Αφηρημένο

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια από τις πιο θανατηφόρες μορφές καρκίνου. Αύξηση επίπτωσης και θνησιμότητας υποδεικνύει ότι υπάρχει ακόμα πολύ λείπει στην ανίχνευση και τη διαχείριση της νόσου. Αυτό οφείλεται εν μέρει στην έλλειψη συγκεκριμένων συμπτωμάτων κατά τα αρχικά στάδια της νόσου. Αρκετές υποδοχείς αυξητικού παράγοντα έχουν συσχετιστεί με τον καρκίνο του παγκρέατος. Εδώ, ερευνήσαμε εάν η προσέγγιση παρεμβολή RNA απευθύνονται σε IGF-IR θα μπορούσε να είναι αποτελεσματική και αποδοτική κατά του παγκρέατος ανάπτυξη του καρκίνου και της μεταστάσεως. Για αυτό, αξιολογήσαμε τις επιδράσεις της αναστολής IGF-1 R χρησιμοποιώντας μικρά RNA παρεμβολής (siRNAs) σχετικά με την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση σε HPAC και PANC-1 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Βρήκαμε ότι η φίμωση του IGF-1R αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος και μετάσταση μπλοκάροντας βασικά μονοπάτια σηματοδότησης όπως AKT /PI3K, ΜΑΡΚ, JAK /STAT και EMT. Σίγαση IGF-1 R είχε ως αποτέλεσμα μία αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του παγκρέατος PANC-1 και HPAC. Matrigel εισβολή, μετανάστευση transwell και δοκιμασίες επούλωσης τραυμάτων αποκάλυψε επίσης ένα ρόλο για τον IGF-1 R σε μεταστατικές ιδιότητες του καρκίνου του παγκρέατος. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με χρήση κηλίδωσης Western ανάλυση των βασικών ενδιαμέσων που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό, επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση, τη μετανάστευση, και εισβολή. Επιπλέον, προσδιορισμούς μαλακού άγαρ έδειξαν ότι αποσιώπηση IGF-1 R αποκλείει επίσης τη διαμόρφωση δυνατοτήτων των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων αποικία

in vitro.

Κηλίδες Western, καθώς και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε την επαγωγή της απόπτωσης σε IGF-1 R φιμώνονται κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, φίμωση IGF-1 R κατέστειλε επίσης την έκφραση του β υποδοχέα ινσουλίνης. Όλα αυτά τα αποτελέσματα μαζί ελέγχουν σημαντικά παγκρεατικού την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση. Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν τη σημασία του IGF-1R στον καρκίνο του παγκρέατος

Παράθεση:. Subramani R, Lopez-Valdez R, Arumugam Α, Nandy S, Boopalan Τ, Lakshmanaswamy Ε (2014) Στόχευση ινσουλίνη-όπως αυξητικού παράγοντα 1 υποδοχέα Αναστέλλει καρκίνο του παγκρέατος ανάπτυξη και μετάσταση. PLoS ONE 9 (5): e97016. doi: 10.1371 /journal.pone.0097016

Επιμέλεια: Λουκία R. Languino, Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Ιανουαρίου του 2014? Αποδεκτές: 15, Απρίλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: May 8, 2014

Copyright: © 2014 Subramani et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Texas Tech University Κέντρο Επιστημών Υγείας Paul L. Foster Σχολή κεφαλαίων Ιατρικής. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος είναι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου που σχετίζονται με τον καρκίνο, ακόμη κι αν είναι μόνο η δέκατη τρίτη πιο συχνή κακοήθεια στον κόσμο [1]. Το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος είναι η χαμηλότερη αναφερθεί για οποιαδήποτε καρκίνου, η οποία είναι μικρότερη από 1 [2]%. Αυτό συμβαίνει κυρίως επειδή ο καρκίνος του παγκρέατος είναι δύσκολο να ανιχνευθεί σε πρώιμο στάδιο, λόγω της έλλειψης έγκαιρης προειδοποίησης σημάδια ή συμπτώματα [1]. Παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC), η οποία είναι η πιο κοινή μορφή αυτού του εξαιρετικά επιθετικού καρκίνου, είναι ιδιαίτερα επεμβατική και μεταστατικές και είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά σε όλες τις μορφές τις υπάρχουσες θεραπείες [3]. Οι ασθενείς που έχουν διαγνωστεί με PDAC σε προχωρημένα στάδια έχουν λίγη ελπίδα αποτελεσματική χειρουργική εκτομή [1] και άλλες θεραπείες όπως η ακτινοβολία, χημειοθεραπεία (γεμσιταβίνη, 5-φλουορουρακίλη, σισπλατίνη, πακλιταξέλη, ντοσεταξέλη, κλπ) ή στοχευμένες θεραπείες (Η erlotinib-Tarceva) [4] δεν προσφέρουν προς το παρόν πολλά οφέλη, είτε. Η ασυμπτωματική φύση της νόσου στα αρχικά της στάδια διασφάλισε ότι PDAC παραμένει ένα θανάσιμο και σχεδόν ανίατη καρκίνου παρά τις πολλαπλές προσπάθειες για να βρουν καλύτερες στρατηγικές θεραπείας [5]. Σύμφωνα με την πιο πρόσφατη έκθεση, περίπου 280.000 νέα κρούσματα καρκίνου του παγκρέατος διαγιγνώσκονται σε παγκόσμιο επίπεδο και η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του παγκρέατος συνεχίζει να αυξάνεται [6], [7]. Αύξηση επίπτωσης και θνησιμότητας υποδεικνύει ότι υπάρχει ακόμα πολύ λείπει στην ανίχνευση και τη διαχείριση της νόσου. Ως εκ τούτου, είναι απολύτως απαραίτητο να βρούμε καλύτερες διαγνωστικές και θεραπευτικές στρατηγικές για τη θεραπεία αυτής της ασθένειας.

