, (D) πολυπυρήνωση, (Ε) μια πλάκα διάχυτη μετάφαση και (F), το χαμηλότερο ποσοστό των κυττάρων σε κυτοκίνηση. (G) χρώση πόλο Ενδιάμεσο άτρακτος συνδέθηκε με το χαμηλότερο ποσοστό των κυττάρων που παρουσιάζουν ένα ελάττωμα κυτοκίνηση. (H) FACS ανάλυση έδειξε ότι μόνο τα κύτταρα με υψηλά επίπεδα ΝυΜΑ ήταν ανευπλοειδικών.

Η

FACS

ανάλυση FACS έδειξε ότι μόνο κύτταρα από πρωτογενείς καλλιέργειες με υψηλή ΝυΜΑ εντάσεις χρώσης πόλου ατράκτου ήταν ανευπλοειδικών (Σχήμα 6Η), μια στατιστικά σημαντική παρατήρηση (

p =

0.008).

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη στοχεύει να διερευνήσει

NuMA1

έκφρασης στην EOC και συσχετίζει αυτό με ανευπλοειδία βρέθηκε σε αυτόν τον τύπο καρκίνου. Μια αρχική Oncomine αναζήτηση έδειξε ότι η έκφραση ΝυΜΑ ρυθμίζεται αυξητικά στην EOC. πιλοτικά δεδομένα μας δημιουργούνται από Affymetrix προφίλ πρότεινε, επίσης, ότι

NuMA1

έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά στον καρκίνο των ωοθηκών. Εμείς επιβεβαίωσε την παρατήρηση αυτή στο επίπεδο της πρωτεΐνης με IHC, σημειώνοντας ότι η πυρηνική ΝυΜΑ ήταν παρούσα σε χαμηλά επίπεδα στους πυρήνες των κανονικών στρώματος των ωοθηκών και του επιθηλίου, ενώ πρωτογενείς όγκους των ωοθηκών είχαν αυξημένα επίπεδα ΝυΜΑ. Υψηλά επίπεδα ΝυΜΑ συσχετίστηκαν με βαθμό του όγκου, το στάδιο της νόσου, και η συμμετοχή των λεμφαδένων και αντιστρόφως στην εισβολή του όγκου. Ωστόσο, η έκφραση ΝυΜΑ διέφερε μεταξύ των τεσσάρων μεγάλων υποτύπους του ΕΓΚ. Ενώ τα επίπεδα ΝυΜΑ μειώθηκε με το βαθμό του όγκου και αυξάνεται με το στάδιο της νόσου στο ορώδες υπότυπο, αυξήθηκαν με βαθμό όγκου στο βλεννώδες υποτύπου και μειωμένη με το στάδιο της νόσου στον υπότυπο ενδομητριοειδές. Εις το διαυγές κύτταρο υποτύπου παρατηρήθηκαν μόνο χαμηλά επίπεδα ΝυΜΑ. Οι διαφορές αυτές είναι πιθανό να αντανακλά τη μοριακή ετερογένεια των EOCs. Πρόσφατα, έχουν EOCs αναταξινομήθηκαν σύμφωνα με τα μοριακά χαρακτηριστικά τους σε τύπου Ι (χαμηλής ποιότητας ορώδες, χαμηλής ποιότητας ενδομητριοειδές, όλα βλεννώδες και σαφή καρκινώματα) και τύπου ΙΙ (υψηλού βαθμού ορώδες και ενδομητριοειδές καρκινώματα) με μεταλλάξεις κυρίως σε

KRAS

και

PTEN

τύπου Ι και μεταλλάξεις στο

TP53

τύπου II [25], [26]. επίπεδα ΝυΜΑ στη μελέτη μας ήταν υψηλότερα σε EOCs τύπου Ι (χαμηλού βαθμού ορώδης και βλεννώδες καρκίνοι), γεγονός που υποδηλώνει ΝυΜΑ υπερέκφραση μπορεί να είναι ένα πρώιμο γεγονός στην καρκινογένεση.

