Αφηρημένο

Κατά την τελευταία δεκαετία, η υψηλή συχνότητα των σωματικών μιτοχονδριακού DNA (mtDNA) μεταλλάξεις έχει παρατηρηθεί, ως επί το πλείστον με βάση ένα κλάσμα του μορίου, σε διάφορους καρκινικούς ιστούς? Παρ ‘όλα αυτά, μερικοί από αυτούς είχαν ερωτηθεί λόγω προβλημάτων στην ποιότητα των δεδομένων. Προφανώς, χωρίς μια ολοκληρωμένη κατανόηση του mtDNA μεταλλάξεων προφίλ στον καρκινικό ιστό ενός συγκεκριμένου ασθενούς, είναι απίθανο να αποκαλύψει την πραγματική σχέση μεταξύ των σωματικών μεταλλάξεων mtDNA και ογκογένεση. Για την επίτευξη αυτού του στόχου, ο πιο απλός τρόπος είναι να συγκρίνει άμεσα το σύνολο της διακύμανσης μιτοχονδριακού γονιδιώματος μεταξύ των τριών ιστών (δηλαδή, καρκινικό ιστό, παρα-καρκινικό ιστό και μακρινό φυσιολογικό ιστό) από τον ίδιο ασθενή. Λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι οι περισσότερες από τις προηγούμενες μελέτες σχετικά με το ρόλο του mtDNA σε ορθοκολικό όγκο επικεντρώθηκαν απλώς στην D-loop ή μερική τμήμα του μορίου, στην παρούσα μελέτη έχουμε συλλέξει τρεις ιστούς (καρκινικά, παρα-καρκινικούς και φυσιολογικούς ιστούς) αντίστοιχα προσλαμβάνονται από 20 ασθενείς με ορθοκολικό όγκο και αλληλουχήθηκε πλήρως το μιτοχονδριακό γονιδίωμα του κάθε ιστού. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν μια σχετικά χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης σωματικών μεταλλάξεων σε αυτούς τους ασθενείς? περίεργο, όλες οι σωματικές μεταλλάξεις είναι σε ετεροπλασμικά κατάσταση. Παραδόξως, οι παρατηρούμενες σωματικές μεταλλάξεις δεν περιορίζεται σε ιστούς καρκίνου, για τους ιστούς παρα-καρκίνου και μακρινό φυσιολογικούς ιστούς φιλοξενούν επίσης σωματικές μεταλλάξεις του mtDNA με χαμηλότερη συχνότητα από καρκινικούς ιστούς, αλλά υψηλότερη από εκείνη που παρατηρήθηκε στο γενικό πληθυσμό. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι σωματικές μεταλλάξεις του mtDNA σε καρκινικούς ιστούς δεν θα μπορούσε να εξηγηθεί απλά ως συνέπεια της ογκογένεσης? Εν τω μεταξύ, οι σωματικές μεταλλάξεις του mtDNA σε φυσιολογικούς ιστούς μπορεί να αντανακλά μια αλλαγμένη φυσιολογικό περιβάλλον σε ασθενείς με καρκίνο

Παράθεση:. Wang C-Υ, Li Η, Hao Χ-D, Liu J, Wang J-Χ, Wang W-Ζ, et al. (2011) αποκάλυψη του προφίλ των σωματικών mtDNA μεταλλάξεις στην κινεζική καρκίνο του παχέος εντέρου ασθενείς. PLoS ONE 6 (6): e21613. doi: 10.1371 /journal.pone.0021613

Επιμέλεια: Janine Santos, Πανεπιστήμιο Ιατρικής και Οδοντιατρικής του Νιου Τζέρσεϊ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Μαρ, 2011? Αποδεκτές: 3 Ιουνίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 28 Ιούνη 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Επιστήμης και Τεχνολογίας Επιτροπή της επαρχίας Γιουνάν (2007C103M), και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

