Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη είναι μια ετερογενής ομάδα ασθενειών και υπάρχει ανάγκη για περισσότερη αποτελεσματική και στοχευμένη μεθόδους θεραπείας. Σε αυτή τη μελέτη, το δυναμικό της τεχνικής δεδομένα γονιδιακής έκφρασης και παρεμβολή RNA συνενώθηκαν για να προωθήσει τις μελλοντικές εξατομικευμένες θεραπευτικές του καρκίνου του προστάτη. Να διακρίνει τα πιο ελπιδοφόρα

in vivo

επικυρωμένες στόχων φαρμάκων καρκίνου του προστάτη, μια βιοπληροφορική ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας δεδομένα γονιδιακής έκφρασης γονιδιώματος σε επίπεδο από 9.873 δείγματα ανθρώπινου ιστού. Συνολικά, επελέγησαν 295 γονίδια για περαιτέρω λειτουργικές μελέτες σε καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου του προστάτη, λόγω της υψηλής έκφρασης του mRNA τους σε προστάτη, καρκίνο του προστάτη ή σε μεταστατικό καρκίνο του προστάτη δείγματα. Δεύτερον, δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας RNAi βασισμένη διεξήχθη σε VCAP και LNCaP κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Με βάση τα αποτελέσματα siRNA, τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης σε ανθρώπινους ιστούς και καινοτομία, η λειτουργία του ενδοπλασματικού δικτύου συνδέονται στόχους

AIM1

,

ERGIC1

και

TMED3

, καθώς και της μίτωσης ρυθμίζουν

επιλέχθηκαν TPX2

για περαιτέρω επικύρωση.

AIM1

,

ERGIC1

, και

TPX2

δείχθηκε να είναι ιδιαίτερα εκφράζεται ειδικά σε ιστούς καρκίνου του προστάτη, και η έκφραση του mRNA του υψηλής

ERGIC1

και

TMED3

που σχετίζονται με

AR

και em

ERG

ογκογόνο έκφραση.

ERGIC1

φίμωση ειδικά ρυθμίζεται ο πολλαπλασιασμός των

ERG

ογκογονιδίου θετικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη και ανέστειλε την έκφραση ERG mRNA σε αυτά τα κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι είναι ένας ισχυρός στόχος των ναρκωτικών στην ERG θετική υποομάδα των καρκίνων του προστάτη.

TPX2

έκφραση που σχετίζεται με την αποτυχία PSA και

TPX2

αποσιώπηση μειωμένη έκφραση του PSA, υποδεικνύοντας ότι TPX2 ρυθμίζει σηματοδότηση με τη μεσολάβηση υποδοχέα ανδρογόνων. Συμπερασματικά, η συνδυαστική χρήση των τεχνικών RNAi μικροσυστοιχιών και απέδωσε σε ένα μεγάλο αριθμό πιθανών νέων βιολογικών δεικτών και θεραπευτικών στόχων, για τη μελλοντική ανάπτυξη στοχευμένων και εξατομικευμένων προσεγγίσεων για τη διαχείριση του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Vainio P, Mpindi JP , Kohonen P, Fey V, Mirtti Τ, Alanen ΚΑ, et al. (2012) High-Throughput Transcriptomic και RNAi ανάλυση εντοπίζει

AIM1

,

ERGIC1

,

TMED3

και

TPX2

ως πιθανοί στόχοι φαρμάκων στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 7 (6): e39801. doi: 10.1371 /journal.pone.0039801

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Οκτώβρη του 2011? Αποδεκτές: 31η Μάη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 28, Ιουνίου του 2012

Copyright: © 2012 Vainio et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη έχει υποστηριχθεί από Marie Curie Canceromics (MEXT-CT-2003-2728), έργο ΕΕ-PRIMA (σύμβαση # LSHC-CT-204 – 504.587), TIME έργο συνεργασίας, Καρκίνο Οργανώσεις της Φινλανδίας, Sigrid Ίδρυμα Juselius, Ακαδημία της Φινλανδίας και Drug Discovery Graduate School στο Πανεπιστήμιο του Turku. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται κακοήθεια και η δεύτερη πιο κοινή αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στον δυτικό πληθυσμό αρσενικών [1]. Ωστόσο, οι καρκίνοι του προστάτη αποτελούν μια ετερογενή ομάδα παθήσεων και ορισμένοι άνδρες εξακολουθούν να έχουν διαγνωστεί με υψηλής ποιότητας ασθένεια και τελικά να αποτύχει θεραπεία [1], [2]. Παρά τη φαινοτυπική και μοριακή ετερογένεια της ασθένειας υπάρχει έλλειψη ισχυρών και ειδικών προγνωστική βιοδείκτες για τη διάκριση μεταξύ νωχελικός και επιθετικών καρκίνων σε πρώιμα στάδια της νόσου. Επιπλέον, λόγω της έλλειψης αποτελεσματικών προγνωστικών και θεραπευτικών βιοδείκτες, καθώς και στοχευμένες θεραπευτικές ουσίες, η κλινική διαχείριση είναι ακόμα μακριά από εξατομικευμένες.

