Αφηρημένο

Ιστορικό

Γονιδιωματική διαγραφή στο ογκοκατασταλτικό τόπους είναι μια κοινή γενετική ανωμαλία σε ανθρώπινους καρκίνους. Στόχος της μελέτης ήταν να διερευνήσει γονίδια καταστολής υποψηφίου όγκου στο χρωμόσωμα 4q25-q28.2 και να οριοθετηθούν τα νέα προγνωστικούς βιοδείκτες που σχετίζονται με καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC).

Μέθοδοι

χαρτογράφηση διαγραφή του χρωμοσώματος 4q25-Ε28 .2 διεξήχθη σε 114 σποραδικές CRC από την απώλεια της μελέτης ετεροζυγωτίας με 11 δείκτες μικροδορυφόρων. Ένα νέο γονίδιο καταστολής όγκων υποψήφιο, δηλαδή

NDST4

, εντοπίστηκε στο 4q26. Γονιδιακή έκφραση

NDST4

διερευνήθηκε σε 52 ζεύγη των πρωτογενών ιστών CRC με αλυσιδωτή μεταγραφή-αντίδραση πολυμεράσης ποσοτική αντίστροφη. Αλληλόμορφη απώλεια

NDST4

γονίδιο περαιτέρω προσδιορίζεται σε 174 ορθοκολικό καρκίνωμα από την απώλεια της ανάλυσης ετεροζυγωτίας, και στη συνέχεια αξιολογήθηκε για κλινική σημασία.

Αποτελέσματα

Μια ελάχιστη περιοχή διαγραφή ήταν οριοθετείται μεταξύ D4S2297 και D4S2303 τόπους στο 4q26, όπου

NDST4

ήταν το μόνο γονίδιο που είχε αισθητά έχουν μειωτικά σε όγκους CRC. Με σύλληψη λέιζερ μικροδιατομής,

NDST4

έκφραση RNA αποδείχθηκε σε επιθηλιακά κύτταρα του κόλου, αλλά ήταν μη ανιχνεύσιμη σε κύτταρα όγκου. Συνολικά, 30 (57,7%) του 52 ορθοκολικά καρκινώματα παρουσίασαν δραματική μείωση του

NDST4

γονιδιακής έκφρασης σε σύγκριση με την κανονική συμφωνημένα βλεννογόνων. Η γενετική απώλεια

NDST4

συσχετίστηκε σημαντικά με προχωρημένο παθολογικό στάδιο (

P =

0,039) και των φτωχότερων συνολική επιβίωση των ασθενών (

P =

0.036).

Συμπεράσματα

NDST4

γονίδιο είναι ένα νέο γονίδιο καταστολέα υποψήφιος του όγκου στον καρκίνο του ανθρώπου, και η απώλεια της λειτουργίας του ενδέχεται να εμπλέκονται στην εξέλιξη της CRC. Επιπλέον, η απώλεια της δοκιμασίας ετεροζυγωτίας, η οποία ιδρύθηκε για να προσδιοριστεί η απώλεια αλληλομόρφων του

NDST4

γονίδιο, θα μπορούσε να είναι ένα αποδοτικό εργαλείο για την παροχή χρήσιμων βιοδεικτών δυσμενών πρόγνωση CRC.

Παράθεση: Tzeng ST, Tsai ΜΗ, Chen CL, Lee JX, Jao TM, Yu SL, et al. (2013)

NDST4

είναι μια νέα υποψήφια ογκοκατασταλτικό γονίδιο στο χρωμόσωμα 4q26 και Γενετικής Απώλεια του Προβλέπει κακή πρόγνωση στον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (6): e67040. doi: 10.1371 /journal.pone.0067040

Επιμέλεια: Ludmila Prokunina-Olsson, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 Ιαν 2013? Αποδεκτές: 13η Μαΐου 2013? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 Tzeng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, Εκτελεστικό Yuan (NSC99-2320-B-002-020-my3), το Cardinal Tien Νοσοκομείο (CTH-93-1-2A01), και το Εθνικό Δίκτυο Έρευνας Υγείας Ινστιτούτα (NHRI-EX101 -10136BI), Ταϊβάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC) είναι μία από τις πιο κοινές αιτίες των θανάτων από καρκίνο παγκοσμίως, και οι περισσότεροι όγκοι προκύπτουν σποραδικά από έναν συνδυασμό διακριτών μεταλλάξεων και χρωμοσωμικών ανωμαλιών [1] – [3]. Παρά τις επιθετικές ενέργειες συμπληρώνονται με διάφορες επικουρικές θεραπείες και αυξημένη κατανόηση των γενετικών μηχανισμών που διέπουν αυτή τη διαταραχή, υπήρξε μικρή βελτίωση στην επιβίωση των ασθενών με διηθητικό CRC [4], [5]. Αν και ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά και σταδιοποίηση κατά τη στιγμή της παρουσίασης παραμένουν οι πιο σημαντικές προγνωστικούς δείκτες, πολλοί ασθενείς με παρόμοια παθολογικά χαρακτηριστικά εμφανίζουν σημαντικά διαφορετικές κλινικές εκβάσεις [6]. Επομένως, η εφαρμογή των ευαίσθητων γενετική ανάλυση μπορεί να είναι χρήσιμη για τον εντοπισμό ασθενών υψηλού κινδύνου και στη συνέχεια στρωματώσεως του σχεδιασμού της επικουρικής θεραπείας. Επιπλέον, μια βελτιωμένη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ογκογένεση του παχέος εντέρου μπορεί να παρέχει νέες βιοδείκτες για τους πιθανούς στόχους της θεραπευτικής παρέμβασης και προγνωστικούς δείκτες για τη χειρουργική επέμβαση [7].

