Αφηρημένο

Ιστορικό

Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι όγκου του παχέος εντέρου κύτταρα διεγείρουν τα μακροφάγα για να απελευθερώσει την IL-1β, το οποίο με τη σειρά του απενεργοποιεί ΟδΚ3β και ενισχύει σηματοδότηση Wnt σε καρκινικά κύτταρα κόλου, δημιουργώντας ένα βρόχο αυτο-ενίσχυση που προάγει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων.

Principal Εκτίμηση

Εδώ περιγράφουμε ότι τα μακροφάγα προστατεύουν HCT116 και HKE-3 καρκινικά κύτταρα κόλου από TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. Η απενεργοποίηση της IL-1β με την εξουδετέρωση αντίσωμα IL-1β, ή αποσιώπηση της IL-1β σε μακροφάγα ανέστειλε την ικανότητά τους να αντιμετωπίσουν TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. Συνεπώς, η IL-1β ήταν επαρκής για να αναστείλει TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. TRAIL επαγόμενη κατάρρευση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (Δψ) και την ενεργοποίηση των κασπασών εμποδίστηκαν από μακροφάγα ή με ανασυνδυασμένη IL-1β. Η φαρμακολογική αναστολή της IL-1β απελευθέρωση από τα μακροφάγα με βιταμίνη D

3, ένας ισχυρός παράγοντας χημειοπροληπτική για τον ορθοκολικό καρκίνο, αποκατέστησε την ικανότητα του TRAIL να επάγει απόπτωση των καρκινικών κυττάρων που καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα. Τα μακροφάγα και IL-1β απέτυχε να αναστείλει TRAIL-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα HCT116 που εκφράζουν dnIκB, dnAKT ή dnTCF4, επιβεβαιώνοντας ότι αντιτίθενται TRAIL-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο μέσω επαγωγής Wnt σηματοδότηση σε κύτταρα όγκου. Δείξαμε ότι τα μακροφάγα και IL-1β σταθεροποιημένο σαλιγκάρι σε κύτταρα όγκου σε ένα ΝΡ-κΒ /Wnt εξαρτώμενο τρόπο και ότι Σαλιγκάρι κύτταρα ελλειμματικά όγκου δεν προστατεύθηκαν από TRAIL απόπτωση που επάγεται από μακροφάγα ή από την IL-1β, επιδεικνύοντας σημαντικό ρόλο των σαλιγκαριών στην αντίσταση των καρκινικών κυττάρων να διαδρομή

η σημαντικότητα

Έχουμε αναγνωρίσει ένα θετικό βρόχου ανάδρασης μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και των μακροφάγων που διαδίδεται την ανάπτυξη και προάγει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου:. καρκινικά κύτταρα διεγείρουν μακροφάγων να εκκρίνουν IL-1β, το οποίο με τη σειρά του, προωθεί την σηματοδότηση Wnt και σταθεροποιεί σαλιγκάρι σε κύτταρα όγκου, που προσδίδει αντίσταση σε TRAIL. Η βιταμίνη D

3 στάσεις αυτό ενίσχυση βρόχου παρεμβαίνοντας με την απελευθέρωση της IL-1β από τα μακροφάγα. Κατά συνέπεια, η βιταμίνη D

3 ευαισθητοποιεί κύτταρα όγκου σε TRAIL-επαγόμενης απόπτωσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι η θεραπευτική αποτελεσματικότητα του TRAIL μπορούσε να αυξηθεί με την παρούσα άμεσα διαθέσιμα χημειοαποτρεπτικό παράγοντα

Παράθεση:. Kaler Ρ, Galea V, Augenlicht L , Klampfer L (2010) που σχετίζεται με όγκο μακροφάγα Προστατέψτε τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα από TRAIL απόπτωση που επάγεται μέσω της IL-1β- εξαρτημένων Σταθεροποίηση των σαλιγκαριών στα κύτταρα των όγκων. PLoS ONE 5 (7): e11700. doi: 10.1371 /journal.pone.0011700

Επιμέλεια: Dong-Yan Jin, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 13 του Απριλίου του 2010? Αποδεκτές: 27 Ιουν 2010? Δημοσιεύθηκε: 22 Ιουλ 2010

Copyright: © 2010 Kaler et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την CA 111361 (για να LK), U54 CA 100926 (για LA) και P30-13330 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η φλεγμονή συμβάλλει στην πρόοδο του όγκου με τη δημιουργία συνθηκών που υποστηρίζουν την ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων και την επιβίωση και την αύξηση μεταστατικό δυναμικό τους. Πράγματι, η χρόνια φλεγμονή έχει δειχθεί ότι προδιαθέτουν για την ανάπτυξη μιας ποικιλίας όγκων, ένα εντυπωσιακό παράδειγμα είναι η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου, η οποία συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου [1]. Επιπλέον, φαίνεται ότι οι καρκίνοι του παχέος εντέρου που δεν αναπτύσσονται ως επιπλοκή της φλεγμονώδους νόσου του εντέρου είναι επίσης από φλεγμονή, επειδή έχει δείξει ότι η τακτική χρήση των NSAIDs μειώνει το θνησιμότητα από σποραδικό καρκίνο του παχέος εντέρου και έχει σαν αποτέλεσμα υποστροφή αδενωμάτων σε ασθενείς FAP , που κληρονομούν μια μετάλλαξη στο γονίδιο APC [2]. Διαλυτό παράγοντες που διαδίδουν φλεγμονή μπορεί να παραχθεί με τον εαυτό τους ή κύτταρα όγκου, πιο συχνά, από κύτταρα προσλαμβάνονται στο μικροπεριβάλλον του όγκου, όπως είναι τα μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ). Συντονισμένη σηματοδότηση μεταξύ των κυττάρων του όγκου και μη κακοήθη κύτταρα στο μικροπεριβάλλον του όγκου που απαιτείται για την εξέλιξη των όγκων, και μονοπάτια που ρυθμίζουν την στιχομυθία μεταξύ των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου και του στρώματος, όπως NF-κΒ και STAT3 σηματοδότησης, έχουν αναδειχθεί ως σημαντικούς στόχους για χημειοπροληπτική και χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [3], [4]. Ομοίως, TNFa ανταγωνιστές είναι σε φάση Ι /ΙΙ κλινικών δοκιμών και έχουν δειχθεί να είναι καλά ανεκτές σε ασθενείς με συμπαγείς όγκους [5], [6].