Εκτός από τη ρύθμιση της ανάπτυξης και συντήρησης του προστάτη, ανδρογόνα τη στήριξη της ανάπτυξης και της ανάπτυξης των περισσότερων πρωτογενών καρκίνων του προστάτη, και του υποδοχέα ανδρογόνων (AR) παίζει το ρόλο ενός ογκογονιδίου σε καρκίνο του προστάτη [3] – [7]. Κατά συνέπεια, ανδρογόνων είναι σήμερα η θεραπεία επιλογής για προχωρημένο καρκίνο του προστάτη. Ωστόσο, αν και ανδρογόνων απόφραξη οδηγεί αρχικά σε μια καλή ανταπόκριση στη θεραπεία, είναι σχεδόν ποτέ θεραπευτική [2]. Ανδρογόνο-ανεξάρτητες καρκινικά κύτταρα συνήθως αρχίζουν να εμφανίζονται κατά τη διάρκεια της θεραπείας, οδηγώντας τελικά σε επαναλαμβανόμενες, ορμόνη-ανθεκτική νόσο [8], [9]. Εκτός από την επικρατούσα μεταβολές στην έκφραση AR και λειτουργία, περίπου το ήμισυ των δειγμάτων καρκίνου του προστάτη φιλοξενούν ένα ογκογόνο γονίδιο σύντηξης που συνδυάζουν ανδρογόνα ρυθμίζονται διαμεμβρανική πρωτεάση σερίνης 2 (

TMPRSS2

) με ογκογόνο παράγοντες μεταγραφής ETS [10]. Πιο συχνά, ο εταίρος σύντηξης είναι

ERG

(v-ETS ιό ερυθροβλάστωση E26 ογκογονίδιο ομόλογο, γρίπη), ακολουθούμενο από

ETV1

(παραλλαγή ETS 1),

ETV4

, και

ETV5

[11] – [13]. ERG mRNA δεν εκφράζεται σε υγιείς ιστούς του προστάτη, αλλά ως αποτέλεσμα της

TMPRSS2-ERG

γονίδιο σύντηξης νωρίς στην καρκινογένεση, μια σημαντική αύξηση στα επίπεδα μεταγραφής ERG μπορεί να ανιχνευθεί σε καρκίνους του προστάτη. συντήξεις γονιδίου ETS προωθήσει πολλαπλές οδούς σηματοδότησης που σχετίζονται με τον σχηματισμό και την εξέλιξη του καρκίνου, και έκτοπη

ERG

ογκογονίδιο έκφρασης έχει συσχετισθεί με ένα συγκεκριμένο μοριακό υπογραφή στον καρκίνο του προστάτη [14] – [19]. Αν και

ERG

διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση ογκογόνες διαδικασίες μπορεί να παρακαμφθεί σε προχωρημένο καρκίνο του προστάτη, ορμόνη-ρυθμιζόμενη έκφραση του

ERG

έχει περιγραφεί να επιμένουν επίσης σε ανθεκτικά ευνουχισμό καρκίνο του προστάτη, υποστηρίζοντας τη σημασία αυτής της αναδιάταξης επίσης, σε προχωρημένο στάδιο της νόσου [15], [20], [21]. Στο σύνολό τους, συντήξεις ETS είναι βασικές μοριακές μεταβολές οδηγούν στην ανάπτυξη και την πρόοδο της διακριτής κατηγορίας καρκίνων του προστάτη, και ως εκ τούτου θα μπορούσαν να ωφεληθούν από στοχευμένη θεραπεία.

Τα τελευταία χρόνια προηγμένων τεχνικών μοριακής γενετικής σε συνδυασμό με την ανάπτυξη των νέων βιοπληροφορική ανάλυση εργαλεία έχουν προσφέρει αποτελεσματικούς τρόπους για να εξετάσει τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης του όγκου, το οποίο διευκολύνει την ανακάλυψη βιοδεικτών, καθώς και τον εντοπισμό των πιθανών νέων φαρμακευτικών στόχων. προφίλ γονιδιακής έκφρασης επιτρέπει βελτιωμένη διάγνωση και σταδιοποίηση της νόσου, παρέχει πληροφορίες σχετικά με τις αντιδράσεις της θεραπείας και οδηγεί σε μειωμένες παρενέργειες [22], [23]. Παρεμβολή RNA (RNAi) τεχνική επιτρέπει την εξερεύνηση της λειτουργικής αποτέλεσμα των μεμονωμένων γονιδίων για τα χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων, όπως η ανάπτυξη και επιβίωση, περαιτέρω προώθηση της ανάπτυξης στοχοθετημένων και εξατομικευμένη θεραπευτικών [24] – [26]. Σε αυτή τη μελέτη, το δυναμικό των τεχνικών αυτών συνδυάστηκε με προ-επιλέγοντας τα γονίδια για RNAi λειτουργικές δοκιμασίες χρησιμοποιώντας δεδομένα γονιδιακής έκφρασης. Για τον προσδιορισμό των δυνητικών σημείων παρούσα σε καρκίνους του προστάτη, μια βιοπληροφορική ανάλυση έκφρασης mRNA για πρώτη φορά πραγματοποιείται με βάση 9873 δειγμάτων ανθρώπινου ιστού, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη 349 και 147 μη κακοήθη δείγματα προστάτη, για τη διάκριση του προστάτη και του καρκίνου του προστάτη ιστών ειδικών γονιδίων. Δεύτερον, μια RNAi υψηλής απόδοσης (ΗΤ) λειτουργική προφίλ των επιλεγμένων

in vivo

επικυρωμένες πιθανοί στόχοι φαρμάκων διεξήχθη σε καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές VCAP και LNCaP, προκειμένου να προσδιοριστούν τα γονίδια και τις οδούς ουσιώδης για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη και την επιβίωση. Τα αποτελέσματα, επισήμανε τη δυνατότητα στόχευσης ενδοπλασματικό δίκτυο (ER), οξείδωση, ακτίνης του κυτταροσκελετού και μίτωση στη διαχείριση του καρκίνου του προστάτη, και περαιτέρω επικύρωση προσδιορίζεται

AIM1

(απουσιάζει στο μελάνωμα 1),

ERGIC1

( ενδοπλασματικό δίκτυο-Golgi ενδιάμεσο διαμέρισμα πρωτεΐνη 1),

TMED3

(διαμεμβρανική emp24 τομέα πρωτεΐνη μεταφοράς που περιέχει 3) και

TPX2

(στόχευση πρωτεϊνών για Xklp2) ως πιθανοί στόχοι νέου φαρμάκου για τον καρκίνο του προστάτη.

