Αφηρημένο

Ιστορικό

LIM και SH3 πρωτεΐνη 1 (LASP- 1) είναι ένα συγκεκριμένο εστιακό πρωτεΐνη προσκόλλησης που ενέχονται σε διάφορες κακοήθεις όγκους. Ωστόσο, ο ρόλος της στη στοματική καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (OSCC) είναι άγνωστος. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να χαρακτηρίσει τον ρόλο και τη μοριακή κατάσταση /μηχανισμού LASP-1 σε OSCC.

Μέθοδοι

Εμείς αξιολογούνται

LASP-1

mRNA και εκφράσεις πρωτεΐνης σε OSCC που προέρχονται από κυτταρικές σειρές και πρωτογενή OSCCs. Χρησιμοποιώντας ένα σύστημα shRNA, αναλύσαμε την επίδραση της LASP-1 για τη βιολογία και τη λειτουργία των κυτταρικών σειρών OSCC, HSC-3 και Ca9-22. Τα κύτταρα επίσης εγχύθηκαν υποδορίως για να αξιολογηθεί η ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με την ακριβή δοκιμή του Fisher ή του Mann-Whitney U. Bonferroni διόρθωση χρησιμοποιήθηκε για πολλαπλές δοκιμές.

Αποτελέσματα

Σημαντική ανοδική ρύθμιση του LASP-1 ανιχνεύθηκε σε OSCC προερχόμενων κυτταρικών σειρών (n = 7,

P

& lt ? 0.007) και πρωτοβάθμια OSCCs (n = 50,

P

& lt? 0.001) σε σύγκριση με φυσιολογικούς μάρτυρες. LASP-1 νοκ ντάουν κυττάρων ανέστειλαν σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε σύγκριση με shMock-επιμολυσμένα κύτταρα (

P

& lt? 0.025) συλλαμβάνοντας εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου στη φάση G2. Παρατηρήσαμε δραματική μείωση στην ανάπτυξη των shLASP-1 ξενομοσχευμάτων OSCC σε σύγκριση με ξενομοσχεύματα shMock

in vivo

.

Συμπέρασμα

Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι η υπερέκφραση του LASP-1 συνδέεται στενά με το στόμα το ογκογόνο και περαιτέρω παρέχει νέα στοιχεία ότι LASP-1 διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη του όγκου με τη μεσολάβηση G2 /M μετάβαση

Παράθεση:. Shimizu F, Shiiba Μ, Ogawara Κ, Kimura R, Minakawa Υ , Baba Τ, et al. (2013) Η υπερέκφραση της ΕΑΥ και SH3 πρωτεΐνη 1 που οδηγούν στην επιταχυνόμενη φάση G2 /M μετάβαση συμβάλλει στην ενίσχυση Ογκογένεση στον καρκίνο του στόματος. PLoS ONE 8 (12): e83187. doi: 10.1371 /journal.pone.0083187

Επιμέλεια: Jörg Δ Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Γερμανία

Ελήφθη: 21 Αύγ 2013? Αποδεκτές: 11 Νοεμ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 26, Δεκ του 2013

Copyright: © 2013 Shimizu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικές ενδιαφέρον

Εισαγωγή

σημαντικές ενδείξεις πρότεινε ότι οι ξαφνικές αυξήσεις στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό να συμβεί λόγω διαταραχής του μηχανισμού ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει μια συσχέτιση μεταξύ ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και την ανάπτυξη του στόματος πλακωδών κυττάρων καρκινώματα (OSCCs) [1], [2], [3]. Παρά τη συσσώρευση των δεδομένων, ο ακριβής μηχανισμός της κλινικό όφελος της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου σε OSCCs δεν έχει διευκρινισθεί.

κυτταρικό πολλαπλασιασμό του καρκίνου συμβαίνει ως αποτέλεσμα της διαταραχής των μηχανισμών ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και συνεχής σηματοδότηση για μίτωσις. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναφέρει ότι απορρύθμισης σε G2 /M μετάπτωσης προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε πολλούς τύπους όγκων [4], [5], [6]. Μεταξύ των γονιδίων συσχετίζονται με την G2 /M φάση, νουκλεϊκά LIM και πρωτεΐνη SH3 (LASP-1) στο G2 /M φάση θεωρείται απαραίτητη για την ογκογόνο δράση σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού [7]. LASP-1 ταυτοποιήθηκε αρχικά από μια βιβλιοθήκη cDNA του μεταστατικού καρκίνου του μαστού μεταστάσεων [8]. Είναι εντοπισμένη μέσα σε πολλαπλές τοποθεσίες της δυναμικό σύστημα F-ακτίνης, όπως εστιακές επαφές [9] και συμμετέχει στο κυτταροσκελετού αρχιτεκτονική [10]. Σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα προερχόμενα, ενώ αποσιώπηση LASP-1 είχε σαν αποτέλεσμα μια ισχυρή αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης [11], η υπερέκφραση του LASP-1 προωθείται σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

[12]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του LASP-1 έχει παρατηρηθεί σε μια ποικιλία των κακοήθων όγκων, όπως μεταστατικό καρκίνο του μαστού [11], τον καρκίνο των ωοθηκών [13], ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης [14], μυελοβλάστωμα [15], και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [16].