Αρκετές υποδοχείς αυξητικών παραγόντων όπως 1 υποδοχέα ινσουλινόμορφου αυξητικού παράγοντα (IGF-1 R), τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) κ.λπ., τα παρεκκλίνοντα εκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του παγκρέατος [8]. Αυξημένα επίπεδα έκφρασης IGF-1 R που σχετίζονται με υψηλότερο κίνδυνο ανάπτυξης διαφόρων νεοπλασμάτων [9]. Ο άξονας σηματοδότησης IGF-1R είναι ιδιαίτερα ενεργοποιείται κατά τα πρώτα στάδια του πνεύμονα καρκινογένεσης, όπου ένας ρόλος για τον IGF-1 R σηματοδότηση αποδείχθηκε όχι μόνο στο σχηματισμό πρωτογενούς όγκου, αλλά επίσης σε εξέλιξη σε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα πιο επιθετική [10]. Jie Tang et al., 2013 ανέφεραν υψηλά επίπεδα έκφρασης του IGF-1 R σε δείγματα ιστού του όγκου από 25 από τους 36 ασθενείς με επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών. Επίσης ανέφεραν σταθερά υψηλότερα επίπεδα του IGF-1 σε πρωτογενείς καλλιέργειες καρκινικών κυττάρων (230 ng /ml) σε σύγκριση με φυσιολογικά καλλιέργειες ωοθηκών κυττάρων ιστού (101.9 ng /ml) [11]. IGF-1 R σηματοδότηση ενεργοποιεί την ενδοκυτταρική σηματοδότηση καταρρακτών που περιλαμβάνουν φωσφατιδυλο ινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ), ΑΚΤ, Rac και ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) [12], [13]. Αυτά τα μονοπάτια ρυθμίζουν βασικά γονίδια που εμπλέκονται σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες όπως πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, τη διαφοροποίηση, τη μετατροπή και την απόπτωση [10]. Επιπλέον, IGF-1 R στοχεύει 70 έως 100% των βασικών μεταβολικών μονοπατιών που συχνά μεταβάλλονται σε PDAC παθογένεση [14]. Στόχευση IGF-1 R έχει ήδη αποδειχθεί ότι ενισχύει τα θεραπευτικά αποτελέσματα των αναστολέων mTOR σε μεταστατικό νεφροκυτταρικό καρκίνωμα, [15]. Ομοίως, σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών του ανθρώπου, που στοχεύουν IGF-1 R με αντιπληροφοριακό νουκλεοτίδιο μειωμένο πολλαπλασιασμό κατά 70% και κλωνογονικότητας κατά 10 φορές [11]. Σε αμφότερα in vitro και in νίνο συστήματα, ένας ανταγωνιστής του IGF-1 R (μονοκλωνικό αντίσωμα ΜΚ-0646) αποδείχθηκε ότι ρυθμίζει σημαντικά κάτω αναστολέας φυλοσύνδετη απόπτωσης πρωτεΐνης (ΧΙΑΡ), η οποία έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στην επιβίωση των κυττάρων και η αναστολή του κυτταρικού θανάτου σε καρκίνο του παχέος εντέρου [16]. Επιπλέον, IGF-1 R στοχευμένες θεραπείες έχουν ήδη μετακινηθεί προς τα εμπρός σε κλινικές δοκιμές φάσης Ι για προστάτη, του μαστού, του παχέος εντέρου, του ήπατος, αρθρικό σάρκωμα, κλπ, [12], [17] – [19] με ελπιδοφόρα πρώτα αποτελέσματα. Ωστόσο, το δυνητικό όφελος από τη χρήση του IGF-1R στοχευμένη θεραπεία για τον καρκίνο του παγκρέατος δεν έχει διερευνηθεί πλήρως. Περαιτέρω, εξακολουθεί να υπάρχει έλλειψη λεπτομερούς γνώσης όσον αφορά τις ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους IGF-1 R ρυθμίζει παγκρεατικών καρκινογένεση.

Ως εκ τούτου, με βάση την απόδειξη τοποθέτησης για την αποτελεσματικότητα της στόχευσης IGF-1R σε ένα ευρύ φάσμα καρκίνων , έχουμε προσδιορίσει τις επιδράσεις της στόχευσης IGF-1 R σε καρκίνο του παγκρέατος στη μελέτη αυτή. Ο τελικός στόχος αυτής της μελέτης είναι να προσδιορίσει αν IGF-1 R σηματοδότηση είναι ένα αποτελεσματικό θεραπευτικό στόχο για τον καρκίνο του παγκρέατος με τη δυνατότητα να μεταφράζει γρήγορα σε κλινική χρήση. Εδώ έχουμε δείχνουν σαφώς ότι η αναστολή της έκφρασης του IGF-1R ενισχύει την απόπτωση και καταστέλλει την κυτταρική εισβολή, τη μετανάστευση και την μετάσταση μέσω της διαφοροποίησης των PI3K /AKT, ΜΑΡΚ και μονοπάτια JAK /STAT σηματοδότησης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εγκρίθηκαν από και εκτελούνται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Επιτροπής για την Βιοασφάλεια Θεσμικών του Πανεπιστημίου Tech Κέντρο Επιστημών Υγείας του Τέξας.

Γραμμές κυττάρων και αντιδραστήρια

Ανθρώπινο παγκρεατικού κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος πόρου, PANC-1 (καρκίνωμα επιθηλιοειδής), ΜΙΑ PaCa-2 (καρκίνωμα) και HPAC (αδενοκαρκίνωμα) αγοράστηκαν από την Συλλογή Καλλιεργειών Αμερικανικού τύπου, και διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 μέσο συμπληρωμένο με 10 % FBS, 100 μονάδες /κ.εκ πενικιλίνης, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνης. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% διοξείδιο του άνθρακα.