Μέθοδοι

in silico

Data Mining

Η βάση δεδομένων GeneSapiens [27] εφαρμόστηκε για να εξερευνήσετε bioinformatically τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε όλη 9783 δείγματα ανθρώπινου ιστού. Εν συντομία, GeneSapiens (https://www.genesapiens.org/) είναι μια συλλογή από 9873 πειράματα Affymetrix μικροσυστοιχιών. Όλα τα δείγματα reannotated και κανονικοποιούνται με ένα προσαρμοσμένο αλγόριθμο. Τα δεδομένα που συλλέγονται από διάφορες πηγές διαθέσιμες στο κοινό, συμπεριλαμβανομένης της γονιδιακής έκφρασης Omnibus και Array-Express και καλύπτει 175 διαφορετικά είδη ιστών. Η μέση έκφραση του κάθε γονιδίου προσδιορίστηκε σε καρκίνο προστάτη (n = 349), υγιή προστάτη (n = 147), και όλα τα δείγματα φυσιολογικού ιστού (n

=

1476). Τα δεδομένα από δείγματα καρκίνου του προστάτη διαθέσιμη στη βάση δεδομένων GeneSapiens χρησιμοποιήθηκαν επίσης στο

in silico

αναλύσεις συνέκφραση. Οι σχολιασμοί οντολογία λειτουργικού γονιδίου αναλύθηκαν για τις συν-εκφρασμένων γονιδίων (R & gt? 0,5 ​​και P & lt? 0.001) χρησιμοποιώντας DAVID λειτουργικό εργαλείο σχολιασμού [28] και την εφευρετικότητα Pathway Ανάλυση (IPA) Λογισμικό (Ingenuity Systems Inc., Redwood City, CA, ΗΠΑ).

Cell Culture

vcap προστάτη καρκινικά κύτταρα ελήφθησαν από Kenneth Pienta (Πανεπιστήμιο του Michigan, MI) ή αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (LGC Promochem ΑΒ, Borås, Σουηδία) και αναπτύσσονται σε μέσο RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA). LNCaP κύτταρα ελήφθησαν από τον Dr. Marco Cecchini (University of Βέρνη, Ελβετία) και διατηρήθηκαν σε Τ-Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA). PC-3, DU145 και MDA-PCA-2b κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (LGC Promochem ΑΒ), και τα κύτταρα 22Rv1 από Deutsche Sammlung νοη Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Braunschweig, Γερμανία). Οι μη κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη EP156T ελήφθησαν από το Δρ Βάρδα Rotter (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Ισραήλ) και RWPE-1 κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (LGC Promochem ΑΒ). Πρωτογενή προστάτη επιθηλιακά κύτταρα (PrEc) αγοράστηκαν από την Lonza (Lonza Group Ltd, Βασιλεία, Ελβετία). Ανεξάρτητου από ανδρογόνα LNCaPs και τη γονική ομολόγων τους ελήφθησαν από τον Dr. Zoran Culig (Innsbruck Medical University, Αυστρία) και αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 (Invitrogen) που περιέχει απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα ή φυσιολογικό ορό εμβρύου μόσχου, αντίστοιχα. Συνθετικά ανδρογόνα R1881 αγοράστηκε από την PerkinElmer.

Gene knock-down Χρησιμοποιώντας παρεμβολή RNA

Πριν από τον έλεγχο, ο αριθμός των κυττάρων τιτλοδοτήθηκε για τόσο VCAP και LNCaP κύτταρα χωριστά ώστε να εξασφαλισθεί ότι κυτταρικού πολλαπλασιασμού παρέμεινε σε γραμμική -exponential φάση σε όλο το πείραμα. Για τις μελέτες RNAi, τέσσερα siRNAs ανά γονίδιο (HP GenomeWide, Qiagen) απλώθηκαν πάνω σε πλάκες 384 φρεατίων (Greiner Βίο-One, Frickenhausen, Γερμανία), που ακολουθείται από προσθήκη του παράγοντα μορφομετατροπής (λιπιδικό αντιδραστήριο siLentFect? Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) σε μέσο Opti-ΜΕΜ (Invitrogen) και κατάλληλη ποσότητα των κυττάρων (1500-2000 ανά φρεάτιο), με τη χρήση αυτοματοποιημένων ρομπότ χειρισμού υγρών (Hamilton) και διανομέα υγρού (ThermoFisher). Η τελική συγκέντρωση siRNA ήταν 13 nM. Allstars αρνητικού ελέγχου (ομελέτα siRNA, Qiagen) και λιπιδίων χρησιμοποιήθηκαν μόνο ως αρνητικοί μάρτυρες, τα siRNA έναντι

KIF11

(κινεσίνη μέλος της οικογένειας 11? SI02653770) και

PLK1

(πόλο-όπως κινάση 1? SI02223844) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι. Για τα κύτταρα πειράματα επικύρωσης επιμολύνονται με δύο siRNAs ανά γονίδιο (

AIM1

: SI03126704, SI03212846?

ERGIC1

: SI03164763, SI04302872?

TMED3

: SI00746711, SI00746718?

TPX2

:. SI00097188, SI00097195) όπως περιγράφεται παραπάνω στις κατάλληλες πλάκες

κυττάρων η βιωσιμότητα και η απόπτωση Δοκιμασία

CellTitre-Μπλε (CTB) και CellTiter-Glo (CTG) κυττάρων δοκιμασίες βιωσιμότητας (Promega), και ApoONE απόπτωση (επαγωγή της κασπάσης -3 και 7 δραστηριότητες) δοκιμασία (Promega) διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή σε απόκριση σε 48 ώρες ή θεραπεία siRNA 72 ώρες. Τα αποτελέσματα σαρώθηκαν με EnVision Multilabel platereader (PerkinElmer /Wallac).