κατά την τελευταία δεκαετία, ο ρόλος του μιτοχονδριακού DNA (mtDNA) μετάλλαξη σε ογκογένεση έχει λάβει πολλή προσοχή. Μια υψηλή συχνότητα εμφάνισης σωματικών μεταλλάξεων mtDNA, ως επί το πλείστον σε homoplastic, έχει ταυτοποιηθεί σε σχεδόν όλους τους τύπους των καρκινικών ιστών [1], [2]. Παρ ‘όλα αυτά, η σχέση των σωματικών μεταλλάξεων mtDNA και ογκογένεση έχει πολυσυζητημένο. Ορισμένες μελέτες πρότειναν ότι η mtDNA σωματικές μεταλλάξεις πιθανό αποτέλεσμα από τα αυξημένα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) σε κύτταρο όγκου [3], [4], [5], επειδή οι περισσότερες από αυτές τις μεταλλάξεις είναι Τ σε C και G σε Α μεταβάσεις βάση [ ,,,0],1], [2], παρόμοια με το πρότυπο μετάλλαξης της οξειδωτικής αποσύνθεσης στο DNA [6], [7]. Προτάθηκε επίσης ότι ορισμένες αλλαγές στο mtDNA θα μπορούσε να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία της μιτοχονδριακής αναπνευστικής αλυσίδας και να συμβάλει έτσι στην πομπή του όγκου [8], [9], [10], [11]. Για παράδειγμα, μια πρόσφατη μελέτη προτείνει ότι μεταλλάξεις του mtDNA που παράγουν το ανεπάρκεια του αναπνευστικού συστήματος συμπλόκου Ι δραστηριότητα θα μπορούσε να συμβάλει στην εξέλιξη του όγκου μέσω της ενίσχυσης της μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων [12]. Αντίθετα, ορισμένες μελέτες πρότειναν ότι η σωματική μετάλλαξη σε ιστό όγκου θα μπορούσε απλά να προκύψει τυχαία στο προγονικά κύτταρα όγκου χωρίς οποιαδήποτε φυσιολογική πλεονέκτημα ή ογκογόνο απαίτηση [13], [14]. Πράγματι, Vega και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν ότι πολλά mtDNA μεταλλάξεις ανιχνεύονται σε όγκο ήταν στην πραγματικότητα οι κοινοί πολυμορφισμοί ή μεταλλάξεων hotspots που επικρατούν στην ανθρώπινη γενικό πληθυσμό, οδηγώντας τους συγγραφείς να προτείνουν ότι αυτές οι σωματικές μεταλλάξεις είναι πιο πιθανό να είναι ουδέτερη [15]. Ομοίως, οι λειτουργικούς ρόλους ορισμένων από τις προσδιοριζόμενες σωματικών μεταλλάξεων mtDNA είχαν ερωτηθεί λόγω των προβλημάτων στην ποιότητα των στοιχείων [16] σε μεγάλο βαθμό, [17], [18]. Προφανώς, περαιτέρω στοιχεία για να διαλευκανθεί η ακριβής ρόλος που σωματικές μεταλλάξεις του mtDNA έχει το παιχνίδι στην ογκογένεση.

Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε ολόκληρο το μιτοχονδριακό γονιδίωμα διαλογής για σωματική μετάλλαξη σε ζεύγη καρκινικών και μη καρκινικών ιστών από 20 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Χρησιμοποιώντας τα ίδια μέτρα ελέγχου της ποιότητας, όπως αυτά υιοθετήθηκαν σε προηγούμενες μελέτες μας σε πλήρη αλληλούχιση του mtDNA [19], [20], [21], [22], θέλουμε να πάρετε μια βαθύτερη κατανόηση του προφίλ των σωματικών μεταλλάξεων mtDNA σε ορθοκολικό Καρκίνος. Η άμεση σύγκριση του συνόλου των ακολουθιών μιτοχονδριακού DNA των πρωτογενών καρκινικών, σε συνδυασμό παρα-καρκινικές κανονικό και μακρινό φυσιολογικούς ιστούς από τον ίδιο τον ασθενή, που συνοδεύεται με το αυστηρό έλεγχο ποιότητας δεδομένων, υιοθετείται για να αποκαλύψει ένα λεπτομερές προφίλ του mtDNA σωματικών μεταλλάξεων τόσο φυσιολογικό και ιστοί όγκου στον ίδιο ασθενή. Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψε ότι οι παρατηρούμενες σωματικές μεταλλάξεις στα δείγματα μας είναι πολύ λιγότερο συχνές από ό, τι τις προηγούμενες μελέτες. Παραδόξως, όλοι οι παρατηρούμενες σωματικές μεταλλάξεις είναι ετεροπλασμικά κατάσταση, μια παρατήρηση αρκετά διαφορετική από τις προηγούμενες μελέτες.