Διαπιστώσαμε πρόσφατα ότι τα μακροφάγα προωθούν σηματοδότηση Wnt σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα και έτσι να ενισχύσουν τον πολλαπλασιασμό τους, και απέδειξαν ότι τα μακροφάγα ασκούν protumorigenic τους δραστηριότητα κυρίως μέσω της απελευθέρωσης της IL-1β [7], [8]. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι μακροφάγα προερχόμενα παράγοντες, εκτός από την υποστήριξη της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων, να προωθήσει επίσης την επιβίωσή τους κατά την κατεργασία με TNF που σχετίζονται με την απόπτωση που επάγει συνδέτη (TRAIL), ενός ισχυρού διεγέρτη της εξωγενούς οδού της απόπτωσης.

TRAIL εκκινεί την απόπτωση με δέσμευση σε δύο υποδοχείς θανάτου, DR4 και DR5, ενώ η πρόσδεση στους υποδοχείς δολώματα που στερούνται την περιοχή θανάτου, όπως DCR1, DCR2 και οστεοπροτεγερίνη, αναστέλλει προ-αποπτωτική δραστηριότητα του [9]. Η δέσμευση του TRAIL με το θάνατο επάγει υποδοχείς αποτελέσματα DR4 /DR5 στην πρόσληψη του Fas -associated περιοχή θανάτου (FADD) στους υποδοχείς, η οποία εκκινεί σύνδεση του procaspase-8 και procaspase-9, και ο σχηματισμός του θανάτου που επάγει συγκρότημα σηματοδότησης (DISC) [9]. Στον τύπο Ι κύτταρα, κασπάσης-8 ενεργοποίησης είναι επαρκής για την ενεργοποίηση κασπάσες ενέργειας 3, 6 και 7, ενώ στα κύτταρα τύπου II, η αποπτωτικού καταρράκτη απαιτεί ολοκλήρωση της μιτοχονδριακής οδού διαμεσολαβείται από την κασπάση-8 επαγόμενη διάσπαση της προσφοράς.

Tumor κύτταρα είναι σημαντικά πιο ευαίσθητα σε TRAIL απόπτωση που επάγεται από τα φυσιολογικά κύτταρα, για την ίδρυση TRAIL και DR4 ή DR5 αγωνιστικά αντισώματα όπως ελκυστική αντικαρκινικά φάρμακα. Πράγματι, σε πλήρη αντίθεση με τα άλλα μέλη της οικογένειας TNF, αγωγή ποντικών και των πρωτευόντων με ανασυνδυασμένο TRAIL επήγαγε σημαντική υποχώρηση των όγκων χωρίς συστηματική τοξικότητα [10], [11]. Πρόσφατα, ο συνδυασμός του TRAIL με όλα οξικό trans-ρετινόλη (RAC) έχει δειχθεί ότι επάγει απόπτωση επιλεκτικά σε αδενωματώδη πολυποδίαση (APC) με ανεπάρκεια επιθηλιακών κυττάρων χωρίς να βλάπτουν την κανονική cellsαα και θεραπεία της aPC

Min

ποντίκια με TRAIL και RAC επαγόμενη απόπτωση σε εντερικούς πολύποδες και παρατεταμένη επιβίωση των ζώων [12].

Ωστόσο, υπάρχουν σημαντικές διαφορές στην ευαισθησία TRAIL μεταξύ ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Αντοχή σε TRAIL έχει αποδειχθεί να αναπτύξει σε κύτταρα με μεταλλαγμένη DR5 [13] ή στην ανεπάρκεια αναντιστοιχία επισκευή όγκους με μεταλλάξεις Bax [14]. Σε αντίθεση, ο-Μγο προάγει την δυνατότητα ανταπόκρισης σε TRAIL αναστέλλοντας την έκφραση του FLIP, έναν αναστολέα της σηματοδότησης TRAIL [15], και εξουδετερώνοντας TRAIL επαγόμενη προς τα πάνω ρύθμιση mcl-1 και cIAP2, δύο πρωτεΐνες με εγγενή ικανότητα να αναστέλλουν την απόπτωση [ ,,,0],16]. Επιπλέον, τα στρωματικά κύτταρα και διαλυτούς παράγοντες που υπάρχουν στο μικροπεριβάλλον του όγκου έχουν δειχθεί ότι έχουν σημαντική επίδραση στην ευαισθησία των κυττάρων του όγκου σε θεραπευτικούς παράγοντες [17], [18].

TRAIL ανεπαρκή ποντίκια εμφανίζουν αυξημένη ευαισθησία για καρκινογόνο επαγόμενη ογκογένεσης και αύξησαν μεταστατικό δυναμικό [19], [20], αποδεικνύοντας ότι το TRAIL εξασκεί δραστικότητα καταστολέα όγκων, και προτείνει ένα σημαντικό ρόλο των ενδογενών TRAIL στην επιτήρηση του όγκου. Πράγματι, οι συγγραφείς έδειξαν ότι το TRAIL είναι, τουλάχιστον εν μέρει, υπεύθυνη για ΝΚ κυττάρων με τη μεσολάβηση, ΙΡΝγ εξαρτώμενο, μηχανισμός αποβολής του όγκου.