Κανονικοποίηση και στατιστική ανάλυση των siRNA οθόνη αποτελεσμάτων

Οι πρώτες αποτελέσματα που προέκυψαν από αναλύσεις βιωσιμότητας των κυττάρων και την απόπτωση ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το

Β

-score [29], και siRNAs μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων από -2 SD από τη διάμεση τιμή των ελέγχων (που αντιστοιχούν σε Ρ & lt? 0,05) σε τουλάχιστον δύο από τις οθόνες ή επαγωγή απόπτωσης από 3 SD (που αντιστοιχούν σε Ρ & lt? 0,01) θεωρήθηκαν αντι-πολλαπλασιαστική ή προ-αποπτωτικών siRNAs χτύπημα.

ιστός κλινικά δείγματα προστάτη

Τα δείγματα όγκου 33 πρωτοβάθμια προστάτη (19 ERG ογκογονίδιο θετικά και 14 αρνητικά ERG) και 3 μη-κακοήθεις του προστάτη τα δείγματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη έχουν περιγραφεί προηγουμένως [30]

ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφάσης

Η επικύρωση των επιπέδων έκφρασης του mRNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας TaqMan PCR ποσοτικών ανάστροφης μεταγραφάσης (qRT-PCR) ανάλυση (. μικροσυστοιχιών Κέντρο φινλανδική DNA, Κέντρο Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου του Turku). RNA δείγματα εκχυλίζονται με RNeasy Mini Kit (Qiagen) έχουν αντίστροφα μεταγράφεται προς cDNA (High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems) και τα δείγματα της αντίδρασης PCR αναλύθηκαν σε 96 φρεατίων ή 384 φρεατίων. Ποσοτική RT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ΑΒΙ Prism 7900 (Applied Biosystems) και ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του

μέθοδος ΔΔCT με RQ διαχειριστής 1,2 λογισμικό (Applied Biosystems). Τρία όμοια δείγματα μελετήθηκαν για την ανίχνευση της έκφρασης του mRNA στόχου και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένα ενδογενές ελέγχου. Οι εκκινητές και ανιχνευτές σχεδιάστηκαν και επιλέγονται με τη βοήθεια της Universal ProbeLibrary Assay Design Center (Roche Diagnostics) (Υποστηρικτικά Πίνακας S1).

Ανάλυση Western Blot

λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας λύσεως ρυθμιστικό διάλυμα (62,5 mM Tris, 1% SDS, 5%, β-μερκαπτοαιθανόλη 10% γλυκερόλη, κυανούν βρωμοφαινόλης). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν περιελάμβαναν αντι-AR (1:1,000, NeoMarkers, Thermo Fisher Scientific Inc., Fremont, CA), αντι-PSA (1:1,000, A0562, DakoCytomation, Glostrup, Δανία), καθώς και οι δευτερογενείς Alexa Fluor (1: 4000, Molecular Probes, Invitrogen) αντισώματα. β-ακτίνης (1:5,000, αντίσωμα από την Sigma) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Το σήμα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας Οδύσσεια Infrared System Imaging (LI-COR Biosciences, Lincoln, ΝΕ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Στατιστική Ανάλυση

Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση t-test του Student (*, Ρ & lt? 0,05? **, Ρ & lt? 0,01? ***, Ρ & lt? 0.001) και ο συντελεστής συσχέτισης Pearson

Αποτελέσματα

Υψηλή. -throughput Screening Αποτελέσματα αναδείξει το ρόλο των ενδοπλασματικό δίκτυο και Μίτωση Σχετικές γονίδια στη ρύθμιση του καρκίνου του προστάτη κυτταρικής ανάπτυξης και επιβίωσης

για να επιλέξετε

in vivo

επικυρωμένες πιθανών φαρμακευτικών στόχων και βιολογικών δεικτών για περαιτέρω σπουδές σε καλλιεργημένα προστάτη καρκινικά κύτταρα τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης στη βάση δεδομένων GeneSapiens χρησιμοποιήθηκε. Συνολικά, επιλεγμένα 295 προστάτη ή /και καρκίνου του προστάτη ειδικών γονιδίων βασίστηκαν σε έκφραση υψηλού mRNA στον προστάτη, ο καρκίνος του προστάτη ή σε δείγματα ιστού μεταστατικό καρκίνο του προστάτη, και μια βιβλιοθήκη siRNA κατασκευάσθηκε για λειτουργικές μελέτες (Εικόνα 1). Για τις μελέτες RNAi 4 siRNAs ανά γονίδιο αγοράστηκαν και οθόνες siRNA HT πλάκα βασίζεται έγιναν με κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη vcap και LNCaP. Vcap είναι ένα μοντέλο για TMPRSS2-ERG θετικό καρκίνο του προστάτη, που εκφράζει άγριου τύπου AR, ενώ LNCaPs λιμάνι ένα μεταλλαγμένο

AR

(T877A) με εκτεταμένη εξειδίκευση συνδέτη. Για τον προσδιορισμό των θεραπευτικά σχετικών γονιδίων και μονοπατιών στην καρκινογένεση του προστάτη, οι αλλαγές στη βιωσιμότητα των κυττάρων και την επαγωγή της απόπτωσης (κασπάσης -3 και 7 ενεργοποίησης) μελετήθηκαν ως τα τελικά σημεία (Στήριξη Πίνακας S2).

Μια παρουσίαση Heatmap της τα μέσα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης των γονιδίων 295 (χ-άξονας) που επιλέγεται για περαιτέρω RNAi εξερεύνηση σε όλους τους ιστούς (υγιείς και κακοήθεις) που υπάρχουν στη βάση δεδομένων GeneSapiens (γ-άξονας). έχουν εμφαίνεται η θέση του καρκίνου του προστάτη (άνω αστερίσκος) και υγιή προστάτη (κατώτερο αστερίσκο). Το χρώμα απεικονίζει το επίπεδο έκφρασης σε διάφορους ιστούς, και γκρι τιμές που λείπουν. Ο θερμικός χάρτης έχει συνταχθεί με βάση την χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση.

