Αφηρημένο

Ο τύπος 2 διαμεμβρανική matriptase πρωτεάσης σερίνης εκφράζεται ευρέως σε ανθρώπινα καρκινώματα και αιματολογικών καρκίνων. Η πρωτεολυτική δραστηριότητα των matriptase είναι ένας δυνητικός στόχος φαρμάκων και ανιχνευτές απεικόνισης. Εκτιμήσαμε την τύχη του δραστικού matriptase μετά την επαγωγή της ενεργοποίησης matriptase ζυμογόνου. Εκθέτοντας οκτώ ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος σε ρΗ ισχυρή ενεργοποίηση matriptase ζυμογόνου που προκαλείται 6.0 ρυθμιστικό που ακολουθείται από ταχεία αναστολή της εκκολαπτόμενη ενεργό matriptase από αναστολέα του παράγοντα ενεργοποίησης ανάπτυξης ηπατοκυττάρων (ΕΑΒ) -1. Κατά συνέπεια, δεν ενζυμικά ενεργή matriptase ανιχνεύθηκε σε αυτά τα κύτταρα. Κάποια ενεργός matriptase, ωστόσο, ταχέως υπόστεγο στο εξωκυτταρικό περιβάλλον από αυτά τα κύτταρα καρκινώματος. Η έλλειψη κυττάρων σχετιζομένου ενεργό matriptase και η απόπτωση των ενεργών matriptase παρατηρήθηκαν επίσης σε δύο αιματολογικών σειρές καρκίνου. Matriptase απόπτωση συσχετίζεται στενά με την επαγωγή της ενεργοποίησης matriptase, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ενεργοποίηση matriptase και ρίχνει τα κινητικά συνδυασμό. Η σύζευξη επιτρέπει ένα ποσοστό του δραστικού matriptase να επιβιώσουν ΕΑΒ-1 αναστολή από την ταχεία αποβολή από την επιφάνεια των κυττάρων. Η μελέτη μας δείχνει ότι η κυτταρική ελεύθερο, ενεργό matriptase είναι σπάνια και δεν θα μπορούσε να είναι ένας αποτελεσματικός στόχος για

in vivo

απεικόνιση και ναρκωτικών ανάπτυξη

Παράθεση:. Chu LL, Xu Υ, Yang JR, Χου YA, Chang HH, Lai ΗΥ, et al. (2014) ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου Διατηρήστε μέτρια επίπεδα ενζυμικά ενεργής Matriptase Μόνο στο εξωκυτταρικό περιβάλλον μετά την επαγωγή της ζυμογόνο ενεργοποίησης. PLoS ONE 9 (3): e92244. doi: 10.1371 /journal.pone.0092244

Επιμέλεια: Jian Cao, Stony Brook University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 του Ιανουαρίου, 2014? Αποδεκτές: 9 του Φλεβάρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 24 Μάρτη 2014

Copyright: © 2014 Chu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI) Επιχορηγήσεις RO1 CA 123223 (για M. Johnson και Ο.-Υ. Lin)? Ταϊβάν Υπουργείο Άμυνας Grant ΜΑΒ-102-08 (για J.-K. Wang)? και επιχορήγηση Chi-Mei Ιατρικό Κέντρο CMNDMC-10211 (για J.-K. Wang και L.-L. Chu). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. C.-Y.L. Είναι ένας εφευρέτης για τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας των ΗΠΑ # 6077938 και # 6677377 και M.D.J. και C.-Y.L. είναι οι εφευρέτες των ΗΠΑ δίπλωμα ευρεσιτεχνίας # 7.355.015. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Οι πρωτεάσες καταλύουν τη διάσπαση των πρωτεϊνών από την υδρόλυση των πεπτιδικών δεσμών. Μέσω της ρυθμιζόμενης διάσπαση των πρωτεϊνών, οι πρωτεάσες εμπλέκονται σε πολλές ιδιαίτερα ελεγχόμενο φυσιολογικές διεργασίες, όπως αντιγραφή του DNA, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, ο κυτταρικός θάνατος, αγγειογένεση, θρόμβωση του αίματος, φλεγμονή, νευρογένεση και ανοσία. Πρωτεάση απορύθμιση έχει εμπλακεί σε ένα ευρύ φάσμα ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου και των καρδιαγγειακών διαταραχών. Οι πρωτεάσες είναι, ως εκ τούτου, θεωρείται ότι είναι αποτελεσματική στόχους για την ανάπτυξη και φαρμακευτικών στόχων και βιολογικών δεικτών. Αναστολείς πρωτεασώματος, για παράδειγμα, έχουν χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία αιματολογικών κακοηθειών [1], [2], και τα επίπεδα του PSA πρωτεάσης (ειδικό προστατικό αντιγόνο) στον ορό έχουν χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης για την παρακολούθηση του καρκίνου του προστάτη σε διάφορες [3] πλαίσια. Η εφεύρεση των ανιχνευτών βάσει δραστηριοτήτων (ABP) επιτρέπει την αξιολόγηση της δραστηριότητας της πρωτεάσης μέσα σε ζωντανά κύτταρα ή σε ολόκληρους οργανισμούς [4]. Παρά την επιτυχία κάποιων φαρμάκων και ανιχνευτών, ωστόσο, η στόχευση πρωτεολυτική δραστικότητα για την ανάπτυξη φαρμάκων και βιολογικών δεικτών δεν ήταν πάντα πολύ ικανοποιητικό. Όπως ελκυστική όπως είναι, πρωτεάσες-εμπνευσμένο διάγνωση και θεραπείες έχουν πολλά εγγενή πολυπλοκότητα και τους περιορισμούς που πρέπει να ληφθούν υπόψη πριν από την ανάπτυξη νέων φαρμάκων ή ανιχνευτές που στοχεύουν πρωτεάσες και πρωτεάσες δραστηριότητες. Αυτοί οι περιορισμοί περιλαμβάνουν την Ενεργοποιητικές κατάσταση των πρωτεασών, τη λειτουργική εντόπιση των πρωτεασών, και ενδογενών αναστολέων πρωτεασών, οι οποίες όλες να επηρεάσει δραστικότητα πρωτεάσης και μπορεί με τη σειρά τους να επηρεάσουν την αποτελεσματικότητα του αναστολέα πρωτεάσης και ανιχνευτές.

