Αφηρημένο

ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό, ένα σημαντικό χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων, είναι συχνά προκαλούνται από την δυσλειτουργία των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου, όπως πρωτεϊνικών κινασών. Πρόσφατα, τον κυτταρικό κύκλο που σχετίζονται με κινάσες πρωτεΐνης έχουν καταστεί ελκυστικοί στόχοι για αντικαρκινική θεραπεία, επειδή παίζουν θεμελιώδεις ρόλους σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Ωστόσο, τα φάρμακα κινάση στοχευμένες πρωτεΐνης που έχουν αναπτυχθεί μέχρι σήμερα δεν παρουσιάζουν εντυπωσιακά κλινικά αποτελέσματα και επίσης εμφανίζουν σοβαρές παρενέργειες? Ως εκ τούτου, υπάρχει αναμφίβολα η ανάγκη να διερευνηθούν νέα φάρμακα που στοχεύουν άλλες κινάσες πρωτεϊνών που είναι ζωτικής σημασίας στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. κινάση Vaccinia που σχετίζονται με 1 (VRK1) είναι μια μιτωτική κινάση που λειτουργεί στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου με φωσφορυλίωση υποστρωμάτων συνδέονται με τον κύκλο των κυττάρων όπως φραγμός-to-autointegration παράγοντα (BAF), ιστόνη Η3, και το στοιχείο απόκρισης cAMP (CRE) -σύνδεση πρωτεΐνης (CREB). Στη μελέτη μας, εντοπίσαμε luteolin ως αναστολέας της VRK1 με διαλογή ενός μικρού μορίου φυσική ένωση βιβλιοθήκης. Εδώ, έχουμε αξιολόγησε την αποτελεσματικότητα της luteolin ως αναστολέας VRK1-στόχο για την ανάπτυξη μιας αποτελεσματικής στρατηγικής για την καταπολέμηση του καρκίνου. Επιβεβαιώσαμε ότι luteolin μειώνει σημαντικά την φωσφορυλίωση του κυτταρικού κύκλου που σχετίζονται με υποστρώματα BAF και ιστόνης Η3 VRK1 μεσολάβηση, και άμεσα αλληλεπιδρά με τον καταλυτικό τομέα της VRK1. Επιπλέον, λουτεολίνη ρυθμίζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέσω διαμόρφωσης της δραστηριότητας VRK1, που οδηγεί στην καταστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και την επαγωγή απόπτωσης. Ως εκ τούτου, η μελέτη μας δείχνει ότι luteolin που προκαλείται από την αναστολή VRK1 μπορεί να συμβάλει στη δημιουργία μιας νέας στρατηγικής κύκλο στοχευμένων κυττάρων για αντικαρκινική θεραπεία

Παράθεση:. Kim YS, Kim SH, Shin J, Harikishore Α, Lim JK , Jung Y, et al. (2014) Luteolin Καταστέλλει Cancer Cell Πολλαπλασιασμός με στόχευση Vaccinia που σχετίζονται κινάσης 1. PLoS ONE 9 (10): e109655. doi: 10.1371 /journal.pone.0109655

Επιμέλεια: Α Ρ Μ Ruhul Amin, Winship Cancer Institute του Πανεπιστημίου Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 του Απριλίου του 2014? Αποδεκτές: 2 Σεπτεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 13 Οκτωβρίου 2014

Copyright: © 2014 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα relevent δεδομένα είναι εντός του αρχεία της να χορηγεί Πληροφορίες χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας (NRF) (2013 – 056085), το Πρόγραμμα Next-Generation BioGreen 21 (Αρ PJ009503), Αγροτικής Ανάπτυξης Διοίκησης, Δημοκρατία της Κορέας. Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από το πρόγραμμα του Υπουργείου Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας της Κορέας Brain Κορέα 21. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ογκογένεση συνδέεται με μια κακή ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης, η οποία συχνά προκαλείται από ελαττώματα στη ρύθμιση της πρωτεΐνης ρυθμιστών που παίζουν κρίσιμους ρόλους σε σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και την εξέλιξη [1]. Μεταξύ των πρωτεϊνών που απαρτίζουν το μηχανισμό του κυττάρου του κύκλου, πρόσφατες θεραπευτικές στρατηγικές έχουν επιχειρήσει να επωφεληθούν από τη στόχευση αρκετών πρωτεϊνικών κινασών κυτταρικού κύκλου για την ενίσχυση της επιλεκτικότητας του φαρμάκου και θεραπευτική αποτελεσματικότητα [2], [3]. Κατά συνέπεια, αυτά συνδέονται με τον κύκλο κινασών κυτταρικής πρωτεΐνης έχουν καταστεί ελκυστικοί στόχοι για αντικαρκινική θεραπεία, λόγω θεμελιώδεις λειτουργίες τους στον έλεγχο της ανάπτυξης των κυττάρων. Για παράδειγμα, οι αναστολείς μικρού μορίου των πρωτεϊνών οδοφράγματος βλάβης του DNA Chk 1 και 2 χρησιμοποιήθηκαν με την πρόθεση να προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης κατά τη μεσόφαση [4] – [6]. Επιπλέον, ορισμένοι μιτωτικούς αναστολείς που στοχεύουν στην οικογένεια εξαρτώμενων από κυκλίνη κινάση (ΟϋΚ), κινάσες Aurora, και Polo-όπως κινάσες έχουν αναπτυχθεί για να προκαλέσει παρακωλύουν την είσοδο μιτωτική, μιτωτική σύλληψη και μιτωτική καταστροφές προκαλώντας ελλείψεις σε συμπύκνωση χρωμοσώματος, η ευθυγράμμιση χρωμόσωμα, άξονα του σχηματισμού, και το σημείο ελέγχου συναρμολόγηση ατράκτου [1] – [3]. Για αρκετές αναστολείς υποσχόμενη, κλινικές μελέτες έχουν ήδη διεξαχθεί για την ανάπτυξη μιας νέας κατηγορίας αντικαρκινικών φαρμάκων. Στα στάδια κλινική δοκιμή, δυστυχώς, η κλινική αποτελεσματικότητα τους δεν παρουσιάζουν εντυπωσιακά αποτελέσματα, αλλά μάλλον προκάλεσε περιορισμένες αντιδράσεις ή ακόμη και μη αναμενόμενες σοβαρές παρενέργειες [3]. Παρ ‘όλα αυτά, αποτελεσματική αναστολή ορισμένων φάσης του κυτταρικού κύκλου εξακολουθεί να θεωρείται ως μια πολύτιμη στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου, Έτσι ταυτοποίηση νέων, τον κυτταρικό κύκλο ειδικών, druggable πρωτεΐνες-στόχους και την ανάπτυξη των εκλεκτικών αναστολέων τους, που θα μπορούσαν να έχουν δυνατότητα να γίνουν χημειοθεραπευτικούς παράγοντες είναι αναμφίβολα απαιτείται.