Η

Η οθόνη siRNA βιωσιμότητα των κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε τρεις επαναλήψεις και ο προσδιορισμός της απόπτωσης μία φορά στις δύο κυτταρικές σειρές. Οι θετικές siRNAs έλεγχος στόχευσης γνωστό κλειδί ρυθμιστές της προόδου μιτωτικής καθώς και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη, KIF11 και PLK1 [31], [32], ήταν σε θέση να μειώσει σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα (Σχήμα 2Α) επιβεβαιώνοντας έτσι την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Οι οθόνες επαναληπτικές κυτταρικής βιωσιμότητας συσχετίζεται θετικά (0,67 & lt? R & lt? 0,78 σε LNCaP και 0,36 & lt? R & lt? 0,66 σε VCAP) σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές που υποστηρίζουν τη λειτουργικότητα των πρωτογενών οθονών (Σχήμα 2Β και Υποστήριξη Πίνακας S2).

Α. Επισκόπηση της κανονικοποιημένης LNCaP και vcap αποτελέσματα οθόνη βιωσιμότητα των κυττάρων (Β-score). Τα αποτελέσματα από τις θετικές siRNAs ελέγχου (KIF11 και PLK1) που αναφέρεται στην μπλε, αρνητικά φρεάτια αναφοράς (Allstars αρνητικός κωδικοποιημένο siRNA και ρυθμιστικό μόνο) σε πράσινο, και siRNAs γονιδίου στόχου σε γκρι. B. Μια παρουσίαση heatmap των αποτελεσμάτων της οθόνης βιωσιμότητα των κυττάρων (Β-score). Η δοκιμασία επανελήφθη τρεις φορές και στα δύο LNCaP και κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη VCAP. Το μπλε χρώμα υποδεικνύεται μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων, κόκκινο αυξημένη βιωσιμότητα των κυττάρων. Ο θερμικός χάρτης έχει συνταχθεί με βάση την χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση. C. Η επικάλυψη μεταξύ των γονιδίων hit οθόνη RNAi (μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων σε απόκριση προς φίμωση) σε κυτταρικές σειρές LNCaP και vCap. Δ

Σε silico

ανάλυση συν-έκφραση των γονιδίων hit κυτταρικής βιωσιμότητας σε δείγματα καρκίνου του προστάτη. Τα γονίδια οργανώνονται με την ίδια σειρά στα δύο y- και άξονα χ και οι συσχετίσεις (R) μεταξύ των γονιδίων υποδεικνύονται με τα χρώματα. Κόκκινο δείχνει θετική συσχέτιση, μπλε αρνητική συσχέτιση.

Η

Οι οθόνες siRNA είχε ως αποτέλεσμα 94 δυναμικό πολλαπλασιασμού προώθηση (χτυπήματα σε τουλάχιστον δύο από τις οθόνες κυτταρικής βιωσιμότητας) και 97 αντι-αποπτωτικών γονιδίων σε κύτταρα LNCaP. Από το 94 αναπαραχθεί γονίδια χτύπημα βιωσιμότητα των κυττάρων 45 (47,9%) ήταν επίσης αντι-αποπτωτικά. Σε κύτταρα vcap το τελικό ποσοστό επιτυχίας ήταν 35 αναπαραγόμενες πολλαπλασιασμό προώθηση και 34 αντι-αποπτωτικών γονιδίων χτύπημα, 9 (25,7%), εκ των οποίων προωθείται η βιωσιμότητα των κυττάρων και να προστατεύεται από την απόπτωση. Αποσιώπηση του 17 γονιδίων οδήγησε σε μια αντι-πολλαπλασιαστική απόκριση και στα δύο κύτταρα LNCaP και vCap. (Εικόνα 2Β-C και Υποστήριξη Πίνακας S2).

Το

in silico

ανάλυση συν-έκφραση των γονιδίων πολλαπλασιασμό χτύπημα (n = 112) πρότεινε τρεις μεγάλες καρκίνο του προστάτη υπο-ομάδες με διαφορετικούς μηχανισμούς για ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης. Το μεγαλύτερο σύνολο γονιδίων είχε ένα ρόλο στην ER και τη συσκευή Golgi, ανάπτυξη του προστάτη αδένα, καθώς και σε μείωση της οξείδωσης. Οι άλλες υποομάδες του καρκίνου του προστάτη βιωσιμότητας ρυθμίζει γονίδια που εμπλέκονται στην ακτίνη του κυτταροσκελετού και μίτωση (Σχήμα 2D).

Πολεμά τον Καρκίνο του Προστάτη Μυθιστόρημα Υποθετικά Φαρμάκων

AIM1

,

ERGIC1

,

TMED3

, και

TPX2

επιλέχθηκαν για περαιτέρω επικύρωση

Οι οθόνες RNAi επιβεβαίωσαν το ρόλο των πολλαπλών προηγουμένως δημοσιευθεί στόχους φάρμακο για τον καρκίνο του προστάτη, όπως την ανάπτυξη και γονίδια που ρυθμίζουν την απόπτωση σε καλλιεργημένα καρκίνο του προστάτη κύτταρα. Μεταξύ άλλων, αυτά τα γονίδια που περιλαμβάνονται

CLDN3

,

CYP4F8

,

EPHX2

,

FAAH

,

FOXA1

,

MTDH

,

ODC1

,

PLA2G2A

,

PLA2G7

,

SIM2

και

UBE2C

[30], [33] -. [41] (Υποστήριξη Πίνακας S2)

Τέσσερις νέους στόχους υποψήφιου φαρμάκου,

AIM1

,

ERGIC1

,

TMED3

, και

TPX2

, επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτες με βάση την υψηλή έκφραση σε καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικό προστάτη και όλους τους άλλους φυσιολογικούς ιστούς που περιλαμβάνονται στη βάση δεδομένων GeneSapiens (Υποστηρικτικά Σχήμα S1), καθώς επίσης και την πρωτοτυπία τους ως ρυθμιστές του πολλαπλασιασμού του καρκίνου του προστάτη και των κυττάρων απόπτωση.