Στην παρούσα μελέτη αποδείξαμε ότι TRAIL απόπτωση που επάγεται από τον καρκίνο του παχέος εντέρου κυττάρων αναστέλλεται από μακροφάγα προερχόμενα IL-1β, και έδειξε ότι τα μακροφάγα και ανασυνδυασμένης IL-1β να αντισταθμίζουν τη TRAIL επαγόμενη απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης του σηματοδότηση Wnt και σταθεροποίηση σαλιγκάρι σε καρκινικά κύτταρα. Τέλος, παρουσιάζουμε δεδομένα που υποδεικνύουν ότι «ομαλοποίηση» του μικροπεριβάλλοντος του όγκου από τη βιταμίνη D

3, ένας ισχυρός παράγοντας χημειοπροληπτικός, αποκαθιστά την ευαισθησία του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων σε TRAIL, γεγονός που υποδηλώνει ότι η θεραπευτική αποτελεσματικότητα του TRAIL μπορεί να βελτιωθεί σε μεγάλο βαθμό από παράγοντες ότι αναστέλλουν την αλληλοπαρεμβολές μεταξύ καρκινικών κυττάρων και μικροπεριβάλλοντος του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές γραμμές και συν-καλλιέργειας πειράματα

Ο HCT116 και HKE-3 κυτταρικές σειρές ορθοκολικού καρκινώματος , τα οποία διαφέρουν μόνο από την παρουσία του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου K-RAS [21] και SW480 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ, ενώ τα κύτταρα 293Τ καλλιεργήθηκαν σε DMEM. Η ανθρώπινη μονοκυτταρική γραμμή, ΤΗΡ1, καλλιεργήθηκε σε RPMI. Φυσιολογικά ανθρώπινα μονοκύτταρα, & gt? 90% CD14 και CD11c θετική και κυτταρικό υποδοχέα αντι Τ λιγότερο από το 1% θετική, αγοράστηκαν από την

Αστάρτη Βιολογικών

(Redmond, WA). Τα κύτταρα όγκου και τα μονοκύτταρα /μακροφάγα συνκαλλιεργήθηκαν χωρίζονται από παρεμβλημάτων Transwell μιας μεμβράνης πολυανθρακικού με μέγεθος πόρου 0.4 μm, το οποίο αποκλείει την άμεση επαφή κυττάρου-κυττάρου, αλλά επιτρέπουν την ανταλλαγή των διαλυτών παραγόντων (Corning Incorporated, Lowell, ΜΑ).

για κλωνογονική δοκιμασία, HCT116 και τα κύτταρα HKE-3 σπάρθηκαν σε πυκνότητα 200 κύτταρα ανά φρεάτιο μόνο του ή μαζί με ΤΗΡ1 μακροφάγα ή μονοκύτταρα περιφερικού αίματος για 7 ημέρες ενός τρυβλίου έξι. Τα κύτταρα όγκου καλλιεργήθηκαν με ΤΗΡ1 μονοκύτταρα άμεσα (1.600 ανά φρεάτιο μιας πλάκας 6 φρεατίων), όπως ΤΗΡ1 κύτταρα δεν αποδίδουν και σχηματίζουν αποικίες. Η βέλτιστη αναλογία μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και των μακροφάγων ιδρύθηκε προηγουμένως [7], [8]. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 6% γλουταραλδεϋδη και 0,5% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν με Total Lab 1.1 λογισμικό (Nonlinear Dynamics, Durham, NC, USA).

Προσδιορισμός απόπτωσης

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ανασυνδυασμένο TRAIL (50 ng /ml, τα οποία διαπιστώσαμε ήταν η βέλτιστη συγκέντρωση) μόνο ή με την παρουσία μακροφάγων, IL-1β (5 ng /ml) ή TNFa (10 ng /ml) για 7 ώρες. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε υπότονο ρυθμιστικό διάλυμα (0,1% Triton Χ-100, 0.1% κιτρικό νάτριο) και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (50 μg /ml) για 4 ώρες στους 4 ° C όπως περιγράφεται [22]. Τα δείγματα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής και την κατανομή του κυτταρικού κύκλου και την έκταση της απόπτωσης (κύτταρα με περιεκτικότητα subG1 DNA) αναλύθηκαν με τη

ΜΟϋΡΙΤ

λογισμικού. δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας το φθορίζουσα χρωστική JC-1 (

Invitrogen

). Τα κύτταρα βάφτηκαν με 1 μΜ JC1 για 1 ώρα στους 37 ° C, πλύθηκαν με PBS και αναλύθηκαν με φθορισμό στο κανάλι FL2. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με TRAIL για ~ 7 ώρες και συλλέχθηκαν για εκτίμηση με βάση μορφολογικά κριτήρια. Ωστόσο, όπως χρώση ΡΙ μπορεί να υποτιμούν το ποσό της απόπτωσης [23], που επιβεβαίωσε την αποπτωτική φύση των κυττάρων από βιοχημική ανάλυση κυτταρολυμάτων. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση t test unpaired του Student, με τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Παροδική επιμόλυνση και Reporter προσδιορισμό γονιδίου

HCT116 και HKE-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με το TOP-. FLASH ή TOP-FOP πλασμίδια αναφοράς της λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του φωσφορικού ασβεστίου. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης ομαλοποιήθηκε με συν-επιμόλυνση με ΡΤΚ Renilla και δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του πωλητή (δοκιμασία ρεπόρτερ λουσιφεράσης Διπλή, Promega, Madison, WI). Κυρίαρχο αρνητικό ΙκΒα εκφράστηκε από ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί για ΙκΒα με σερίνες 32 και 36 μεταλλαγμένο σε αλανίνη, η οποία προσδίδει αντοχή σε ερεθίσματα που προκαλείται αποικοδόμηση [24]. Πλασμίδια που εκφράζουν μόνιμα ενεργών ΑΚΤ, (ΗΑ-mdelta (4-129) PH-ΑΚΤ), και κυρίαρχη αρνητική ΑΚΤ (ΗΑ-ΑΚΤ-K179M) δόθηκαν από τον Richard Roth [25], [26]. dnTCF4 περιγράφηκε προηγουμένως [27].

Τα μακροφάγα επιμολύνθηκαν με 20 ηΜ μη ειδικό siRNA (NSP) ή siRNAs ειδικό για VDR, IL-1β ή STAT1 (Dharmacon, Lafayette, CO) χρησιμοποιώντας Lipofectamin LTX (Invitrogen , Carlsbad, CA). Η αποτελεσματικότητα της αποσιώπησης παρακολουθήθηκε με ανοσοκηλίδωση (για STAT1 και VDR), ή με ELISA (για την IL-1β), όπως αναφέρεται [7], [8].

