Αφηρημένο

Ιστορικό

Τ κυττάρων ανοσοσφαιρίνης-3 (TIM-3), έχει καθιερωθεί ως ένα αρνητικό ρυθμιστικό μόριο και διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανοσολογική ανοχή. ΤΙΜ-3 υπερεκφράζεται σε εξαντληθεί CD8

+ Τ κυττάρων σε τόσο χρόνιας λοίμωξης και όγκου. Ωστόσο, η φύση του ΤΙΜ-3

+ CD4

+ Τ κυττάρων στο μικροπεριβάλλον του όγκου δεν είναι σαφής. Αυτή η μελέτη είναι για να χαρακτηρίσει TIM-3 που εκφράζουν λεμφοκυττάρων μέσα σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα και να δημιουργήσουν κλινική σημασία της TIM-3 έκφρασης σε εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα.

Μεθοδολογία

Ένα σύνολο των 51 ανθρώπινων ιστών καρκίνου του πνεύμονα δείγματα ελήφθησαν από παθολογικά επιβεβαιώνεται και νεοδιαγνωσθέντες μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ασθενείς. Λευκοκύτταρα από ιστούς όγκων, περιφερικό φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων, και μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) αναλύθηκαν για ΤΙΜ-3 επιφανειακή έκφραση με κυτταρομετρία ροής. TIM-3 έκφρασης σε ογκο-διηθητικά λεμφοκύτταρα (TILs) συσχετίστηκε με κλινικοπαθολογικών παραμέτρων.

Συμπεράσματα

TIM-3 είναι ιδιαίτερα απορυθμίζεται τόσο CD4

+ και CD8

+ TILs από ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα αλλά αμελητέα εκφράζεται σε Τ κύτταρα από το περιφερικό αίμα των ασθενών. Συχνότητες της IFN-γ

+ κύτταρα μειώθηκαν σε TIM-3

+ CD8

+ TILs σε σύγκριση με το TIM-3

-CD8

+ TILs. Ωστόσο, το επίπεδο της TIM-3 έκφραση CD8

+ TILs απέτυχε να συνδέσει με οποιαδήποτε κλινική παθολογική παράμετρο. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι περίπου το 70% της TIM-3

+ CD4

+ TILs εξέφρασε FoxP3 και περίπου το 60% των Foxp3

+ TILs ήταν TIM-3

+. Είναι σημαντικό, TIM-3 έκφραση CD4

+ Τ κυττάρων συσχετίζεται με κακή κλινικοπαθολογικών παραμέτρων του NSCLC όπως κομβικά μετάσταση και προχωρημένα στάδια του καρκίνου. Η μελέτη μας αποκαλύπτει ένα νέο ρόλο της TIM-3 ως ένα σημαντικό ανοσοποιητικού ρυθμιστή στο μικροπεριβάλλον του όγκου μέσω κυρίαρχη έκφραση του σε ρυθμιστικά Τ κύτταρα

Παράθεση:. Gao Χ, Zhu Υ, Li G, Huang Η, Zhang G , Wang F, et al. (2012) TIM-3 Έκφραση Χαρακτηρίζει Ρυθμιστική Τ κύτταρα σε ιστούς όγκων και συνδέεται με τον καρκίνο του πνεύμονα Εξέλιξη. PLoS ONE 7 (2): e30676. doi: 10.1371 /journal.pone.0030676

Συντάκτης: Michael P. Bachmann, Carl-Gustav Carus Μετσόβιο Πολυτεχνείο-Δρέσδη, Γερμανία

Ελήφθη: 13 Οκτωβρίου του 2011? Αποδεκτές: 20 Δεκέμβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 17, Φεβρουαρίου, 2012