TransIT- siQUEST αντιδραστήριο επιμόλυνσης αγοράστηκε από την Bio Mirus (Madison, WI, USA). Το 6,5 mm Transwell με 8,0 μm ένθετα μεμβράνη πόρου από πολυανθρακικό ελήφθη από Corning Incorporated (Corning, ΝΥ, USA). BD Matrigel (Bedford, ΜΑ, USA) και BD Pharmingen αννεξίνης V-FITC Apoptosis Detection Kit Ι (San Diego, CA, USA) ελήφθη από BD Biosciences. BSA αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich Corporation (St Louis, ΜΟ, USA). siRNA που στοχεύει IGF-1 R αγοράστηκε από ΟηΟεηε (Rockville, MD, USA). αντιδραστήριο MTS [3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο] ελήφθη από την Promega (Madison, WI, USA). Θηλαστικών αντιδραστήριο εκχύλισης πρωτεΐνης (mPER) αγοράστηκε από την Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)

Τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη:. ΡΑΚΤ (SC-101629), ΑΚΤ (5298), Bcl- 2 (sc-783), pERK, (SC-101760), ERK (sc-94) και STAT3 (H-190) (sc-7179) (Santa Cruz, CA, USA)? IGF-1 R (3027), Notch 2 (4530P), σαλιγκάρι (3879), Ε-καδερίνης (3195), Ν-καντερίνη (4061), Zeb (3396), βιμεντίνη (5741), Slug (9585), Βαχ (2772 ), Caspase3 (9661), PARP (9542), pPI3K ρ85 (4228), ΡΙ3Κ ρ85 (4292), IR-β (3024), Pirs-1 (2388), IRS-1 (2382), pSTAT3 (ser727) ( 4113), COX-2 (4842), pPTEN (9549), pmTOR (2974), mTOR (4517), ρ-p70s6kinase (9206) και p70s6kinase (9202) (Cell Signaling Technology, (Boston, ΜΑ)? Caspase8 (ab 25901) (Abcam, Cambridge, MA, USA)? β-ακτίνης (Sigma Aldrich, (St.Louis, ΜΟ, USA).. Κατάλληλα δεύτερα αντισώματα ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)

Πάγκρεας αδενοκαρκίνωμα Tissue Array

μικροσυστοιχιών Pancreas αδενοκαρκινώματος ιστού (ΤΜΑ) ελήφθη από US Biomax, Inc, Rockville, MD Η ΤΜΑ περιέχουν σταθεροποιημένο με φορμαλίνη ενσωματωμένα σε παραφίνη δείγματα του παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα και κανονική παγκρεατική ιστούς υποβλήθηκε σε ανοσοϊστοχημεία (IHC) για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης του IGF-1R. έγκρισης Institutional Review Board δεν απαιτούνται για τη χρήση TMAs.

η ανοσοϊστοχημεία (IHC)

IHC για το αντιγόνο IGF-1 R έγινε με τη χρήση του παγκρέατος adenocarcionma TMA. TMAs επωάστηκαν πρώτα σε ένα φούρνο στους 58 ° C για 2 ώρες για να ενισχύσει την πρόσφυση του ιστού με τα φορτισμένα γυάλινες διαφάνειες. Αποπαραφινώσεως συνέχεια διεξάγεται για να αφαιρέσει το ενσωματωμένο μέσο χρησιμοποιώντας ξυλόλιο επώαση για 20 λεπτά. TMAs σταδιακά επανυδατώθηκαν σε σειριακές λουτρά αλκοόλης (100, 95, 70, 50 και 30%) που ακολουθείται από μια πλύση αποσταγμένο νερό για 5 λεπτά. που προκαλείται από τη θερμότητα επιτόπου ανάκτησης με την τριλογία (Cell Marque, Rocklin, CA) στη συνέχεια διεξήχθη για να ξεσκεπάσουν τις αντιγονικές θέσεις μέσα στις τομές ιστού. TMAs αποκλείστηκαν σε TBS που περιέχει 1% ορό εμβρύου μόσχου και 1% αλβουμίνη βόειου ορού για 15 λεπτά. Perox χωρίς αντιδραστήριο αποκλεισμού (Cell Marque, Rocklin, CA) προστέθηκε επίσης για 10 λεπτά για να εμποδίσει την μη ειδική σύνδεση αντισώματος. TMAs επωάστηκαν με αντίσωμα IGF-1 R (1:50 αραίωση) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Τα πλακίδια στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS για 5 λεπτά και επωάστηκαν με Ultra Marque polyscan HRP Label (Cell Marque, Rocklin, CA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. TMAs στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS και χρωματίστηκαν με διάλυμα χρωμογόνου (Cell Marque, Rocklin, CA) για 20 λεπτά. Χρωμογόνο αντίδραση χρώσης σταμάτησε ξεπλένοντας με απεσταγμένο νερό. πυρήνες κυττάρων αντιχρωματισμός διεξήχθη με επώαση αιματοξυλίνη για 40 δευτερόλεπτα. TMAs ξεπλύθηκαν με απεσταγμένο νερό και αφυδατωθεί με αύξοντα λουτρά αιθανόλη (30, 50, 70, 95 και 100%) που ακολουθείται από ένα λουτρό ξυλολίου. Τέλος, TMAs καλύφθηκαν με το μέσο στερέωσης (Surgipath Medical Industries, Richmond, IL) και ψηφιακές εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon Microscope- ECLIPSE 50i.