ανοσοφθορισμού

Για την υποκυτταρική ανίχνευση β-κατενίνης με ανοσοφθορισμό, κύτταρα στερεώθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-β-κατενίνης (1:100) για 1 ώρα στους 37 ° C και με δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού συζευγμένο με FITC για 45 λεπτά στους 37 ° C. Οι εικόνες ελήφθησαν με μια φωτογραφική μηχανή SPOT CCD και αναλύθηκαν με λογισμικό SPOT.

Western Blot

στυπώματα Western πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών. Οι μεμβράνες δεσμεύτηκαν με 5% γάλα σε TBS που περιέχει 0.1% Tween 20, και επωάζονται με αντισώματα ειδικά για κασπάση 8 (Abcam), κασπάσης 9, PARP, σαλιγκάρι (Cell Signaling Technology), pGSK3β (Millipore, Billerica, ΜΑ), το σύνολο των β κατενίνης (BD Biosciences, San Jose, CA), και β-ακτίνης (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Ανοσοαντιδραστικές ζώνες έγιναν ορατές με χημειοφωταύγεια (Amersham ECLTM δυτικό κιτ κηλίδωση ανίχνευση, Piscataway, NJ).

Αποτελέσματα

Τα μακροφάγα και IL-1β προστατεύουν κύτταρα καρκίνου κόλου από επάγεται TRAIL απόπτωση

Δείξαμε ότι τα μακροφάγα διεγείρουν διάφορες prosurvival μονοπατιών σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα κόλου, συμπεριλαμβανομένης της ΝΡ-κΒ, ΑΚΤ και σηματοδότηση Wnt [7], [8], υποδεικνύοντας ότι η παρουσία των μακροφάγων θα μπορούσαν να επηρεάσουν την απόκριση των καρκινικών κυττάρων σε θεραπευτικούς παράγοντες. HCT116 κύτταρα καρκίνου κόλου είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι σε TRAIL-επαγόμενη απόπτωση [16]. Κατά συνέπεια, TRAIL ανέστειλε σημαντικά την κλωνογόνο αύξηση των κυττάρων HCT116 και HKE-3 (Εικ. 1Α και Β), κυτταρικές σειρές που διαφέρουν μόνο με την παρουσία των μεταλλαγμένων Kras [21]. Δεν υπήρχε επαναλήψιμη διαφορά μεταξύ της ανταπόκρισης των HCT116 και HKE-3 κύτταρα για TRAIL (Σχ. 1 και 2), καταδεικνύοντας ότι η παρουσία του μεταλλαγμένου KRAS δεν ρυθμίζει την ανταπόκριση των κυττάρων σε TRAIL. Για να καθοριστεί εάν τα μακροφάγα μεταβάλλει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε TRAIL, υποβάλλαμε σε αγωγή HCT116 και HKE-3 κύτταρα με TRAIL με την απουσία ή παρουσία του ΤΗΡ1 μακροφάγα. Είναι αξιοσημείωτο ότι η παρουσία των ΤΗΡ1 μακροφάγα ή θεραπεία με IL-1β, μια κυτοκίνη που παράγεται σε συνκαλλιέργειες κυττάρων όγκου και των μακροφάγων [7], αποκατέστησε την κλωνογόνο αύξηση του TRAIL-θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα (Σχ. 1).

Α και Β: κύτταρα HCT116 και HKE-3 σπάρθηκαν σε πυκνότητα 200 κύτταρα ανά φρεάτιο ενός πλακιδίου έξι απουσία ή την παρουσία μακροφάγων (1600 /φρεάτιο) ή IL-1β, και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TRAIL για 4 ώρες. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον Β αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο δύο ανεξάρτητων πειραμάτων κάθε εκτελέστηκαν εις διπλούν.

Η

Τα μακροφάγα δεν ανέστειλε την έκφραση του DR4 ή DR5, ή ρυθμίζουν τα επίπεδα των υποδοχέων δολώματα DcR1 ή DcR2 σε HCT116 /HKE-3 κύτταρα (Σχήμα S1), γεγονός που υποδηλώνει ότι δεν διαμορφώνουν την δυνατότητα ανταπόκρισης σε μονοπάτι μέσα ρύθμισης των υποδοχέων TRAIL.

Στη συνέχεια δείξαμε ότι τα μακροφάγα και IL-1β ανέστειλε TRAIL επαγόμενη απόπτωση HCT116 και Hke- 3 κύτταρα (Σχ. 2Α). ΤΗΡ1 μακροφάγα και IL-1β απέκλειαν TRAIL-επαγόμενης κατάρρευση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (ΜΜΡ) (Σχ. 2Β) και απέτρεψε TRAIL επαγόμενη ενεργοποίηση της κασπάσης-8 και κασπάσης-9 (Σχ. 2C). Η ανθρώπινη μονοκυτταρική κυτταρική γραμμή ΤΗΡ-1 προήλθε από το περιφερικό αίμα ενός ασθενούς με οξεία μονοκυτταρική λευχαιμία και ΤΗΡ1 κύτταρα έχουν ιδιότητες του ανθρώπινου προερχόμενων από μονοκύτταρα μακροφάγων [28]. Αυτά τα κύτταρα έχουν πολλά χαρακτηριστικά των μακροφάγων που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ), συμπεριλαμβανομένης εξασθενημένη ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ, έλλειψη παραγωγής νιτρικού οξειδίου σε απόκριση σε LPS /ΙΡΝγ (δεν φαίνεται) και υψηλή συστατική STAT1 σηματοδότηση [7], [8]. Ωστόσο, για να επιβεβαιώσει ότι τα αποτελέσματα που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας ΤΗΡ1 κύτταρα είναι βιολογικώς σχετικό, δείξαμε ότι οι κανονικές μονοκύτταρα περιφερικού αίματος, πρόδρομοι των μακροφάγων που σχετίζονται με όγκους, που προστατεύεται από ένα πάνελ κόλον καρκινικές κυτταρικές γραμμές από TRAIL-επαγώμενη απόπτωση (Σχ. 2D). Όπως ΤΗΡ1 μακροφάγα, η κανονική μονοκύτταρα περιφερικού αίματος αποκατέστησε την ΜΜΡ και εμπόδισε την ενεργοποίηση της κασπάσης 8 και διάσπαση της ΡΑΚΡ σε κύτταρα όγκου TRAIL-αγωγή (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα, Εικόνα S2), η οποία είναι συνεπής με την ικανότητα των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου για να επάγει IL- 1β απελευθέρωση από μονοκύτταρα περιφερικού αίματος [7]