Ο τύπος 2 διαμεμβρανική πρωτεάση σερίνης (TTSP) matriptase είναι ένα ιδιαίτερα ενδιαφέρον παράδειγμα από τις προκλήσεις που μια πρωτεάση μπορεί να παρουσιάσει σχετικά με την επιλογή της ως στόχο για την ανάπτυξη των κλινικών εφαρμογών και τις στρατηγικές που θα μπορούσαν να απαιτούνται για να χρησιμοποιήσουν αποτελεσματικά αναστολείς και ανιχνευτών για δραστικότητα matriptase . Matriptase εκφράζεται ευρέως από επιθηλιακών ιστών και μάλιστα απαιτείται για τη διατήρηση της επιθηλιακής ακεραιότητας [5] – [7]. Matriptase συνήθως απορρυθμισμένη σε καρκινώματα μέσω αυξημένη έκφραση, αυξημένη ενεργοποίηση ζυμογόνου, και μια ανισορροπία στην έκφραση των matriptase σχέση με αναστολέα αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων ενεργοποιητής (ΕΑΒ) -1, η κύρια ενδογενής αναστολέας πρωτεάσης δραστηριότητας matriptase [8] – [10] . Εκτός από επιθηλιακά κύτταρα, matriptase εκφράζεται επίσης σε μονοκύτταρα [11] – [13], μαστοκύτταρα [14], τα χονδροκύτταρα [15] και νευρικών προγονικών κυττάρων [16], και matriptase έχει εμπλακεί στην οστεοαρθρίτιδα [15] και της αθηροσκλήρωσης [13]. Η έκφραση του matriptase σε μαστοκύτταρα δείχνουν ότι matriptase έχει τη δυνατότητα να συνεισφέρει σε ασθένειες που σχετίζονται με αλλεργίες, όπως το άσθμα. Αρκετοί matriptase καταλυτική αναστολείς έχουν αναπτυχθεί, συμπεριλαμβανομένου του μικρού μορίου και βασιζόμενοι σε πεπτίδια αναστολείς. Αυτοί οι αναστολείς matriptase παρουσιάζουν μεγάλη δραστικότητα έναντι δραστικότητας matriptase όταν δοκιμάζεται χρησιμοποιώντας το

in vitro δοκιμασίες

που, στις περισσότερες περιπτώσεις, έχουν κάνει χρήση των ανασυνδυασμένων matriptase περιοχής σερίνης πρωτεάσης [17] – [22]. Οι αναστολείς που βασίζονται σε αντισώματα που στοχεύουν ειδικά κατά ενεργός matriptase (σε αντίθεση με τη μορφή ζυμογόνου) έχουν επίσης αναπτυχθεί [23] και χρησιμοποιείται για την ανίχνευση όγκων σε ποντίκια μέσω δέσμευσης στην ενεργό matriptase στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων [24], [25].

Matriptase συντίθεται ως ένα ζυμογόνο και υφίσταται αυτοενεργοποίηση να αποκτήσει ισχυρή τύπου τρυψίνης δραστικότητα της. Η ενεργοποίηση του matriptase ταχέως ακολουθούμενη από την αναστολή της εν τω γεννάσθαι δραστικού matriptase από την πρωτεΐνη ΗΑΙ-1 και παραμένει προσκολλημένο στα κύτταρα μέσω της διαμεμβρανικής περιοχής του ΗΑΙ-1. Δεν είναι σαφές το πόσο και για πόσο καιρό εκκολαπτόμενη δωρεάν ενεργό matriptase επιμένει στην κυτταρική επιφάνεια: παράμετροι που είναι σημαντικές για οποιαδήποτε δικαιολογία για την ανάπτυξη αναστολέων και ανιχνευτές βάσει δραστηριοτήτων matriptase για κλινικές εφαρμογές. Στην παρούσα μελέτη, στόχος μας ήταν να αξιολογηθεί η τύχη της δραστικής matriptase μετά την επαγωγή της ενεργοποίησης ζυμογόνου matriptase σε ανθρώπινο καρκίνωμα και αιματολογικές καρκινικά κύτταρα. Ανεξάρτητα από την έκταση της ενεργοποίησης ζυμογόνου matriptase επάγεται, δεν παρέχεται δωρεάν, ενεργό matriptase βρέθηκε να επιμένουν επί των καρκινικών κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον, ωστόσο, ένα μικρό ποσοστό του ενεργού matriptase επιβιώνει ΕΑΒ-1 αναστολή από υπό ταχέως ρίξει στο εξωκυτταρικό περιβάλλον. Η μελέτη μας δείχνει ότι, λόγω της έλλειψης της ελεύθερης δραστικής matriptase παρόντα στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων, matriptase καταλυτική δράση είναι απίθανο να παρουσιάζει μια αποτελεσματική στόχος για κλινικές εφαρμογές.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και αντιδραστήρια

ζελατίνη και 5,5′-διθειο-δις- (2-νιτροβενζοϊκό οξύ) (ϋΤΝΒ) ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ)? Ν-τ-βουτοξυκαρβονυλ (Boc) -Gln-Ala-Arg-7-Αμιδο-4- μεθυλοκουμαρίνη (AMC) αγοράστηκε από Enzo Life Sciences (Farmingdale, ΝΥ)? Ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) αποκτήθηκε από την Omega Scientific (Tarzana, CA).

κυτταροκαλλιέργειες

καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου μαστού MCF7 και ΜϋΑ-ΜΒ-468 διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο Βελτιωμένη Ελάχιστο Απαραίτητο Medium (ΙΜΕΜ), συμπληρωμένο με 10% FBS. Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα προστάτη LNCaP, PC3 και DU145, τα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών OVCAR-3, ανθρώπινα κύτταρα πολλαπλού μυελώματος κύτταρα RPMI 8226 και ανθρώπινα κύτταρα λεμφώματος Burkitt Ramos καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI-1640, συμπληρωμένο με 10% FBS. Ανθρώπινα καρκίνου του μαστού κύτταρα ανθρώπινου καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα OV-2008 SK-BR-3, τα ανθρώπινα κερατινοκύτταρα HaCaT, και διατηρήθηκαν σε μέσο Dulbecco Τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ), συμπληρωμένο με 10% FBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2. Όλα τα κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, Βιρτζίνια) εκτός HaCaT (CLS τηλέφωνα Γραμμές Service GmbH, Eppelheim Γερμανία) και OV2008 (ευγενικά παρέχεται από το Δρ Gaetano Marverti, Πανεπιστήμιο της Modena και Reggio Emilia, Ιταλία) [26] .