Πρόσφατες μελέτες απέδειξαν LASP-1 μαζί με μια άλλη πρωτεΐνη εστιακή προσκόλληση παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη G2 /M μετάπτωσης με αναστολή cdc2 [17], [18], υποδηλώνοντας πιθανή σχέση του με την κυτταρικού κύκλου στον καρκίνο. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις υποθέσαμε ότι LASP-1 είναι στενά συνδεδεμένη με το στόμα ογκογένεση με επιταχυνόμενη G2 /M μετάβαση.

Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε παρεκκλίνουσα έκφραση LASP-1 και αξιολόγησε τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά OSCCs. Πραγματοποιήσαμε επίσης λειτουργική ανάλυση για να καθορίσει τις βιολογικές επιδράσεις της LASP-1.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Graduate School Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Chiba (Ο αριθμός έγκρισης, 236) και έγινε σύμφωνα με τα δεοντολογικά πρότυπα που ορίζονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς.

Όλα τα πειραματόζωα υποβλήθηκαν σε θεραπεία και φροντίδα σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του Πανεπιστημίου Chiba. Τα πειραματόζωα θυσιάστηκαν με αυχενική εξάρθρωση. Κάναμε κάθε δυνατή προσπάθεια για να ανακουφίσει τον πόνο των πειραματόζωων. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Πανεπιστημίου Chiba (ο αριθμός έγκρισης, 25-221).

Cell Culture and Tissue δείγματα

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές OSCC (HSC -3, ΚΩΝ και ΗΟ-1-Ν-1) αγοράστηκαν από το Science Research Τράπεζα Πόρων του Ανθρώπου, Osaka, Japan. RIKEN BRC (Tsukuba, Japan) υπό την προϋπόθεση Sa3, ΗΟ-1-u-1, HSC-4, και Ca9-22 μέσω του Εθνικού Προγράμματος Bio-Resource του Υπουργείου Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας στην Ιαπωνία. Κυτταρική ταυτότητα επιβεβαιώθηκε με μικρή διαδοχική επανάληψη προφίλ. Πρωτογενή καλλιεργημένα ανθρώπινα κανονικά από το στόμα κερατινοκύτταρα (HNOKs) ελήφθησαν από τρεις υγιείς δότες και υπηρέτησε ως τις συνήθεις ελέγχους [19], [20], [21]. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Sigma) και 50 μονάδες /ml πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (Sigma) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% διοξειδίου του άνθρακα /αέρα στους 37 ° C.

Πενήντα ζευγάρια των πρωτογενών δειγμάτων OSCC και τα αντίστοιχα κανονικά από το στόμα επιθηλιακών ιστών ελήφθησαν διεγχειρητικά στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Chiba. Η επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Chiba ενέκρινε την εν λόγω μελέτη. Ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς. Οι εκτομή ιστών χωρίστηκαν για απομόνωση RNA και ανοσοϊστοχημεία (IHC)? ο πρώην καταψύχθηκε αμέσως και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C, ο τελευταίος είχε καθοριστεί σε διάλυμα φορμαλδεΰδης 20% ρυθμισμένο. Κάθε ιστός διαγνώστηκε ιστοπαθολογικά σύμφωνα με τα κριτήρια του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας από το Τμήμα Παθολογίας, Chiba University Hospital. Κλινικοπαθολογοανατομικές στάσης προσδιορίστηκε σύμφωνα με τον όγκο-κόμβο-μεταστάσεις κατάταξη της Διεθνούς Ένωσης κατά του Καρκίνου. Όλα τα δείγματα OSCC επιβεβαιώθηκαν ιστολογικά ότι όγκου ήταν παρούσα σε πάνω από το 90% των δειγμάτων.