Αποτέλεσμα

Ένα σύνολο των 59 πλήρεις μιτοχονδριακών αλληλουχιών γονιδιώματος των τριών συνδεδεμένων ιστών από 20 καρκίνο του παχέος εντέρου ασθενών λήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη, και όλες οι αλληλουχίες έχουν κατατεθεί σε GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) με αριθμούς πρόσβασης GU392048-GU392106. Όλες οι μεταβλητές θέσεις mtDNA από κάθε ιστό έχουν εμφανίζονται σε μια σχηματική δέντρο (Σχήμα 1), η οποία θα μπορούσε να προσφέρει μια άμεση σύγκριση του συνόλου διακύμανσης μιτοχονδριακού γονιδιώματος μεταξύ τριών ιστών από τον ίδιο ασθενή και έτσι επιτρέπουν να εντοπίσει τη σωματική μετάλλαξη (ες) σε ένας ασθενής βολικά. Όπως καταδεικνύεται στο Σχήμα 1, έξι από τους 20 ασθενείς μεταφέρονται mtDNA σωματικές μεταλλάξεις σε καρκινικούς ιστούς τους, καταλαμβάνοντας πολύ μικρότερο ποσοστό (6/20? 30%) από ό, τι πολλές προηγούμενες αναφορές. Για παράδειγμα, Tan et al. Βρήκαμε 27 σωματικές μεταλλάξεις σε 14/19 ασθενείς μαστού (74%) [23]? Zhu et al. Βρήκαμε 45 σωματικές μεταλλάξεις στους 35 νουκλεοτιδίων θέση σε 14/15 ασθενείς (93%) του καρκίνου του μαστού [24]? σε Polyak et al. (1998), 7/10 (70%) του παχέος περιπτώσεις όγκων αποδειχθεί ότι φέρουν ένα έως τρεις μεταλλάξεις.

Τα ονόματα

Haplogroup εισάγεται κατά μήκος των κλάδων προσδιορισμό τις θέσεις των αντίστοιχων προγονική απλοτύπων. Οι παραλλαγές (ανακατασκευάστηκε πιο φειδωλά) για αδιάλειπτη υποκαταστήματα που αναφέρονται αυθαίρετα σε αύξουσα σειρά. Καταλήξεις «Α, C και Τ» δηλώνουν μεταστροφές, «in» υποδεικνύει μια παρεμβολή νουκλεοτιδίου? «C /T, A /C, και A /G» υποδηλώνουν ετεροπλασμικά μεταλλάξεις, «d» υποδεικνύει μία διαγραφή. Οι επαναλαμβανόμενες παραλλαγές υπογράμμισε. παραλλαγή Μήκος C-οδού γύρω θέσεις 310 και 16189 δεν ενδείκνυται στο σχήμα. Καταλήξεις «C, CP, και ΣΟ» στο δείγμα ονόματα δείχνουν «καρκινικό ιστό, παρα-καρκινικό ιστό και φυσιολογικό ιστό», αντίστοιχα.