χρωμοσωμική αστάθεια είναι η πιο κοινή γενετική ανωμαλία στο σποραδικές CRC [8], [9]. Σημαντικές μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι οι αλληλόμορφες απώλειες σε πολλές περιοχές του χρωμοσώματος 4 που συνδέονται με την εξέλιξη στάδιο, μετάσταση όγκου, και μικρότερες επιβίωση σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους, υποδεικνύοντας την παρουσία ενός ή περισσοτέρων ογκοκατασταλτικό γονίδιο (TSG) loci [10] – [15 ]. Ωστόσο, έχουν λίγες ΕΠΙΠ στο χρωμόσωμα 4 εμπλέκονται στην παθογένεια CRC έχουν εντοπιστεί. Πραγματοποιήσαμε πρόσφατα χαρτογράφηση διαγραφή του χρωμοσώματος 4 από την απώλεια της ετεροζυγωτίας μελέτης (ΑΕ), και προσδιόρισε τον τόπο D4S402 στο 4q27 που παρουσίασαν την υψηλότερη αλληλική συχνότητα απώλεια 32,5% σε 106 σποραδικές CRC (αδημοσίευτα στοιχεία μας). Στην παρούσα μελέτη, έχουμε ως στόχο να διερευνήσει CRC που σχετίζονται με ΕΠΠΕ στην παρακείμενη περιοχή του D4S402. Δύο προσεγγίσεις έγιναν: (1) πρόστιμο χαρτογράφηση διαγραφή στο χρωμόσωμα 4q25-q28.2 για την οριοθέτηση της περιοχής που φιλοξενούν ΕΠΠΕ, και (2) τις αναλύσεις των μεταβολών (έκφραση γονιδίων και αλληλομόρφων διαγραφή) των υποψηφίων ΕΠΠΕ σε πρωτογενείς όγκους CRC. Επιπλέον, η γενετική απώλεια της υποψήφιας TSG αξιολογήθηκε για κλινική σημασία.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα ιστών

Ένα σύνολο 174 ασθενών με σποραδική CRC, ο οποίος υποβλήθηκε σε χειρουργική επέμβαση στο Cardinal Tien Νοσοκομείο, την Ταϊβάν, προσλήφθηκαν μεταξύ Αυγούστου 1997 και Δεκεμβρίου 2008 (Πίνακας 1). Ακολουθήστε-ups διεξήχθησαν μέχρι τον Απρίλιο του 2010. λειτούργησαν Όλα τα 174 ασθενείς για ιστολογικά επαληθεύεται ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα χωρίς προεγχειρητική χημειοθεραπεία ή /και ακτινοθεραπεία. Τόσο ζεύγη όγκου και παρακείμενα φυσιολογικά δείγματα βλεννογόνου συλλέχθηκαν από κάθε ασθενή κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης. Επιπλέον, αδενωματώδεις ιστούς πολύποδα συλλέχθηκαν από 57 ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε κολονοσκοπική πολύποδα. Όλα τα δείγματα ιστού καταψύχθηκαν αμέσως μετά την εκτομή και αποθηκεύτηκε σε υγρό άζωτο μέχρι την εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων. Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση και η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με την Διακήρυξη του Ελσίνκι και έχουν εγκριθεί από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του καρδινάλιου Tien Νοσοκομείο, Ταϊβάν.

Η

ΑΕ Ανάλυση

DNA εκχυλίστηκε από κατεψυγμένους ιστούς με τη χρήση του QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). Για λεπτή χαρτογράφηση διαγραφής του χρωμοσώματος 4q25-q28.2 (12,9 cm), μελέτη LOH με ένα πάνελ 11 μικροδορυφόρων διεξήχθη σε 114 ζεύγη DNA ιστού CRC (Σχήμα 1Α και Πίνακας 2). Να καθορίσει περαιτέρω την απώλεια αλληλομόρφων του

NDST4

γονίδιο, μελέτη ΑΕ με δύο δείκτες, MS5850 (UniSTS: 536617) και D4S1580, διεξήχθη σε 174 περιπτώσεις CRC (Εικόνα 1Α και Πίνακας 2). Σε κάθε ζεύγος εκκινητή, ο πρόσθιος εκκινητής συντέθηκε με 6-FAM, VIC ή την ετικέτα φθορισμού NED ανάλογα με το μέγεθος αμπλικονίου. PCR ενίσχυση πραγματοποιήθηκε σε έναν τελικό όγκο 6 μΙ με τη χρήση 20 ng του DNA, 500 ηΜ του καθενός από τους αντίστοιχους εκκινητές, 200 μΜ από κάθε dNTP, και 0,3 μονάδες AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems). PCR διεξήχθη υπό τις ακόλουθες συνθήκες κύκλων: ένα προ-PCR στάδιο επώασης στους 95 ° C για 15 λεπτά? που ακολουθείται από 35 κύκλους των 95 ° C για 15 s, 55 ° C για 45 s, και 72 ° C για 30 s? και μια τελική επέκταση 72 ° C για 10 λεπτά. Τα ενισχυμένα θραύσματα διαχωρίστηκαν σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου μετουσίωσης 6% σε ΑΒΙ Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), όπως περιγράφεται στις οδηγίες του κατασκευαστή. Φυσιολογικών και καρκινικών ζεύγη DNA συγκρίθηκαν για τις αλλαγές στον αριθμό των κορυφών αλληλόμορφο και το ύψος της κορυφής του κάθε δείκτη με τη χρήση του λογισμικού GeneScan Analysis (Applied Biosystems). Ο δείκτης LOH κάθε κανονικό και DNA του όγκου ζεύγος υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, ο λόγος των υψών των κορυφών αλληλόμορφο υπολογίζεται για κάθε δείγμα όγκου διαιρέθηκε με την αναλογία ύψους κορυφής αλληλόμορφο του κανονικού ελέγχου που να ταιριάζουν. Ένας δείκτης ΑΕ της ≤0.67 ή ≥1.5, που αντιπροσωπεύει τουλάχιστον μια μείωση 33% του αλληλόμορφου όγκου, ήταν ενδεικτική των αλληλομόρφων απώλεια.