Α:. HCT116 (μέσος όρος των 5 ανεξάρτητων πειραμάτων) και HKE-3 κύτταρα (μέσος όρος από 4 ανεξάρτητα πειράματα) υποβλήθηκαν σε αγωγή με TRAIL απουσία ή την παρουσία μακροφάγων ή IL-1β (5 ng /ml) όπως υποδεικνύεται και η έκταση της απόπτωσης προσδιορίσθηκε μετά από 7 ώρες. Β: Το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) προσδιορίστηκε με χρώση JC1 5 ώρες μετά τη θεραπεία. C: Η ενεργοποίηση της κασπάσης 8 και κασπάσης-9 προσδιορίστηκε σε κύτταρα καρκίνου κόλου σε επεξεργασία με TRAIL (50 ng /ml) κάτω από συνθήκες που υποδεικνύονται. D: ρυμουλκουμένων ευαίσθητη καρκινικές κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με TRAIL απουσία ή την παρουσία ανθρωπίνων μονοκυττάρων περιφερικού αίματος (Μο) και την έκταση της απόπτωσης προσδιορίσθηκε 7 ώρες μετά την αγωγή. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο 2 ή 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Περιφερειακά μονοκυττάρων αίματος παρεμπόδισε TRAIL απόπτωση επίσης σε κύτταρα 293Τ (Σχ. 2D), καταδεικνύοντας ότι μακροφάγα προερχόμενα παράγοντες είναι γενικά και ισχυροί αναστολείς του TRAIL-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο.

Τα μακροφάγα προστατεύσει από TRAIL απόπτωση που επάγεται μέσω της IL-1β

Δείξαμε ότι η IL-1β είναι επαρκής για να αναστείλει TRAIL-επαγώμενη απόπτωση (Εικ. 2). Για να διαπιστωθεί αν το IL-1β απαιτείται για μακροφάγων διαμεσολαβείται προστασία των κυττάρων όγκου από TRAIL απόπτωση, εμείς σιγήσει πρώτα IL-1β σε ΤΗΡ 1 μακροφάγα. Αυτά τα πειράματα αποκάλυψαν ότι η IL-1β με ανεπάρκεια μακροφάγα δεν μπορούν να προστατεύσουν τα καρκινικά κύτταρα από TRAIL-επαγώμενη απόπτωση (Σχ. 3Α και 3Β). Σε συμφωνία με αυτά τα δεδομένα, η εξουδετέρωση της IL-1β με ειδικό αντίσωμα IL-1β, ή αποσιώπηση STAT1, έναν παράγοντα μεταγραφής που δείξαμε απαιτείται για την αποδέσμευση της IL-1β από τα μακροφάγα [7] ανέστειλε επίσης την αντι-αποπτωτική δραστηριότητα του μακροφάγα (Σχ. 3Α και 3Β). Όπως αναμενόταν, το αντίσωμα εξουδετέρωσης της IL-1β ανέστειλε την prosurvival δραστικότητα της IL-1β, αποδεικνύοντας την ιδιαιτερότητα του αντισώματος. Μαζί, αυτά τα δεδομένα καθορίστηκε ότι τα μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους προστατεύουν τα καρκινικά κύτταρα από TRAIL επαγόμενη απόπτωση σε ένα τρόπο που εξαρτάται από την IL-1β

Α και Β:. Κύτταρα HCT116 καλλιεργήθηκαν με ΤΗΡ1 μακροφάγα με σιγήσει IL-1β ή έκφραση STAT1 και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TRAIL όπως υποδεικνύεται. IL-1β εξουδετερώθηκε με ειδικό αντίσωμα αντι-ΙL-1β. Ελήφθησαν εικόνες (Α) και η ποσότητα της απόπτωσης (Β) προσδιορίσθηκε μετά από 7 ώρες. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται σε Β αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Γ και Δ: Μελέτες από Γκιορφί

et al

([29], C) και από Khambata-Ford

et al

([30], D) που συμμετείχαν στην έρευνα μέσω Oncomine και δείχνουν ότι η κυτταρική γραμμές (C) και πρωτογενείς καρκίνους του παχέος εντέρου (D) με υψηλότερα επίπεδα αντίστασης IL-1βdisplay για θεραπευτικούς παράγοντες, όπως η βινβλαστίνη, δοξορουβικίνη και cetuximab (CTX).

η

για να καθοριστεί αν η ικανότητα της IL -1β να παρεμβαίνει με τη θεραπεία με επαγόμενη απόπτωση περιορίζεται σε TRAIL, ερευνήσαμε Oncomine (www.oncomine.org), η οποία είναι μια διάταξη μελέτες ανθρώπινης μικροσυστοιχιών όγκου. Η ανάλυση των 30 κυτταρικών σειρών από Γκιορφί

κ.ά.

[29] έδειξε ότι η υψηλή έκφραση της IL-1β σε κύτταρα γραμμές όγκου συσχετίζεται έντονα με την αντίσταση των κυττάρων σε βινμπλαστίνη και δοξορουβικίνη (Σχ. 3C). Η ανάλυση των 70 μεταστατικών όγκων του παχέος εντέρου [30] έδειξε ότι οι όγκοι του παχέος εντέρου που φιλοξενούν μεταλλαγμένο KRAS έχουν υψηλότερα επίπεδα της IL-1β από τους όγκους με WT KRAS (Εικ. 3D, αριστερό πάνελ). Είτε IL-1β παράγεται από στρωματικά κύτταρα ή κύτταρα όγκου μόνα τους δεν μπορούν να ολοκληρωθούν, ωστόσο, η ανάλυση της βάσης δεδομένων αποκάλυψε ότι τα υψηλότερα επίπεδα της IL-1β σε όγκους συσχετίζονται με αντοχή στην cetuximab [30] (Σχ. 3D, δεξί πάνελ). Συνοπτικά, αυτά τα δεδομένα καθορίστηκε ότι τα επίπεδα της IL-1β αυξημένα σε ένα υποσύνολο των ανθρώπινων όγκων του παχέος εντέρου, και ότι η IL-1β ρυθμίζει την απόκριση των καρκινικών κυττάρων σε μια ποικιλία θεραπευτικών παραγόντων τόσο

in vitro

και

in vivo

.