Η σίγαση του IGF-1 R σε PANC-1 και HPAC Cells

siRNA που στοχεύει IGF-1 R επιμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα PANC-1 και HPAC χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο διαμόλυνσης Mirus βιο TransIT siQUEST. Κωδικοποιημένα siRNA (ακολουθία μη αποσιώπηση) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 2,5 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις και διαφορετικούς υποτύπους (Α, Β και C) του siRNA που κυμαίνεται από 10 έως 50 ηΜ για 48 ώρες ή 72 ώρες, με χρήση αντιδραστηρίου Mirus siQUEST επιμόλυνση. Η αναλογία του siRNA για αντιδραστηρίου επιμόλυνσης διατηρήθηκε ως 1:0.5 για αποδοτική σίγηση χωρίς τοξικότητα σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι τελικές συγκεντρώσεις του siRNA επιλέχθηκαν με βάση τις μελέτες δόσης-απόκρισης. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για την απομόνωση της πρωτεΐνης ή κλωνογονικότητας, εισβολή, και τη μετανάστευση, μελέτες. Η απόπτωση μελετήθηκε στις 48 και 72 ώρες μετά την φίμωση του IGF-1R.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

PANC-1 και HPAC κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε πυκνότητα 0,3 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο και 0,5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο, αντιστοίχως, και επιμολυσμένα με IGF-1 R σε μία τελική συγκέντρωση 30 ηΜ του υποτύπου «Β» και 50 ηΜ του υποτύπου «Α» για 48 ώρες μαζί με τα ανακατωμένα ελέγχους. Μετά από 48 h επιμόλυνσης, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό MTS. Η απορρόφηση διαβάστηκε στα 490 nm προκειμένου να υπολογιστεί το ποσοστό βιώσιμων κυττάρων.

κλωνογονικότητας /Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού σε μαλακό άγαρ

δοκιμασία σχηματισμού αποικίας διεξήχθη με σκοπό να μετρηθεί η in vitro ικανότητα επιβίωσης ενός απλού κυττάρου να αναπτυχθούν σε μια αποικία σε αγκυροβόλιο ανεξάρτητη περιβάλλον ανάπτυξης. Εν συντομία, μετά την επιμόλυνση PANC-1 και HPAC κυττάρων με IGF-1 R siRNA ή ομελέτα ελέγχου για 48 ώρες, αυτά τα επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλήρες μέσο σε πυκνότητα 2 × 10

4 κύτταρα σε δίσκους 60-mm που περιέχει ένα top στρώμα% άγαρ 0,7 και ένα κάτω στρώμα από 1% άγαρ. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 3 έως 4 εβδομάδες και στη συνέχεια χρωματίζονται με 0,2% ιώδες κρύσταλλο. Αποικίες μεγαλύτερη από 20 κύτταρα μετρήθηκαν με το χέρι.

Επούλωση Δοκιμασία

κυττάρων που μεταναστεύουν ικανότητα του IGF-1 R σιγήσει παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία μηδέν. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 3,5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο για IGF-1 R διαμόλυνση. Σε αυτό το πυκνότητας, PANC-1 και τα κύτταρα HPAC έφθασαν σε συρροή μονοστιβάδα μετά από 48 × h. Μια ευθεία πληγή ή το μηδέν στη συνέχεια δημιουργήθηκε ήπια στις κυτταρικές μονοστοιβάδες με ένα στείρο ρύγχος πιπέτας. Τα κύτταρα αποσπώνται από το μηδέν πλύθηκαν δύο φορές με PBS και καλλιέργειες ακολούθως συμπληρώνονται με φρέσκο ​​μέσο και παρακολουθούνται για 96 ώρες στους 37 ° C με τη χρήση του Biostation CT (Nikon Instruments Inc. Melville, ΝΥ, USA) για συνεχή παρακολούθηση. Η Biostation αυτομάτως προγραμματισμένο να συλλάβει τις φωτογραφίες σε διαστήματα 2 ώρες έως 96 ώρες. εικόνες μετανάστευσης συνελήφθησαν και τεκμηριώνονται σε διαφορετικά χρονικά σημεία χρησιμοποιώντας το λογισμικό NIS-Element AR.

Μετανάστευση και την εισβολή Δοκιμασία

Η επίδραση του IGF-1R siRNA για τα χωροκατακτητικά ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας φρεατίων δοκιμασίες μετανάστευσης και της εισβολής. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, PANC-1 κύτταρα και τα κύτταρα HPAC τρυψινοποιήθηκαν και επανεναιωρήθηκαν σε FBS χωρίς RPMI-1640. Για τον προσδιορισμό της μετανάστευσης, συνολικά 5 × 10

3 κύτταρα απλώθηκαν στην κορυφή θάλαμο του transwell με μη επικαλυμμένη μεμβράνη πολυανθρακικό (ένθετο διάμετρο 6,5 χιλιοστά, 8,0 im μέγεθος πόρων? Corning Incorporated). Για τη δοκιμασία εισβολή, 2 × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν στον άνω θάλαμο του transwell με Matrigel επικαλυμμένα πολυανθρακική μεμβράνη (1 mg /mL). RPMI-1640 με 10% FBS προστέθηκε στο κατώτερο θάλαμο ως χημειοελκτικό. Μετά από επώαση για 48 ώρες στους 37 ° C με 5% CO

2, τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με 5% φορμαλίνη και χρωματίζονται με 0.2% κρυσταλλικό ιώδες. Τα κύτταρα που δεν μετανάστευσαν στην επάνω πλευρά του ενθέτου σκουπίζονται με ένα βαμβάκι. Εικόνες των κυττάρων τα οποία μετανάστευσαν στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης συνελήφθησαν με τυφλό τρόπο σε 5 διαφορετικές μικροσκοπικά πεδία με 20 × μεγέθυνση. Ο αριθμός των μετανάστευσαν ή εισβολή κυττάρων μετρήθηκε από πέντε ή έξι τυχαία επιλεγμένα πεδία με τυφλό τρόπο. Πειράματα έγιναν εις τριπλούν για στατιστική σημαντικότητα.