Copyright: © 2012 Gao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο στηρίζεται εν μέρει από NSFC (Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας) χορηγεί 30528008, Πρόγραμμα για Changjiang μελετητές και τα καινοτόμα ερευνητική ομάδα του Πανεπιστημίου (IRT0849) και ένα έργο που χρηματοδοτήθηκε από την Προτεραιότητα Ακαδημαϊκό Πρόγραμμα Ανάπτυξης των Jiangsu Ίδρυμα Ανώτατης Εκπαίδευσης (PAPD) (στο BL και XZ). BL εν μέρει υποστηρίζεται από την Νέων Ερευνητών Βραβείο από Cancer Research Institute και το Πανεπιστήμιο του Πίτσμπουργκ ταμείο εκκίνησης. ΟΥ υποστηρίζεται από Έντεκα-Πέμπτη Mega-επιστημονικό έργο για την «πρόληψη και τη θεραπεία του AIDS, ιογενής ηπατίτιδα και άλλες μολυσματικές ασθένειες» (2008ZX10003-012). GL και XG υποστηρίζονται από μια υποτροφία από την Κίνα Υποτροφιών του Συμβουλίου. YZ υποστηρίζεται από NSFC επιχορήγηση 31170866, Jiangsu Φυσικών Επιστημών Ταμείο BK2011289 και Έργων Ανάπτυξης Suzhou Κοινωνική (SYS201009). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ανάπτυξη των όγκων προκαλεί αντικαρκινική ανοσολογική απόκριση. Type 1 προσαρμοστικές άνοσες αποκρίσεις, που προκαλούνται από Th1 κύτταρα και τα CTLs, πιστεύεται ότι είναι ένα κρίσιμο συστατικό της κυτταρικής ανοσίας κατά του καρκίνου [1]. Έχει καθιερωθεί, ωστόσο, ότι πολλές ενδοδιηθητικά όγκου Τ κύτταρα είναι σε κατάσταση μη-αποκρισιμότητα οφείλεται στο ανοσοποιητικό κατασταλτικό μικροπεριβάλλον του όγκου [2], [3]. Τα ρυθμιστικά Τ κύτταρα και εξάντληση των δραστικών Τ κυττάρων πιστεύεται ότι είναι δύο κύριοι εγγενείς μηχανισμούς των κυττάρων Τ που καθιστούν αναποτελεσματικά αντικαρκινικές ανοσολογικές αποκρίσεις [2], [4], [5]. Πολλαπλές μοριακές οδοί, όπως ΤΟΡβ, IL-10, τα μέλη της Β7 οικογένειας, εμπλέκονται στον καθορισμό της κατάστασης της ανοσοκαταστολής εντός του όγκου [2], [6], [7], [8]. Κατανόηση του ρόλου των νέων ανοσοποιητικού ανασταλτικά μονοπάτια στη μεσολάβηση ανοσολογικής ανοχής σε μικροπεριβάλλον του όγκου θα βοηθήσουν στη βελτίωση ανοσοθεραπεία του καρκίνου.

ΤΙΜ-3 εκφράζεται επί Th 1, κύτταρα Th17, και CD8 Τ κύτταρα, αλλά όχι τα κύτταρα Th2 [9], [10], [11]. Η αλληλεπίδραση μεταξύ ΤΙΜ-3 και συνδέτη γαλεκτίνης-9 του αναστέλλει Th1 και Th17 αποκρίσεις [12] και προκαλεί περιφερική ανοχή [13], [14], υποστηρίζοντας μια ανασταλτική ρόλο της ΤΙΜ-3 σε Τ κυτταρικές αποκρίσεις. TIM-3 έκφραση εντοπίζει επίσης εξαντληθεί Τ κύτταρα κατά τη διάρκεια της χρόνιας λοίμωξης. TIM-3 που εκφράζουν CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα παράγουν μειωμένες ποσότητες κυτοκινών ή είναι λιγότερο πολλαπλασιασμού ως απάντηση στο αντιγόνο. Ο αποκλεισμός του μονοπατιού σηματοδότησης ΤΙΜ-3 αποκαθιστά πολλαπλασιασμό και αυξάνει την παραγωγή κυτοκινών σε HIV-1-ειδικά Τ κύτταρα [15]. Πρόσφατες μελέτες έχουν υποστηρίξει σημαντικό ρόλο της TIM-3 εξάντληση των Τ κυττάρων σε καρκινικά. Tim-3 και PD-1, ένας άλλος δείκτης της ανάλωσης Τ κυττάρου, συν-εκφράζονται σε CD8 TILs σε ποντικούς που φέρουν μεταμοσχευμένους όγκους καθώς και σε NY-ESO-1-ειδικά CD8

+ Τ κύτταρα σε ασθενείς με προχωρημένο μελάνωμα [4], [5]. ΤΙΜ-3

+ PD-1

+ Τ κύτταρα εμφανίζουν την πιο σοβαρή εξαντληθεί φαινότυπο, όπως ορίζονται από την αποτυχία να πολλαπλασιάζονται και παράγουν IL-2, TNF, και IFN-γ. Ο αποκλεισμός των δύο Tim-3 και PD-1 οδούς είναι πιο αποτελεσματικές στον έλεγχο της ανάπτυξης του όγκου από τη στόχευση είτε οδού μόνο, προτείνοντας οι δύο αυτές οδοί λειτουργούν συνεργικά για τον καθορισμό των Τ κυττάρων εξάντληση [4], [5].