AIM1

,

TMED3

και

TPX2

ήταν μεταξύ των 17 γονιδίων, η αποσιώπηση της οποίας επάγεται αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα και στα δύο κύτταρα VCAP και LNCaP, καθώς και την απόπτωση σε τουλάχιστον ένα από τις κυτταρικές σειρές. Αποσιώπηση του

ERGIC1

που προκαλείται από αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση ειδικά στα ERG ογκογονίδιο θετικά κύτταρα vcap (Στήριξη Πίνακας S2).

AIM1

,

ERGIC1

και

TMED3

ήταν συν-εκφράζεται στο σύνολο των γονιδίων λειτουργικά σχολιασμένη στις αντιδράσεις ER και της συσκευής Golgi και οξειδοαναγωγής, ενώ

TPX2

εκφράστηκε μεταξύ των γονιδίων που εμπλέκονται στη μίτωση (Σχήμα 2D).

AIM1 πρωτεΐνη είναι ένα μέλος της βγ-κρυσταλλική υπεροικογένεια. Σε αντίθεση με άλλες β- και γ-crystallines, είναι γνωστό ότι εκφράζεται ειδικά σε επιμήκυνση κύτταρα ίνα φακό που υφίστανται μεγάλες αλλαγές στην αρχιτεκτονική του κυτταροσκελετού και σύνθεση, AIM1 έχει ένα ρόλο μη φακού. Ωστόσο, αλληλουχία πρωτεΐνης AIM1 έχει ασθενή ομοιότητα με νήμα ή πρωτεΐνες πρόσδεσης ακτίνης, υποδεικνύοντας ένα πιθανό ρόλο στη διαχείριση της μορφολογίας και του σχήματος [42] κυττάρων.

AIM1

γονίδιο εντοπίζεται σε 6 Q21, εντός της υποτιθέμενης καταστολέα περιοχή του όγκου για ανθρώπινο μελάνωμα, και η έκφραση AIM1 έχει φανεί ότι μεταβάλλεται σε σχέση με την καταστολή όγκου σε ένα μοντέλο ανθρώπινου μελανώματος [43]. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι το

AIM1

δεν είναι ο κύριος ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε del6q21 σε κακοήθειες φυσικών φονικών κυττάρων [44], [45]. Υποστηρίζοντας τον πιθανό ρόλο του

AIM1

ως καταστολέας όγκου, AIM1 μεθυλίωση έχει συσχετισθεί με ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα και πρωτογενή προσβολή όγκου του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [46], [47]. Από την άλλη πλευρά, η έκφραση AIM1 έχει αποδειχθεί ότι είναι υψηλή σε ανθεκτικά TRAIL καρκινικές κυτταρικές γραμμές [48].

ERGIC1 είναι μία πρωτεΐνη μεμβράνης ποδηλασίας που συμβάλλουν στην κυκλοφορία μεμβράνη και επιλεκτική μεταφορά του φορτίου μεταξύ του ER, το ενδιάμεσο διαμέρισμα, και η συσκευή Golgi [49], ενώ TMED3 αποτελεί συστατικό των επικαλυμμένων κυστιδίων που εμπλέκονται στη μεταφορά των μορίων φορτίων από το ER στο συγκρότημα και τη λειτουργία Golgi ως υποδοχείς για ειδικά εκκριτικά φορτίου [50]. Αν και ο ακριβής ρόλος των ERGIC1 και TMED3 στον καρκίνο μένει να διευκρινιστεί, η δυσλειτουργία του proteostasis και ER είναι γνωστό ότι προκαλεί μια απόκριση στρες (ξεδιπλωμένη απόκριση πρωτεΐνη) που οδηγεί σε απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα [51], [52].

TPX2 εκφράζεται αποκλειστικά σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα από τη μετάβαση G1 /S μέχρι το τέλος του κυτοκίνηση. Μίτωση είναι μια σημαντική βιολογική διαδικασία απορυθμισμένη στον καρκίνο και την κύρια βιολογική διεργασία στοχεύονται από κυτταροτοξικά φάρμακα. Είναι ενδιαφέρον, TPX2 είναι γνωστό ότι εκφράζεται υψηλά σε διάφορους ιστούς του καρκίνου, και έχει προταθεί ως βιοδείκτη για φτωχή πρόγνωση [53] – [55]. Ως ένα σημαντικό ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου και ένα συνεταίρο δέσμευσης για Aurora Α κινάση, TPX2 έχει προταθεί επίσης ως ένας πιθανός στόχος φαρμάκου σε πολλαπλές κακοήθειες [56] – [58]. Ωστόσο, TPX2 δεν έχει μελετηθεί σε καρκίνο του προστάτη προηγουμένως. Έχει προταθεί ότι TPX2 στοχευμένες θεραπευτικές ουσίες θα μπορούσαν να είναι πιο αποτελεσματική από τη χρήση των αναστολέων της κινάσης Aurora Α, λόγω της μη ειδική φύση των συμβατικών αναστολέων κινάσης [58]. Επιπλέον, συνδυάζοντας TPX2 και Aurora Μια κινάση στοχευμένη θεραπευτική θα μπορούσε να αναστείλει την αντίσταση ανάπτυξη φαρμάκων [59], [60].