σε αυτό το πλαίσιο, ερευνήσαμε αν Vaccinia που σχετίζονται με την κινάση 1 (VRK1) θα μπορούσε να είναι ένα επαρκές μοριακό στόχο, σύμφωνα με τη στρατηγική στόχευση του κυτταρικού κύκλου. VRK1, η οποία φωσφορυλιώνει ειδικά υπολείμματα σερίνης και θρεονίνης, είναι ένα μιτωτική κινάση που παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, συμμετέχοντας σε ευρεία ποικιλία διεργασιών κυτταρικής διαίρεσης [7], [8]. έκφραση VRK1 είναι ειδικά άφθονο σε υψηλά πολλαπλασιαστικών κυττάρων όπως εμβρυϊκά και όγκου ιστών, και κυρίως εμφανίζει μια τάση να ρυθμίζουν προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της μιτωτικής φάσης στο [9] του κυτταρικού κύκλου, [10]. Στο G1 /S φάσεων, VRK1 προωθεί κυκλίνη D1 (CCND1) έκφραση για την επαγωγή της G1 /S μετάβαση με φωσφορυλίωση στοιχείο απόκρισης cAMP (CRE) -σύνδεση πρωτεΐνη (CREB) και ενισχύοντας έτσι τη συγγένεια δέσμευσης του CREB με τον υποκινητή CCND1 [11 ]. Επιπλέον, VRK1 συμμετέχει στο πυρηνικό φάκελο (ΝΕ) δυναμική, όπως η ΒΑ συναρμολόγησης /αποσυναρμολόγησης μέσω φωσφορυλίωσης του φράγματος-to-autointegration παράγοντα (BAF) κατά τη μεσόφαση και μιτωτικής εισόδου /εξόδου [12]. BAF είναι μια χρωματίνης που σχετίζεται με πρωτεΐνη λειτουργεί ως σύνδεσμος μεταξύ του DNA και της ΒΑ [13]. Η δυναμική κατάσταση των BAF κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου ρυθμίζεται αυστηρά από τη δραστηριότητα VRK1? φωσφορυλίωση BAF από VRK1 διεγείρει την απελευθέρωση της χρωματίνης από ΒΑ, και στρατολογεί NE-πρωτεΐνες που συνδέονται σε κεντρική περιοχή κατά τη διάρκεια της τελόφασης [12], [14]. Στην μιτωτική φάση, VRK1 επηρεάζει τροποποίηση ιστονών με φωσφορυλίωση της ιστόνης Η3 [10]. Η φωσφορυλίωση ιστόνης Η3 Ser10 από VRK1 και άλλα διάφορα μιτωτική κινάσες είναι ένα πολύ γνωστό κώδικα ιστόνης επαγωγή συμπύκνωση χρωματίνης σε μιτωτική είσοδο ή την /μετάβαση φάσης G2 Μ. Στον κυτταρικό κύκλο, VRK1 μεσολάβηση ιστόνης Η3 φωσφορυλίωση επηρεάζεται από άλλες ρυθμιστικές αρχές. Μιτογόνο-ενεργοποιημένης κινάσης πρωτεΐνης φωσφατάσης 2 (MKP2), μία φωσφατάση διπλής ειδικότητας που αδρανοποιεί ΜΑΡ κινάσες (MAPKs), παίζει ένα ρόλο ως ένας αρνητικός ρυθμιστής του VRK1 μεσολάβηση ιστόνης Η3 φωσφορυλίωση στη μιτωτική φάση [15]. Κατά τη διάρκεια της ενδιάμεσης φάσης, Macro ιστόνης H2A1.2 (MacroH2A1), μια παραλλαγή του πυρήνα των ιστονών, καταστέλλει την προσέγγιση των VRK1 να ιστόνης H3 από παγίδευση [16].

Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης δείξει τη σημασία της VRK1 στο διαδικασία του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. VRK1 έχει έναν κρίσιμο ρόλο όχι μόνο στον πολλαπλασιασμό σωματικών κυττάρων, αλλά επίσης και σε γεννητικά ανάπτυξη κυττάρου [17], [18]. Επιπλέον, VRK1 παίζει επίσης ένα ρόλο στην διατήρηση της τελομερούς με φωσφορυλίωση hnRNP Α1, η οποία διεγείρει την τελομεράση και συνδέεται με την αλληλουχία DNA του τελομερούς [19]. VRK1 απαιτείται για την έξοδο G0, Golgi κατακερματισμό, βλάβες στο DNA που προκαλείται από απόπτωση, και αποκρίσεις στρες, οι οποίες είναι απαραίτητες για τη διατήρηση προόδου του κυτταρικού κύκλου [20] – [24]. Έτσι, λαμβάνοντας υπόψη τα χαρακτηριστικά συνδέονται με τον κύκλο των κυττάρων του VRK1, ο προσδιορισμός του αναστολέα VRK1 απαιτείται για αντικαρκινικές θεραπείες. Αν και αναφέρεται ότι μερικά φάρμακα για την αναστολή άλλων πρωτεϊνικών κινασών θα μπορούσαν να αναστέλλουν τη δράση της κινάσης της VRK1 [25], οι ανασταλτικές μηχανισμός και αντικαρκινικές επιδράσεις μέσω αναστολής VRK1 ήταν ακόμα ασαφείς.