Η

Συνολικά, υπάρχουν 18 σωματικές μεταλλάξεις εντοπίστηκαν στο 59 δείγματα ιστού υπό μελέτη (Σχήμα 1 και Πίνακας S1), καθώς και όλα τα σωματικών μεταλλάξεων συμβαίνουν απλώς επί των τερματικών κλαδιά του δέντρου phylogenic, και δεν παρατηρήθηκε απλότυπος βάρδιας. Με την εξαίρεση των γονιδίων RNA που κωδικοποιούν (συμπεριλαμβανομένων sRNA και tRNA), αυτές οι σωματικές θέσεις μετάλλαξης διασπείρονται σε ολόκληρο το γονιδίωμα mtDNA, που φαίνεται αρκετά διαφορετικό από το φάσμα μετάλλαξη παρατηρείται σε ασθενείς με μιτοχονδριακές ασθένειες [25], [26]. Συγκεκριμένα, επτά μεταλλάξεις εντοπίσει στην περιοχή της D-loop, ενώ το υπόλοιπο 11 εντοπίσετε σε περιοχές που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη. Μεταξύ των 11 κωδικοποίησης περιοχής σωματικές μεταλλάξεις, μόνο δύο (δηλαδή, G4532A και A9275G) είναι συνώνυμα μεταβάσεις που συμβαίνουν σε δύο ασταθείς περιοχές? ενώ τα υπόλοιπα εννέα μεταλλάξεις όλα είναι μη συνώνυμες αντικαταστάσεις που εντοπίσετε στις θέσεις 6718, 14288, 15332, 15447 και 15276, οι περισσότεροι εκ των οποίων είναι εξελικτικά πολύ συντηρημένες μετά από σύγκριση με τις μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων από 13 διαφορετικά είδη σπονδυλωτών (Πίνακας S1). Με την περαιτέρω αξιολόγηση της διατήρησης αυτών των πέντε μεταλλάξεων θέσεις μεταξύ των συνολικά δημοσιεύθηκε 3635 πλήρεις αλληλουχίες μιτοχονδριακού γονιδιώματος από τη γενική ανθρώπινους πληθυσμούς, τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν ότι όλα τα πέντε περιοχές είναι εξαιρετικά διατηρημένες μεταξύ των γενικών ανθρώπινων πληθυσμών, καθώς και (Πίνακας S1). Παραδόξως, παρά την υψηλή διατήρηση του site 6718, ετεροπλασμικά παραλλαγή 6718A /G παρουσιάζει τόσο ο καρκίνος και η παρα-καρκίνος φυσιολογικούς ιστούς του ασθενούς 1, εγείροντας την πιθανότητα ότι η παρα-καρκίνος φυσιολογικό ιστό ενδέχεται να έχει ήδη προσβληθεί από καρκινικά κύτταρα . Πράγματι, μια παρόμοια κατάσταση παρατηρείται σε Ασθενής 3, στην οποία ο καρκίνος και παρα-καρκινικούς ιστούς του μοιράζονται την ίδια ετεροπλασμικά παραλλαγή 16365C /T. Αυτή η παρατήρηση, και πάλι, υπογραμμίζει την ιδιαίτερη ανάγκη της συμπερίληψης του μακρινού φυσιολογικού ιστού για ανάλυση.

Περιέργως, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, οι εντοπιστούν mtDNA σωματικές μεταλλάξεις δεν περιορίζονται απλώς σε ιστούς όγκων, για κάναμε έχουν παρατηρήσει κάποιες σωματικές μεταλλάξεις στους φυσιολογικούς ιστούς των ασθενών 1, 3, 8, 14, και 20. Συγκεκριμένα, μετάβαση 14288 φαίνεται να είναι ένα επαναλαμβανόμενο σημείο μετάλλαξης, επειδή φαίνεται σε τρεις ασθενείς που ανήκουν σε διαφορετικές haplogroups. Αυτή η μη-συνώνυμη μετάλλαξη παρουσιάζει μόνο σε φυσιολογικούς ιστούς των ασθενών. Το ίδιο το 14288 το site δεν διατηρείται μεταξύ των διαφόρων ειδών, αλλά φαίνεται να είναι αρκετά συντηρημένη μεταξύ των ανθρώπινων πληθυσμών? αν αυτή η μετάλλαξη έχει λειτουργικό αποτέλεσμα είναι άγνωστο.

Σε ασθενούς 14, το site 16093 σε καρκινικούς ιστούς είναι homoplastic C, ενώ στην παρα-καρκινικές φυσιολογικό και μακρινό φυσιολογικό ιστό αυτό το site μετατοπίζει να ετεροπλασμικά ως C /T. Αυτό το πρότυπο επιβεβαιώθηκε με αποτέλεσμα δοκιμασίας DHPLC: σε θέση καρκινικό ιστό C14 16093 εμφανίζει μία απλή κορυφή, ενώ στην παρα-καρκινικές κανονικό και μακρινό φυσιολογικούς ιστούς δείχνει διπλή κορυφή (Σχήμα 2). Αξιοσημείωτο είναι ότι η ίδια η θέση 16093 είναι ένα καυτό σημείο στο γενικό πληθυσμό και μετάλλαξης σε αυτήν την περιοχή έχει επίσης βρεθεί σε κανονικό ιστό των ασθενών με καρκίνο σε άλλες μελέτες [27]. Παρόμοιο φαινόμενο συνέβη και σε 20 ασθενείς, στους οποίους μόνο μακρινό φυσιολογικό ιστό έτρεφε σωματική μετάλλαξη (δηλ., A9275G). Αυτές οι mtDNA σωματικές μεταλλάξεις μπορεί να είναι άσχετο με ογκογένεση εξετάζει την εμφάνισή τους στους φυσιολογικούς ιστούς.