Τα μονοκλωνικά αντισώματα

Τα ανθρώπινα matriptase μονοκλωνικά αντισώματα M24 και M69 χρησιμοποιήθηκαν για αναλύσεις ανοσοστυπώματος για την ανίχνευση συνολική matriptase και ενεργοποιείται matriptase, αντίστοιχα [27] – [29]. Το mAb M69 ακινητοποιημένο σε Sepharose σφαιριδίων χρησιμοποιήθηκε για τις μελέτες ανοσοεξάντληση.

θρυπτικής δοκιμασία δραστικότητας μετά την επαγωγή του matriptase ζυμογόνου

ενεργοποίηση

Για την επαγωγή της ενεργοποίησης ζυμογόνου matriptase σε κύτταρα καρκινώματος, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πιάτα 150 mm ή πλάκες 6 φρεατίων. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS τρεις φορές και στη συνέχεια επωάζονται για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με 150 mM φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα ρΗ 6,0 (7 ml για τα πιάτα 150 mm και 1 ml για πλάκα 6 φρεατίων) ή 150 mM φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα ρΗ 8,0 ως μη -ενεργοποίηση ελέγχου. Σε ορισμένες περιπτώσεις, PBS χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος μη ενεργοποίησης. Μετά την επώαση, 2 Μ βάσης Trizma προστέθηκε για να φέρει το ρΗ στο 8,0. Τα κύτταρα ξύστηκαν από τα πιάτα ή φρεάτια για να δώσει ένα συνδυασμένο εναιώρημα που περιέχει ένα μίγμα των κυττάρων και να ρίξει πρωτεΐνες. Ένα μέρος αυτού του μίγματος υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 10.000 rpm χρησιμοποιώντας μια επιτραπέζια φυγόκεντρο Eppendorf για 1 λεπτό. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε ως κλάσμα υπόστεγο και το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε 150 mM φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος ρΗ 8.0 στον ίδιο όγκο με το δείγμα πριν από την φυγοκέντρηση για να δώσει το κλάσμα κυττάρων. Η διαδικασία της διάλυσης των κυττάρων από το δίσκο και την επεξεργασία με φυγοκέντρηση δόση δεν έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση της matriptase ή ΗΑΙ-1 από τα κύτταρα. Η διαδικασία σχεδιάστηκε για να δημιουργήσει το κύτταρο και κλιματισμό ρυθμιστικό κάτω από τις ίδιες συνθήκες, σε σχέση με το ρΗ και την ιοντική ισχύ στο ρυθμιστικό για την δοκιμασία πρωτεολυτική. Για τις δύο αιματολογικά καρκινικά κύτταρα τα οποία αναπτύσσονται ως καλλιέργειες εναιωρήματος, ο λόγος του αριθμού των κυττάρων σε σχέση με τον όγκο του ρυθμιστικού φωσφορικών ήταν 5 × 10

5 κύτταρα /200 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος. Η δραστηριότητα matriptase σε 195 μΙ των κλασμάτων υπόστεγο και κυττάρου αξιολογήθηκε με μέτρηση 7-αμινο-4-μεθυλοκουμαρίνη (AMC) απελευθέρωση από ένα συνθετικό υπόστρωμα Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (5 μΐ από ένα διάλυμα αποθέματος 5 mM) σε microfluor 96 φρεατίων μαύρες πλάκες μικροτίτλου (Thermo Scientific). Η διάσπαση του συνθετικού φθορισμογόνου υποστρώματος καταγράφηκε χρησιμοποιώντας ένα Wallac 1420 Victor αναγνώστη μικροπλακών 2 με ένα μήκος κύματος διέγερσης 360 nm και ανίχνευση εκπομπής στα 480 nm.

ανοσοεξάντληση

Το M69 mAb συζεύχθηκε ομοιοπολικά με Sepharose 4Β στα 5 mg /ml γέλης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Για ανοσοεξάντληση, τα δείγματα (200 μΙ) επωάστηκαν με 15 μΙ M69-Sepharose περιστρέφεται σε κρύο δωμάτιο για 2 ώρες. Το υπερκείμενο διαχωρίστηκε από τα σφαιρίδια με φυγοκέντρηση και συλλέγεται σαν το μη δεσμευμένο κλάσμα. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) που περιέχει 1% Triton Χ100 τέσσερις φορές μετά την οποία τα σταματούν πρωτεΐνες εκλούστηκαν από τα σφαιρίδια με 0.1 Μ γλυκίνης ρΗ 2.4, που ακολουθείται από εξουδετέρωση με βάση 2 Μ Trizma.

κηλίδωση Western

τα κύτταρα λύθηκαν σε PBS που περιείχε 1% Triton Χ-100 και 1 mM DTNB. ΫΤΝΒ προστέθηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης για την αποφυγή διάσπασης των δισουλφιδικών δεσμών [30]. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με δοκιμασία πρωτείνης Bradford και ίσες ποσότητες πρωτεϊνών ή ίσες αναλογίες των υλικών κυτταρικής λύσεως και κλιματιζόμενο ρυθμιστικά αναλύθηκαν με κηλίδα Western. Τα δείγματα πρωτεΐνης αραιώθηκαν σε 5 χ ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος που δεν περιέχει αναγωγικό μέσο και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με 7,5% SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης και στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με τα διάφορα mAbs. Η πρόσδεση του mAbs ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα, και ορατή χρησιμοποιώντας Western Lightening® Χημειοφωταύγειας αντιδραστηρίου Plus (Perkin-Elmer, Boston, ΜΑ).

Ζελατίνη zymography

πηκτές ζελατίνης χυτεύθηκαν με προσθήκη ζελατίνης (τελική συγκέντρωση 1 mg /ml) για να πηκτές SDS πολυακρυλαμιδίου 7,5%. Τα δείγματα πρωτεΐνης επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά υπό την απουσία ενός παράγοντα αναγωγής. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πηκτές ζελατίνης πλύθηκαν με 2,5% Triton Χ-100 /PBS τρεις φορές και στη συνέχεια επωάστηκαν ΙΝ100 mM Tris ρυθμιστικό ρΗ 8.0 στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Τα πήγματα στη συνέχεια χρωματίζονται με Coomassie Brilliant Blue.