Η έκφραση mRNA Ανάλυση

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA παρήχθη από 5 μg ολικού RNA με τη χρήση Ready-To-Go You-Prime First-Strand Χάντρες (GE Healthcare, Buckinghamshire, Ηνωμένο Βασίλειο) και ολιγο (dT) εκκινητή (Hokkaido System Science, Σαπόρο, Ιαπωνία). Πραγματικού χρόνου ποσοτική αλυσίδα ανάστροφης μεταγραφάσης αντίδραση πολυμεράσης (PCR qRT-) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση LightCycler® 480 σύστημα PCR (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) για την αξιολόγηση του επιπέδου έκφρασης του

LASP-1

mRNA στο OSCC προερχόμενο από κυτταρικές σειρές και HNOKs. Οι αλληλουχίες εναρκτήρα που χρησιμοποιούνται για qRT-PCR ήταν:

LASP-1

, προς τα εμπρός, 5′-CAGCCCCAGTCTCCATACAG-3 ‘? αντίστροφη, 5’-ATACTGATGTCGCGGCGG-3 ‘? και καθολική καθετήρα # 77. Εκκινητές και ανιχνευτές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το ProbeFinder qPCR Δοκιμασία Σχεδιασμός Λογισμικού, που διατίθεται στη www.universalprobelibrary.com. Οι qRT-ενισχύσεις PCR διεξήχθησαν ως ακολούθως: αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά, 45 κύκλους ενίσχυσης στους 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα, μετουσίωση στους 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα για την συγκόλληση /επέκτασης, και την ψύξη στους 40 ° C για 30 δευτερόλεπτα. Το ποσό μεταγραφή για το

LASP-1

υπολογίστηκε από τις αντίστοιχες τυπικές καμπύλες και ομαλοποιούνται στη

αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης

(

GAPDH

) (προς τα εμπρός 5 ‘ -CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3’cell, αντίστροφη 5’-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 ‘, και καθολική καθετήρα # ποσό 60) απομαγνητοφώνηση προσδιορίζεται σε αντίστοιχα δείγματα.

ανοσοαποτύπωσης Ανάλυση

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό ( 7 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 4% β /ο CHAPS, και 10 mM Tris [ρΗ 7.4]) με το κοκτέιλ αναστολέα πρωτεϊνάσης (Roche) και επωάστηκε στους 4 ° C για 30 λεπτά. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας προσδιορισμό πρωτεΐνης Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Εκχυλίσματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου δωδεκύλ θειικού νατρίου σε 10% πηκτή και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης πριν από την επώαση όλη την νύχτα με πρωτεύοντα αντισώματα ενάντια LASP-1 (Applied βιολογικά υλικά, Richmond, BC, Canada), κυκλίνη Α, κυκλίνη Β, ή φωσφο -cdc2 (Tyr15) (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ) στους 4 ° C. Η μεμβράνη πλύθηκε με 0.1% Tween-20 σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα, επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα, χρένο συζευγμένο με υπεροξειδάση αντι-κουνελιού ή αντι-ποντικού IgG (Promega, Madison, WI, USA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. SuperSignal χημειοφωταυγές υπόστρωμα (Thermo, Waltham, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της πρωτεΐνης. Οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες απεικονίστηκαν σε ένα σύστημα ψύχεται CCD κάμερα (ATTO, Τόκιο, Ιαπωνία), και η έκδοση του λογισμικού CS Analyzer 3.0 (ATTO) χρησιμοποιήθηκε για την ένταση του σήματος ποσοτικοποίηση.

IHC

IHC εκτελέστηκε σε εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα κόπηκαν σε 4-μm τομές χρησιμοποιώντας αντι-LASP-1 πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Applied Βιολογικών Υλικών). Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με επώαση 30 λεπτών σε 0.3% διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου σε 100% μεθανόλη. Οι τομές επωάστηκαν σε 1.5% ορό φραγμού (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, ΤΧ, USA) σε αλατούχο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την αντίδραση όλη τη νύκτα με αντι-LASP-1 αντίσωμα (1: 1000 αραίωση) στους 4 ° C σε ένα υγρό θάλαμο. Πριν από την επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα, τα πλακίδια πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Histofine Simplestain Max-ΡΟ (G) (Nichirei, Tokyo, Japan). 3,3′-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική (DAKO, Carpinteria, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο, και οι τομές ιστού βάφτηκαν αντίθετα ελαφρά με αιματοξυλίνη, αφυδατώθηκαν με αιθανόλη, καθαρίζονται με ξυλόλιο, και τοποθετείται με Marinol (Muto Pure Chemicals, Tokyo , Ιαπωνία). Για να αποφευχθεί η μη ειδική σύνδεση ενός αντισώματος με τις πρωτεΐνες, εκτός από το αντιγόνο, ένα πείραμα παρεμπόδισης πεπτίδιο ανοσοποίησης διεξήχθη. Τριπλά τομές ανοσοχρωματίστηκαν χωρίς να αντιδρά πρωτογενές αντίσωμα ως αρνητικός έλεγχος για την επιβεβαίωση χρώση ειδικότητα.