Α. δείκτες μικροδορυφόρων που χρησιμοποιούνται για την απώλεια της μελέτης ετεροζυγωτίας. Τα τρία γονίδια που βρίσκεται στην ελάχιστη περιοχή που οριοθετείται από τη διαγραφή D4S2297 και D4S2303. Μαύρες μπάρες δείχνουν

UGT8

και

NDST4

γονίδια.

miR-577

(

MIR577

) βρίσκεται στο ιντρόνιο του

UGT8

. B. Ανάλυση του

UGT8

και

NDST4

mRNAs σε όγκους (Τ) και να συνδυαστούν κανονική βλεννογόνων (Ν) των ιστών CRC με RT-PCR.

β-ακτίνης

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος RNA. Γ Ανάλυση του

miR-577

έκφραση σε ιστούς CRC από qRT-PCR. Τα επίπεδα έκφρασης των όγκων κανονικοποιήθηκαν με εκείνα του αντίστοιχου κανονικού βλεννογόνου. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD.

Η

RNA Extraction

Το συνολικό RNA εξήχθη από τους κατεψυγμένους ιστούς και 10 κυτταρικές σειρές CRC (ΟοΙο205, HCC2998, HCT116, HCT15, ΗΤ29 , KM12 και SW620 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου των ΗΠΑ? LoVo, SW48, SW480 και από τη Συλλογή Bioresource και Research Center, Ταϊβάν) χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση και η καθαρότητα του RNA προσδιορίστηκαν με ένα Nanodrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο (Thermo Scientific), και η ακεραιότητα του RNA επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης.

Αντίστροφη Μεταγραφή-Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Δέκα τυχαία επιλεγμένες περιπτώσεις CRC χρησιμοποιήθηκαν σε μια πιλοτική μελέτη για την έκφραση των γονιδίων. Συμπληρωματικό DNA (cDNA) μεταγράφηκε αντίστροφα από ολικό RNA (2 μg /20 μΙ αντίδρασης), χρησιμοποιώντας το High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Αντίστροφη μεταγραφή διεξήχθη υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 25 ° C για 10 λεπτά, 37 ° C για 2 ώρες, και 85 ° C για 5 λεπτά. Το προκύπτον cDNA αραιώθηκε 5-φορές με πυροανθρακικό διαιθύλιο (DEPC) κατεργασμένους H

2O. σύνολα εκκινητών Gene-ειδικά σχεδιασμένα εξόνια που εκτείνονται είχαν ως εξής:

NDST4

εμπρός 5′-TCTGGGAGTTACACCTCG-3 ‘και αντίστροφος 5′-TCTTGAGAGGCTTAGTTCTTG-3’?

UGT8

μπροστά 5′-TTATATTATTCGTCACAATGG-3 ‘και αντίστροφη 5′-AAAACTAAGGTCTGACACAGT-3’?

β-ακτίνης

μπροστά 5′-ACAGAGCCTCGCCTTTGC-3 ‘και αντίστροφη 5′-TCATCTTCTCGCGGTTGG -3’. PCR ενίσχυση διεξήχθη σε ένα τελικό όγκο 25 μι χρησιμοποιώντας 2,5 μL αραιωμένου cDNA, 1 μΜ εκάστου των αντίστοιχων εκκινητών, 250 μΜ από κάθε dNTP και 1 μονάδα του Super-Therm Gold DNA Polymerase (Bertec Enterprise). PCR διεξήχθη κάτω από τις ακόλουθες συνθήκες κύκλων: ένα προ-PCR στάδιο επώασης στους 95 ° C για 10 λεπτά? 36 (

NDST4

και

UGT8

) ή 28 (

β-ακτίνης

) κύκλοι των 95 ° C για 15 s, 55 ° C για 45 s, και 72 ° C για 45 s? ακολουθούμενη από μια τελική επέκταση 72 ° C για 3 λεπτά. Τα ενισχυμένα θραύσματα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.

Ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR)

Για την ποσοτικοποίηση του

NDST4

έκφραση RNA σε 52 ζεύγη πρωτογενούς CRC ιστοί και 57 πολύποδες, μια TaqMan Gene Expression Assay (Hs00224024_m1, Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε με ένα γονίδιο αναφοράς

ΤΒΡ

(πρωτεΐνη ΤΑΤΑ box-δέσμευσης, Hs00920497_m1) ως έλεγχος για την ποιότητα και την ποσότητα RNA. Το cDNA συνετέθη όπως αναφέρεται στην ενότητα RT-PCR. Ποσοτικά στοιχεία PCR συνελήφθησαν από ΑΒΙ PRISM 7000 Sequence Detection System και αναλύθηκαν από την ABI PRISM 7000 SDS Λογισμικού (Applied Biosystems). Το μίγμα της αντίδρασης που περιλαμβάνεται 5 μL του αραιωμένου cDNA, 1 μL από ένα μίγμα ανιχνευτή υδρόλυσης, 10 μL TaqMan Καθολικής Master Mix (Applied Biosystems), με την προσθήκη του επεξεργασμένου με DEPC H

2O σε ένα τελικό όγκο 20 μι . Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις διπλούν υπό τις ακόλουθες συνθήκες κύκλων: ένα στάδιο επώασης στους 50 ° C για 2 λεπτά? και ένα στάδιο ενεργοποίησης ενζύμου στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 45 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. Τα επίπεδα έκφρασης του

NDST4

σε όγκους, η κανονική βλεννογόνο και πολύποδες κανονικοποιήθηκαν στο άτομο γονίδιο αναφοράς,

ΤΒΡ

. Η αναλογία όγκου-προς-συμφωνημένα-κανονική-βλεννογόνο του

NDST4

έκφραση RNA υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο Ct, 2

-ΔΔCt [17]. Τα επίπεδα σχετική έκφραση

NDST4

στις κυτταρικές γραμμές CRC συγκρίθηκαν με μέση έκφραση του 52 κανονικής βλεννογόνου, η οποία προσαρμόστηκε σε 1.

microRNA 577 Ανάλυση έκφρασης

Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των

microRNA 577

(

miR-577

) έκφραση σε 10 ζεύγη τυχαία επιλεγμένων πρωτογενών ιστών CRC, μικρά RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας την mirVana ™ miRNA κιτ απομόνωσης (Ambion) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα πρότυπα cDNA παρασκευάστηκαν από ολικό RNA χρησιμοποιώντας το TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), η οποία χρησιμοποιεί αντίστροφη εκκινητές stem-loop. Εν συντομία, 10 ng ολικού RNA αναμίχθηκαν με 0,8 μΙ των εκκινητών stem-loop RT, 0.15 μί 100 mM dNTP, 1.5 μλ ρυθμιστικό 10 × RT, 0,2 μί αναστολέα RNase (20 U /μL), και 1.0 μι MultiScribe αντίστροφης μεταγραφάσης (50 U /μL). Το μίγμα (τελικός όγκος 15 μL) επωάστηκε στους 16 ° C για 30 λεπτά, 42 ° C για 30 λεπτά, 85 ° C για 5 λεπτά, και κατόπιν διατηρήθηκε στους 4 ° C. Μετά RT, τα προϊόντα cDNA, εκτός από τα εναύσματα TaqMan και ανιχνευτές, αναμίχθηκαν με τα άλλα αντιδραστήρια PCR στην PCR καθολική Κύριο Μείγμα Kit (Applied Biosystems), και qPCR διεξήχθη εις τριπλούν στην ΑΒΙ PRISM 7000 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας. Οι συνθήκες PCR που περιλαμβάνονται αρχική επώαση στους 50 ° C για 2 λεπτά και μετουσίωσης στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για

miR-577

(κωδικός 4408995) και

RNU6B

(RNA, U6 μικρών πυρηνικών 2, 4373381) αγοράστηκαν από την Applied Biosystems. Ως ενδογενής έλεγχος,

RNU6B

ενισχύθηκε, παράλληλα, και η τιμή Ct

miR-577

ομαλοποιήθηκε με εκείνη του

RNU6B

. Τα επίπεδα έκφρασης των όγκων συγκρίθηκαν με συμφωνημένα φυσιολογικό βλεννογόνο, τα οποία ρυθμίστηκαν σε 1.

Laser Capture μικροανατομίας

Για να επιβεβαιωθεί

NDST4

έκφραση RNA σε συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους του πρωτεύοντες ιστούς CRC, ορθοκολικό καρκίνωμα και επιθηλιακά κύτταρα από το συμφωνημένα φυσιολογικού βλεννογόνου συνελέγησαν από τις δύο περιπτώσεις CRC, καθώς και λεμφοειδή κύτταρα στο βλεννογόνο που σχετίζεται συλλέχθηκαν από την τρίτη κανονικό τμήμα ιστού. Κατεψυγμένα τμήματα καθηλώθηκαν και χρωματίστηκαν με τη χρήση του HistoGene LCM κατεψυγμένα Τμήμα χρώσης Kit (Arcturus Μηχανικών). Κύτταρα απομονώθηκαν από την εκτέλεση λέιζερ συλλαμβάνει μικροδιατομής με AutoPix Αυτοματοποιημένο Σύστημα Λέιζερ Capture μικροανατομίας (Arcturus Μηχανικών). Μετά την μικροδιατομής, τα κύτταρα σταματούν στο πώμα αμέσως επωάστηκαν με ρυθμιστικό εκχύλισης, και το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το PicoPure RNA κιτ απομόνωσης (Arcturus Engineering), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Στατιστική Ανάλυση

η σχέση μεταξύ της απώλειας των αλληλομόρφων

NDST4

γονιδίων και κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές αναλύθηκαν από τον φοιτητή του

t-test

(για την ηλικία), γραμμική-από-γραμμική συσχέτιση chi-square test ( για chi-square test Dukes ‘στάδια) ή Pearson (για άλλες κατηγορικές μεταβλητές). Ένα δύο όψεων

P

αξία των & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. χρόνος επιβίωσης θεωρήθηκε το διάστημα μεταξύ χειρουργική επέμβαση και την ημερομηνία της τελευταίας παρακολούθησης ή θανάτου της νόσου (συνολική επιβίωση, OS), ή την ημερομηνία της τελευταίας παρακολούθησης ή επανάληψης (ελεύθερη νόσου επιβίωση, DFS). Οι καμπύλες επιβίωσης, εκτιμάται με τη μέθοδο Kaplan-Meier, συγκρίθηκαν με τη δοκιμασία log-rank. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με την IBM SPSS® λογισμικό, έκδοση 17.0.