Άμεση αλληλουχίας καταδεικνύουν ότι η περιοχή νουκλεοτιδίων 16093 εμφανίζει ένα homoplastic C σε καρκινικό ιστό, ενώ στην παρα-καρκίνου φυσιολογικό και μακρινό φυσιολογικό ιστό αυτό το site είναι σε ετεροπλασμικά κατάσταση των Τ /Κ. δοκιμασία DHPLC επιβεβαίωσε το αποτέλεσμα αλληλουχίας: το C14 ιστού εμφανίζει μία μόνο κορυφή, ενώ στην CP14 και CN14 δείχνει διπλή κορυφή

Η

Συζήτηση

Μέχρι σήμερα, οι περισσότερες από τις προηγούμενες μελέτες σχετικά. ο ρόλος του mtDNA σε ορθοκολικό όγκο επικεντρώθηκαν απλώς στην D-loop ή μερική τμήμα του μορίου [28], [29], [30], [31], μόνο μερικές αναφορές έχουν εστιάσει στην μεταλλακτική προφίλ σε ολόκληρο το γονιδίωμα του (Polyak et al. 1998). Για να πάρετε περισσότερες γνώσεις σχετικά με τη σχέση μεταξύ του mtDNA και του παχέος όγκου, στην παρούσα μελέτη έχουμε προσλάβει τρεις ιστούς (καρκινική, παρα-καρκινικών και φυσιολογικών ιστών) δείγματα από 20 ασθενείς με ορθοκολικό όγκο? με αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος mtDNA από κάθε ιστό και σύγκριση της μεταλλάξεως διαφορά ανάμεσα σε τρεις ιστούς από τον ίδιο ασθενή, η μελέτη μας έδειξε μια σχετικά χαμηλή συχνότητα και μεταλλάξεων της ετεροπλασμικά κατάσταση όλων των παρατηρούμενων σωματικές μεταλλάξεις. Αυτές οι παρατηρήσεις είναι αρκετά διαφορετική από τις προηγούμενες μελέτες, με έμφαση την πολυπλοκότητα στην αιτιολογία του ορθοκολικού καρκίνου.

Δεδομένου ότι οι περισσότεροι από τους ασθενείς (12/20) υπό μελέτη δεν φιλοξενούν καμία σωματική μετάλλαξη mtDNA σε καρκινικούς ιστούς τους, μια εξήγηση θα μπορούσε να είναι ότι η τροποποίηση στο πυρηνικό γονιδίωμα που έχει συμβάλει στην ογκογένεση στα δείγματα χωρίς τη συμμετοχή οποιεσδήποτε αλλαγές mtDNA. Η συχνότητα του mtDNA σωματικών μεταλλάξεων (6/20? 30%) παρατηρήθηκε σε τρέχουσα μελέτη μας, η οποία είναι συγκρίσιμη με τα προηγούμενα αποτελέσματα μας για τον καρκίνο του μαστού (2/10? 20% [22]), αλλά είναι σημαντικά χαμηλότερο (ρ & lt? 0,05 ) από τις προηγούμενες παρατηρήσεις, ειδικά εκείνες που ορθοκολικού όγκου. Για παράδειγμα, Polyak et al. Βρέθηκε ότι 7/10 (70%) ασθενείς με ορθοκολικό όγκο φορείς ενός να τρεις μεταλλάξεις [32]. Είναι πιθανό ότι η σωματική συχνότητα μετάλλαξης μπορεί να ποικίλει μεταξύ των διαφόρων εθνοτικών πληθυσμών ή συσχετίζονται με τα στάδια του καρκίνου? δοκιμή της δυνατότητας αυτής θα απαιτούσε τη συστηματική σχεδιασμός της μελέτης στο εγγύς μέλλον. Εναλλακτικά, η πολύ χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης των σωματικών μεταλλάξεων που παρατηρήθηκαν στη μελέτη μας είναι πιο εύλογα αποδίδεται στον αυστηρό έλεγχο της ποιότητας, το οποίο εγκρίθηκε κατά την παραγωγή και την ανάλυση δεδομένων. Πράγματι, όταν εξαιρέθηκαν τα πιθανά προβλήματα εντοπίζονται στις προηγούμενες μελέτες χρησιμοποιώντας ένα φυλογενετικό προσέγγιση [18], η συχνότητα των σωματικών μεταλλάξεων τότε θα μειωθεί σημαντικά.