Επικύρωση

AIM1

,

ERGIC1

,

TMED3

, και

TPX2

έκφραση και siRNA Induced Target γονιδιακή σίγηση σε καλλιεργημένα κύτταρα του προστάτη

Η έκφραση του mRNA της

AIM1

,

ERGIC1

,

TMED3

, και

TPX2

μελετήθηκε σε έξι καρκίνο του προστάτη (VCAP, PC-3, MDA-PCA-2b, LNCaP, DU145 και 22Rv1) και των κυττάρων του επιθηλίου τρεις μη κακοήθεις του προστάτη γραμμές (RWPE-1, PrEc, EP156T) (Σχήμα 3Α). Ιδιαίτερα

ERGIC1

και

TMED3

βρέθηκαν να είναι άκρως εκφρασμένη σε καρκίνο αλλά όχι στα μη-κακοήθεις κυτταρικές σειρές. Μεταξύ των κακοηθών κυτταρικών σειρών

AIM1

,

ERGIC1

, και

TMED3

ήταν πιο υψηλή εκφράζονται σε vcap, και

TPX2

στα κύτταρα LNCaP. Δύο siRNAs ανά γονίδιο, επιλέγονται με βάση σχετικά με την αποτελεσματικότητα στόχου φίμωση, επιλέχθηκαν για μελέτες επικύρωσης (Σχήμα 3Β και Σχήμα Υποστηρικτικά S2). Τα αποτελέσματα από βιωσιμότητα 72 ώρες κυττάρου και δοκιμασία απόπτωσης επιβεβαίωσε την αντιπολλαπλασιαστική επίδραση της

TMED3

και

TPX2

αποσιώπηση και στις δύο κυτταρικές σειρές. Όπως αναμένεται με βάση τα αποτελέσματα διαλογής,

ERGIC1

είχε έναν ρόλο ειδικά στο ογκογονίδιο ERG που εκφράζει την κυτταρική βιωσιμότητα VCAP. Ωστόσο, αν και AIM1 siRNAs ήταν σε θέση να μειώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων VCAP, δεν συνάδει επιδράσεις παρατηρήθηκαν σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 3C). Η δράση της κασπάσης 3/7 ενισχύθηκε κυρίως ως απάντηση στην

TPX2

και

TMED3

αποσιώπηση στα κύτταρα LNCaP, ενώ

TPX2

και ERGIC1 φίμωση επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα vcap τόσο με siRNAs (Σχήμα 3D).

Α. Η έκφραση του mRNA των γονιδίων στόχων σε 6 καρκίνου του προστάτη (VCAP, PC-3, ΜϋΑ-PCa-2b, LNCaP, DU145 και 22Rv1) 3 μη-κακοήθεις (RWPE-1, PrEc, EP156T) κυτταρικές γραμμές προστάτη και. Για κάθε γονίδιο η σχετική έκφραση του mRNA σε RWPE-1 κυτταρική γραμμή που να 1. Β Επικύρωση του γονιδίου στόχου αποσιώπησης. Το επίπεδο του mRNA του κάθε γονιδίου σε δείγμα ελέγχου έχει οριστεί ως 100%. C. Η επίδραση της αποσιώπησης γονιδίου στόχου στη βιωσιμότητα των κυττάρων VCAP και LNCaP σε 72 ώρες χρονικό σημείο. D. Η επίδραση της αποσιώπησης γονιδίου στόχου επί της διέγερσης απόπτωσης σε κύτταρα VCAP και LNCaP σε 72 ώρες χρονικό σημείο. Τα αποτελέσματα σε σύγκριση με μπερδεμένο siRNA επάγεται αλλαγές και η σημασία των αντι-πολλαπλασιαστική και προ-αποπτωτικά αποτελέσματα έχουν υποδειχθεί. KIF11 siRNA έχει χρησιμοποιηθεί ως θετικός μάρτυρας.

Η

AIM1

,

ERGIC1

, και

TPX2

εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό στην Κλινική του καρκίνου του προστάτη δείγματα

Επικύρωση προτύπων έκφρασης γονιδίου-στόχου σε κλινικά δείγματα προστάτη επιβεβαίωσε ότι AIM1, ERGIC1, και τα επίπεδα mRNA TPX2 ήταν σημαντικά αυξημένα σε ιστούς καρκίνου του προστάτη (n = 33), σε σύγκριση με τα δείγματα μη κακοήθη ιστό ελέγχου (n = 3). Όλα τα δείγματα του καρκίνου που εκφράζονται AIM1 mRNA σε υψηλότερα επίπεδα από ό, τι οποιοδήποτε από τα μη-κακοήθη δείγματα? ενώ ERGIC1 ήταν υπερ-εκφράζεται σε 94% (n = 31), και TPX2 σε 64% (n = 23) των δειγμάτων καρκίνου. Ωστόσο, παρά τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα των προτύπων έκφρασης TMED3 σε καλλιεργημένα κύτταρα του προστάτη, TMED3 mRNA εκφράστηκε σε ίσα επίπεδα σε μη κακοήθη και καρκινικούς ιστούς (Σχήμα 4Α). Για λόγους σύγκρισης, τα επίπεδα mRNA για το κλειδί του καρκίνου του προστάτη ογκογονίδια AR και ERG προσδιορίστηκαν επίσης στα ίδια κλινικά δείγματα, και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως θερμικός χάρτης στο Σχήμα 4Β. Από τα τέσσερα πιθανά γονίδια νέο στόχο,

ERGIC1

(R = 0,51) και

TMED3

(R = 0,69) μοτίβα έκφρασης συσχετίζονται πιο σημαντικά με

AR

έκφρασης (Σχήμα 4C). Επιπλέον, αν και ERGIC1 και TMED3 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε αμφότερες τις ERG καρκίνους αρνητικών και θετικών προστάτη, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA τους συσχετίζεται θετικά με τα επίπεδα έκφρασης της ERG τον ERG θετικά δείγματα (Ρ = 0,002 και Ρ = 0,007 αντιστοίχως) (Σχήμα 4D). Σύγκριση του γονιδίου-στόχου έκφρασης με κλινικές παραμέτρους αποκάλυψε ότι

AIM1

συσχετίζονται σημαντικά (P = 0,03), με το νεαρό της ηλικίας (& lt? 60 ετών) (Σχήμα 4Ε). Επιπλέον, οι υψηλές

TPX2

έκφραση συσχετίζεται με αντιγόνο (PSA) αποτυχία ειδικού προστατικού (P = 0,02), και συνδέονται με υψηλής ποιότητας ΠΟΥ και το νεαρό της ηλικίας (Σχήμα 4F). Δεν ενώσεων αυτών βρέθηκαν με ERG1C1 ή έκφραση TMED3 mRNA.