η φαρμακολογική αναστολή της IL-1β διέγερση με βιταμίνη D

3 αναστέλλει την prosurvival δράση των μακροφάγων

Εμείς απέδειξε πρόσφατα ότι ο σταυρός συζήτηση μεταξύ του όγκου κυττάρων και των μακροφάγων διαταράσσεται από τη βιταμίνη D

3, ένα σημαντικό παράγοντα χημειοπροληπτική για τον ορθοκολικό καρκίνο. Η βιταμίνη D

3 ανέστειλε την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να διεγείρουν IL-1β απελευθέρωση από τα μακροφάγα [7] και, στη συνέχεια, η βιταμίνη D

3 αντιμετωπίζονται μακροφάγα απέτυχε να επάγει σηματοδότηση Wnt σε κύτταρα όγκου [7]. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η βιταμίνη D

3 μπορεί επίσης να ρυθμίζουν TRAIL απόπτωση. κύτταρα HCT116 καλλιεργήθηκαν μόνα ή υπό την παρουσία μακροφάγων, και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TRAIL απουσία ή την παρουσία της βιταμίνης D

3. Η βιταμίνη D

3 δεν επηρέασε TRAIL επαγόμενη απόπτωση σε HCT116 κύτταρα ή HKE-3 (τα δεδομένα δεν φαίνονται), η οποία είναι συνεπής με την έλλειψη ανταποκρίσεως των κυττάρων αυτών με τη βιταμίνη D

3 [31]. Ωστόσο, αποδείξαμε ότι η ικανότητα των μακροφάγων να προστατεύουν κύτταρα καρκίνου κόλου από TRAIL επαγόμενη απόπτωση ανεστάλη με βιταμίνη D

3 (Σχ. 4Α). Η προσθήκη εξωγενούς IL-1β εμπόδισε την ικανότητα της βιταμίνης D

3 για τη ρύθμιση TRAIL απόπτωση που επάγεται, επιβεβαιώνοντας ότι η βιταμίνη D

3 αποκατασταθεί η ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε TRAIL με αναστολή της απελευθέρωσης της IL-1β από τα μακροφάγα, και όχι επηρεάζοντας σηματοδότηση από την IL-1β. Αποσιώπηση του VDR από VDR ειδικό siRNA στα μακροφάγα δεν επηρέασε την ικανότητά τους να αναστέλλουν TRAIL επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα όγκου, ωστόσο η βιταμίνη D

3 απέτυχε να αποκαταστήσει TRAIL απόπτωση που επάγεται από κύτταρα όγκου συν-καλλιεργήθηκαν με ανεπάρκεια VDR μακροφάγα (Εικ. 4Α) . Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η βιταμίνη D

3 επηρεάζει την στιχομυθία μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και των μακροφάγων με τη στόχευση των μακροφάγων και όχι τα κύτταρα του όγκου, και ότι, κατά συνέπεια, απαιτεί την έκφραση VDR σε μακροφάγα, σε συμφωνία με τα δημοσιευμένα δεδομένα μας [7].

Α: Η ποσότητα της απόπτωσης προσδιορίστηκε σε κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με TRAIL υπό υποδεικνύεται συνθήκες. Οι ράβδοι σφάλματος προήλθαν από 2 ανεξάρτητα πειράματα. Β: Η επίδραση της βιταμίνης D

3 σε TRAIL-επαγόμενη ενεργοποίηση των κασπασών και την διάσπαση της PARP και β-κατενίνης καθορίστηκε με ανοσοαποτύπωση

Η

Βιοχημική ανάλυση επιβεβαίωσε ότι ενώ τα μακροφάγα ανέστειλε ρυμουλκουμένων. επαγόμενη ενεργοποίηση της κασπάσης 8 και κασπάσης-9 και διάσπαση της PARP και β-κατενίνης, η θεραπεία με βιταμίνη D

3 προωθείται TRAIL-μεσολαβούμενη ενεργοποίηση του αποπτωτικού καταρράκτη σε καρκινικά κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε παρουσία WT, αλλά όχι VDR ανεπάρκεια μακροφάγα (Εικ. 4Β). Καθώς η βιταμίνη D

3 ενεργεί ως αναστολέας της απελευθέρωσης IL1-β, η δραστικότητα του εμποδίστηκε από εξωγενή IL-1β και εξηρτάτο από την έκφραση του VDR σε μακροφάγα (Σχ. 4Α, Σχ. 4Β) και όχι σε κύτταρα όγκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

η βιταμίνη D

3 επίσης αποκατέστησε την ευαισθησία στην TRAIL σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου που καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία μονοκυττάρων περιφερικού αίματος. Είναι αυξημένη ενεργοποίηση της κασπάσης 8 και επακόλουθη διάσπαση της PARP και β-κατενίνης σε HCT116 που επίκτητη αντοχή σε TRAIL, λόγω της παρουσίας των μονοκυττάρων του περιφερικού αίματος (Εικόνα S2).

Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η θεραπευτική αποτελεσματικότητα του TRAIL θα μπορούσε να βελτιωθεί σε μεγάλο βαθμό από τη βιταμίνη D

3 σε καρκίνους που διείσδυσε από τα μακροφάγα.