Αποτελέσματα

MCF7 κύτταρα καρκίνου του μαστού συστατικά ενεργοποιούν matriptase αλλά η ελεύθερη ενεργό matriptase δεν παραμένει συνδέονται με τα κύτταρα

Για να αρχίσουν να διερευνήσει κατά πόσον matriptase πρωτεολυτική δραστικότητα που συνδέεται με κύτταρα καρκίνου του μαστού θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως στόχος για την ανάπτυξη φαρμάκων ή /και ανιχνευτές απεικόνισης, μετρήσαμε την διάσπαση του υποστρώματος Boc-Gln-Ala-Arg-AMC με καρκίνο του μαστού MCF7 κύτταρα πριν και μετά την επαγωγή της ενεργοποίησης ισχυρή matriptase ζυμογόνου (Εικ. 1Α). ενεργοποίηση ζυμογόνου Matriptase προφανώς συμβαίνει ιδιοσυστατικά σε κύτταρα MCF7, δεδομένου ότι η matriptase-ΗΑΙ-1 σύμπλοκο 120-kDa ανιχνεύθηκε εύκολα εκτός από το 70-kDa matriptase ζυμογόνο στα κυτταρολύματα πριν από την πρόκληση της ενεργοποίησης matriptase ζυμογόνου (Εικ. 1Α λωρίδα 1) . Μετά την επαγωγή της ενεργοποίησης ζυμογόνου matriptase από έκθεση των κυττάρων σε ρΗ 6 ρυθμιστικό για 20 λεπτά [27], [31], [32], ένα μεγάλο μέρος της matriptase ζυμογόνου 70k-Da μετατράπηκε στο 120-kDa matriptase-HAI- 1 σύμπλοκο (Εικ. 1Α λωρίδα 4). Εμείς επόμενη μέτρησε την ποσότητα των θρυπτικών δραστηριότητας που σχετίζεται με MCF7 υπό συστατική ή επαγόμενη οξύ συνθήκες η οποία αποδίδει τα δύο διαφορετικά επίπεδα ενεργοποίησης matriptase. Δεδομένης της δυνατότητας που ΕΑΒ-1 θα μπορούσε να δεσμεύσει και να αναστέλλουν την ενεργό matriptase αφού και οι δύο πρωτεΐνες είχαν απελευθερωθεί από την κυτταρική μεμβράνη, μετρήσαμε την θρυπτικών δραστηριότητα που συνδέεται με την επιφάνεια των κυττάρων απουσία του μη ιοντικού απορρυπαντικού Triton Χ-100 . Υπό αυτές τις συνθήκες υπήρχε σχεδόν καμία διάσπαση των φθοριζόντων υποστρωμάτων από τα κύτταρα MCF7 αν η ενεργοποίηση matriptase ήταν συστατική ή με σθένος που προκαλείται από την έκθεση οξύ (Εικ. 1 Β, καμπύλη 1 και 4). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι αυτά τα κύτταρα καρκίνου του μαστού δεν διατηρούν ελεύθερο, ενεργό matriptase ανεξάρτητα από τα επίπεδα της ενεργοποίησης ζυμογόνου matriptase.

A.

Καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου μαστού MCF7 επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα ρΗ 6 να επάγει την ενεργοποίηση matriptase ζυμογόνου (

A.

δεξιά, Act.) ή με το ρΗ 6 ρυθμιστικό συμπληρωμένο με 150 mM NaCl ως έλεγχο μη ενεργοποίησης (

A.

αριστερά, μη πράξη .). Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν, και τα δείγματα διατηρούνται για ανάλυση (διαδρομές 1 και 4). Τα υπόλοιπα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανοσοεξάντληση με την ενεργό matriptase-ειδικό mAb M69 ακινητοποιημένη σε σφαιρίδια Sepharose για να καταστρέφουν το ενεργοποιημένο matriptase, κυρίως του συμπλόκου 120-kDa (διαδρομές 2 και 5, και Δ). Η ενεργοποιημένη matriptase αντίσωμα δεσμευμένο ανακτήθηκε με ρΗ έκλουση 2.4 ρυθμιστικό που ακολουθείται από εξουδετέρωση του ρΗ (Λωρίδα 3, E). Αυτά τα δείγματα στη συνέχεια αναλύθηκαν για είδη matriptase με SDS-PAGE (χωρίς βρασμό των δειγμάτων ή χρησιμοποιώντας παράγοντες αναγωγής) και στύπωμα Western με τη χρήση του συνολικού matriptase mAb Μ24.

Β.

Τα κύτταρα, τα ανοσολογικά λύματα και τα εκλούσματα αναλύθηκαν τρυπτική δραστηριότητα με τη διάσπαση ενός συνθετικού φθορισμογόνου υποστρώματος με Arg και Ρ1 ιστοσελίδα. Για το τρυπτικό δοκιμασία, τα κύτταρα παρέμειναν ανέπαφα απουσία Triton Χ-100. NA σημαίνει μη ενεργοποίησης? L για τη φόρτωση των ανοσοεξάντληση, D για ανοσολογικά κλάσμα? Ε για εκλουόμενο κλάσμα? Α για την ενεργοποίηση? RFU για σχετική φθορίζουσα μονάδα.