Για να προσδιορισθούν τα επίπεδα έκφρασης LASP-1, τα πλακίδια αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα βαθμολόγησης IHC περιγράφηκε προηγουμένως [22], [23]. Οι εντάσεις χρώσης βαθμολογήθηκαν ως 1, αδύναμη? 2, μέτρια? και 3, ισχυρή. Το σκορ IHC υπολογίστηκε πολλαπλασιάζοντας το ποσοστό των θετικών κυττάρων του όγκου και την ένταση χρώσης. Θήκες με βαθμολογία άνω των 113,0 (+3 τυπική απόκλιση [SD] βαθμολογία για φυσιολογικό ιστό) ορίστηκαν ως LASP-1-θετικά. Ο ± 3 αποκοπής SD, που στατιστικά είναι μόλις 0,2% της μέτρησης και αναμένεται να πέσει έξω από αυτό το εύρος, χρησιμοποιήθηκε γιατί ήταν απίθανο να επηρεαστεί από ένα τυχαίο πειραματικό σφάλμα που παράγεται από το χειρισμό του δείγματος [24]. Δύο ανεξάρτητες παθολόγους που δεν είχαν καμία γνώση της κλινικής κατάστασης των ασθενών γίνονται αυτές τις αποφάσεις.

Η επιμόλυνση με shRNA πλασμίδιο

Οι κυτταρικές σειρές OSCC, HSC-3 και Ca9-22, με υψηλότερη LASP- έκφραση 1 πρωτεΐνης επιμολύνθηκαν σταθερώς με το LASP-1 shRNA (shLASP-1) ή τον έλεγχο shRNA (shMock) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη LTX και Plus Αντιδραστήρια (Invitrogen). Επιμολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν σε μέσο που περιείχε 1 μg /ml πουρομυκίνη (Invitrogen).

Αναλύσεις Cellular διάδοσης

Για να προσδιοριστεί η επίδραση LASP-1 νοκ ντάουν στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, shLASP-1- και shMock- επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο, επεξεργασία με θρυψίνη, και μετρήθηκαν εις τριπλούν κάθε ημέρα για 7 ημέρες χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο.

Ανάλυση κυτταρικού κύκλου

Επτά ημέρες μετά την ίδρυση της LASP-1 νοκ ντάουν κύτταρα, τη διανομή του κυτταρικού κύκλου ελέγχθηκε. Για το συγχρονισμό των κυττάρων στο G2 /M μετάπτωσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 200 ng /ml nocodazole (Sigma) για 20 ώρες [25]. Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν, ξεπλύθηκαν με PBS, και ανιχνεύθηκαν με κιτ αντιδραστηρίου DNA CycleTEST Plus (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά από φυγοκέντρηση στα 400 χ g για 5 λεπτά, προστέθηκαν 250 μικρολίτρα του διαλύματος Α (ρυθμιστικό θρυψίνη) και το μίγμα επωάστηκε για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Διακόσια μικρολίτρα διαλύματος Β (αναστολέα της θρυψίνης και RNase σε ένα ρυθμιστικό) κατόπιν προστέθηκε και το μίγμα επωάστηκε για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, προστέθηκαν 200 μικρολίτρα του διαλύματος C (προπίδιο διάλυμα ιωδιούχου λεκέ), και το μίγμα επωάστηκε στο σκοτάδι για 10 λεπτά επί πάγου. Προσδιορισμός με κυτταρομετρία ροής του περιεχομένου DNA αναλύθηκε με τη χρήση του Accuri C6 Κυτταρόμετρο Ροής (Becton-Dickinson). κατανομές κυτταρικού κύκλου ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας FCS Express 4 (de novo Software, Los Angeles, CA, USA). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

In vivo

Ανάπτυξης Όγκου Δοκιμασία

Για την αξιολόγηση της ανάπτυξης του καρκίνου

in vivo

, 2 × 10

7 shLASP-1- και shMock-επιμολυσμένα κύτταρα ανεξάρτητα εγχύθηκαν υποδορίως στη ράχη θηλυκών γυμνών ποντικών, BALB /c-nu, αγοράστηκε από την Oriental Yeast Co. (Tokyo, Japan). Όλα τα πειραματόζωα υποβλήθηκαν σε θεραπεία και φροντίδα σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος. Οι όγκοι μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας καλίμπρες κάθε 3 έως 4 ημέρες μετά την φτάσει σε ένα όγκο 100 mm

3. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο 4π /3 × (πλάτος /2)

2 χ (μήκος /2). Οι ποντικοί θανατώθηκαν μετά από 28 ημέρες. ιστοί όγκου μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη, και τομές παραφίνης (4 μm) παρασκευάστηκαν για ανοσοϊστοχημεία της LASP-1 και αιματοξυλίνη και εοσίνη (Η &? Ε). χρώσης

Στατιστική Ανάλυση

Στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher ή το Mann-Whitney U.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Bonferroni διόρθωση χρησιμοποιήθηκε για πολλαπλές δοκιμές. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM).