Στη μελέτη μας, έχουμε διαλογή ένα μικρό μόριο-φυσική ένωση βιβλιοθήκης και προσδιορίζονται λουτεολίνη (3 ‘, 4’, 5,7-tetrahydroxyflavone) ως μικρού μορίου να αναστέλλει δραστικότητα κινάσης VRK1. Luteolin είναι ένα φυσικό φλαβονοειδές που συνήθως διανέμεται σε φυτά και είναι καλά γνωστό ότι δρα ως ένα ισχυρό αντιοξειδωτικό [26]. Στις παραδοσιακές ασιατικές θεραπείες, έχουν λουτεολίνη-άφθονη βότανα έχουν χρησιμοποιηθεί ως παραδοσιακά φάρμακα για τη θεραπεία πολλών διαταραχών όπως επώδυνες καταστάσεις, φλεγμονώδεις ασθένειες, υπέρταση, και τον καρκίνο [27]. Σήμερα, πολλές γραμμές αποδείξεως κατέδειξαν πολυάριθμες φαρμακολογικές επιδράσεις του λουτεολίνη συμπεριλαμβανομένων κατά του καρκίνου, αντι-φλεγμονή, και οι δραστηριότητες αντιαλλεργικό [27], [28]. Αν και έχει διαπιστωθεί ότι οι αντικαρκινικές ιδιότητες των λουτεολίνη σχετίζεται με προ-αποπτωτικά αποτελέσματα, αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα, και η αναστολή της αγγειογένεσης και της μετάστασης, οι μοριακοί μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω αντικαρκινικές δραστηριότητες δεν έχουν πλήρως προσδιορισθεί [29] , [30].

Εδώ, επιβεβαίωσε ότι luteolin εμφανίζει σημαντικά μειωμένη φωσφορυλίωση του κυτταρικού κύκλου που σχετίζονται Η3 υποστρώματα των ιστονών και BAF, και αλληλεπιδρά άμεσα με VRK1, ειδικά πιάνουν σε καταλυτικό τομέα του. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι luteolin θα μπορούσε να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου με αναστολή δραστικότητας κινάσης VRK1, που οδηγεί στην καταστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων και την απόπτωση. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι luteolin είναι ένας αναστολέας της VRK1, η οποία είναι ένας από τους καλούς υποψήφιους για τη θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και Αντιδραστήρια

Luteolin ήταν αναλυτικών βαθμού και αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Eupatilin και Wogonin δόθηκαν από το Εργαστήριο Δρ Μπεκ στο Πανεπιστήμιο Kyung-Hee. Αυτές οι ενώσεις παρασκευάστηκαν σε DMSO (Sigma-Aldrich). [

32Ρ-γ] ΑΤΡ αγοράστηκε από την Perkin Elmer /ΝΕΝ (Waltham, ΜΑ, USA) και η ανασυνδυασμένη Η3 ιστόνης αγοράστηκε από την Roche Applied Science (Indianapolis, ΙΝ, USA). Άλλες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες όπως γλουταθειόνη σουλφοτρανσφερασών (GST), GST-VRK1, GST-aurora κινάση Β (AURKB) και His-BAF εκφράστηκαν σε

E.coli

(BL21) και καθαρίστηκαν με χρωματογραφία συγγένειας. Lamin B, αφυδρογονάση γλυκεραλδεϋδη 3-φωσφορική (GAPDH) και GST αντίσωμα αγοράστηκε από Santa Cruz Technology (Santa Cruz, CA, USA) και ιστόνης Η3 φωσφο-Ser10 αντίσωμα αγοράστηκε από την Abcam (Cambridge, UK) και εκείνων κατά της ιστόνης Η3, φωσφο-CREB και CREB ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA). VRK1 και φωσφο-BAF (δώρο από τον Robert Craigie, ΝΙΗ, USA) αντίσωμα που παράγεται σε κουνέλια χρησιμοποιώντας καθαρισμένες πρωτεΐνες VRK1. Hoechst 33342 αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich. CNBr-Sepharose 4Β αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich.

Κυτταρική καλλιέργεια και διαμόλυνση

κύτταρα BEAS-2Β ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA). Προηγουμένως περιγράφηκε HeLa [31], HEK293A [16], SH-SY5Y [32], U2OS [32], και Α549 [31] κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Το ανθρώπινο τραχηλικό κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος HeLa, ανθρώπινη εμβρυϊκή νεφρική κυτταρική γραμμή HEK293A, το ανθρώπινο βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή BEAS-2Β και την ανθρώπινου νευροβλαστώματος κυτταρική γραμμή SH-SY5Y αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με εμβρυϊκό βόειο 10% ορό και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Η κυτταρική σειρά ανθρώπινου οστεοσαρκώματος U2OS και το ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Α549 κυτταρική γραμμή αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2. Παροδική διαμόλυνση κυττάρων HeLa και U2OS διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα MP-100 μικροπόρων (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

πρωτεϊνοκινάσης δοκιμασία

Μια in vitro κινάσης δοκιμασία πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως [31]. Εν συντομία, μια in vitro δοκιμασία κινάσης διεξήχθη σε ρυθμιστικό διάλυμα κινάσης που περιείχε GST-VRK1, GST-AURKB, His-BAF, ιστόνη Η3, και [32Ρ-γ] ΑΤΡ. Τα μίγματα δοκιμασία κινάσης επωάστηκαν στους 30 ° C για 30 λεπτά και ραδιενεργών ενσωμάτωση ανιχνεύθηκε με αυτοραδιογραφία. Οι ποσότητες των πρωτεϊνών που χρησιμοποιούνται σε δοκιμασίες κινάσης μετρήθηκαν με τη χρήση νιτρικού αργύρου (Sigma-Aldrich) ή μπλε coomassie (Sigma-Aldrich).