Αποτελέσματα

NDST4 Gene είναι υποψήφια ογκοκατασταλτικό γονίδιο στο χρωμόσωμα 4q26

Ένα σύνολο από 114 ζεύγη πρωτεύοντες ιστούς CRC χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η ελάχιστη περιοχή διαγραφή στο χρωμόσωμα 4q25-q28.2 χρησιμοποιώντας ανάλυση LOH. Πενήντα (43,9%) από τους 114 όγκους εμφάνισαν ΑΕ σε έναν ή περισσότερους δείκτες μικροδορυφόρων. Συχνές LOH, που ορίζεται ως εμφανιζόμενη σε περισσότερο από το 30% των πληροφοριακών όγκων, παρατηρήθηκε σε τέσσερις τόπους, συμπεριλαμβανομένων D4S2297, D4S2303, D4S402, D4S2394 και. Κατά συνέπεια, μία ελάχιστη περιοχή διαγραφής με μια γενετική μήκους 1,4 Mb στη συνέχεια οριοθετείται μεταξύ D4S2297 και D4S2303, που είχε εμπλακεί σε 80,0% (40/50) των όγκων με ΑΕ. Τα αποτελέσματα δείχνουν μια υψηλή συχνότητα του χρωμοσώματος 4q26 απώλεια σε ορθοκολικά καρκινώματα, και αποκαλύπτουν μία πιθανή θέση TSG εμπλέκονται στην ανάπτυξη CRC.

Με την αναζήτηση στο National Center for Biotechnology Information (NCBI) βάση δεδομένων, μόνο δύο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη

γονίδια,

UGT8

και

NDST4

, καθώς και ένα microRNA,

miR-577

, έδειξαν να βρίσκονται εντός της οριοθετημένης περιοχής ελάχιστη διαγραφή. Η έκφραση του

UGT8

,

NDST4

, και

miR-577

προβλήθηκε σε 10 ζεύγη τυχαία επιλεγμένα πρωτεύοντες ιστούς CRC με RT-PCR ή qRT-PCR (Εικόνα 1Β και 1Γ). Τα επίπεδα έκφρασης του

UGT8

και

miR-577

στις δοκιμάστηκαν όγκους ήταν συμβατά με γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνοι τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το

NDST4

έκφραση γονιδίου προφανώς μειώθηκε σε έξι από 10 όγκων. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το

NDST4

μπορούσε να είναι μια νέα TSG που βρίσκεται στην περιοχή 4q26, η οποία είναι συχνά διαγραφεί CRC.

NDST4 γονίδιο εκφράζεται σε φυσιολογικό εντερικό βλεννογόνο και πολύποδες, αλλά ρυθμίζεται μειωτικά σε ορθοκολικό καρκινώματα

παχέος καρκίνωμα προέρχεται από το βλεννογόνο του παχέος εντέρου μέσω της συσσώρευσης των γενετικών αλλοιώσεων. Ως υποψήφιος του CRC-συνδέονται ΕΠΠΕ,

NDST4

θα πρέπει να εκφράζεται στο επιθήλιο του κόλου. Ως εκ τούτου, η σύλληψη λέιζερ μικροανατομή διεξήχθη για την απομόνωση διαφορετικών τύπων κυττάρων σε τμήματα ιστών, συμπεριλαμβανομένης της επιθηλιακής και λεμφοειδή κύτταρα του φυσιολογικού βλεννογόνου, καθώς επίσης και τα καρκινικά κύτταρα του CRC, και στη συνέχεια

NDST4

έκφραση προσδιορίστηκε με qRT -PCR (Σχήμα 2). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το

NDST4

mRNA ήταν ανιχνεύσιμη σε επιθηλιακά κύτταρα από αμφότερες τις περιπτώσεις κανονικών βλεννογόνων, αλλά ούτε σε ζεύγη κύτταρα όγκου τους, ούτε σε λεμφοειδή κύτταρα, ακόμη και μετά από 45 κύκλους ενίσχυσης PCR. Για να εξακριβωθεί η ρύθμιση προς τα κάτω των

NDST4

έκφραση στο CRC, αναλύσαμε περαιτέρω 52 ζεύγη των πρωτογενών ιστών. Σύμφωνα με την Knudson δύο-hit υπόθεση, ένα λειτουργικό αντίγραφο ενός TSG μπορεί να συμβάλει στην έκφραση μερικό γονίδιο [18]. Ως εκ τούτου, η μείωση 0,25 φορές ορίστηκε ως το κατώφλι σημαντικών αρνητική ρύθμιση. Συνολικά, 30 όγκοι (57,7%) έδειξε εμφανή μείωση στα

NDST4

έκφραση, σε σύγκριση με την κανονική συμφωνημένα βλεννογόνοι τους (Σχήμα 3Α). Επιπλέον,