Αποτελέσματα

Αξιολόγηση των LASP-1 Έκφραση σε OSCC κυτταρικές σειρές προερχόμενες

Για να αναλύσουμε η κατάσταση έκφρασης του

LASP-1

, εκτελέσαμε qRT-PCR και ανοσοστύπωμα αναλύσεις χρησιμοποιώντας επτά OSCC προερχόμενων κυτταρικών σειρών (HSC-3, HSC-4, ΚΩΝ, ΗΟ-1-υ-1, ΗΟ- 1-Ν-1, Ca9-22, και Sa3) και HNOKs.

LASP-1

mRNA ήταν σημαντικά (

P

& lt? 0.007) πάνω ρυθμισμένα σε όλες τις κυτταρικές σειρές OSCC σε σύγκριση με εκείνη των HNOKs (Εικόνα 1Α). Η Εικόνα 1Β δείχνει αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα της ανοσοκηλιδώσεως αναλύσεων. Μια σημαντική αύξηση στην έκφραση πρωτεΐνης LASP-1 παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές OSCC προερχόμενου σύγκριση με τα HNOKs. Η ανάλυση έκφρασης έδειξαν ότι και οι δύο μεταγραφή και μετάφραση των προϊόντων LASP-1 εκφράζεται υψηλά σε OSCC προερχόμενων κυτταρικών σειρών.

(Α) Ποσοτικοποίηση των

έκφραση

mRNA LASP-1 σε OSCC προερχόμενο κύτταρο γραμμές με ανάλυση qRT-PCR. τα επίπεδα έκφρασης του mRNA κανονικοποιούνται σε GAPDH. Σημαντικές πάνω ρύθμιση του

LASP-1

mRNA παρατηρείται σε επτά OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται σε σύγκριση με εκείνη σε HNOKs. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± SEM των αποτελεσμάτων τριπλούν (*

P

& lt? 0,007? Mann-Whitney U test με διόρθωση Bonferroni). (Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των πρωτεϊνών LASP-1 στα OSCC προερχόμενων κυτταρικών σειρών και HNOKs. έκφραση πρωτεΐνης LASP-1 ρυθμίζεται προς τα πάνω στις OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται σε σύγκριση με εκείνη στα HNOKs. Η πυκνομετρική δεδομένα πρωτεΐνη LASP-1 κανονικοποιούνται τα επίπεδα πρωτεΐνης GAPDH. Οι τιμές εκφράζονται ως ποσοστό των HNOKs.

Η

Αξιολόγηση των LASP-1 Έκφραση στην Πρωτοβάθμια OSCCs

Για να μάθετε την κατάσταση έκφρασης του LASP-1 στην πρωτοβάθμια OSCCs και της σχέσεις με τις κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά, μελετήσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης LASP-1 στην πρωτοβάθμια OSCCs και σε συνδυασμό κανονική προφορική ιστών από 50 ασθενείς που χρησιμοποιούν το σύστημα βαθμολόγησης IHC. Ισχυρή LASP-1 ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε στο κυτταρόπλασμα του OSCCs, ενώ οι φυσιολογικοί ιστοί έδειξαν αρνητική ανοσοχρώση (Σχήμα 2Β, C). Οι LASP-1 IHC βαθμολογίες εκυμαίνοντο μεταξύ 43 και 265 σε OSCCs (διάμεσος, 178) και 2,5 97 σε φυσιολογικούς ιστούς του στόματος (διάμεσος, 35). IHC βαθμολογίες στην πρωτοβάθμια OSCCs ήταν σημαντικά (

P

& lt? 0,05) υψηλότερες από αυτές των κανονικών ιστών του στόματος (Εικόνα 2Α)

(α) την κατάσταση της πρωτεϊνικής έκφρασης LASP-1. πρωτογενή OSCCs (n = 50) και τα φυσιολογικά αντίστοιχα βασίζεται σε ένα σύστημα βαθμολόγησης IHC. Τα IHC βαθμολογίες υπολογίζονται ως εξής: βαθμολογίας IHC = 1 × (τον αριθμό των ασθενώς χρωματισμένο κυττάρων στον τομέα) + 2 × (αριθμός μέτρια χρώση κυττάρων στον τομέα) + 3 × (τον αριθμό των έντονα χρωματισμένο κυττάρων στο πεδίο). Οι βαθμολογίες LASP-1 IHC για την κανονική στοματική ιστούς και OSCCs κυμαίνονται από 2,5 να 97 (διάμεσος, 35) και 43 έως 265 (διάμεσος, 178), αντίστοιχα. επίπεδα έκφρασης LASP-1 πρωτεΐνης σε OSCCs είναι σημαντικά υψηλότερο από ό, τι στην κανονική στοματική ιστούς (*

P

& lt? 0,001? Mann-Whitney τεστ U). αποτελέσματα (B, C) Αντιπρόσωπος IHC του LASP-1 σε φυσιολογικούς ιστούς του στόματος και της πρωτογενούς OSCCs. Αρχική μεγέθυνση, × 100. Ράβδοι κλίμακας, 5 μm. LASP-1 είναι εξαιρετικά υπερεκφράζεται σε OSCCs σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς του στόματος.