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν για 24 ώρες ή 48 ώρες με φλαβονοειδή (λουτεολίνη, eupatilin, και wogonin) ή με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ως μάρτυρα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-diphenyltetarazolium (ΜΤΤ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ημι-μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC50) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Graphpad Prism (GraphPad, San Diego, CA, USA).

Luteolin-Sepharose 4Β προετοιμασία και in vitro pull-down δοκιμασία

Sepharose 4Β σκόνη χάντρα αιωρήθηκε σε διάλυμα ενεργοποίησης για την αντίδραση σύζευξης. Ενεργοποιημένα σφαιρίδια Sepharose 4Β επωάστηκαν σε διάλυμα σύζευξη με λουτεολίνη σε περιστροφικό αναδευτήρα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Για να τραβήξει την in vitro δοκιμασία κάτω, GST-VRK1 και GST επωάστηκαν με σφαιρίδια λουτεολίνη-Sepharose 4Β σε διάλυμα της αντίδρασης για 12 ώρες. Πρωτεΐνες δεσμεύονται στα σφαιρίδια αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. Πραγματοποιήσαμε τις λεπτομερείς διαδικασίες που περιγράφηκαν προηγουμένως [33].

επιφανειακών πλασμονίων (SPR) δοκιμασία

Οι κινητικές παράμετροι της αλληλεπίδρασης μεταξύ VRK1 και luteolin αξιολογήθηκαν από μια SPR δοκιμασία με τη χρήση το αυτόματο σύστημα SR7500DC (Reichert Technologies, Depew, NY, USA). Για την παρασκευή του VRK1-συζευγμένου τσιπ χρυσός, VRK1 ακινητοποιήθηκε σε ένα τσιπ CMDH (# 13206066) και, στη συνέχεια, λουτεολίνη, eupatilin και wogonin εγχύθηκαν στην επιφάνεια του τσιπ στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις, αραιωμένο σε 10 mM ορού ρυθμισμένου με φωσφορικά (PBS ) που περιέχει 1% DMSO ως τρεχούμενο ρυθμιστικό διάλυμα. Η ανάλυση των συλλεχθέντων στοιχείων έγινε με το λογισμικό scrubber2 (BioNavis, Τάμπερε, Pirkanmaa, Φινλανδία).

ρίζας σύνδεσης δοκιμασία

Ένα μοντέλο ομολογίας που αναπτύχθηκε από τη δομή ακτίνων Χ του VRK1 χρησιμοποιήθηκε για την αξιολογήσει τη μοριακή αλληλεπίδραση και τη λειτουργία δέσμευσης που εντοπίσθηκαν πρόσφατα οδηγεί VRK1. Στην παρούσα μελέτη, η δομή του μοντέλου ήταν ενέργειας ελαχιστοποιείται για 5.000 βήματα με τη μέθοδο κλίσης CHARM δυναμικό πεδίο και σύζευξης στο Discovery Studio 3.0 σουίτα [34]. Οι συντεταγμένες 3-D του λουτεολίνη παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το Ετοιμάστε μονάδα Ligand και ενεργειακά ελαχιστοποιημένο για 2000 βήματα χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Smart σμικροποιών στο Discovery Studio 3.0 σουίτα. Το πρόγραμμα σύνδεσης GOLD μοριακού 5.0 χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει την κατάσταση σύνδεσης των απαγωγών VRK1. προηγούμενες μελέτες NMR δέσμευσης μας έχουν προσδιορίσει τα βασικά κατάλοιπα που είναι ανήσυχοι με την δέσμευση συνδέτη? αυτά χρησιμοποιούνται για να καθορίσουν την ενεργή θέση [34]. προεπιλεγμένες ρυθμίσεις και τις λειτουργίες βαθμολόγησης, η λειτουργία GOLD PLP και GOLD βαθμολόγησης, χρησιμοποιήθηκαν για να σκοράρει αλληλεπιδράσεις σύνδεσης και την πιθανή κατάσταση σύνδεσης τους δεσμευτική.

Η κυτταρομετρία ροής

δοκιμασία

Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με GFP, GFP-VRK1, GFP-BAF και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO (όχημα) και 10 μΜ λουτεολίνη. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 70% αιθανόλη που περιέχει 0,4% Tween-20 και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο σε PBS. Τα περιεχόμενα του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό DNA αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής σε ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Η απόκτηση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα Cell Quest (BD Biosciences). Για την ανάλυση απόπτωσης, κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με λουτεολίνη σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο και διπλή χρώση με ιωδιούχο propodium και Annexin-V αλλοφυκοκυανίνη. Τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

ανοσοφθορισμού χρώση

κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (RFP), RFP-VRK1, GFP, και GFP-BAF χρησιμοποιώντας μικροπόρων, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 μΜ λουτεολίνη για 24 ώρες. Ακολούθως, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεϋδη για 20 λεπτά και αποκλείστηκαν με 10% FBS σε PBS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 σε PBS για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ σάρωσης (Fluoview FV1000? Της Olympus, Tokyo, Japan). κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς λουτεολίνη (10 μΜ) για 24 ώρες. Στη συνέχεια, θα πραγματοποιηθεί λεπτομερείς διαδικασίες που περιγράφηκαν, και στη συνέχεια τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αντίσωμα λαμίνη Β και προβληθούν χρησιμοποιώντας Zeiss μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss Ltd., Jena, Germany) ή ομοεστιακή μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ.