Η

Η έλλειψη δωρεάν, ενεργό matriptase συνδέονται με τα κύτταρα οφείλεται στην ταχεία αναστολή της δραστικής matriptase με ΕΑΒ-1. Προηγουμένως, έχουμε δημιουργήσει ένα matriptase μονοκλωνικό αντίσωμα που αναγνωρίζει ειδικά και συνδέεται με την ενεργοποιημένη μορφή του matriptase (αν είναι ή όχι σε ένα συγκρότημα με ΕΑΒ-1), χωρίς διασταυρούμενη αντίδραση με matriptase ζυμογόνο [33], [34]. Χρησιμοποιήσαμε αυτό το mAb, M69, συζευγμένο με σφαιρίδια, για την απομάκρυνση τυχόν ενεργοποιημένη matriptase που ήταν παρούσα στα προϊόντα λύσης κυττάρων με ανοσοεξάντληση. Όπως αναμενόταν, το 120-kDa matriptase-ΕΑΒ-1 σύμπλοκο απομακρύνθηκε αποτελεσματικά από τα προϊόντα λύσης κυττάρου MCF7 με αυτή τη μέθοδο (Εικ. 1Α, συγκρίνοντας λωρίδες 2 και 5 με λωρίδες 1 και 4, αντίστοιχα). Το 70-kDa πρωτεΐνη matriptase μπάντα στα δύο δείγματα δεν εξαντλήθηκε από τον ενεργοποιημένο mAb matriptase, υποδεικνύοντας ότι η πρωτεϊνική ζώνη matriptase 70-kDa και στα δύο παρασκευάσματα περιέχει λίγο ή καθόλου ενεργό matriptase και είναι matriptase ζυμογόνο. Όπως αναμένεται, οι ανοσολογικά δείγματα δεν είχε δραστικότητα διάσπασης κατά το φθορίζον υπόστρωμα (Εικ. 1Β). Τα ενεργοποιημένα είδη matriptase δεσμεύεται στα σφαιρίδια M69 mAb-Sepharose χρησιμοποιείται για να immunodeplete τα δείγματα εκλούστηκαν χρησιμοποιώντας ρΗ 2.4 ρυθμιστικό διάλυμα γλυκίνης. Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι αυτό το όξινο ρυθμιστικό προκαλεί την διάσταση του συμπλόκου matriptase-ΕΑΒ-1 [33]. Εξουδετέρωση συνήθως έχει ως αποτέλεσμα την εκ νέου σύνδεση της μερικά από τα ΗΑΙ-1 και την ενεργό matriptase αφήνοντας το υπόλοιπο του διαχωριστεί δραστικού matriptase σε μη συμπλοκοποιημένης μορφή μετά την εξουδετέρωση του εκλούσματος, με αποτέλεσμα ότι το δραστικό matriptase ανιχνεύθηκε με ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας συνολικά matriptase mAb κυρίως ως ένα συγκρότημα 70-kDa. Η ένταση αυτής της 70-kDa ενεργό ζώνη matriptase ήταν ανάλογη προς την ένταση της 120-kDa matriptase-ΕΑΒ-1 σύνθετη λωρίδα ανιχνευθεί και στις δύο περιπτώσεις (σχ. 1Α, διαδρομές 3 και 6). Αυτό διαχωριστεί ενεργός matriptase παρουσίασαν τρυπτική δραστικότητα όπως εκτιμήθηκε με διάσπαση του φθορισμογόνου υποστρώματος (Σχ. 1 Β, καμπύλη 3 και 6). Τα ποσοστά διάσπασης υποστρώματος που παρατηρήθηκαν συσχετίζονται καλά με τα επίπεδα του δραστικού matriptase ανιχνεύεται με ανάλυση στυπώματος Western. Αυτές οι αναλύσεις επιβεβαιώνουν ότι οι κυτταρικές-συναφών ειδών matriptase 120-kDa είναι ένα αδρανοποιημένο δραστικό σύμπλοκο matriptase και ότι το εκλουσμένο είδος 70-kDa είναι πράγματι ενεργός matriptase.

Ένα ποσοστό των δραστικών matriptase χύθηκε στο εξωκυτταρικό περιβάλλον

παρά την ταχεία ΕΑΒ-1-μεσολαβούμενη αναστολή της ενεργού matriptase που σχετίζεται με το κύτταρο, ελεύθερα δραστικά matriptase ήταν στην πραγματικότητα ρίξει στο εξωκυτταρικό περιβάλλον πριν από την ΕΑΒ-1 αναστολής (Σχ. 2). Όταν οι MCF7 καρκίνου του μαστού κύτταρα παροδικά εκτέθηκαν σε ρΗ 6.0 ρυθμιστικό που ακολουθείται από εξουδετέρωση σε ρΗ 8.0, ισχυρή τρυπτική δραστικότητα έναντι φθορίζοντος υποστρώματος ανιχνεύθηκε στο μίγμα των κυττάρων και κλιματιζόμενα ρυθμιστικά (υπόστεγο κλάσμα) (Σχ. 2Α). Όταν διαχωρίστηκαν τα κύτταρα και τα κλάσματα υπόστεγο, το τρυπτικό δραστικότητα ανιχνεύθηκε μόνο στα κλάσματα υπόστεγο (υπερκείμενο) και δεν συνδέονται με τα δισκία κυττάρων. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι μαζί με την επαγωγή της ενεργοποίησης ζυμογόνου matriptase, μερικά δραστικά πρωτεάσες με τρυπτική δραστηριότητα αποβάλλονται στο εξωκυτταρικό περιβάλλον. Για να αντιμετωπίσει το ζήτημα του κατά πόσον αυτό το ρίξει πρωτεολυτική δραστηριότητα προέρχεται από την ενεργό matriptase προσδιορίσαμε αν M69-χάντρες μπορούσε immunodeplete τη δραστηριότητα από τα δείγματα (Εικ. 2Β και C). Ανοσοεξάντληση του υλικού αποβάλλεται από τα κύτταρα ελέγχου επεξεργασμένα δεν είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική αλλαγή στην ένταση της matriptase ζώνη 70kDa (Εικ. 2Β, λωρίδες 1 και 2) και όχι matriptase ανιχνεύθηκε στο υλικό που εκλούεται από τα σφαιρίδια (Εικ . 2Β, λωρίδα 3), συνεπές με την απουσία ή χαμηλό επίπεδο ρίξει ελεύθερο, ενεργό matriptase υπό αυτές τις συνθήκες. Αντίθετα, μετά την ενεργοποίηση matriptase οξύ επαγόμενη, εξάντληση με τα M69-σφαιρίδια μείωσε σημαντικά τα επίπεδα της ολικής matriptase υπάρχει στο κλάσμα υπόστεγο (Σχ. 2Β, συγκρίνετε λωρίδα 5 έως λωρίδα 4), και μια ισχυρή matriptase ταινία 70-kDa είναι που υπάρχει στο έκλουσμα από τα σφαιρίδια (Σχ. 2Β, λωρίδα 6). Αυτό είναι σύμφωνο με την παρουσία ελεύθερου, ενεργός matriptase στο ρυθμισμένο διάλυμα από τα κύτταρα στα οποία η ενεργοποίηση matriptase είχε προκληθεί από την έκθεση οξύ. Όταν δοκιμάστηκαν για τρυπτική δραστηριότητα χρησιμοποιώντας το φθορογόνο προσδιορισμού υποστρώματος βρήκαμε ότι πρωτεολυτική δραστικότητα μειώθηκε δραματικά μετά ανοσοεξάντληση (Σχήμα 2C, συγκρίνετε τις καμπύλες Α-Ε και Α-Δ), επιβεβαιώνοντας ότι η πλειοψηφία των θρυπτικών δραστηριότητα που υπάρχει στο κλάσμα υπόστεγο ήταν που αναλογεί στους ελεύθερο, ενεργό matriptase. Η παρουσία του δραστικού matriptase στο κλάσμα υπόστεγο επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ανίχνευση μιας 70-kDa ζελατινολυτική δραστικότητα στο κλάσμα υπόστεγο (Σχ. 2D, λωρίδα 1) και η εξάντληση του ζελατινάσης 70-kDa από τα ενεργοποιημένα σφαιρίδια matriptase mAb (Εικ . 2D, λωρίδα 2). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι ενώ MCF7 κύτταρα καρκίνου του μαστού ενεργοποιούν ιδιοσυστατικά matriptase υπό κανονικές συνθήκες, η συντριπτική πλειοψηφία του ενεργού matriptase ταχέως αναστέλλεται από ΗΑΙ-1 αν και ένα μικρό ποσοστό του ενεργού ενζύμου μπορεί να είναι ταχέως ρίξει στο εξωκυτταρικό περιβάλλον. Η αποβολή του δραστικού matriptase προς το εξωκυτταρικό περιβάλλον με τον τρόπο αυτό είναι σύμφωνο με την ανίχνευση των δραστικών matriptase στο ρυθμισμένο μέσο των κυττάρων καρκίνου του μαστού σε πρώιμο μελέτη μας [35].