Κατά περίεργο τρόπο, όλες οι σωματικές μεταλλάξεις εντοπίστηκαν εδώ είναι ετεροπλασμικά, η οποία είναι αρκετά διαφορετική από τις προηγούμενες παρατηρήσεις. Ιδιαίτερα, ορισμένες από τις σωματικών ετεροπλασμικά μετάλλαξη επίσης παρούσα στους φυσιολογικούς ιστούς των ασθενών με καρκίνο. Ομοίως, Taylor και οι συνεργάτες του βρήκαν επίσης mtDNA σωματικές μεταλλάξεις εις το φυσιολογικό ιστό σε ασθενείς με ορθοκολικό όγκο, και οι περισσότερες από αυτές τις μεταλλάξεις ήταν ετεροπλασμικά [33]. Για να αξιολογηθεί κατά πόσον οι ετεροπλασμικά mtDNA σωματικές μεταλλάξεις ανιχνεύονται στους φυσιολογικούς ιστούς των ασθενών με καρκίνο είναι ένα φυσιολογικό φαινόμενο, διερευνήθηκε η συχνότητα των ετεροπλασμικά σωματικές μεταλλάξεις του mtDNA στις γενικές ανθρώπινων πληθυσμών (αγκαλιάζει συνολικά 4738 ακολουθίες μιτοχονδριακού γονιδιώματος που ανακτώνται από τη βιβλιογραφία). Το αποτέλεσμά μας αποκάλυψε ότι η συχνότητα των ατόμων που φέρουν ετεροπλασμικά μετάλλαξη (ες) σωματικών mtDNA είναι μικρότερη από 4%, γεγονός που υποδηλώνει ότι ετεροπλασμία στο mtDNA από τον γενικό πληθυσμό είναι ένα σπάνιο φαινόμενο, τουλάχιστον όταν ανιχνεύεται με τη μέθοδο άμεσης αλληλουχίας του DNA [34], [ ,,,0],35], [36]. Στη συνέχεια εξετάσαμε διεξοδικά τις προηγούμενες μελέτες για την μετάλλαξη mtDNA σε διάφορους τύπους όγκων και διαπίστωσαν ότι ετεροπλασμικά σωματικές μεταλλάξεις του mtDNA παρατηρήθηκαν επίσης στους φυσιολογικούς ιστούς των ασθενών με καρκίνο [9], [22], [27], [33], [37] , με μια σημαντική υψηλότερη συχνότητα (38,6%) από ό, τι στο γενικό πληθυσμό (3,2%? ρ & lt? 0.001), αλλά εξακολουθεί να είναι χαμηλότερο από εκείνο του καρκινικού ιστού (52,9%? ρ & lt? 0,05) (Πίνακας S2). Δεδομένου ότι κάθε άτομο χαρακτηρίζεται από ένα μίγμα των σχετικών μιτοχονδριακών απλοτύπων, και ευρέως διαδεδομένη ετεροπλασμία στα mtDNAs διαφόρων φυσιολογικών ανθρώπινων ιστών δεν έχουν παρατηρηθεί [27], [38], [39], [40]. Είναι πιθανό ότι η παρατηρούμενη διαφορά στις συχνότητες των μεταλλάξεων ετεροπλασμικά μεταξύ του φυσιολογικού ιστού των ασθενών όγκου και του γενικού πληθυσμού (κοινώς υιοθέτηση περιφερικό αίμα τους) αποδίδεται στην ετεροπλασμία μεταξύ διαφορετικών ιστών. Εναλλακτικά, η αυξημένη συχνότητα ετεροπλασμικά μετάλλαξης, τόσο καρκινικούς και συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς σε ασθενείς με όγκο σε σχέση με τον γενικό πληθυσμό (Πίνακας S2), θα μπορούσε να προκύψει από μία αλλοιωμένη φυσιολογικό περιβάλλον (ίσως το αυξημένο επίπεδο ROS, ή κάποια άλλα άγνωστα μεταλλαξιογόνες). Για παράδειγμα, Goodwin et al. (2008) βρήκαν ότι τόσο όγκου και συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη εμφανίζουν σημαντικά υψηλότερη έκφραση της σπερμίνης οξειδάσης [41], το οποίο έχει συνδεθεί με αυξημένη ROS και βλάβη του DNA [42], [43], έναντι ιστούς από ασθένειες του προστάτη δωρεάν ασθενείς.