Ποσοτική αντίστροφης μεταγραφής (RT) -PCR

Ολικό RNA από κύτταρα HeLa παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τον παράγοντα TRI (Molecular Research Center, Cincinnati, ΟΗ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και στη συνέχεια μεταγράφεται ανάστροφα για να δημιουργήσει συμπληρωματικό DNA. Ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του μίγματος SYBR Green PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) και ένα σύστημα πραγματικού χρόνου ανιχνευτή (Applied Biosystems, Foster City, CA USA). επίπεδο GAPDH χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει τα επίπεδα μεταγραφής.

Αποτελέσματα

Luteolin είναι ένας ισχυρός αναστολέας της δραστηριότητας της κινάσης VRK1

Για να εξεταστεί αν luteolin θα μπορούσε να καταστείλει αποτελεσματικά την ενζυμική δραστηριότητα της VRK1, πραγματοποιήσαμε μια

in vitro δοκιμασία κινάσης

και συγκρίθηκαν τα ανασταλτικά αποτελέσματα της λουτεολίνη με εκείνες των άλλων φλαβονοειδών ενώσεις που ομοιάζουν. Luteolin ανέστειλε σημαντικά την VRK1 μεσολάβηση φωσφορυλίωση του BAF και ιστόνης Η3 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, η δραστικότητα αυτο-φωσφορυλίωση του VRK1 εξασθένισε με κατεργασία με λουτεολίνη με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 1Α και Β). Παρά το γεγονός ότι eupatilin και wogonin, φλαβονοειδή όπως χημικές ενώσεις που εμφανίζουν δομική ομοιότητα με luteolin (Εικ. 1Γ), ασθενώς αναστέλλουν τη δράση κινάσης VRK1 (Εικ. 1 D και E), luteolin έδειξε τις πιο εξέχουσες ανασταλτικές επιδράσεις στην φωσφορυλίωση BAF και VRK1 auto-φωσφορυλίωση , γεγονός που υποδηλώνει την ιδιαιτερότητα του luteolin. Η εξειδίκευση της λουτεολίνη για VRK1 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με κανονικοποιημένη ανασταλτικά αποτελέσματα της επί της φωσφορυλίωσης BAF και VRK1 αυτο-φωσφορυλίωση (Εικ. 1 F και G). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι luteolin είναι ένας ισχυρός αναστολέας της δραστικότητας κινάσης VRK1, η οποία απαιτείται για τη ρύθμιση της προόδου του κυτταρικού κύκλου.

(Α) και (Β),

in vitro

μετρήσεις δραστικότητας κινάσης για VRK1 με BAF (Α) ή VRK1 με ιστόνη Η3 (Β) διεξήχθησαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις λουτεολίνη (0.0, 1.0, 10, 50, 100, και 250 μΜ), και στη συνέχεια VRK1 και πρωτεΐνες υπόστρωμα χρωματίστηκαν με νιτρικό άργυρο. (C), χημικές δομές και τα μοριακά βάρη των λουτεολίνη, eupatilin, και wogonin. (Δ) και (Ε),

in vitro δοκιμασία κινάσης

για VRK1 με BAF διεξήχθησαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις (0,0, 1,0, 10, 50, 100, και 250 μΜ) του eupatilin (D) ή wogonin ( Ε), και στη συνέχεια οι πρωτεΐνες VRK1 και BAF χρωματίστηκαν με νιτρικό άργυρο. (F) και (G), Ποσοτικοποίηση του VRK1 αυτο-φωσφορυλίωση (F) ή φωσφορυλίωση BAF (G) που περιγράφεται στο (Β), (Δ) και (Ε). Δεδομένων σε (F) και (G) αντιπροσωπεύουν μέσα από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± SEM τους.

Η

Luteolin αλληλεπιδρά άμεσα με VRK1

Επειδή luteolin κατέστειλε την δράση του VRK1 προς υποστρωμάτων του, εμείς υποτιθέμενη ότι luteolin μπορεί να αναστέλλουν τη δράση κινάσης μέσω απευθείας σύνδεσης σε VRK1. Για τη διερεύνηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ luteolin και VRK1, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία pull-down χρησιμοποιώντας λουτεολινο-συζευγμένα σφαιρίδια sepharose. GST δεν μπορούσε να συνδεθεί με είτε λουτεολίνη-συζευγμένα σφαιρίδια sepharose ή σφαιρίδια ελέγχου. Ωστόσο, GST-VRK1 δεσμεύεται με επιτυχία σε λουτεολίνη-συζευγμένα σφαιρίδια sepharose, αλλά δεν συνδέεται προς τον έλεγχο σφαιρίδια που δεν συζευγμένο με λουτεολίνη (Εικ. 2Α). Εμείς επόμενη πραγματοποίησε pull-down δοκιμασία με λύματα κυττάρων SH-SY5Y να επιθεωρήσει αν λουτεολίνη δεσμεύεται με ενδογενή VRK1 εκτός από ανασυνδυασμένο VRK1 (Εικ. 2Β). Η ενδογενής VRK1 θα μπορούσε επίσης να συνδεθεί με λουτεολίνη-συζευγμένα σφαιρίδια sepharose. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι luteolin αλληλεπιδρά άμεσα με VRK1

in vitro

.