A.

κύτταρα MCF7 διεγέρθηκαν για την ενεργοποίηση matriptase με ρυθμιστικό διάλυμα ρΗ 6.0 που ακολουθείται από εξουδετέρωση σε ρΗ 8,0. Το μίγμα των κυττάρων και το ρυθμιστικό διάλυμα (Συνδυάστε), τα σφαιροποιημένα κύτταρα μετά από φυγοκέντριση (Cell), και το υπερκείμενο ρυθμιστικό (υπόστεγο κλάσμα) μόνο (υπόστεγο) αναλύθηκαν για τρυπτική δραστικότητα με διάσπαση ενός συνθετικού φθορίζοντος υποστρώματος με Arg ως Ρ1 θέση . RFU σημαίνει σχετική φθορίζουσα μονάδα. B. Η ρίξει κλάσματα που συλλέχθηκαν από κύτταρα MCF7 μετά την επαγωγή της ενεργοποίησης matriptase (Πράξη.) Και τον έλεγχο της μη ενεργοποίησης (μη-πράξης.) Υποβλήθηκαν σε ανοσοεξάντληση με ενεργό matriptase χάντρες mAb M69. Τα κλάσματα υπόστεγο (L, λωρίδες 1 και 4), τα κλάσματα απεμπλουτισμένο (D, λωρίδες 2 και 5) και τα εκλουόμενα κλάσματα (Ε, διαδρομή 3 και 6) αναλύθηκαν για είδη matriptase με κηλίδα Western χρησιμοποιώντας το mAb Μ24.

Γ.

Και

Δ.

Το κλάσμα υπόστεγο που συλλέγονται από ρΗ 6 ρυθμιστικό εκτεθειμένα κύτταρα MCF7 ήταν ανοσολογικά χρησιμοποιώντας χάντρες M69. Το κλάσμα υπόστεγο (L, λωρίδα 1) και το κλάσμα ανοσολογικά (D, λωρίδα 2) αναλύθηκαν για την δραστηριότητα τρυπτικό (πίνακας

C

) και ζελατινολυτική δραστηριότητα με ζυμογραφία ζελατίνης (πίνακας

D

, Gel. Ζιμ.). RFU σημαίνει σχετικές μονάδες φθορισμού? Α-Ε για ενεργοποιημένα-φόρτωση? Α-Δ για ενεργού εξαντλημένο.

Η

Για να προσδιοριστεί αν άλλες matriptase εκφράζουν μαστού καρκινικά κύτταρα ρυθμίζουν επίσης matriptase με παρόμοιο τρόπο σε κύτταρα MCF7, αναλύσαμε δείγματα δημιουργούνται χρησιμοποιώντας MDA-MB-468 και SK -Br-3 κύτταρα καρκίνου του μαστού υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης και όταν υποβάλλονται σε ενεργοποίηση matriptase ζυμογόνου οξύ που προκαλείται. είδη Matriptase και πρωτεολυτική δραστικότητα εκτιμήθηκαν όπως προηγουμένως μέσω ενός συνδυασμού των δοκιμασία φθορισμού διάσπασης υποστρώματος, ανοσοεξάντληση και αναλύσεις ανοσοστυπώματος (Εικ. 3). Παρόμοια με τα κύτταρα MCF7, MDA-MB-468 κύτταρα ιδιοσυστατικά ενεργοποιούν matriptase (Σχ. 3Α διαδρομή 1), και μπορεί να διεγείρονται για να ενεργοποιήσει δυναμικά matriptase ακολουθούμενη από ταχεία αναστολή ΗΑΙ-1-μεσολάβηση σε απόκριση σε κυτταρική έκθεση σε ήπια όξινο ρυθμιστικό (Εικ . 3Α γραμμή 2). Το 120-kDa matriptase-ΕΑΒ-1 σύμπλοκο είναι ειδικά ανοσολογικά χρησιμοποιώντας τα ενεργοποιημένα σφαιρίδια matriptase mAb (Σχ. 3Α λωρίδα 3) και το μεγαλύτερο μέρος του οξέος-διίσταται ελεύθερα δραστικά matriptase εκλούεται και παρέμεινε μη συμπλοκοποιημένων εξής εξουδετέρωση (Σχ. 3 διαδρομή 4 ). Θρυπτικής δραστικότητα ανιχνεύθηκε μόνο στα κλάσματα υπόστεγο και όχι στα κλάσματα των κυττάρων (Εικ. 3Β), η πλειοψηφία των οποίων ήταν ανοσολογικά με το ενεργοποιημένο matriptase mAb M69 (Σχ. 3C), επιβεβαιώνοντας την παρουσία του δραστικού matriptase στο εξωκυτταρικό περιβάλλον. Το τρίτο κύτταρα καρκίνου του μαστού, SK-BR3 μοιάζει MCF7 και ΜϋΑ-ΜΒ-468 σε σχέση με την ενεργοποίηση matriptase οξύ που προκαλείται από (Σχ. 3D, λωρίδα 1), ανοσοεξάντληση, και την έκλουση της μη συμπλοκοποιημένης ενεργοποιημένων matriptase από τα ενεργοποιημένα σφαιρίδια matriptase mAb ( Σχ. 3D, λωρίδες 2 και 3). Και πάλι, το τρυπτικό δραστηριότητα που δημιουργείται μαζί με την επαγωγή της ενεργοποίησης ζυμογόνου matriptase χύθηκε και όχι συγκρατείται με τα κύτταρα (Σχ. 3 Ε), και η πλειοψηφία του ρίξει θρυπτικών δραστικότητα προήλθε από το ενεργό matriptase (Εικ. 3 F).