Εκ των υστέρων, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το μιτοχονδριακό DNA μετάλλαξη με δυναμικό λειτουργικό αποτέλεσμα θα μπορούσε να συμβάλει στην πομπή του όγκου [8], [12]. Στην παρούσα μελέτη, που εντοπίστηκαν σωματικές μεταλλάξεις του mtDNA στην περιοχή κωδικοποίησης όλα βρίσκονται σε εξελικτικά πολύ συντηρημένες περιοχές. Ως εκ τούτου, φαίνεται πιθανό ότι αυτές οι σωματικές μεταλλάξεις, αν και όλα σε ετεροπλασμικά, θα μπορούσε να παίξει μερικές ρόλους στην επηρεάζουν τη λειτουργία των αναπνευστικών αλυσίδας και ως εκ τούτου έχουν κάποια βιοχημική λειτουργικό αποτέλεσμα σε κύτταρο ξενιστή. Ωστόσο, δεδομένου ότι οι περισσότεροι από τους ασθενείς δεν φιλοξενούν σωματικές μεταλλάξεις στα καρκινικούς ιστούς, αν η λειτουργική επίδραση αυτών των σωματικών μεταλλάξεων είναι αναγκαία για το κύτταρο ξενιστή παραμένει άγνωστη. Όσον αφορά τις σωματικές μεταλλάξεις του mtDNA υπάρχει σε φυσιολογικούς ιστούς, θα πρέπει να αντικατοπτρίζουν ένα αλλαγμένο μικροπεριβάλλον για την mtDNA. Είτε αυτές τις μεταλλάξεις, καθώς και την αλληλεπίδραση με την αλλαγμένη μικροπεριβάλλον, θα μπορούσε να αυξήσει την ευαισθησία για ένα κύτταρο να ογκογένεση είναι άγνωστη.

Συνολικά, η κατανόηση της σχέσης μεταξύ του mtDNA σωματικές μεταλλάξεις και καρκινογένεση είναι ένα δύσκολο έργο, διότι στρατηγικές που απευθείας εκτίμηση μοίρα των κυττάρων ή τον εντοπισμό της λεπτομερούς διαδικασίας και των δύο γεγονότα είναι ακόμα ανέφικτη in vivo. Με την άμεση σύγκριση των mtDNA παραλλαγή γονιδιώματος σε τρία ζεύγη ιστούς από τον ίδιο ασθενή, η μελέτη μας θα μπορούσε να παρέχει ένα εκτεταμένο προφίλ της σωματικής μετάλλαξης mtDNA σε ασθενή με όγκο. Μια χαμηλή συχνότητα μετάλλαξης σωματικών mtDNA εντοπίστηκε στα παχέος ασθενείς και όλοι οι μεταλλάξεις ήταν ετεροπλασμικά. Εν τω μεταξύ, μερικές σωματικές μεταλλάξεις θα μπορούσαν να υπάρχουν στο φυσιολογικό ιστό που δείχνει ότι αυτές οι σωματικές μεταλλάξεις δεν είναι συνέπεια της ογκογένεσης, και θα μπορούσε να αντανακλά μια αλλαγή φυσιολογικό περιβάλλον για την mtDNA σε ασθενή με όγκο.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα

Ένα σύνολο από 59 δείγματα ιστών συλλέχθηκαν σε αυτή τη μελέτη, συμπεριλαμβανομένων των πρωτογενών παχέος καρκινικούς ιστούς (C1-C10), που αντιστοιχεί παρα-καρκινικούς φυσιολογικούς ιστούς (CP1-CP10) και μακρινό φυσιολογικούς ιστούς (CN1-CN10), που ελήφθησαν από 20 Κινέζους ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης με ενημερωμένη συγκατάθεση. Το καρκινικό ιστό επιβεβαιώθηκε με HE-χρώση διαφάνειες του κατεψυγμένου τμήματος μετά την επέμβαση, ενώ η παρα-καρκινικό φυσιολογικό ιστό ελήφθη από το φυσιολογικό ιστό που περιβάλλει τον καρκίνο, και το μακρινό κανονικός ιστός είναι τουλάχιστον 5 cm μακριά από την άκρη της καρκινικό ιστό. Όλοι οι ασθενείς με κλινική διάγνωση με το στάδιο Ι (Τ1-Τ2, N0, M0) ορθοκολικού καρκίνου σύμφωνα με την κλινική πρότυπο για την κατηγορία του καρκίνου [44]. Δεδομένου ότι ο κύριος στόχος της μελέτης μας είναι να εντοπίσουμε την λεπτή διαφορά μεταξύ του καρκίνου και των αντιστοιχεί φυσιολογικούς ιστούς από την άποψη του μιτοχονδριακού γονιδιώματος, επομένως λαμβάνονται μόνο οι παχέος φυσιολογικούς ιστούς (συμπεριλαμβανομένων των παρα-καρκινικές και μακρινό φυσιολογικούς ιστούς) από τον ίδιο ασθενή υπόψη. Η παρα-καρκινικό φυσιολογικού ιστού δεν ήταν διαθέσιμη για Ασθενών 19. Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με την Διακήρυξη του Ελσίνκι.