(Α), Pull-down ανάλυση χρησιμοποιώντας λουτεολινο συζευγμένο με sepharose 4Β σφαιρίδια ή sepharose έλεγχο 4Β χάντρες με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη VRK1. Οι πρωτεΐνες καθαρισμένο GST και GST-VRK1 επωάζονται με ενδεικνυόμενη χάντρες, και στη συνέχεια, τραβήξτε προς τα κάτω δοκιμασία εκτελέστηκε. Κάθε πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση με αντίσωμα GST. (Β), Pull-down ανάλυση χρησιμοποιώντας luteolin συζευγμένο sepharose 4Β σφαιρίδια με λύμα κυττάρων SH-SY5Y. Λύματος κυττάρων επωάζονται με ενδεικνυόμενη χάντρες, και στη συνέχεια, τραβήξτε προς τα κάτω εκτελέστηκε. Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση με VRK1 αντίσωμα. (C), SPR ανίχνευσης για την αλληλεπίδραση των λουτεολίνη με VRK1. Τα δεδομένα που ελήφθησαν με κινητική μέθοδο τιτλοδότησης με ένεση διαδοχικά αναλυτών χωρίς βαθμίδες αναγεννήσεως. Τα στοιχεία για eupatilin και wogonin ελήφθησαν με κλασικές μεθόδους.

Η

Η άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ luteolin και VRK1 αναλύθηκε περαιτέρω χρήση συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων (SPR) για την παρακολούθηση των δεσμευτικών κινητική. Ανασυνδυασμένες VRK1 πρωτεΐνες ομοιοπολικά ακινητοποιούνται επί ενός τσιπ αισθητήρα ως συνδέτης? Στη συνέχεια, λουτεολίνη, eupatilin και wogonin προστέθηκαν σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, όπως έναν αναλύτη (Σχ. 2C). Οι κινητικές παράμετροι της αλληλεπίδρασης μεταξύ του VRK1 επικαλυμμένα τσιπ αισθητήρα και αυτών των αναλυτών αξιολογήθηκαν με το λογισμικό και αντιπροσωπεύονται στον Πίνακα 1. Υπολογιζόμενη σταθερές αυτών των αναλυτών προς VRK1 έκθεμα ότι luteolin έχει πλέον ισχυρή δεσμευτική συγγένεια μεταξύ τους. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι luteolin συνδέεται άμεσα με VRK1 με υψηλή συγγένεια πρόσδεσης.

Η

Το ανασταλτικό αποτέλεσμα των λουτεολίνη διαμεσολαβείται από την άμεση σύνδεση του με το καταλυτικό τομέα του VRK1

Για καθορίζουν την περιοχή δέσμευσης του VRK1 για λουτεολίνη, η αλληλεπίδραση μεταξύ λουτεολίνη και VRK1 εκτιμήθηκε με πειράματα τιτλοδότησης NMR και

in silico

μοντελοποίηση. υπολείμματα αμινοξέων που επηρεάζονται από την αλληλεπίδραση με luteolin έδειξαν δραματική αύξηση διαταραχές χημική μετατόπιση (Εικ. 3Α). Αυτά τα υπολείμματα αντιπροσωπεύονται στο φάσμα των διαταραχών χημική μετατόπιση και επίσης αποδίδεται από το μοριακό χάρτη του VRK1 (Σχήμα 3Β), υποδηλώνοντας ότι τα κατάλοιπα αυτά βρίσκονται κυρίως στην περιοχή του καταλυτικού τομέα, η οποία εμπλέκεται στην ΑΤΡ δέσμευσης [34].

(Α), πραγματοποιήθηκαν πειράματα τιτλοδότησης NMR. Φάσμα διαταραχών χημική μετατόπιση έναντι υπολειμμάτων αμινοξέων της πρωτεΐνης VRK1 μετά τη σύνδεση του luteolin. (Β), Χαρτογράφηση διαταραχές χημικής μετατόπισης για την πρωτεΐνη VRK1. Οι περισσότερες από τις διαταραγμένες υπολείμματα (εμφανίζονται με κόκκινο) βρίσκονται κοντά στην καταλυτική περιοχή της VRK1. (C),

in silico

μοντελοποίηση του τρόπου σύνδεσης του λουτεολίνη στην πρωτεΐνη VRK1. Luteolin προβλέπεται να χωρέσει στην περιοχή της G-βρόχου, καταλυτική περιοχή, και α-C λοβού.

Η

in silico

μοντελοποίηση του τρόπου δέσμευσης του luteolin προς VRK1 , λουτεολίνη προβλέπεται να χωρέσει στην περιοχή του G-βρόχου, καταλυτική θέση, και α-Ο λοβός (Σχ. 3C). Οι 2, 3-διύδροξυ τμήματα της ομάδος 2-φαινυλ στο ικρίωμα χρωμένιο αλληλεπιδρούν με το υπόλειμμα Ε83 του α-C λοβού. Περαιτέρω, η 2-υδροξυλ ομάδα αλληλεπιδρά επίσης με το υπόλειμμα D197 της καταλυτικής βρόχου. Παρομοίως, η ομάδα 4-κετο στο ικρίωμα χρωμένιο αλληλεπιδρά με S181 μέσω μιας αλληλεπίδρασης δέσμευσης υδρογόνου. Το 7-υδροξυλ χαρακτηριστική ομάδα στο ικρίωμα χρωμένιο καθιστά επίσης τις αλληλεπιδράσεις δεσμών υδρογόνου με τις I43 και Q45 κατάλοιπα από την G-βρόχου. Εκτός από αυτές τις αλληλεπιδράσεις δεσμών υδρογόνου, το ικρίωμα χρωμένιο έχει επίσης ισχυρή στοίβαξη υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων με το υπόλειμμα F48 του G-βρόχου και τα υδρόφοβα υπολείμματα που περιβάλλουν τη δραστική θέση (δεν φαίνεται). Luteolin έχει περισσότερες από τις βασικές αλληλεπιδράσεις του με τα υπολείμματα καταλυτική θέση G-βρόχου και, τα οποία σταθεροποιούν το μόριο σταθερά λουτεολίνη στο ενεργό κέντρο και αναστέλλουν τη δραστικότητα της κινάσης του.