σηματοδότηση Wnt που απαιτείται για την prosurvival δραστηριότητα των μακροφάγων

Δείξαμε πρόσφατα ότι τα μακροφάγα και IL-1β επάγουν σηματοδότηση Wnt σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου μέσω της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ-εξαρτώμενη σηματοδότηση AKT [8], μονοπάτια που έχουν αποδειχθεί ότι προστατεύουν τα καρκινικά κύτταρα από την απόπτωση. Για να καθοριστεί εάν τα μακροφάγα και αναστέλλουν την IL-1β TRAIL επαγόμενη απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης αυτών των προ-επιβίωσης οδών σηματοδότησης, εκφράσαμε σε κύτταρα HCT116 dnIκB (ένας αναστολέας του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση), dnAKT (ένας αναστολέας της σηματοδότησης ΑΚΤ) και dnTCF4 ( ένας αναστολέας της σηματοδότησης Wnt). Η αναστολή της ΝΡ-κΒ ή ΑΚΤ δεν είχε επίδραση TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. Εντούτοις, κύτταρα μετεμβολιασμένα με dnTCF4 αναπαραγώγιμα έδειξε μια μέτρια μειωμένη ποσότητα TRAIL-επαγώμενη απόπτωση (οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντική), το οποίο μπορεί να είναι συνεπής με την απαίτηση του μονοπατιού Wnt για βέλτιστη TRAIL-επαγώμενη απόπτωση [32] (Σχ. 5Α) . Ωστόσο, το κρίσιμο σημείο ήταν ότι σε αντίθεση με τα κύτταρα επιμολυσμένα με ένα άδειο πλασμίδιο, μακροφάγα και IL-1β δεν προστατεύουν τα κύτταρα με διαταραχή της ΝΡ-κΒ, ΑΚΤ ή σηματοδότηση Wnt από TRAIL-επαγώμενη απόπτωση (Σχ. 5Α). Επιβεβαιώσαμε ότι τα μακροφάγα και IL-1β απέτυχε να εξουδετερώσει TRAIL επαγόμενη ενεργοποίηση της κασπάσης-8 και κασπάσης-9 και την επακόλουθη διάσπαση της ΡΑΚΡ σε κύτταρα που εκφράζουν είτε dnIκB, dnAKT ή dnTCF4 (Εικ. 5Β). Ιδιαίτερου ενδιαφέροντος, τα μακροφάγα και IL-1β εμπόδισε TRAIL-επαγόμενη διάσπαση του β-κατενίνης, αλλά μόνο σε κύτταρα με ανέπαφη ΝΡ-κΒ /ΑΚΤ /Wnt σηματοδότηση (Εικόνα 5Β).

Α και Β:. HCT116 εκφράζοντας dnIκB, dnAKT ή dnTCF4 υποβλήθηκαν σε αγωγή με TRAIL υπό συνθήκες υποδεικνύεται και η ποσότητα της απόπτωσης προσδιορίστηκε με χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Α: Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο από 5 ανεξάρτητα πειράματα. Β: Η έκταση της ενεργοποίησης κασπάσης και η διάσπαση της PARP και β-κατενίνης προσδιορίστηκαν στα κυτταρολύματα με ανοσοκηλίδωση. C:. Ο εντοπισμός του β-κατενίνης προσδιορίστηκε με ανοσοφθορισμό σε κύτταρα HCT116 που έλαβαν θεραπεία με TRAIL απουσία ή παρουσία IL-1β ή ΤΝΡα

Η

Διάσπαση της β-κατενίνης ήταν διαμεσολαβείται από κασπάσες, όπως θα μπορούσε να αποτρέψει την επεξεργασία του από zVAD, ενός αναστολέα της παν-κασπάσης (Σχήμα S3). Διασπασμένη β-κατενίνης έχει δειχθεί ότι εμφανίζουν διαταραγμένη μεταγραφική δραστηριότητα [33]. Δείξαμε ότι το TRAIL αναστέλλει TCF4 /β-κατενίνης μεταγραφική δραστηριότητα και ότι τα μακροφάγα και IL-1β μπορεί να αποκαταστήσει μερικώς β-κατενίνης μεταγραφική δραστικότητα σε κύτταρα TRAIL-αγωγή (Σχήμα S3).

Παρόμοια με τις δημοσιευμένες εκθέσεις [34] βρήκαμε ότι, παρά το γεγονός ότι τα κύτταρα HCT116 φέρουν ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο β-κατενίνης, οι περισσότερες από β-κατενίνης είναι εντοπισμένη στις μεμβράνες στα κύτταρα HCT116. Συνεπής με τη διάσπαση του β-κατενίνης με TRAIL, μεμβρανώδη εντοπισμός της β-κατενίνης ήταν σοβαρά μειωμένη σε κύτταρα κατεργασμένα TRAIL (Εικ. 5C). Τόσο η IL-1β και TNFa αποκατέστησε το μεμβρανώδης εντοπισμός της β-κατενίνης σε κύτταρα HCT116 σε κύτταρα TRAIL-αγωγή (Εικ. 5C), σύμφωνα με prosurvival δραστηριότητά τους.

Μαζί, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι τα μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ) προστατεύουν τα καρκινικά κύτταρα από TRAIL απόπτωση που επάγεται μέσω της ικανότητάς τους να σταθεροποιούν β-κατενίνης και την προώθηση σηματοδότηση Wnt σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

μακροφάγα, TNFa και IL-1β σταθεροποιηθεί σαλιγκάρι σε ένα ΝΡ-κΒ και ΑΚΤ /WNT τρόπο που εξαρτάται από