ενίσχυση του DNA και αλληλούχιση

Σύνολο γονιδιακό DNA ήταν αντίστοιχα εξάγεται από την παρά- καρκινικό ιστό, πρωτογενή καρκινικό ιστό και μακρινό κανονικό ιστό χρησιμοποιώντας την πρότυπη μέθοδο φαινόλης /χλωροφορμίου. Το σύνολο γονιδιώματα mtDNA ενισχύθηκαν και αλληλουχήθηκαν, όπως περιγράφεται πλήρως σε προηγούμενες μελέτες μας [19], [20], [21], [22]. δεδομένα αλληλουχίας επιμελήθηκε και ευθυγραμμισμένο με τη χρήση του λογισμικού DNASTAR (DNAStar Inc., Madison, Wisc.), καθώς και μεταλλάξεις βαθμολογήθηκαν σε σχέση με την αναθεωρημένη σειρά Cambridge αναφοράς (rCRS) [45]. Η φυλογενετική κατάσταση κάθε μιτοχονδριακού DNA προσδιορίστηκε σύμφωνα με την ανακατασκευή της Ανατολικής Ασίας mtDNA φυλογένεση [20], [46], και οι σχέσεις τους ήταν απεικονίζεται μέσω ενός σχηματική φυλογενετικό δέντρο (Εικόνα 1).

Ποιοτικός έλεγχος

Για να αποφευχθούν πιθανά προβλήματα και τα λάθη που παρατηρήθηκαν στις δημοσιευμένες μελέτες της νόσου του mtDNA [18], [47], [48], [49], μια διαδικασία αυστηρό ποιοτικό έλεγχο [19], [20], [21 ] χρησιμοποιήθηκε κατά τη διάρκεια του χειρισμού του δείγματος και την παραγωγή δεδομένων. Επιπλέον, για να αποφευχθεί πλήρως τεχνητή ανασυνδυασμός προκαλείται από δείγμα μπέρδεμα ή μόλυνση [18], [50], το κάθε δείγμα ιστού ενισχύθηκε και προσδιορίστηκε η ακολουθία ξεχωριστά όπως έχουμε κάνει στο παρελθόν [22].

Προσδιορισμός ετεροπλασμία από DHPLC

Για την παρατηρούμενη ετεροπλασμικά μετάλλαξη κατά τη διάρκεια της άμεσης αλληλουχίας του DNA, μπορούμε να επιβεβαιώνεται περαιτέρω από μετουσίωση υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (DHPLC) (Σχήμα 2).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακας S1.

σωματικά mtDNA μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε 20 παχέος ασθενείς

doi: 10.1371 /journal.pone.0021613.s001

(DOC)

Πίνακας S2.

Σύγκριση της συχνότητας των ατόμων που φέρουν μεταλλάξεις ετεροπλασμικά mtDNA σε φυσιολογικό πληθυσμό και σε ασθενείς με καρκίνο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0021613.s002

(DOC)

Ευχαριστίες

Είμαστε ευγνώμονες σε όλους τους συμμετέχοντες σε αυτή την έρευνα. Θα θέλαμε επίσης να αναγνωρίσουμε Shi-Fang Wu και Chun-Ling Zhu για τη βοήθειά τους σε πειράματα. Ευχαριστούμε τους ανώνυμους αναθεωρητές για τα χρήσιμα σχόλια για την προηγούμενη έκδοση του χειρογράφου.