Ανάλυση

κυτταρικού θανάτου

Η επίδραση του IGF-1 R φίμωση στην απόπτωση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αννεξίνης V-FITC ανίχνευσης απόπτωσης Kit I. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση και στη συνέχεια βάφονται με Annexin V-FITC και το ιωδιούχο προπίδιο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το ποσοστό των νεκρών κυττάρων ή απόπτωση ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής (FACS Accuri C6) [20].

Ανάλυση Western Blotting

PANC-1 και HPAC κύτταρα επιμολύνθηκαν με IGF-1 R siRNA για 48 ώρες. Μετά την επώαση, η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από επιμολυσμένα κύτταρα με λύση της μεμβράνης των κυττάρων χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο εκχύλισης πρωτεΐνης θηλαστικού (mPER) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας BSA τυποποιημένη μεθοδολογία. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης φορτώθηκαν και διαχωρίστηκαν με SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% BSA σε 1 Χ TBST για 1 ώρα και ανιχνεύθηκαν με ένα πάνελ των πρωτογενών αντισωμάτων έναντι ρΑΚΤ, ΑΚΤ, Bcl-2, pERK, ERK, STAT3, IGF-1 R, Notch 2, σαλιγκάρι, Ε-καδερίνης , Ν-cadherin, Zeb, βιμεντίνη, Slug, Bax, Caspase3, PARP, pPI3K ρ85, ρ85 ΡΙ3Κ, IR-β, Pirs-1, IRS-1, pSTAT3, COX-2, pPTEN, pmTOR, mTOR, pp70s6kinase, p70s6kinase , Caspase8 ή β-ακτίνης. Μετά από πλύσιμο με TBS-T, η μεμβράνη επωάστηκε με αντισώματα υπεροξειδάση συζευγμένο δευτερεύον χρένο και έπειτα θετικά ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια.

Στατιστική Ανάλυση

Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν με μη ζευγαρωμένα έλεγχος τ. Η GraphPad Prism 5 πακέτο λογισμικού έκδοση 5.03 χρησιμοποιήθηκε για να κάνει όλους τους στατιστικούς υπολογισμούς. Πιθανότητα τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν ότι είναι στατιστικώς σημαντικές

Αποτελέσματα

IGF-1 R εκφράζεται έντονα σε καρκίνους του παγκρέατος

Εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης του IGF-1 R σε. παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα κυτταρικές γραμμές (HPAC, ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1) χρησιμοποιώντας κηλίδα western. Και οι τρεις κυτταρικές σειρές είχαν ένα υψηλό επίπεδο έκφρασης του IGF-1 R σε σύγκριση με το φυσιολογικό πάγκρεας. HPAC είχε την υψηλότερη έκφραση του IGF-1 R μεταξύ των τριών παγκρεατικών κυτταρικών σειρών αναλύσαμε ενώ PANC1 είχε το λιγότερο έκφραση. Έτσι επέλεξε να χρησιμοποιήσει HPAC και τα κύτταρα PANC1 για όλα τα πειράματά μας με βάση την έκφραση του IGF-1R τους (Σχήμα 1Α). Ανοσοϊστοχημική ανάλυση του IGF-1 R σε μικροσυστοιχία πάγκρεας αδενοκαρκίνωμα ιστού (TMA) έγινε για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η παθοφυσιολογικός ρόλος του IGF-1 R σε PDAC παθογένεση. PDAC ιστοί όγκου σε διάφορα στάδια έδειξαν αυξημένη έκφραση του IGF-1 R σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς παγκρέατος (Σχήμα 1Β).

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης του IGF-1 R σε PANC-1, HPAC και ΜΙΑ PaCa-2 ήταν σε σύγκριση με το κανονικό παγκρεατικά κύτταρα από αρουραίο χρησιμοποιώντας κηλίδα western. (Β) Αντιπροσωπευτική ανοσοϊστοχημική ανάλυση του IGF-1 R με το στάδιο του όγκου σε παγκρεατικά ιστούς αδενοκαρκίνωμα και φυσιολογικό πάγκρεας ιστό. (C) PANC-1 και τα κύτταρα HPAC επιμολύνθηκαν με τρία προσχεδιασμένα IGF-1 R siRNAs (Α, Β και C) σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις (10, 30 και 50 ηΜ) μαζί με περιπλεγμένο έλεγχο siRNA. Σίγαση αποτελεσματικότητα του IGF-1 R siRNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας στύπωμα Western σε PANC-1 και κύτταρα HPAC. (D) Επίδραση του IGF-1 R siRNA επί της κυτταρικής βιωσιμότητας των PANC-1 και HPAC. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 30 ηΜ και 50 ηΜ του IGF-1 R siRNA σε PANC-1 και τα κύτταρα HPAC αντίστοιχα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με χρήση κιτ δοκιμασίας MTS. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (η = 3). (Ε) Η αναστολή της έκφρασης μπλοκ IGF1R σχηματισμού αποικιών δυνατότητες του παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, PANC-1 και HPAC. Μια δοκιμασία μαλακού άγαρ χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί η ικανότητα σχηματισμού αποικιών των PANC-1 και HPAC κύτταρα. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA, PANC-1 και HPAC κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε 0,7% αγαρόζη σε μέσο RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% FBS για 16 και 22 ημέρες, αντίστοιχα. Εδώ φαίνονται αντιπροσωπευτικές εικόνες του σχηματισμού αποικιών από δύο ανεξάρτητα πειράματα γίνονται εις τριπλούν. (F) Ποσοστό αποικιών σε αμφότερες κύτταρα PANC-1 και HPAC υπολογίστηκαν με περιπλεγμένο ελέγχου (SCR) που χρησιμεύει ως γραμμή βάσης.