Κακοήθη κύτταρα που προέρχονται από ασκητικά υγρά έχουν χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν για να δημιουργήσει έναν πλούτο των πληροφοριών σχετικά με την ανοσολογία και θεραπευτικών στην EOC και έχει προταθεί ότι η χρήση τους θα μπορούσε να συμπληρώσει τις συμβατικές διαγνωστικές διαδικασίες [27]. Εδώ, η μελέτη IF των πρωτογενών καλλιεργειών επιτρέπεται ένα μυθιστόρημα και λεπτομερή εξέταση των αποδεικτικών στοιχείων ανευπλοειδισμών μέσω της αναγνώρισης τόσο των συγκεκριμένων ελαττωμάτων μιτωτική και της ενδιάμεσης συνέπειες αυτών των ελαττωμάτων. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι υψηλά επίπεδα ΝυΜΑ στο άτρακτος πόλους συσχετίστηκαν με υψηλά επίπεδα binucleation και πολυπυρήνωση. Η ανάπτυξη tetraploidy ως αποτέλεσμα της απέτυχε κυτταροκίνηση αντιπροσωπεύει δυνητική πρώιμο συμβάν στην ανάπτυξη της χρωμοσωμικής αστάθειας (CIN) και τελικά ανευπλοειδικών καρυότυποι σε κύτταρα όγκου [10]. Οι μιτωτικές ελαττώματα που παρατηρήσαμε σε πρωτογενείς καλλιέργειες μας, όπως πολυπολική ατράκτους και ελαττώματα κυτοκίνηση, θα μπορούσε να εξηγήσει την επίπτωση της διπύρηνα και πολυπύρηνων σε αυτά τα δείγματα. Σύμφωνα με αυτό, βρήκαμε επίσης μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ ανευπλοειδίας και τα υψηλά επίπεδα ΝυΜΑ στους πόλους της ατράκτου σε καλλιέργειες μας.

Αφού διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα ΝυΜΑ πρωτεΐνης ρυθμίζεται προς τα πάνω στην EOC και ότι αυτό συνδέεται με ανευπλοειδία, το επόμενο βήμα θα είναι να καθοριστεί η λειτουργική συνενοχή ΝυΜΑ στην ανάπτυξη αυτής της ανευπλοειδίας. Εργασία από άλλους ερευνητές έχει δείξει ότι η υπό όρους έκφραση ΝυΜΑ σε μυελοειδή ποντικού οδηγεί σε κυτταρική γραμμή ανευπλοειδίας και απόπτωση [28]. Προτάθηκε ότι ΝυΜΑ υπερέκφραση από μόνη της δεν ήταν αρκετή για να οδηγήσει σε κακοήθη μετασχηματισμό λευχαιμικά κύτταρα αλλά ότι μπορεί να συμβάλει στην χρωμοσωμική αστάθεια, επιτρέποντας γενετικά γεγονότα προώθηση πρόοδο του κυτταρικού κύκλου ή την προστασία από την απόπτωση να συμβεί. Ένα τέτοιο γεγονός θα μπορούσε να είναι η απόκτηση των μεταλλάξεων ρ53, όπως εκείνες που παρατηρούνται σε υψηλού βαθμού ορώδες καρκίνωμα [29]. Εναλλακτικά, ΝυΜΑ αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη μοτέρ δυνεΐνης κατά τη διάρκεια της μίτωσης και έχει προταθεί ότι ο κορεσμός της δραστηριότητας δυνεΐνης με ΝυΜΑ υπερέκφραση μπορούσε να ανταγωνισθεί οδούς που τα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιούν για την επίλυση προβλημάτων όπως πολυπολικό ατράκτους. Αυτά συνήθως προκύπτουν λόγω της παρουσίας υπεράριθμων κεντροσωμάτια, οδηγώντας σε αύξηση των γενωμική αστάθεια οδηγείται από ελαττώματα στο μίτωσης [30]. Αυτή η υπόθεση μπορεί να εφαρμόζεται σε EOC αφού οι βιολογικές συνέπειες της πολυπολικού κυτταρικές διαιρέσεις είναι συνεπή με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν στην εργασία ανοσοφθορισμού μας. Centrosomal ενίσχυση έχει επίσης προηγουμένως σημειωθεί στα κύτταρα EOC και έχει συνδεθεί με ανευπλοειδία και την κακή έκβαση του ασθενούς στο ορώδες ΕΓΚ. Αυτό το φαινόμενο φαίνεται να προκαλείται από την υπερέκφραση του Aurora-Α, ένα μέλος της οικογένειας κινασών σερίνης /θρεονίνης εμπλέκονται σε μιτωτική γεγονότα [31], [32].