αυτή η μελέτη, ερευνήσαμε ΤΙΜ-3 έκφραση σε TILs σε κανένα μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC). Έχουμε βρει ότι ΤΙΜ-3 εκφράζεται σε αμφότερα CD4

+ και CD8

+ TILs σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. Τόσο η TIM-3

+ CD4

+ και TIM-3

+ CD8

+ Τ κύτταρα που παράγονται πολύ μειωμένα επίπεδα της IFN-γ σε σύγκριση με εκείνες στο TIM-3

-CD4

+ και TIM-3

-CD8

+ Τ κύτταρα, αντίστοιχα. Είναι ενδιαφέρον, TIM-3 έκφραση CD4

+ Τ κύτταρα αλλά όχι CD8

+ Τ κυττάρων συσχετίζεται με κακή κλινικοπαθολογικών παραμέτρων του NSCLC όπως κομβικά μετάσταση και προχωρημένα στάδια του καρκίνου. Εντυπωσιακά, περίπου το 70% της TIM-3

+ CD4

+ TILs εξέφρασε FoxP3 και περίπου το 60% των Foxp3

+ TILs ήταν TIM-3

+. Σε αντίθεση, ΤΙΜ-3 ήταν ελάχιστα εκφρασμένη στο περιφερικό CD4

+ Τ κύτταρα, Tregs, και CD8

+ Τ κύτταρα. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ένα μυθιστόρημα ρόλο της TIM-3 σε όγκο που σχετίζεται ρυθμιστικά Τ κύτταρα και τη σημασία της στην εξέλιξη του καρκίνου του ανθρώπου.

Υλικά και Μέθοδοι

Η επιλογή των δειγμάτων ιστού

συνολικά δείγματα καρκινικού ιστού 51 πνεύμονα ελήφθησαν από παθολογικά επιβεβαιώθηκε και πρόσφατα διαγνωστεί μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), οι ασθενείς που έλαβαν λειτουργία από Οκτώβριος 2009-Μάιος 2011 σε Καρδιοχειρουργικής Τμήμα Πρώτον Affiliated Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Soochow στην παρούσα μελέτη . Επιπλέον, 51 περιπτώσεις των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών από μη κακοήθεις τμήμα αποκόπηκαν και επιλέγονται ως έλεγχοι. Οι φυσιολογικούς ιστούς ήταν τουλάχιστον 5 εκατοστά μακριά από το ορατό μάζα του όγκου. Αυτόλογη μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) απομονώθηκαν από ολικό αίμα με φυγοκέντρηση σε διαβάθμιση πυκνότητας Ficoll πριν τη λειτουργία. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πρώτου Ενταγμένο Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Soochow. Τα δεδομένα αναλύθηκαν ανώνυμα και δεν απαιτήθηκε ενημερωμένη συγκατάθεση.

Συγκομιδή διηθητικών του όγκου λεμφοκυττάρων (TILs) έχουν κιμάς

Ιστός όγκου και παρακείμενο φυσιολογικό ιστό από τον ίδιο ασθενή και υποβάλλεται σε πέψη με το διάλυμα πέψης κολλαγενάσης (1 mg /ml κολλαγενάση IV (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) σε RPMI1640) στους 37 ° C για 45 λεπτά. Τα κομμάτια μεταφέρθηκαν στη συνέχεια στον πλεγμάτων και απλά εναιωρήματα κυττάρου που λαμβάνεται με μηχανική άλεσμα. TILs καθαρίστηκαν περαιτέρω με την κλίση σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε μέσο του Hank για διάφορες αναλύσεις.