Η

Σίγαση IGF-1 R χρησιμοποιώντας siRNAs σε καρκίνο του παγκρέατος Κυτταρικές Γραμμές

Για σίγαση της έκφρασης του IGF-1 R, χρησιμοποιήσαμε 3 διαφορετικά siRNAs σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 10 έως 50 ηΜ. Κωδικοποιημένα siRNA που δεν στοχεύει οποιοδήποτε γονίδιο χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. siRNA αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης μεταβάλλεται με βάση την υποτύπου και συγκέντρωση των siRNA και για τις δύο κυτταρικές σειρές. Κατά συνέπεια, τα επίπεδα έκφρασης του IGF-1 R ήταν σημαντικά μειωμένες σε συγκέντρωση 30 ηΜ «Β» και 50 ηΜ «Α» για PANC-1 και HPAC καρκινικά κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα 1 C). Ως εκ τούτου, επελέγησαν οι δύο αυτές δόσεις siRNA για όλες τις μετέπειτα μελέτες.

Σίγαση IGF-1 R Προκαλεί αντιπολλαπλασιαστικής επίδρασης σε καρκίνο του παγκρέατος Κυτταρικές Γραμμές

Δεδομένου ότι IGF-1 R είναι γνωστό ότι διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, εξετάσαμε την επίδραση της αποσιώπησης IGF-1 R επί του πολλαπλασιασμού των παγκρεατικών κυττάρων αδενοκαρκινώματος. Σίγαση IGF-1 R μείωσε τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση σε σύγκριση με τα ανακατωμένα siRNA επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου. Μόνο 45.24% & amp? 47.28% των κυττάρων ήταν βιώσιμα μετά την αναστολή του IGF-1R σε PANC1 και HPAC κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα 1 D). Το αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του στόχευσης IGF-1 R είναι ιδιαίτερα σημαντική σε δύο από τα εξαιρετικά επιθετική παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν έναν κεντρικό ρόλο για τον IGF-1R στον πολλαπλασιασμό των επιθετικών καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος.

Σίγαση IGF-1R Αναστέλλει Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος

Anchorage-ανεξάρτητο αναπτυξιακό δυναμικό της καρκινικά κύτταρα είναι ένα από τα σημαντικά και γνωστά χαρακτηριστικά μετασχηματισμένων κυττάρων. Μαλακό άγαρ δοκιμασίες σε PANC-1 και HPAC κύτταρα διεξήχθησαν για να εκτιμηθεί εάν IGF-1 R knockdown επηρεάζονται αποικία δυναμικό αυτών των κυττάρων που σχηματίζουν. Σίγαση IGF-1 R μείωσε δραματικά την ικανότητα σε αμφότερες τις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 1 Ε) σχηματισμού αποικίας. Τα αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα ποσοτικά, το οποίο αποκαλύπτει & gt? 85% αναστολή της ικανότητας μορφοποίησης σε IGF-1 R αποικία σιγήσει παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 1 F)

IGF-1 R κατασιγάσει Καταστέλλεται καρκίνο του παγκρέατος κυττάρων Μετανάστευση /κινητικότητα

(i) Οι επουλωτικές των πληγών δοκιμασία.

ικανότητα σχηματισμού αποικιών μειωμένη συνδέεται γενικά με μία αντίστοιχη απώλεια της εισβολής των δυνατοτήτων των καρκινικών κυττάρων [20]. Η δοκιμασία κλασικό επούλωσης πληγών διεξήχθη για να ελεγχθεί ο ρόλος του IGF-1 R στη ρύθμιση της μεταναστευτικής ικανότητας των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. μονοστοιβάδες κυττάρων γδαρμένο να δημιουργήσει μια πληγή για την παρακολούθηση της μεταναστεύουν ικανότητα τόσο του ελέγχου και της IGF-1 R κατέστειλε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. IGF-1 R κατέστειλε PANC-1 και HPAC κύτταρα παρουσίασαν μειωμένη μεταναστευτικών δυνατότητες σε σύγκριση με τα ανακατωμένα ελέγχους. HPAC ομελέτα κύτταρα ελέγχου μεταρρυθμιστεί μία πλήρης μονοκυτταρική στοιβάδα μέσα σε 48 ώρες και PANC-1 κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου μεταρρυθμιστεί μία πλήρης μονοκυτταρική στοιβάδα μέσα σε 96 ώρες. Σε IGF-1R κατέστειλε PANC-1 και HPAC κύτταρα, πλήρη μονοστιβάδα δεν αναμορφώθηκε ακόμη και μετά από 96 h (Σχήμα 2Α, Β & amp? C).

(Α) Οι επουλωτικές των πληγών δοκιμασία διεξήχθη για να αξιολογηθεί η μετανάστευση του PANC-1 και HPAC κύτταρα μετά την φίμωση IGF-1 R. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA, τραύματος ικανότητα των κυττάρων επούλωση παρακολουθήθηκαν με αυτοματοποιημένα Nikon Biostation CT σε διαστήματα από 2 ώρες έως 96 ώρες. (Β & amp? C): Η μετανάστευση των κυττάρων προσδιορίστηκε με το ρυθμό των κυττάρων κινείται προς το γδαρμένο περιοχή. Το ποσοστό της μετανάστευσης υπολογίστηκε από το λογισμικό NIS-Element AR. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. (D) σίγαση της έκφρασης του IGF-1R αναστέλλει τη μετανάστευση των PANC-1 και HPAC κύτταρα. Κυττάρων μεταναστευτικών ικανότητες προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μη επικαλυμμένα μεταξύ φρεατίων θαλάμους Boyden. Μετά την επιμόλυνση PANC-1 και HPAC κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν μέσω των πόρων στην κάτω επιφάνεια του transwell. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 0.2% κρυσταλλικό ιώδες σε 5% φορμαλίνη. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά πέντε τυχαίες εικόνες μικροσκοπικό πεδίο των 20Χ μεγέθυνση (Ε) Ποσοστό μετανάστευσης για επικοινωνούντα δοκιμασίες δείχνεται για τον IGF-1 R σιγήσει PANC-1 και HPAC κύτταρα από τα αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

(ii) ανάλυση Transwell μετανάστευσης.