Αν και τα μακροφάγα και προστατευόμενων IL-1β από κύτταρα όγκου TRAIL απόπτωση, δεν ρυθμίζουν τα επίπεδα των μελών της οικογένειας Bcl-2 σε κύτταρα όγκου, όπως Bcl-x ή MCL1 , ή να τροποποιήσει την έκφραση του cIAPs, τα οποία έχουν αποδειχθεί ότι ρυθμίζουν την απόκριση των κυττάρων σε TRAIL επαγόμενη απόπτωση [16] (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, δείξαμε ότι τα επίπεδα του σαλιγκαριού πρωτεΐνης αυξήθηκαν σε κύτταρα HCT116 αγωγή με IL-1β ή σε κύτταρα HCT116 καλλιεργούνται παρουσία μακροφάγων (Σχ. 6Α). TNFa, ένας άλλος παράγοντας μακροφάγων προερχόμενο που μπορεί να επάγει σηματοδότηση Wnt σε κύτταρα όγκου [7], [35], αυξημένα επίσης τα επίπεδα των σαλιγκαριών σε κύτταρα όγκου (Σχ. 6Α). Δείξαμε ότι τα μακροφάγα, IL-1β και TNFa αυξημένα Σαλιγκάρι μέσω ΝΡ-κΒ, ΑΚΤ και σηματοδότηση Wnt, καθώς δεν κατάφεραν να αυξήσουν τα επίπεδα των σαλιγκαριών σε κύτταρα που εκφράζουν dnIκB, dnAKT ή dnTCF4 (Σχ. 6Α). Τα επίπεδα του mRNA σε σαλιγκάρι HCT116 ή κύτταρα HKE-3 δεν αυξήθηκαν από τα μακροφάγα (δεν φαίνεται), υποδεικνύοντας ότι μακροφάγα προερχόμενα παράγοντες σταθεροποιηθεί σαλιγκάρι πρωτεΐνης στα κύτταρα του όγκου. Η επαγωγή του c-Jun από την IL-1β και TNFa απαιτείται επίσης ΝΡ-κΒ, συνεπής με τα δημοσιευμένα δεδομένα (Σχ. 6Α). Δείξαμε ότι ο TNFa και IL-1β απέτυχε επίσης να επάγει c-Jun σε κύτταρα που εκφράζουν dnTCF4, επιβεβαιώνοντας τη σημασία της σηματοδότησης Wnt για την βιολογική δραστικότητα αυτών των κυτοκινών και για την αλληλεπίδραση των καρκινικών κυττάρων με τα μακροφάγα.

Α : Τα μακροφάγα, IL-1β και TNFa σταθεροποιηθεί σαλιγκάρι σε ένα ΝΡ-κΒ /ΑΚΤ /Wnt εξαρτώμενο τρόπο. κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με dnIκB, dnAKT ή dnTCF4 και υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-1β ή ΤΝΡα, ή καλλιεργήθηκαν με ΤΗΡ1 μακροφάγα όπως υποδεικνύεται. Τα επίπεδα των σαλιγκαριών και c-jun προσδιορίστηκαν με ανοσοστύπωμα. Β: Τα επίπεδα των σαλιγκαριών και pGSK3β προσδιορίστηκαν με ανοσοστύπωμα σε HKE-3 κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-1β, ΤΝΡα ή συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα σε απουσία ή την παρουσία LY 294002 για 24 ώρες. C: HCT116 και HKE-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με TRAIL απουσία ή παρουσία IL-1β και LY294002, όπως υποδεικνύεται. Το πείραμα διεξήχθη τρεις φορές.

Η

ΟδΚ3β είναι μια σημαντική κινάση που φωσφορυλιώνει σαλιγκάρι και επάγει αποικοδόμηση της [36], [37]. Επειδή ανέφεραν ότι τα μακροφάγα και IL-1β αδρανοποιούν ΟδΚ3β σε κύτταρα όγκου [7], [8], μπορούμε επόμενο εξετάστηκε αν τα μακροφάγα /IL-1β σταθεροποίηση σαλιγκάρι μέσω αναστολής της ΟδΚ3β. HCT116 και HKE-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με LY294002, ένας αναστολέας της ΡΙ3Κ – και έτσι ενεργοποιητής της ΟδΚ3β (φωσφορυλίωση του ΟδΚ3β επί Σερίνη 9 αναστέλλει τη δράση του). Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Β, η θεραπεία των κυττάρων με LY294002 πράγματι αποκλείεται μακροφάγα /IL-1β /ΤΝΡα μεσολάβηση αδρανοποίηση της ΟδΚ3β, και εντελώς εμπόδισε σταθεροποίηση του σαλιγκαριού από τα μακροφάγα, TNFa και IL-1β. Το αποτέλεσμα αυτό αποδεικνύει ότι η αναστολή της ΟδΚ3β ρυθμίζει την σταθερότητα των σαλιγκάρι σε κύτταρα HCT116 και έντονα υποδηλώνει ότι τα μακροφάγα, TNFa και IL-1β σταθεροποίηση Σαλιγκάρι μέσω της ικανότητάς τους να αναστέλλουν την ΟδΚ3β. Πράγματι, η φαρμακολογική αναστολή της ΟδΚ3β με LiCL ή ΟδΚ3β συγκεκριμένο αναστολέα, AR-A014418, ήταν αρκετή για να σταθεροποιήσει σαλιγκάρι σε καρκινικά κύτταρα (Σχήμα S4).

Τέλος, η θεραπεία των κυττάρων με LY29004 απέτρεψε εντελώς την ικανότητα του IL -1β να προστατεύσει κύτταρα καρκίνου κόλου από TRAIL-επαγώμενη απόπτωση (Σχ. 6C), υποδηλώνοντας ότι τα μακροφάγα και IL-1β προστατεύουν από TRAIL επαγόμενη απόπτωση μέσω εξαρτώμενων ΟδΚ3β σταθεροποίηση του σαλιγκαριού.

Τα μακροφάγα και IL-1β προστατεύουν από TRAIL επαγόμενη απόπτωση μέσω σταθεροποίηση του σαλιγκαριού

σαλιγκάρι έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με β-κατενίνης και να προωθήσει την έκφραση της Wnt γονιδίων στόχων [38]. Σε συμφωνία με τα δεδομένα αυτά, βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του σαλιγκαριού προωθεί TOP-FLASH με γνώμονα δραστηριότητα τόσο HCT116 και τα κύτταρα HKE-3 (Σχ. 7Α). Για να προσδιοριστεί αν η σταθεροποίηση του σαλιγκαριού από τα μακροφάγα /IL-1β συμβάλλει στην ικανότητά τους να οδηγούν σηματοδότηση Wnt, εμείς σιγήσει σαλιγκάρι σε κύτταρα όγκου (Σχ. 7Β), και εξέτασαν την ικανότητα των μακροφάγων και IL-1β να επάγει Wnt σηματοδότηση στα σαλιγκάρι ανεπάρκεια HCT116 και τα κύτταρα HKE-3. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.