Η

Ο Πίνακας 1 δείχνει τις συσχετίσεις μεταξύ των κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών με OSCC και την κατάσταση της πρωτεϊνικής έκφρασης LASP-1 χρησιμοποιώντας το σκορ IHC σύστημα. Μεταξύ των κλινικών ταξινομήσεις, οι LASP-1 θετικά OSCCs συσχετίστηκαν σημαντικά (

P =

0.02) με το μέγεθος του όγκου. Επιπλέον, μια σημαντική (

P =

0.04) βρέθηκε διαφορά στα επίπεδα έκφρασης LASP-1 μεταξύ της ομάδας Τ1 /Τ2 και Τ3 της ομάδας /T4, υποδεικνύοντας επίπεδα έκφρασης LASP-1 είναι υψηλότερα σε προχωρημένα στάδια σε σύγκριση με πρώιμα στάδια. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές σχέσεις βρέθηκαν στην ηλικία, το φύλο, Ν-περιφερειακών λεμφαδένων, ιστοπαθολογικές τύπο, και θέση του όγκου.

Η

Ίδρυση LASP-1 Νοκ ντάουν κύτταρα

Για να μελετηθεί η πιθανή λειτουργία του LASP-1 σε OSCCs, τα OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται, HSC-3 και Ca9-22, επιμολύνθηκαν με LASP-1 shRNA και τον έλεγχο shRNA (shMock). Τα επίπεδα έκφρασης του

LASP-1

mRNA και πρωτεΐνης σε shLASP-1-επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν σημαντική (

P

& lt? 0.025) μειώνονται σε σύγκριση με τις shMock-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 3Α, Β .)

(Α) Έκφραση

LASP-1

mRNA σε shMock- και shLASP-1-επιμολυσμένα κύτταρα (HSC-3- και Ca9-22 που προέρχονται από επιμολύνσεις? 2 κλώνους το καθένα) . Η

LASP-1

mRNA έκφραση στο shLASP-1 είναι σημαντικά (*

P

& lt? 0,025? Mann-Whitney U test με διόρθωση Bonferroni) χαμηλότερο από ότι στις shMock-επιμολυσμένα κύτταρα . (Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των πρωτεϊνών LASP-1 στα shMock- και shLASP-1-επιμολυσμένα κύτταρα (HSC-3- και Ca9-22 προερχόμενο μορφομετατροπείς? 2 κλώνοι καθένα). Η πρωτεΐνη LASP-1 στα shLASP-1 επιμολυσμένων κυττάρων είναι εξαντλημένο σημαντικά σε σύγκριση με τις shMock-επιμολυσμένα κύτταρα.

Η

Μειωμένη κυτταρική ανάπτυξη σε LASP-1 Knockdown Cells

Για να μελετηθεί η αντίκτυπος των LASP-1 επί κυτταρικού πολλαπλασιασμού ικανότητα, παρακολουθήσαμε την κυτταρική ανάπτυξη σε shLASP-1-μορφομετατραπέντα κύτταρα για επτά συνεχείς ημέρες. Τόσο HSC-3 και Ca9-22 shLASP-1-μορφομετατραπέντα κύτταρα είχαν σημαντική (

P

& lt? 0.025). Μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη σε σύγκριση με τις shMock-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 4)

για να προσδιοριστεί η επίδραση της shLASP-1 επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, shLASP-1- και shMock-επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 βιώσιμα κύτταρα /φρεάτιο. Η shLASP-1 επιμολυσμένα HSC-3 και τα κύτταρα Ca9-22 έχουν σημαντική (*

P

& lt? 0,025? Mann-Whitney U test με διόρθωση Bonferroni) μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη σε σύγκριση με τις shMock-επιμολυσμένα κύτταρα.

η

Νοκ ντάουν της LASP-1 επάγει G2 φάση συσσώρευσης

για να διερευνήσει το μηχανισμό με τον οποίο τα κάτω-ρυθμίζονται LASP-1 σχετίζεται με την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, τότε να διερευνηθεί το κύτταρο- διανομές κύκλος shLASP-1-μορφομετατραπέντα κύτταρα χρησιμοποιώντας ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS). Η αναλογία των κυττάρων στη φάση G2 στις shLASP-1-μορφομετατραπέντα κύτταρα ήταν σημαντικά (

P

& lt? 0.025) υψηλότερο από ότι σε shMock-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 5Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα (Σχήμα S1, S2), υποδηλώνοντας ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του LASP-1 ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, η οποία επάγεται G2 σύλληψης.