Το αντιγόνο όγκου ακροσίνη δέσμευσης πρωτεΐνης (ACRBP) /OY-TES-1, έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με ΝυΜΑ. Ένα συν-εξαρτώμενη σχέση με ένα ρόλο στην αντίσταση πακλιταξέλη σε ΕΓΚ έχει προταθεί [33]. ΝυΜΑ υπερέκφραση προτάθηκε να προκαλέσει μιτωτική διαταραχές που απαιτούνται για την πλαστικότητα της προ-νεοπλασματικών γονιδιώματος, με συν-εξελίσσονται υπερέκφραση ACRBP οι όγκοι πρόοδο οδήγηση την απόκτηση των χαρακτηριστικών για την εξομάλυνση αυτών των πρώιμων διαταραχών που θα μπορούσαν αλλιώς να είναι ασύμφορη για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων με την προώθηση μιτωτική καταστροφή. Η ίδια μελέτη έδειξε επίσης ότι οι περισσότεροι επιθετική νόσο ανάμεσα σε μια σειρά ασθενών ΕΓΚ συνδέθηκε με συνδυασμό υψηλών επιπέδων ACRBP και ΝυΜΑ. Η δυνατότητα που ΝυΜΑ υπερέκφραση δρα συνεργικά με την Aurora-Α και ACRBP υπερέκφραση για την προώθηση της ανευπλοειδίας, κακή επιβίωση και χημειοαντίσταση το ΕΓΚ είναι ενδιαφέρουσα και αξίζει περαιτέρω διερεύνησης. Στο πλαίσιο αυτό, τα προκαταρκτικά στοιχεία μας υποδηλώνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης ΝυΜΑ που σχετίζονται με την επιβίωση στην EOC θα διερευνηθούν περαιτέρω σε μεγαλύτερο δείγμα που να καθορίσει αν το φαινόμενο αυτό είναι στατιστικά σημαντική.

Εν κατακλείδι, τα στοιχεία μας αποδεικνύουν για η πρώτη φορά που ΝυΜΑ υπερεκφράζεται σε EOC και ότι τα υψηλά επίπεδα ΝυΜΑ συσχετίζονται με αυξημένη μιτωτική ελαττώματα και ανευπλοειδία σε καλλιέργειες ασκίτη που προέρχονται από ασθενείς με όγκους των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και Primary πολιτισμούς των κακοηθών κυττάρων που παρήχθησαν από ωοθηκικό ασκητικό Υγρά

Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτό το έργο περιελάμβανε τέσσερις κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών (JAMA-2, SKOV-3, TR175 και 1847), μια κυτταρική γραμμή νευροβλαστώματος (SH-SY5Y) , κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος ένα κόλον (SW480), ένα τραχηλικό καρκίνο κυτταρική σειρά (HeLa) και μία καρκίνου του μαστού κυτταρική γραμμή (MCF7). Οι κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από Cancer Research UK, το ECACC και την συλλογή ATCC Cell Biology. Οι πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων που προέρχονται από ασκητικά υγρά ωοθηκών (GYNA0089), ιστοί ωοθηκών όγκου (BE4163-T1 και AQ70880-Τ1) ή καλοήθεις όγκους (1153-Α1) καθορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. την πληροφόρηση των ασθενών και κλινικών δεδομένων για τα ασκητικά υγρά των ωοθηκών έχει περιγραφεί στο παρελθόν [18].