NDST4

έκφραση του γονιδίου επίσης προσδιορίστηκε σε 57 αδενωματώδεις πολύποδες. Σε αντίθεση με CRC όγκων, στην οποία

NDST4

έκφραση μειώθηκε σημαντικά, τα αδενώματα εμφάνισαν ένα παρόμοιο επίπεδο έκφρασης ως κανονικό βλεννογόνων (Εικόνα 3Β). Επιπλέον, όλοι οι 10 κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν CRC εκφράζεται εξαιρετικά χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα επίπεδα

NDST4

mRNA (Σχήμα 3C). Μια δραματική μείωση του

NDST4

έκφραση στο CRC στηρίζει ότι

NDST4

είναι ένα μυθιστόρημα υποψήφιος ΕΠΠΕ, και ότι η απώλεια της λειτουργίας του μπορεί να παίζουν ρόλο στην ογκογένεση του παχέος εντέρου.

ΈΝΑ. Laser σύλληψη μικροδιατομής διαφορετικών τύπων κυττάρων από CRC όγκου και συμφωνημένα τομές φυσιολογικού βλεννογόνου. Αντιπροσωπευτικά εικόνες HistoGene-βάφονται διαφάνειες πριν και μετά τη σύλληψη λέιζερ μικροδιατομής δείξει. Β και Γ qRT-PCR ανάλυση των

NDST4

και

TBP

έκφραση στα συλληφθέντα κύτταρα.

TBP

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος RNA. Rn, κανονικοποιημένο σήμα αναφοράς.

Η

Α. Σύγκριση των

NDST4

έκφρασης μεταξύ όγκου και συμφωνημένα φυσιολογικό βλεννογόνο σε 52 ζεύγη των ιστών CRC από qRT-PCR. Η σχετική έκφραση (Tumor /Normal) σε κάθε περίπτωση υποδεικνύεται με μία στήλη. Β Ελάττωση του

NDST4

έκφραση σε όγκους CRC, αλλά όχι σε αδενωματώδεις πολύποδες. Η

έκφραση NDST4

σε σχέση με ένα εσωτερικό έλεγχο,

TBP

, απεικονίζεται μέσω ανάλυσης Θηκόγραμμα. Τα μουστάκια χαρακτηρίζει το χρονικό διάστημα μεταξύ της 5

ου και 95

ου εκατοστημόρια. Μια σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων δοκιμάστηκε από Φοιτητών

t-test

(Paired, όγκος

vs

βλεννογόνο?. Μονήρη, βλεννογόνο

vs

πολύποδα.). N.S., δεν είναι σημαντική. Γ Ελάττωση του

NDST4

έκφραση σε όλες τις 10 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC δοκιμαστεί. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των κυττάρων CRC συγκρίθηκαν με τη μέση έκφραση του 52 κανονικής κολονικής βλεννογόνων. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD.

Η

Τα αλληλόμορφα Απώλεια NDST4 Gene συνδέεται σημαντικά με την Προηγμένη Παθολογική Stage and Poor Επιβίωση στο CRC

Για να προσδιορίσει με ακρίβεια τη γενετική διαγραφή του

NDST4

στη CRC, το WebSat, λογισμικού web για την ανάπτυξη μικροδορυφορικού δείκτη, χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει σύντομες διαδοχικές επαναλήψεις μέσα στο

NDST4

γονίδιο [19]. Ένα νέο δείκτη, MS5850, η οποία σχεδιάστηκε σε αυτή τη μελέτη, και D4S1580 χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση ΑΕ σε 174 ζεύγη των πρωτογενών CRC ιστούς (Σχήμα 1Α). Οι συσχετίσεις ανάμεσα στη γενετική τροποποίηση και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά που παρατίθενται στον Πίνακα 1. Συνολικά, 53 (30,5%) των 174 όγκοι ήταν θετικά για την απώλεια των αλληλομόρφων

NDST4

γονίδιο. Η γενετική ανωμαλία αυξήθηκε σημαντικά σε όγκους με μεγαλύτερη παθολογικά στάδια (Τ3 και Τ4) (

P =

0.039). Επιπλέον, αν και δεν είναι στατιστικά σημαντική, μια αυξανόμενη τάση παρατηρήθηκε στην εξέλιξη των μακρινών μεταστάσεων και το στάδιο κατά Dukes ‘(

P =

0,075 και 0,083, αντίστοιχα). Παρ ‘όλα αυτά, η γενετική απώλεια δεν σχετίζεται με άλλα κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά.

Η συσχέτιση της απώλειας αλληλομόρφων του

NDST4

γονίδιο με την επιβίωση των ασθενών εκτιμήθηκε περαιτέρω. Ανάλυση OS διεξήχθη σε 174 ασθενείς, από τους οποίους ο ρυθμός OS ήταν 67,8% (n = 118), με μέση επιβίωση 94 μηνών. Με την εφαρμογή ανάλυση Kaplan-Meier καμπύλη επιβίωσης, η απώλεια των αλληλομόρφων

NDST4

γονίδιο προβλέψει χειρότερο λειτουργικό σύστημα (

P

= 0,036) (Εικόνα 4). Πενήντα τρεις ασθενείς με αυτή τη γενετική ανωμαλία είχε OS 60,4% και μέση επιβίωση 74 μηνών, ενώ οι υπόλοιπες 121 ασθενείς είχαν ένα λειτουργικό σύστημα του 71,1% και μέση επιβίωση 100 μήνες. Επιπλέον, η ανάλυση DFS διεξήχθη σε 118 ασθενείς με Dukes ‘τα στάδια Β και Γ, εκ των οποίων το ποσοστό DFS ήταν 73,7% (n = 87) με ένα μέσο DFS των 104 μηνών. Παρ ‘όλα αυτά, η γενετική λειτουργία δεν αναγνωρίστηκε ως σημαντικός παράγοντας πρόβλεψης της DFS για την ομάδα των ασθενών με Dukes’ στάδια Β και Γ