(Α) κυτταρομετρίας ροής προσδιορισμό της περιεκτικότητας DNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρητή ροής Accuri C6. shLASP-1-επιμολυσμένα HSC-3 και Ca9-22 κύτταρα δείχνουν σημαντική (*

P

& lt? 0,025? Mann-Whitney U test με διόρθωση Bonferroni) συσσώρευση φάση G2 σε αντίθεση με τις shMock-επιμολυσμένα κύτταρα. (Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης δείχνει προς τα κάτω ρύθμιση της κυκλίνης Α και κυκλίνη Β και up-ρύθμιση του φωσφο-cdc2 στα κύτταρα νοκ ντάουν.

Η

Για να προσδιορίσετε το μηχανισμό με τον οποίο ρυθμίζεται προς τα κάτω μπλοκ LASP-1 G2 /M μετάπτωσης, αξιολογήσαμε το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης της κυκλίνης Α, κυκλίνη Β, ή φωσφο-cdc2 (Tyr15). Οι εκφράσεις πρωτεΐνη κυκλίνης Α και κυκλίνη Β ρυθμίζεται προς τα κάτω ενώ φωσφο-cdc2 (Tyr 15) ήταν ρυθμισμένη (Σχήμα 5Β), υποδεικνύει την σύλληψη του G2 /M φάση στα shLASP-1 επιμολυσμένων κυττάρων.

LASP-1 Προώθησε την ανάπτυξη όγκων

in vivo

η

για να ορίσετε το αποτέλεσμα της LASP-1 στην ανάπτυξη του καρκίνου

in vivo

, shLASP-1- και shMock- επιμολυσμένα κύτταρα των κυτταρικών γραμμών HSC-3 και Ca9-22 ενέθηκαν υποδορίως στη ράχη θηλυκών γυμνών ποντικών, αντίστοιχα (3 ποντίκια σε κάθε ομάδα). Συνεπής με

in vitro

ευρήματά μας, ο μέσος όγκος του όγκου των κυττάρων shLASP-1 ήταν σημαντικά (

P

& lt? 0,05) μικρότερο σε σύγκριση με τα shMock-επιμολυσμένα κύτταρα. Η &? Χρώση Ε επιβεβαίωσε την παρουσία των κυττάρων όγκου σε όλες τις ομάδες και LASP-1 ανοσοϊστοχημεία τμημάτων όγκου καταδεικνύεται LASP-1 knockdown έχει διατηρηθεί

in vivo

(Σχήμα 6). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι LASP-1 προάγει την ανάπτυξη του όγκου σε γυμνά ποντίκια.

shLASP-1- και shMock-επιμολυσμένα κύτταρα (HSC-3 και Ca9-22) εγχύθηκαν υποδορίως στη ράχη θηλυκών γυμνών ποντικών (η = 3). Η ανάπτυξη του όγκου του shLASP-1-εγχυθεί ποντικούς είναι σημαντικά (*

P

& lt? 0,05? Mann-Whitney U test) ανέστειλαν σε σύγκριση με τα shMock-ενεμένους ποντικούς. Ανοσοϊστοχημεία αποδεικνύεται σαφώς μειωμένη ανοσοχρώση για LASP-1 στα shLASP-1 που προέρχεται από όγκους από shMock ενεμένους ποντικούς. Η &? Χρώση Ε επιβεβαίωσε την παρουσία των καρκινικών κυττάρων. Αρχική μεγέθυνση, × 200.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε ένα υψηλό επιπολασμό της αυξημένης έκφρασης LASP-1 σε ασθενείς με OSCC και μια σημαντική συσχέτιση με τον πρωτογενή όγκο μεγέθους (Πίνακας 1). Επιπλέον, νοκ ντάουν της LASP-1 σε OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται ως αποτέλεσμα τη δραματική επίδραση στην αναστολή της ανάπτυξης

in vitro

και

in vivo

μέσω σύλληψη του G2 /M φάση. Τα τρέχοντα δεδομένα παρέχεται μία νέα εικόνα του ρόλου του παρεκκλίνουσα λειτουργία LASP-1 ως ένα ογκογόνο διαδικασία σε αυτή την ασθένεια.

Ένα σημαντικό αυξητική ρύθμιση του LASP-1 ανιχνεύθηκε σε όλα τα OSCC προερχόμενα κύτταρα εξετάζονται σε πρωτεΐνη επίπεδα (Εικόνα 1Β), υποδεικνύοντας ότι LASP-1 έκφραση είναι απαραίτητη για στοματική καρκινογένεση. Από την άλλη πλευρά, τα κράτη έκφραση mRNA εξαρτάται από τα κύτταρα (Σχήμα 1Α). Μια πιθανή εξήγηση γι ‘αυτή την ασυμφωνία είναι ότι οι πρωτεΐνες LASP-1 επηρεάζονται διαφορετικά από την μετα-μεταφραστική ουβικιτινίωση και πρωτεόλυσης σε κάθε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Σε αυτό το πλαίσιο, οι διαφορές μεταξύ

LASP-1

επίπεδα έκφρασης του mRNA και επίπεδα πρωτεΐνης έχει αναφερθεί σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές γραμμές [14].