Κανονική των ωοθηκών και του όγκου των ιστών

Παθολογική δείγματα της φορμόλης σταθερό, ενσωματωμένα σε παραφίνη ιστούς που αποτελούνται από τμήματα της κανονικής ωοθηκών ιστών και πρωτογενείς όγκους (συμπεριλαμβανομένων των όγκων που παράγονται τα ασκίτη από την οποία πρωτογενείς καλλιέργειες ήταν έτοιμες) ελήφθησαν από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Παθολογικής Ανατομικής Αρχείο St James, Λιντς. Επτά φυσιολογικούς ιστούς ήταν διαθέσιμα, 5 εκ των οποίων είχαν επίσης σχετίζεται δείγματα όγκων. Ελήφθησαν συνολικά 23 καρκινικών ιστών που ταιριάζουν πρωτογενείς καλλιέργειες που προέρχονται από κακοήθη κύτταρα. εντοπίστηκαν και χρησιμοποιείται για να δημιουργήσει μια μικροσυστοιχία μίνι ιστού in-house (ΤΜΑ) επιπλέον 25 άσχετες πρωτοπαθείς όγκους των ωοθηκών με τα συνδεδεμένα κλινικά δεδομένα. Η TMA αποτελείται από 9 ορώδες αδενοκαρκινώματα, 6 καρκινώματα ενδομητριοειδές, 2 βλεννώδες, 2 μικτά του Muller, 5 μικτά ορώδες και ενδομητριοειδές, και 1 αδενοκαρκίνωμα. Μία υψηλή πυκνότητα των ωοθηκών ΤΜΑ καρκίνος που αποτελείται από 280 περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος ωοθηκών (ορώδης, βλεννώδες και ενδομητριοειδές), 13 σαφείς καρκίνωμα, ένα καρκίνωμα από μεταβατικό επιθήλιο, 20 παρακείμενο φυσιολογικό ιστό και 8 φυσιολογικούς ιστούς εις διπλούν, με το στάδιο και πληροφορίες βαθμού, ελήφθη από τα δίκτυα ιστών Array (OV6161, Tissue Network Array). Συνοδευτικά κλινικών δεδομένων που περιλαμβάνονται ασθενής ηλικίας, συμμετοχή των λεμφαδένων, εισβολή και μετάσταση όγκων.

καθορίστηκαν Patient Data

σχετιζόμενες κλινικές λεπτομέρειες για ασθενείς για τους οποίους πρωτογενείς καλλιέργειες κακοηθών κυττάρων που προέρχονται από ασκητικά υγρά ωοθηκών, περιγράφηκαν προηγουμένως [18].

Affymetrix Profiling

τα στοιχεία για τις κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, πρωτογενείς καλλιέργειες και συνδέονται δείγματα όγκων ανακτήθηκε από μια γονιδιακή ανάλυση μικροσυστοιχιών έκφρασης, που δημιουργούνται με GeneChip HG-U133 Plus 2.0 Πίνακες (Affymetrix) που ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας MAS 5,0 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18].

αντισώματα

Ο ΝυΜΑ μονοκλωνικό αντίσωμα Ab-2 (κλώνος 107-7, Calbiochem) χρησιμοποιήθηκε σε όλη αυτή τη μελέτη . Αυτό έχει προηγουμένως χρησιμοποιηθεί εκτενώς για κηλίδωση Western, ανοσοφθορισμό και IHC [19], [20]. Για IF μελέτες αρουραίου αντι-α-τουμπουλίνης αντίσωμα (1/500, MCA77G, Serotec) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό μικροσωληνίσκους και 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης (DAPI 5 μg /ml, Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση του DNA .

Slot Λεκιάζοντας

Slot αποτύπωση των προϊόντων λύσης των κυττάρων έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. 0,01 mg του δείγματος φορτώθηκε σε κάθε πηγάδι και το μονοκλωνικό αντίσωμα ΝυΜΑ Ab-2 χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1/400.