Η ανάλυση Kaplan-Meier διεξήχθη για να συγκρίνει ασθενείς με απώλεια αλληλομόρφων του

NDST4

γονίδιο με τους άλλους (καμία απώλεια αλληλομόρφων). Γενετική απώλεια

NDST4

παρουσιάζει σημαντική συσχέτιση με τις φτωχότερες επιβίωση (log-rank test).

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, εντοπίσαμε

NDST4

γονίδιο ως νέο υποψήφιο TSG στο χρωμόσωμα 4q26, η οποία είναι μια κοινή περιοχή διαγραφή στο CRC. Σε αντίθεση με την κανονική βλεννογόνο του κόλου με

NDST4

έκφραση, η πλειονότητα των όγκων CRC και κυτταρικές γραμμές έδειξαν μία δραματική μείωση στην έκφραση του γονιδίου. Επιπλέον, έχουμε αναπτύξει μια δοκιμασία ΑΕ με δύο δείκτες, και αποκάλυψε ότι η γενετική απώλεια

NDST4

συσχετίστηκε σημαντικά με προχωρημένο παθολογικό στάδιο και φτωχή επιβίωση, υποστηρίζοντας τη λειτουργία των ογκοκατασταλτικών NDST4 στο CRC.

Παρά ορισμένες μοριακών οδών στις οποίες βασίζεται η διαλευκανθεί παχέος ογκογένεση, διαφορετικές γενετικές αλλοιώσεις μπορεί να οδηγήσει σε μια συγκεκριμένη φαινότυπο που συσχετίζεται με διάφορες συμπεριφορές όγκου και έκβαση των ασθενών [20]. Ως εκ τούτου, η ταυτοποίηση νέων μοριακών δεικτών είναι αναγκαία για τη βελτίωση των στρατηγικών για στοχευμένες θεραπείες και προσαρμοσμένη διαχείριση των ασθενών. Στη μελέτη, που διαλευκανθεί μια ελάχιστη περιοχή διαγραφή των 1,4 Mb στο χρωμόσωμα 4q26 σε σποραδικές CRC, σύμφωνα με την προηγούμενη έκθεση ότι η συχνότητα των αλληλομόρφων διαγραφή στο 4q26 αυξήθηκε σε ορθοκολικό καρκίνωμα σε σύγκριση με αδενώματα [11]. Παρά το γεγονός ότι πολλές προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει υποψήφιος ΕΠΠΕ τόπους στο χρωμόσωμα 4 [14], [15], εδώ εντοπίσαμε, για πρώτη φορά,

NDST4

γονίδιο ως νέου υποψήφιος TSG στο 4q26. Επιπλέον, επειδή ΑΕ σε πολυμορφικών θέσεων επιτρέπει την εκφραστικότητα της διαγραφής απώλεια-του-λειτουργία στο ΕΠΠ, αυτή η γενετική μελέτη έχει δυνατότητες διαγνωστικές και προγνωστικές ενδιαφέρον [21]. Η δοκιμασία ΑΕ ιδρύθηκε στη μελέτη θα μπορούσε να είναι ένα αποδοτικό εργαλείο για την παροχή χρήσιμων βιοδεικτών δυσμενών πρόγνωση CRC.

NDST4 είναι ένα μέλος της N-δεακετυλάσης /Ν-σουλφοτρανσφερασών (ηπαράνη γλυκοσαμινύλ) (NDST ) οικογένεια, η οποία είναι υπεύθυνη για τη θειική ηπαράνη (HS) βιοσύνθεσης σε μία πρωτεΐνη πυρήνα για να σχηματίσει πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης (HSPGs) [22], [23]. HSPGs παντού κατοικούν επί της κυτταρικής επιφάνειας, στο εσωτερικό του κυττάρου, και στην εξωκυτταρική μήτρα [24]. Οι αλυσίδες HS του HSPGs αλληλεπιδρούν με ένα ευρύ φάσμα πρωτεϊνών προσδεμάτων, όπως οι οικογένειες παράγοντα ανάπτυξης, και έτσι, συνεισφέρουν στη δομή των ιστών και λειτουργία κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και της ομοιόστασης των ενηλίκων [25], [26]. Είναι σημαντικό ότι, το περιεχόμενο και τη διανομή των HSPGs μεταβάλλονται κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης, που έχουν εμπλακεί στην θετικές ή αρνητικές πτυχές της εξέλιξης του όγκου. Για παράδειγμα, η λειτουργία HSPGs ως συν-υποδοχείς για αυξητικούς παράγοντες και κινάσες τυροσίνης υποδοχέα τους για τη σταθεροποίηση των συμπλεγμάτων σηματοδότησης κατά την διάρκεια του πολλαπλασιασμού του όγκου και εισβολή [27]. Σε αντίθεση, HSPGs προάγουν κυττάρου-κυττάρου και των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-εξωκυτταρικής μήτρας και την οικοδόμηση ανασταλτική εμπόδια για την εισβολή του όγκου. Ως εκ τούτου, τα μειωμένα επίπεδα HSPGs συσχετίζονται με την εξέλιξη του όγκου [28], [29]. Στην παρούσα μελέτη, η γενετική απώλεια