Luteolin επάγει αναστολή του κυτταρικού κύκλου μέσω της αναστολής της φωσφορυλίωσης BAF με VRK1

Luteolin έχει καταδειχθεί προηγουμένως ότι επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G1 /S και G2 /M μεταπτώσεων φάσης [35] – [39]. Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός διακοπής κύκλου κυττάρου από λουτεολίνη είναι άγνωστη, εκτός από τη δυνατότητα που Aurora Β κινάση θα μπορούσε να είναι ένας μοριακός στόχος του λουτεολίνη να ρυθμίζουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, με βάση τα στοιχεία που αποδεικνύουν ότι Aurora Β αναστέλλεται από λουτεολίνη και παίζει ένα ρόλο ως κύριος μεσολαβητής της μιτωτικής εξέλιξης [40]. VRK1 είναι ένα άλλο μιτωτική κινάση που έχει γίνει γνωστό για τη διεξαγωγή συντονιστικό ρόλο στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου από τη φωσφορυλίωση διαφόρων υποστρωμάτων συνδέονται με τον κύκλο των κυττάρων όπως BAF, ιστόνη Η3, και CREB [10] – [12]. Έτσι, εκτιμάται εάν luteolin προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου αναστέλλοντας VRK1. ΡΙ-σημασμένα κύτταρα σε επεξεργασία με DMSO ή λουτεολίνη αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για την εκτίμηση του κυτταρικού κύκλου. Κατά τη θεραπεία με luteolin, ο πληθυσμός στη φάση G1 ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με εκείνη στα κύτταρα DMSO-θεραπεία (Εικ. 4Α, αριστερό πλαίσιο). Αντίθετα, η αύξηση του πληθυσμού G1-φάση εξαφανίστηκε μετά την υπερέκφραση του GFP-tagged VRK1 (Σχήμα 4Α, δεξιό πλαίσιο), υποδεικνύοντας ότι luteolin προκαλεί διακοπή στα πρώτα στάδια του κυτταρικού κύκλου μέσω της αναστολής του VRK1.

( Α), ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέστηκε με κυτταρομετρία ροής. κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με GFP ή GFP-VRK1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με λουτεολίνη επί 24 ώρες, και 10.000 κύτταρα περιφραγμένη για ανάλυση. Ποσοτικά στοιχεία είναι κάτω από τα οικόπεδα ιστόγραμμα. (Β) και (C), κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με όχημα ή λουτεολίνη βάφτηκαν με αντίσωμα λαμίνη Β για να απεικονίσει πυρηνικού φακέλου και με Hoechst 33342 για να οπτικοποιείται DNA. Alexa 488 συζευγμένων με χρωστική αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως δευτερογενές αντίσωμα. Τα πλακίδια έγιναν ορατά με μικροσκοπία φθορισμού (Β), ή ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (C). (D), Fluorescent χρώση VRK1, BAF, και DNA για την ανάλυση της φωσφορυλίωσης μεσολάβηση re-εντοπισμό των BAF. Κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με GFP ή GFP-BAF με RFP ή RFP-VRK1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 10 μΜ λουτεολίνη επί 24 ώρες.

Η

Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, VRK1 συμμετέχει στη φωσφορυλίωση με μεσολάβηση επαν εντοπισμός του BAF στο κυτταρόπλασμα, συμπύκνωση χρωματίνης μέσω φωσφορυλίωσης της ιστόνης Η3, και η έκφραση CCND1 με φωσφορυλίωση CREB να διευκολυνθεί προόδου του κυτταρικού κύκλου [10] – [12]. Για να εξηγήσει περαιτέρω το μηχανισμό της σύλληψης του κυτταρικού κύκλου από λουτεολινο που προκαλείται παρεμβολή δραστηριότητα VRK1, αξιολογήσαμε εάν luteolin διαταράσσει αυτές τις διαδικασίες. Επειδή έχει αποδειχθεί ότι VRK1 ενισχύει την έκφραση του CCND1, που συσχετίζεται με G1 /S εξέλιξη, μέσω αυξημένης δραστηριότητας του στοιχείου CRE στον προαγωγό CCND1 με φωσφορυλιωμένη δεσμευτικός CREB, εμείς εικάζουν ότι η φωσφορυλίωση του CREB και το επίπεδο mRNA του CCND1 δύναται να επηρεαστεί από τη θεραπεία luteolin. Ωστόσο, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην φωσφορυλίωση του CREB και το επίπεδο mRNA του CCND1 μεταξύ DMSO και θεραπεία λουτεολίνη (Εικ. S1), υποδηλώνοντας ότι λουτεολίνη επαγόμενη G1 /S σύλληψης μπορεί να ήταν μια συνέπεια των ελαττωμάτων σε άλλες διεργασίες και όχι η καταστολή της CREB φωσφορυλίωση.

στη συνέχεια εξετάσαμε την πιθανή εμπλοκή της BAF στην G1 /S σύλληψη προκλήθηκε από luteolin. Σε