Μια

και

D

: MDA-MB-468 και SK-bR-3 ανθρώπινου καρκίνου του μαστού κύτταρα διεγείρονται για να ενεργοποιήσετε matriptase (ή όχι) με pH 6 (ή ελέγχου) ρυθμιστικό έκθεσης. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανοσοεξάντληση για την απομάκρυνση ενεργοποιημένου matriptase. Τα προϊόντα λύσης από κύτταρα ελέγχου μη ενεργοποίησης (Ν), οξύ-ενεργοποιημένα κύτταρα (Α), ο M69 απεμπλουτισμένο κυτταρικού εκχυλίσματος (D), και το εκλουόμενο κλάσμα (Ε) αναλύθηκαν για ολική είδη matriptase με ανοσοστύπωμα χρησιμοποιώντας το matriptase mAb Μ24.

Β

και

E

. MDA-MB-468 (

B

) και SK-BR-3 (

E

) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ρΗ 6.0 ρυθμιστικό για να επάγει την ενεργοποίηση matriptase. Μετά την εξουδετέρωση, μίγμα των κυττάρων και του ρυθμιστικού (Συνδυάστε), τα σύμπηκτα κύτταρα μετά από φυγοκέντριση (Cell), και το υπερκείμενο ρυθμιστικό (υπόστεγο κλάσμα) μόνο (υπόστεγο) αναλύθηκαν για τρυπτικά δραστηριότητα.

C

και

F

. MDA-MB-468 και λύματα κυττάρων SK-BR-3, που παρασκευάζεται μετά την επαγωγή της ενεργοποίησης matriptase ήταν ανοσολογικά με τη χρήση του mAb M69. Τα προϊόντα λύσης κυττάρου (Α-Ε) και τα ανοσολογικά κλάσματα (Α-Δ) αναλύθηκαν για τρυπτικά δραστηριότητα.

Η

Κανονισμός του matriptase σε προστάτη και του καρκίνου των ωοθηκών σε

κύτταρα

Matriptase είναι επίσης εκφράζεται σε καρκίνο του προστάτη, και οι τρεις πιο συχνά χρησιμοποιούμενη σειρές καρκίνου του προστάτη, DU145, PC3 και LNCaP όλα εκφράζουν matriptase αν και DU145 εκφράζει πολύ λιγότερο από τις άλλες δύο γραμμές (Σχ. 4Α, αριστερά, λωρίδες 1, 3 και 5). Και οι τρεις γραμμές ενεργοποιούν matriptase σε απόκριση σε έκθεση εξωκυτταρικό οξύ όπως υποδεικνύεται από την παρουσία του kDa matriptase-ΕΑΒ-1 σύμπλοκο 120 (Σχ. 4Α, αριστερά, λωρίδες 2, 4, και 6), η οποία επίσης ανιχνεύεται όταν τα δείγματα είναι ανοσοστυπώθηκαν με τη χρήση του ενεργοποιημένου matriptase-ειδικό mAb M69 (Σχ. 4Α, δεξιά, λωρίδες 2, 4, και 6). Acid έκθεση των κυττάρων επάγει επίσης την απόπτωση των θρυπτικών δραστηριότητα στο εξωκυτταρικό περιβάλλον με PC3 και LNCaP κύτταρα, αλλά όχι από κύτταρα DU145 (Εικ. 4 Β-D). Όπως και με τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού, η πλειοψηφία του υπόστεγο τρυπτικών δραστηριότητα ρίξει από, το PC3 και LNCaP κύτταρα, επιβεβαιώθηκε ότι συνδέεται με την ενεργό matriptase με ανοσοεξάντληση όπως περιγράφηκε παραπάνω (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η έλλειψη ανιχνεύσιμης τρυπτικών δραστηριότητας αποβάλλεται από τα κύτταρα DU145 εμφανίζεται λόγω του χαμηλού επιπέδου έκφρασης matriptase σε αυτή την κυτταρική σειρά. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα μοιάζουν κύτταρα καρκίνου του μαστού σχετικά με την ταχεία ΕΑΒ-1-μεσολαβούμενη αναστολή της κυτταρικής δραστικών matriptase και για το χύσιμο του ορισμένα επίπεδα της ελεύθερης δραστικής matriptase στο εξωκυττάριο περιβάλλον.

A

. Τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, DU145 (DU), PC3 (PC3) και LNCaP (LN) εκτέθηκαν σε ρΗ 6,0 (ή ελέγχου) ρυθμιστικό διάλυμα για να προκληθεί η ενεργοποίηση matriptase. Κυτταρολύματα από ρΗ 6 εκτεθειμένα κύτταρα (Α, λωρίδες 2, 4, και 6) και τα κύτταρα ελέγχου μη ενεργοποίησης (Ν, λωρίδες 1, 3, και 5) αναλύθηκαν για ολική είδη matriptase (αριστερά) με τη χρήση του mAb M24 και ενεργοποιείται matriptase χρησιμοποιώντας το mAb M69 (δεξιά).