NDST4

συσχετίστηκε σημαντικά με προχωρημένο παθολογικό στάδιο, το οποίο αναφέρεται στο τοπικό βάθος του όγκου της εισβολής στην CRC, γεγονός που υποδηλώνει ότι η απώλεια της λειτουργίας του

NDST4

γονίδιο θα μπορούσαν να βλάψουν την τροποποίηση των αλυσίδων ΕΣ συγκεκριμένων HSPGs, οδηγώντας σε πιο επεμβατικές καρκινικά κύτταρα μέσω της αναμόρφωσης της αλληλεπίδρασης των υποδοχέων κυτταρικής προσκόλλησης και συνδετήρων.

οι τέσσερις διαφορετικές ισομορφές της NDSTs προσδιορίζονται στα σπονδυλωτά. Σε αντίθεση με την καθολική έκφραση γονιδίων του

NDST1

και

NDST2

,

NDST3

και

NDST4

μεταγραφές εκφράζονται κυρίως κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης [30], [31 ]. Ωστόσο, οι μορφές έκφρασης του

NDSTs

έχουν ποτέ απεικονίζεται στο ανθρώπινο κόλον. Χρησιμοποιώντας RT-PCR, βρήκαμε ότι οι μεταγραφές των τεσσάρων

NDSTs

ήταν εύκολα ανιχνεύσιμη σε φυσιολογικούς κολονικό βλεννογόνο, ενώ μόνο

NDST4

έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω σε περισσότερες από τις εξετασθείσες όγκων CRC (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα ). Σύμφωνα με την προβλεπόμενη δομή του τομέως σουλφοτρανσφερασών του NDSTs, οι τέσσερις διαφορετικές ισομορφές μπορεί να εμφανίζουν ποικίλες ειδικότητες υποστρώματος [30]. Sheng

et al. Καταδειχθεί

πρόσφατα ότι NDST1 πραγματοποίησε την τροποποίηση σε μια εξαιρετικά διέταξε τρόπο για να ελέγχουν τις περιοχές Ν-θείωση στην HS, γεγονός που υποδηλώνει ότι ξεκίνησε και ακολούθησε Ν-θείωση θα μπορούσε να διεξαχθεί με τη χρήση διαφορετικών NDSTs [32]. Με τη σχετικά φτωχή δραστηριότητα αποακετυλιώσεως NDST4 για μη τροποποιημένου αλυσίδες του ΕΣ, NDST4 μπορεί να προτιμούν αυτά με μια αρχική τροποποίηση με άλλες ισομορφές [30]. Επιπλέον, NDSTs διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στη βιοσύνθεση του ΕΣ, διότι NDSTs είναι οι πρώτοι συμμετέχοντες στη διαδικασία της διαδοχικής τροποποίησης [33]. Είναι ενδιαφέρον, επειδή NDST4 είναι η μόνη ισομορφή που είχαν αξιοσημείωτα κατιούσα ρύθμιση στα δοκιμάστηκαν όγκους CRC (μη δημοσιευμένα δεδομένα μας), οι άλλοι τρεις ισομορφές NDST δεν φαίνεται να αντισταθμίσει την ανεπάρκεια NDST4 σε κόλον-ειδική προϋπόθεση. Οι αλυσίδες HS του HSPGs σε κολονικό βλεννογόνο μπορεί να έχει μοναδικά μοτίβα τροποποίηση προκαλείται, τουλάχιστον εν μέρει, από δραστικότητα NDST4. Altered HSPGs που προκύπτουν από την απώλεια της λειτουργίας του NDST4 μπορεί να ποικίλλει διάταξη των κυττάρων και των ιστών, και στη συνέχεια να προωθήσει CRC παθογένεια. Ωστόσο, οι μεταβολές στην έκφραση του ΕΣ βιοσυνθετικών ενζύμων θα μπορούσε να είναι σχετικά διαφορετικό σε ένα καρκίνο τύπου-ειδικό τρόπο [34]. Fernandez-Vega

et al.

Αναφερθεί αρκετά πρόσφατα ότι

NDST4

μεταγραφή αυξήθηκε σε 50% από 23 διηθητικά πόρου αδενοκαρκινώματα μελετηθεί, όταν ήταν απούσα στους φυσιολογικούς ιστούς του μαστού [35]. Στο σύνολό τους, οι περαιτέρω μελέτες δικαιολογείται να πάρετε ιδέες για το ρόλο της NDST4 στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των ανθρώπινων καρκίνων του όγκου.

Εν κατακλείδι, από οριοθετούν μια ελάχιστη περιοχή διαγραφή στο χρωμόσωμα 4q26, η μελέτη αυτή είναι η πρώτη για τον εντοπισμό

NDST4

γονίδιο ως νέο υποψήφιο TSG στο CRC. Επιπλέον, η γενετική απώλεια του

NDST4

θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως βιοδείκτης δυσμενών πρόγνωση για τους ασθενείς με CRC. Η δοκιμασία LOH σχεδιαστεί για τον προσδιορισμό της απώλειας αλληλόμορφη

NDST4

γονίδιο στη μελέτη θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένα μοριακό διαγνωστικό εργαλείο για τη διαστρωμάτωση του κινδύνου σε μεμονωμένες θεραπευτικές παρεμβάσεις.