Καταστολής μετανάστευση PANC-1 και κύτταρα HPAC επιτευχθεί με αποκλεισμό της έκφρασης του IGF-1R περαιτέρω επιβεβαιώθηκε με τη χρήση φρεατίων δοκιμασίες μετανάστευσης. Για άλλη μια φορά, σε σύγκριση με τους μάρτυρες, IGF-1 R siRNA επιμολυσμένα PANC-1 και κύτταρα HPAC έδειξαν μια σημαντική μείωση του αριθμού των κυττάρων που μετανάστευσαν (Εικόνα 2D & amp? Ε). Αυτό υποδεικνύει έντονα ότι η αναστολή της έκφρασης του IGF-1 R καταστέλλει τις μεταναστεύουν ικανότητες των δύο επιθετικών παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές.

Knockdown του IGF-1R αναστέλλει τον κυτταρικό Invasion

Κυττάρων εισβολή είναι ένα από τα κρίσιμα στάδια που εμπλέκονται σε μετάσταση καρκινικών κυττάρων. Διαφυγής των καρκινικών κυττάρων από πρωτογενή θέση προέλευσης σε απομακρυσμένες θέσεις εμφανίζεται όταν τα κύτταρα αποκτούν την ικανότητα να διεισδύει στο βασικής μεμβράνης όγκου και εισβάλλουν στον περιβάλλοντα ιστό και τελικά μέσα στο αίμα και του λεμφικού συστήματος. In vitro δοκιμασίες Matrigel εισβολή χρησιμοποιώντας Transwell θαλάμους Boyden που μιμούνται την εσωτερική μεμβράνη του μικροπεριβάλλοντος του όγκου χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνηθεί το δυναμικό εισβολής του IGF-1 R siRNA επιμολυσμένα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Συνεπής με μειωμένη ικανότητα μεταναστευτικά, κύτταρα κατεργασμένα με IGF-1 R siRNA επέδειξε μια σημαντική μείωση στην ικανότητα κυτταρικής εισβολής, περισσότερο από 85% σε κύτταρα HPAC PANC-1 και σε σχέση με τα ανακατωμένα κύτταρα siRNA-αγωγή (Σχήμα 3Α & amp? Β). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι αποσιώπηση IGF-1 R μειώνει όχι μόνο την ικανότητα της μετανάστευσης, αλλά και τις επεμβατικές ιδιότητες του παγκρεατικού πόρου κυττάρων αδενοκαρκινώματος.

(Α) PANC-1 και HPAC κύτταρο εισβολή αξιολογήθηκε σε επικοινωνούντα δοχεία επικαλυμμένο με Matrigel. Τα κύτταρα που εισέβαλαν το ένθετο Matrigel επικαλυμμένο μονιμοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και κατέλαβε σε 20 × μεγέθυνση. (Β) Αριθμός εισέβαλαν κύτταρα μετρήθηκαν και εκφράστηκαν ως ποσοστό εισβολή. Πειράματα έγιναν εις τριπλούν (Γ) IGF-1 R σίγηση αναστέλλει την έκφραση αρκετών επιθηλιακών-μεσεγχυματικά δείκτες μετάβασης. Η ολική πρωτεΐνη προϊόντα λύσης από κωδικοποιημένα ελέγχου και IGF-1 R σιγήσει PANC-1 και τα κύτταρα HPAC αναλύθηκαν για την έκφραση του Notch-2, σαλιγκάρι, Ε-καδερίνης, Ν-καδερίνη, Zeb, βιμεντίνη και γυμνοσάλιαγκα μαζί με τον εσωτερικό έλεγχο β-ακτίνης. (δ) Densitometic τιμές των δεικτών EMT εμφανίζεται ως έκφραση%. PS-PANC-1 Ομελέτα, PI-PANC-1 IGF-1R σιγήσει, HS-HPAC Ομελέτα, HI-HPAC IGF-1R σιγήσει.

Η

Σίγαση IGF-1R Blocks Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά Μετάβασης (EMT ) σε κύτταρα καρκίνο του παγκρέατος

η διαδικασία των καρκινικών κυττάρων εισβολής είναι ενεργοποιημένη από EMT, που είναι ο εμπνευστής του μεταστατικού καταρράκτη [21]. Κύτταρα τα οποία υφίστανται ΕΜΤ θα επιτύχει βλαστικών κυττάρων ιδιότητες-όπως που αυξάνουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, μετάσταση, κτλ [22]. Οι παράγοντες που σχετίζονται με ΕΜΤ-όπως Notch-2, σαλιγκάρι, Ν-cadherin, Zeb, βιμεντίνη και Slug μειώθηκαν σημαντικά κατά την αποσιώπηση IGF-1 R σε PANC-1 και HPAC κύτταρα (Σχήμα 3C & amp? D). Είναι ενδιαφέρον ότι, η ανάλυση στυπώματος western σε IGF-1 R κατέστειλε κύτταρα έδειξαν αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης? απώλεια αυτού του μορίου προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου θεωρείται ότι προάγει εισβολή και τη μετάσταση [23]. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν σαφώς ότι η φίμωση του IGF-1R σε παγκρεατικά αποτελέσματα των καρκινικών κυττάρων στην αναστολή των πρωτεϊνών που ευνοούν παγκρέατος EMT καρκίνο.