Β

,

C

, και

D

. Τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, DU145 (

B

), PC3 (

C

) και LNCaP (

D

) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ρΗ 6.0 ρυθμιστικό για να επάγει την ενεργοποίηση matriptase. Μετά την εξουδετέρωση, ο συνδυασμός του κυττάρου και τα κλάσματα υπόστεγο (συνδυάζουν), τα κλάσματα κύτταρα μόνο (κυττάρων), και το κλάσμα υπόστεγο μόνο (υπόστεγο) αναλύθηκαν για τρυπτικά δραστηριότητα. RFU συμβολίζει σχετικές μονάδες φθορισμού.

Η

Δύο κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών που εκφράζουν matriptase, OCAR3 και Ον2008, μελετήθηκαν επίσης και αποκάλυψε τα ίδια χαρακτηριστικά σε σχέση με την ενεργοποίηση matriptase που προκαλείται από την έκθεση σε ρΗ 6.0 ρυθμιστικό με το ταχύ σχηματισμό ενεργοποιημένων συμπλοκών matriptase-ΕΑΒ-1, που είχαν εξαντληθεί από το mAb M69 (Εικ. 5Α). Ούτε κυτταρική γραμμή διατηρείται κυττάρου σχετιζομένου τρυπτικών δραστηριότητα, αλλά να ρίξει την δραστικότητα στην ενδιάμεση μνήμη, η οποία πιστοποιήθηκε να προκύψει από ενεργείς matriptase με ανοσοεξάντληση χρησιμοποιώντας το mAb M69 (Εικ. 5 Β και C). Η matriptase υπόστεγο παρουσίασαν ζελατινολυτική δραστηριότητα, η οποία και πάλι είχε εξαντληθεί από την mAb M69 (Σχ. 5D).

Μια

. Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών OVCAR3 επάχθηκαν για την ενεργοποίηση matriptase με ρΗ 6,0 (ή ελέγχου) ρυθμιστικό διάλυμα. Κυτταρολύματα ανοσολογικά με το mAb M69. Τα κυτταρολύματα των κυττάρων ελέγχου μη ενεργοποίησης (Ν, λωρίδα 1), το ρΗ 6 ενεργοποιημένα κύτταρα (Α, λωρίδα 2), και το ανοσολογικά κλάσμα (D, λωρίδα 3) αναλύθηκαν για είδη matriptase με κηλίδα Western χρησιμοποιώντας το Μ24 mAb .

Β

. και C. Τα κλάσματα κύτταρα (κυτταρική), τα κλάσματα υπόστεγο (υπόστεγο), και τα ενεργοποιημένα matriptase-εξαντλημένο κλάσματα υπόστεγο (καταστρέφουν) του OVCAR3 (

B

.) κύτταρα και Ον2008 κυττάρων (

C

.) αναλύθηκαν για τρυπτικά δραστηριότητα. RFU σημαίνει σχετικές μονάδες φθορισμού.

Δ.

OV2008 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών παρακινήθηκαν να ενεργοποιήσετε matriptase με ρΗ 6,0 ρυθμιστικό. Το κλάσμα υπόστεγο (λωρίδα 1) και το ενεργοποιημένο matriptase εξαντλημένο κλάσμα υπόστεγο (λωρίδα 2) αναλύθηκαν για matriptase ζελατινολυτική δραστηριότητα με ζυμογραφία ζελατίνης.

Η

Η πλειοψηφία του ενεργοποιημένου matriptase αποβάλλεται από αιματολογικές καρκινικά κύτταρα είναι ρίξει ως ελεύθερο ενεργό matriptase

Matriptase εκφράζεται επίσης σε αιματολογικές καρκινικά κύτταρα, αλλά, σε πλήρη αντίθεση με τα κύτταρα επιθηλιακής προέλευσης, εκφράζουν καθόλου ή πολύ χαμηλά επίπεδα της ΕΑΒ-1 [36], [37]. Για να διερευνηθεί η ενεργοποίηση matriptase και το χύσιμο δυναμική σε καρκίνους του τύπου αυτού μπορούμε παροδικά εκτεθειμένοι RPMI 8226 ανθρωπίνων κυττάρων πολλαπλού μυελώματος που και κύτταρα λεμφώματος Burkitt Ramos σε ρΗ 6.0 ρυθμιστικό και ακολούθησε ρύθμιση σε ρΗ 8 με ρυθμιστικό διάλυμα Tris όπως είχαμε κάνει με τους επιθηλιακούς καρκίνους. Υψηλά επίπεδα τρυπτικών δραστικότητας ανιχνεύθηκαν στο μίγμα των κυττάρων και του ρυθμιστικού διαλύματος (υπόστεγο κλάσμα) (Σχ. 6Α), και όταν τα κύτταρα και να ρίξει κλάσματα διαχωρίστηκαν με φυγοκέντρηση, το τρυπτικό δραστικότητα ανιχνεύθηκε μόνο στο κλάσμα υπόστεγο, και δεν συσχετίστηκε με τα κύτταρα. Περαιτέρω, η δραστικότητα τρυπτικό απομακρύνθηκε πλήρως όταν τα κλάσματα υπόστεγο αφαιρέθηκαν χρησιμοποιώντας τα ενεργοποιημένα σφαιρίδια matriptase mAb, επιβεβαιώνοντας ότι η ενεργός matriptase είναι η πηγή του θρυπτικού δραστικότητα που ανιχνεύεται.

A

και em

Β.

ανθρώπινα κύτταρα λεμφώματος Burkitt Ramos (

A

) και 8226 ανθρώπινα κύτταρα πολλαπλού μυελώματος RPMI (

B

) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ρΗ 6.0 ρυθμιστικό για να επάγει την ενεργοποίηση matriptase. Μετά την εξουδετέρωση, ο συνδυασμός του κυττάρου και το κλάσμα υπόστεγο (συνδυάζουν), το κύτταρο κλάσμα μόνο του (κυττάρων), και το κλάσμα υπόστεγο μόνο (υπόστεγο) αναλύθηκαν για τρυπτικά δραστηριότητα.

C

και

D

.