TMA Κατασκευή

Για τη δημιουργία ενός in-house ωοθηκών ΤΜΑ ένα πρωτόκολλο που περιγράφεται από τον Abd El-Rehim

et al

[21] ακολούθησε. Εγχειρίδιο γροθιές arrayer ιστό με διάμετρο 0,6 mm (Beecher Instruments, Inc) χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία των πυρήνων.

Η ανοσοϊστοχημεία

Διαφάνειες που περιέχουν ολόκληρα τμήματα ή πυρήνες TMA αποκλείστηκαν με 3% Η

2O

2 σε μεθανόλη μετά την de-αποτρίχωση και ενυδάτωσης. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη με διαφάνειες πίεση μαγείρεμα για 2 λεπτά σε Antigen αποκάλυψη Solution (χαμηλό ρΗ, Vector Laboratories). Μετά από τρεις πλύσεις 5 λεπτών σε TBS-Tween-20 (0,2%) τα πλακίδια αποκλείστηκαν για 10 λεπτά με 10 × καζεΐνη (Vector Laboratories) αραιωμένο 1:02 σε αποσταγμένο νερό. Μετά από τρεις πλύσεις 5 λεπτών με TBS-Tween 20 τα πλακίδια που περιέχουν ολόκληρα τμήματα τοποθετήθηκαν σε μονάδες sequenzer Shandon ενώ διαφάνειες που περιέχουν τμήματα TMA ξαπλώνονται επίπεδα μέσα σε ένα υγροποιημένο θάλαμο επώασης για επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα. ΝυΜΑ αντίσωμα Ab-2 αραιώνεται σε διάλυμα αντισώματος (Zymed) εφαρμόστηκε σε 1/300 για ολόκληρα τμήματα και 1/100 για τις διαφάνειες TMA. Τα πλακίδια επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Μετά από τρεις πλύσεις των 5 λεπτών η κάθε μία με TBS-Tween-20 τα πλακίδια επωάστηκαν σε 100 μΐ HRP κουνελιού /ποντικό REAL ™ EnVision ™ (ϋΑΚΟ) για 30 λεπτά σε θάλαμο μονάδες sequenzer ή την επώαση. Μετά από τρεις τελικές πλύσεις με TBS επί 5 λεπτά, διάλυμα προγραμματιστής (ρυθμιστικό DAB + χρωμογόνο /υποστρώματος, ϋΑΚΟ) προστέθηκε για έως 10 λεπτά έως ότου η ανάπτυξη του χρώματος ήταν πλήρης. Χρώση εντάθηκε σε 0,5% CuSO4 (σε 0,9% αλατούχο διάλυμα) για 5 λεπτά. Μετά αντικηλίδωση σε αιματοξυλίνη επί 2 λεπτά, οι τομές αφυδατώθηκαν και τοποθετήθηκαν σε DPX (Sigma). TMA εικόνες σαρώθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Aperio ImageScope Viewer. Διαφάνειες που περιέχουν ολόκληρα τομές παρατηρήθηκαν με ένα μικροσκόπιο Olympus BX61 με Colourview κάμερα και λογισμικό CellP®. Ένα σύστημα βαθμολόγησης επισήμανση, η οποία εφαρμόζεται δύο κριτήρια βαθμολόγησης, χρησιμοποιήθηκε [22]. Πρώτον, ο αριθμός των πυρήνων χρωματισμένο μετρήθηκαν και εκφράστηκαν ως ποσοστό του συνολικού αριθμού των πυρήνων εντός του τμήματος του ιστού ή του πυρήνα. Δεύτερον, η κυρίαρχη ένταση πυρηνική έκφραση βαθμολογήθηκε με 0 – καμία χρώση, 1 – ίχνος, 2- αδύναμη, 3 μεσαίες και 4- ισχυρή. Το τελικό αποτέλεσμα υπολογίστηκε ως το ποσοστό των χρωματισμένων πυρήνων πολλαπλασιασμένη με την κυρίαρχη έκφραση ένταση.