Drosophila

και

C. elegans

, είναι καλά τεκμηριωμένο ότι BAF έχει θεμελιώδεις ρόλους στην οργάνωση της πυρηνικής δομής και εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [13], [41]. Επιπλέον, η πυρηνική εντόπιση του BAF επηρεάζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε ανθρώπινα κύτταρα? VRK1, το μόνο αναγνωρισμένο ανάντη της κινάσης του BAF, μπορεί να αλλάξει BAF εντοπισμού με φωσφορυλίωση για να προκαλέσει την απελευθέρωση των BAF από πρωτεΐνες και το DNA και LEM-τομέα, όπως Lap2, emerin και man1 [12], [14], [31], [42]. VRK1 μεσολάβηση BAF re-localization είναι απαραίτητη διαδικασία για την απελευθέρωση του DNA κατά τη διάρκεια της G1 /S μετάβαση. Για την ανίχνευση τυχόν διαταραχές που προκαλούνται από luteolin στη δυναμική του πυρηνικού φακέλου στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, θα βάφονται τον πυρηνικό φάκελο με το αντίσωμα πυρηνική λαμίνης Β. Lamin Β αποσπάται από χρωματίνης σε μίτωση, ωστόσο, απώλεια VRK1 ή έκφραση του μεταλλαγμένου BAF διαταράσσει διαχωρισμό χρωματίνη από ΒΑ [12], [42], [43]. Παρατηρήσαμε αν πυρηνική λαμίνη Β δεν διεσπάρη με κατεργασία με luteolin. Πυρηνική λαμίνη Β απελευθερώνονται στο κυτταρόπλασμα σε όψιμους ανάφαση όπως φαίνεται σε κύτταρα υπό αγωγή με όχημα, ενώ λαμίνη Β έχει κολλήσει στα χρωμοσώματα στο ίδιο στάδιο, όπως φαίνεται στο λουτεολίνη-επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 4Β), υποδηλώνοντας ότι λουτεολίνη επαγόμενη VRK1 διαταράσσεται αναστολή VRK1 μεσολάβηση φωσφορυλίωσης BAF.

Επιπλέον, βρήκαμε ακόμη ότι luteolin προκάλεσε ανώμαλη μορφολογία πυρηνικού φακέλου όπως εγκόλπωση και κύστης (Σχ. 4C), το οποίο είναι ένα φαινόμενο να επάγεται από εξάντληση του VRK1 [44] . Έτσι, προτείνουμε ότι luteolin μεσολάβηση εξασθένηση της φωσφορυλίωσης BAF θα μπορούσε να οδηγήσει σε VRK1 εξάντλησης που προκαλείται από ανώμαλη πυρηνική μορφολογίες. Για να επιβεβαιώσετε ότι luteolin διαταράσσει VRK1 μεσολάβηση BAF φωσφορυλίωση, παρατηρήσαμε επίπεδο φωσφο-BAF χρησιμοποιώντας ανοσοαποτύπωση. επίπεδο φωσφο-BAF μειώθηκε σε 10 μΜ λουτεολινο επεξεργασμένου κυτταρολύματος (Εικ. S2), υποδεικνύοντας ότι καταλυτική δραστικότητα VRK1 μειώνεται κατά λουτεολίνη

in vivo

.

Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η έκτοπη έκφραση των αποτελεσμάτων VRK1 σε BAF εκ νέου εντοπισμό στο κυτταρόπλασμα [12], [31]. Έτσι, ερευνήσαμε περαιτέρω αν το φαινόμενο της BAF εκ νέου εντοπισμό επηρεάστηκε από λουτεολινο μεσολάβηση αναστολή της VRK1. Όταν και οι δύο RFP-VRK1 και GFP-BAF εισήχθησαν μαζί, BAF φάνηκε να διασπείρεται σε όλο το κύτταρο, όπως έχει αναφερθεί προηγουμένως [31]. Ωστόσο, επιβεβαίωσε ότι το φαινόμενο αυτό είχε διαταραχθεί από τη θεραπεία με luteolin (Εικ. 4D). Ο εντοπισμός της GFP-BAF περιορίστηκε στο πυρηνόπλασμα παρά VRK1 υπερέκφρασης, υποδηλώνοντας ότι η αγωγή λουτεολίνη μειωθεί αποτελεσματικά φωσφορυλίωση BAF με αναστολή VRK1, που ακολουθείται από διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Για να εξεταστεί ο ρόλος των BAF κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, αναλύσαμε περιεχόμενα DNA μετά τη θεραπεία λουτεολίνη. Η έκτοπη εκφράζεται BAF δεν επηρεάζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου (σχ. S3A). Κατά την χορήγηση λουτεολίνη, έκτοπη εκφράζεται BAF δεν θα μπορούσε να διασώσει λουτεολινο επαγόμενη συσσώρευση G1 (Εικ. S3b), υποδηλώνοντας ότι η λουτεολίνη επαγόμενη G1 σύλληψη δεν είχε ως αποτέλεσμα με αναστολή BAF αλλά με αναστολή της VRK1 μεσολάβηση BAF φωσφορυλίωσης.

luteolin επάγει μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων και επακόλουθη απόπτωση

Μόλις η ανασταλτική δράση του λουτεολίνη διαμεσολαβούνται από δέσμευση στην καταλυτική περιοχή της VRK1 επιβεβαιώθηκε, αξιολογήσαμε κατά του όγκου αποτελέσματα του επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου και την επιβίωση. Οι επιδράσεις της λουτεολίνη στη βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία luteolin μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη του ογκογόνου κυτταρικές σειρές HeLa και U2OS σε σύγκριση με τα μη ογκογόνων κυτταρικών γραμμών BEAS-2Β και HEK293A (Εικ. 5Α). Το IC

50 τιμές σε κύτταρα HeLa και U2OS προσδιορίστηκαν ως 15,41 μΜ και 36,35 μΜ, αντίστοιχα, ενώ εκείνες στις BEAS-2Β και HEK293A κύτταρα αυξήθηκε πολλές φορές σε σύγκριση με ογκογόνα κύτταρα (74,41 μΜ και 263,3 μΜ, αντίστοιχα) . Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η ανασταλτική επίδραση του λουτεολίνη επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων είναι πιο έντονη σε ογκογόνα κύτταρα από μη ογκογόνα κύτταρα, αν και το επίπεδο της πρωτεΐνης VRK1 σε κυτταρικές γραμμές που δεν συσχετίζεται με ογκογονικότητα (Εικ. S4). Επιπλέον, λουτεολίνη αναστέλλει την κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων HeLa σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 5Β).

(Α), Τα αποτελέσματα της λουτεολίνη επί κυτταρικής βιωσιμότητας των ογκογόνων (HeLa και U2OS) και μη ογκογόνων (BEAS-2Β και HEK293A) κυτταρικές σειρές.