Σίγαση IGF-1R προκαλεί απόπτωση

κανονισμού

απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος αναλύθηκε κατόπιν IGF-1 R σίγηση χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-FITC apoptosis Detection Kit I. ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε μια έντονη επαγωγή απόπτωσης /κυτταρικού θανάτου από τον IGF-1 R φίμωση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (45.4%, 55.4% σε PANC-1 και 47.7%, 59,5% σε HPAC παρατηρήθηκε μετά από 48 ώρες και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, αντιστοίχως) (Σχήμα 4Α & amp?. Β)

(Α) αναστολή IGF1R επάγει απόπτωση σε PANC1 & amp? κύτταρα HPAC. επιμόλυνση τα κύτταρα μετά χρωματίστηκαν με Annexin-V-FITC και το ιωδιούχο προπίδιο που ακολουθείται από κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό των πρώιμων αποπτωτικών (κάτω δεξιά τεταρτημόριο), αποπτωτικών (πάνω δεξιά τεταρτημόριο), αργά αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων (επάνω αριστερά τεταρτημόριο), και να ζήσουν υγιή κύτταρα (κάτω αριστερά τεταρτημόριο) εμφανίζονται. (Β) Ποσοστό απόπτωση και κυτταρικό θάνατο συνοψίζεται για τρία ανεξάρτητα πειράματα σε PANC-1 και HPAC κύτταρα. αναστολή (C) IGF-1 R διεγείρει υποδοχέα θανάτου και μιτοχονδριακή απόπτωση σε PANC1 & amp? κύτταρα HPAC. Bax, Bcl-2, κασπάσης 8, κασπάσης 3 και PARP διασπάται και έκφραση β-ακτίνης αναλύθηκε με χρήση Western blot σε IGF-1 R siRNA επιμολυσμένα PANC-1 και HPAC κύτταρα. (D) Αντιπροσωπευτική ανάλυση πυκνομετρίας εμφανίζει σημαντική ενίσχυση της απόπτωσης μέσω ενδογενών και εξωγενών οδών. PS-PANC-1 Ομελέτα, PI-PANC-1 IGF-1R σιγήσει, HS-HPAC Ομελέτα, HI-HPAC IGF-1R σιγήσει.

Η

Για τον προσδιορισμό του μοριακού μηχανισμού που εμπλέκονται σε αυτή την επαγωγή της απόπτωσης , ερευνήσαμε την μορφή έκφρασης αρκετών αποπτωτικών μορίων σηματοδότησης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Κύτταρα επιμολυσμένα με IGF-1 R siRNA είχε σημαντικά αυξημένη έκφραση του Bax, κασπάση 8, Caspase3 και διασπασμένη PARP σε σύγκριση με κύτταρα επεξεργασμένα με μπερδεμένο siRNA (Σχήμα 4C & amp? D). Σίγαση IGF-1 R μειώθηκε επίσης την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 και στα δύο κύτταρα HPAC (Σχήμα 4C & amp? D) PANC-1 και. Αυτά τα δεδομένα αποκαλύπτουν ότι IGF-1R siRNA επάγει την απόπτωση μέσω δύο υποδοχέων θανάτου και μιτοχονδριακή μεσολάβηση μονοπατιών της απόπτωσης.

Σίγαση IGF-1R Alters Key Σηματοδοσίας Μόρια

Η αναστολή μόνο ένα μέλος ενός συγκεκριμένου σηματοδότησης μονοπάτι ή στοχεύει σε μία μόνο συγκεκριμένη κυτταρική λειτουργία μπορεί να είναι ανεπαρκής για την αντιμετώπιση πολύπλοκων ασθενειών όπως ο καρκίνος. Ως εκ τούτου, η στόχευση των μορίων με τη μεγαλύτερη επίδραση στις πολλαπλές οδούς ογκογόνο σηματοδότηση θα έχουν μεγαλύτερη μεταγραφική δυνατότητες για την κλινική θεραπεία PDAC. Στο πλαίσιο αυτό, επιλέξαμε να εκτελέσει μια ακόμα πιο ολοκληρωμένη ανάλυση των επιπτώσεων του IGF-1R αποσιώπηση στο PANC-1 και HPAC κύτταρα και έχουν διαπιστώσει ότι IGF-1R πράγματι συντονίζουν τη ρύθμιση των πολλαπλών κυτταρικών οδών που εμπλέκονται στην επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό , μετάσταση, ΕΜΤ, απόπτωση και σηματοδότηση του κυτταρικού κύκλου (σχήμα 5)

(A, C & amp? Ε):. Η επίδραση της καταστολής IGF-1 R επί σηματοδότηση AKT /ΡΙ3Κ εξετάσθηκε σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. PANC-1 και HPAC κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με IGF-1 R siRNA για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η έκφραση φωσφο-ΑΚΤ, ΑΚΤ, φωσφο-ΡΙ3Κ, ΡΙ3Κ, φωσφο-ΡΤΕΝ, φωσφο-mTOR, mTOR, φωσφο-p70s6kinase, p70s6kinase και τον εσωτερικό έλεγχο β-ακτίνης μετρήθηκε με κηλίδωση Western. (Β, D & amp? F): Η πυκνομετρική ανάλυση παρουσιάζεται επίσης στα δεξιά του κάθε αντιπροσωπευτική εικόνα

Η

ΑΚΤ είναι ένα από τα πιο εκφράζεται ιδιοσυστατικά μόρια σε πολλούς καρκίνους και έχει αποδειχθεί ότι ενισχύει κακοήθεις. τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [24].