FACS ανάλυση έδειξε ότι LASP-1 είναι ειδικά δραστηριοποιείται στην η φάση G2 /M σε κύτταρα OSCC (Σχήμα 5Α). Το G2 /M σημείο ελέγχου είναι απαραίτητη για το κύτταρο για να επισκευάσει βλάβη του DNA πριν από μιτωτική είσοδο. Όταν το DNA έχει υποστεί ζημιά, cdc2, ένας σημαντικός ρυθμιστής της προόδου του κυτταρικού, αδρανοποιείται μέσω της αύξησης υπολειμμάτων φωσφορυλίωση Tyr 15, προκαλώντας τα κύτταρα να συλλάβουν στη φάση G2 [26]. Κυκλίνη Α και κυκλίνη Β είναι άλλα κρίσιμα ρυθμιστές της προόδου του κυτταρικού κύκλου. Η κυκλίνη Α συνδέεται με cdk2 και cdc2 και απαιτείται κατά την έναρξη της φάσης S και G2 /M μετάπτωσης [27], [28]. Εν τω μεταξύ, η κυκλίνη Β συνδέεται με cdc2 και ρυθμίζει μιτωτική εισόδου και εξόδου [29]. Τα επίπεδα έκφρασης του κυκλίνη Α και κυκλίνη Β είναι συχνά πάνω ρυθμισμένα σε μία ποικιλία όγκων [30], [31]. Η εξάντληση των κυκλίνη Α και κυκλίνη Β οδηγεί σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε G2 [32], [33]. Κατά τη φάση G2, το σύμπλοκο κυκλίνης B /cdc2 αδρανοποιείται με φωσφορυλίωση επί Try15 και Thr14 της cdc2 από τις Wee 1 και Myt 1 κινάσες [34], [35]. Κατά την έναρξη της μίτωσης, cdc25C φωσφατάση ενεργοποιεί cdc2 με την αφαίρεση φωσφορικών αλάτων σε Thr 14 και Προσπαθήστε 15 [36], [37] και αποτρέπει το συγκρότημα κυκλίνης Β1 /cdc2 από το να αδρανοποιηθεί και πάλι [38].

Με βάση την οι παρατηρήσεις αυτές, εμείς επόμενο προσδιορίζεται το καθεστώς έκφραση των σχετικών γονιδίων που αναφέρθηκαν προηγουμένως. Όπως ήταν αναμενόμενο, ενώ η κυκλίνη Α και Β ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω, ανιχνεύσαμε τα πάνω ρύθμιση του phoshpo-cdc2 στα κύτταρα knockdown LASP-1. Αυτό ήταν σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες που υπονοείται LASP-1 είναι υπεύθυνη για κυτταρικό πολλαπλασιασμό λόγω διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G2 φάση σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών [11], [13].

Εν κατακλείδι, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι LASP-1 μπορεί να συνδέεται με την εξέλιξη του όγκου, με την προώθηση της προόδου του κυτταρικού κύκλου στην G2 φάση. Είναι αξιοσημείωτο ότι

in vivo

δεδομένα μας έδειξαν δραματική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου από LASP-1 σίγησης, υποδηλώνοντας ότι αυτό το μόριο μπορεί να είναι ένα χρήσιμο βιοδείκτη του πολλαπλασιασμού και μια πιθανή θεραπευτικός στόχος για την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων στην ανθρώπινη OSCCs επειδή οι περισσότεροι από τους ασθενείς μας με OSCC έχουν υπερεκφράζεται LASP-1 πρωτεΐνη (Πίνακας 1).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

FACS ανάλυση των shMock- και shLASP-1-επιμολυσμένα HSC-3 κύτταρα. Το ποσοστό της G2 /M φάση σε shLASP-1-επιμολυσμένα HSC-3 κύτταρα ήταν υψηλότερη από ό, τι σε shMock-επιμολυσμένα κύτταρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083187.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

FACS ανάλυση των shMock- και shLASP-1-επιμολυσμένα κύτταρα Ca9-22. Το ποσοστό της G2 φάσης /Μ στο shLASP-1-επιμολυσμένα κύτταρα Ca9-22 ήταν υψηλότερη από ό, τι σε shMock-επιμολυσμένα κύτταρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083187.s002

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε κα Lynda Γ Charters για την επεξεργασία αυτού του χειρογράφου.