Α. Η έκφραση του mRNA των γονιδίων στόχων σε 33 πρωτογενή καρκίνο του προστάτη και 3 μη-κακοήθη δείγματα ιστού του προστάτη. Η μέση έκφραση των μη-κακοήθεις δείγματα έχει οριστεί ως 1. Β Heatmap οπτικοποίηση των γονιδίων-σοφός κλιμακωθεί σχετικές τιμές έκφρασης mRNA για

AIM1

,

ERGIC1

,

TMED3

,

TPX2

,

ERG

, και

AR

σε 33 πρωτοβάθμια προστάτη καρκινικούς ιστούς. Ο θερμικός χάρτης έχει συνταχθεί με βάση την χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση των τιμών έκφρασης. Σχετική μέση στάθμη έκφρασης σε φυσιολογικά δείγματα ελέγχου ορίστηκε ως 0. μοτίβα C. Συν-έκφραση μεταξύ ERGIC1 και AR mRNA, καθώς TMED3 και AR mRNA σε 33 πρωταρχικά δείγματα καρκίνου του προστάτη. Δ Σύλλογος ERGIC1 και της έκφρασης TMED3 mRNA με την έκφραση του mRNA ERG στα ERG θετικών όγκων πρωτοβάθμια προστάτη (n = 19). Ε έκφραση Σχετική mRNA της

AIM1

σε δείγματα πρωτοπαθή καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με την ηλικία του ασθενούς. ΣΤ έκφραση Σχετική mRNA της

TPX2

στην πρωτογενή δείγματα καρκίνου του προστάτη σε σύγκριση με το περιστατικό της αποτυχίας PSA, ο βαθμός όγκου ΠΟΥ και την ηλικία του ασθενούς.

Η

AIM1

,

ERGIC1

,

TMED3

, και

TPX2

όλα Εποπτεύεται από

ERG

Oncogene και ανδρογόνα σε καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου προστάτη

Για να την αξιολόγηση του δυνητικού ρόλου της ERG και AR στη ρύθμιση αυτών προστάτη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων προώθηση γονίδια, η επίδραση του

ERG

και

AR

αποσιώπηση, καθώς και στέρησης ανδρογόνων και διέγερση του γονιδίου-στόχου έκφραση αναλύθηκε. Παραδόξως,

ERG

φίμωση σημαντικά μείωσε την έκφραση mRNA και των τεσσάρων γονιδίων στόχων σε κύτταρα VCAP (Σχήμα 5Α). Επιπλέον,

AR

αποσιώπηση μείωσε την έκφραση του mRNA της

AIM1

στα κύτταρα LNCaP και

TPX2

και στα δύο κύτταρα vcap και LNCaP, ενώ η έκφραση του mRNA TMED3 αυξήθηκε (Σχήμα 5Β). Παραδόξως, αν και

ERG1C1

έκφρασης συνδέθηκε με το

AR

και AR οδηγείται

ERG

έκφρασης στην κλινική καρκίνους του προστάτη, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές στην έκφραση της έκφρασης mRNA σε ERGIC1 απάντηση AR αποσιώπηση. Παρά τις διάφορες επιπτώσεις της AR σίγασης επί της έκφρασης γονιδίου-στόχου, στέρηση ανδρογόνου μειώθηκε και το συνθετικό ανδρογόνο R1881 προκάλεσε την έκφραση όλων των γονιδίων στόχων σε κύτταρα LNCaP, σε σύγκριση με τα επίπεδα έκφρασης ανιχνεύθηκαν σε συνθήκες ανδρογόνων υποβαθμισμένες (Σχήμα 5C). Η έκφραση των γονιδίων στόχων μελετήθηκε επίσης σε παράγωγα LNCaP καλλιεργηθούν σε σταθερές ανδρογόνων αποκόπτεται συνθήκες που μιμούνται ευνουχισμός ανθεκτικών όγκων. Τα αποτελέσματα δείχνουν μια σημαντική αύξηση στην έκφραση AIM1 στα αποκόπτεται κύτταρα σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο (Σχήμα 5D).

A. Η επίδραση του 48 h

ERG

φίμωση για την έκφραση των γονιδίων στόχων σε κύτταρα VCAP. B. Η επίδραση του 48 h

AR

σίγηση για την έκφραση των γονιδίων στόχων σε κύτταρα VCAP και LNCaP. C. Η επίδραση του 24 ώρες στέρηση ανδρογόνου και διαδοχική ανδρογόνων διέγερση 24 ώρες (10 ηΜ R1881) επί της έκφρασης των γονιδίων στόχων σε κύτταρα LNCaP. D. Το επίπεδο έκφρασης mRNA στόχου σε κύτταρα LNCaP καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο (FBS) και σε chargoal απογυμνωμένο (CS-FBS) ανδρογόνων αποκοπεί μέσα ενημέρωσης. Ε Η επίδραση των 72 h

TPX2

αποσιώπηση της πρωτεΐνης έκφρασης του AR και PSA. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. έχουν υποδειχθεί Η στατιστική σημασία των αποτελεσμάτων σε σύγκριση με τον έλεγχο του πειράματος.

Η

Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η έκφραση των πιθανών στόχων νέων φαρμάκων

AIM1

,