Ποντίκια

6-8 εβδομάδων θηλυκά C57BL /6 ποντίκια ήταν που χρησιμοποιούνται σε πειράματα όγκων. Όλα τα ζώα διατηρήθηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνων στην εγκατάσταση ζώων στο Πανεπιστήμιο του Πίτσμπουργκ ή Πανεπιστήμιο Soochow. Όλες οι εργασίες των ζώων έχει εγκριθεί από τη Φροντίδα και Χρήση Επιτροπής Θεσμών ζώων στο Πανεπιστήμιο του Πίτσμπουργκ (αριθμός πρωτοκόλλου 0906824). Για πειράματα μοντέλο όγκου, οι ποντικοί προκλήθηκαν με 2 × 10

5 Β 16F0 κύτταρα i.d. και δείγματα όγκου αφαιρέθηκαν για ανάλυση περίπου την ημέρα 20 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16].

In vitro διέγερση των Τ κυττάρων

παρθένα κύτταρα Τ καθαρίστηκαν από PBMCs από υγιείς δότες χρησιμοποιώντας καταστρέφουν αντι-CD45RO αντίσωμα και τα ανθρώπινα Τ κιτ εμπλουτισμού κυττάρων Stemsep® (τεχνολογίες StemCell, Βανκούβερ, βρετανική Κολούμπια, Καναδάς). Η καθαρότητα των κυττάρων Τ ήταν περισσότερο από 90%. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με 1 μg /ml δεσμευμένο στην πλάκα αντι-CD3 (κλώνος ΟΚΤ3) και 2 μg /ml δεσμευμένο στην πλάκα αντι-CD28 mAbs για μέχρι 72 ώρες.

Για την απομόνωση Tregs, PBMCs χρωματίστηκαν με φυκοερυθρίνη-κυανίνη Dye7 (PECY7) συζευγμένο αντι-CD4 mAb (RPA-Τ4) και αντι-CD25 φυκοερυθρίνης (ΡΕ) (BC96). Ένα κυτταρόμετρο MoFlo (Beckman-Coulter, Brea, Καλιφόρνια ΗΠΑ) χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση CD4

+ CD25

υψηλής κύτταρα. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια διεγέρθηκαν με αντι-CD3 (1 μg /ml) και αντι-CD28 (2 μg /ml) με την παρουσία του IL-2 (200 U /ml, R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA). 24, 48, και 72 ώρες αργότερα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση

Αντισώματα και ροής Ανάλυση κυτταρομετρίας

άμεσα συζευγμένα αντι-ανθρώπινα αντισώματα έναντι των ακολούθων επιφανειακών μορίων χρησιμοποιήθηκαν:. Αντι-CD4 (RPA-Τ4) και αντι-CD8 (RPA-Τ8) ελήφθησαν από Beckman Coulter. Αντι-ΤΙΜ-3 (344823), αντι-Ρϋ-1 (2Η7), και αντι-CD25 (BC96) αγοράστηκαν από την R & amp? D Systems. Τα ακόλουθα μονοκλωνικά αντισώματα ειδικά για αντιγόνα ποντικού αγοράστηκαν από eBioscience (San Diego, CA, USA): CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7), Tim-3 (RMT3-23) και Foxp3 (FJK-16) . Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός κυτταρομέτρου ροής FACS.

Για τη χρώση ενδοκυτταρικής κυτοκίνης, τα ανθρώπινα TILs συλλέχθηκαν από δείγματα καρκίνου του πνεύμονα, διεγείρονται με δεσμευμένο στην πλάκα αντι-CD3 mAbs (1 μg /ml) και δεσμευμένο στην πλάκα αντι-CD28 mAbs (2 μg /ml) για 16 ώρες και επωάζονται για τις τελευταίες 3 ώρες με Brefeldin Α (10 μg /ml, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε μία πλάκα πυθμένα σχήματος V, χρωματίστηκαν με αντι-CD4 ή αντι-CD8 σε ρυθμιστικό του Hank (που περιέχει 1% FCS), στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με μέσο στερέωσης, το οποίο ακολουθήθηκε από μέσο διαπερατοποίηση (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) . Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με αντι-ΙΡΝ-γ αντίσωμα (4S.B3, Biolegend, San Diego, CA, USA). Τα κύτταρα που παράγουν ΙΡΝ-γ εξετάστηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Για την ανάλυση της έκφρασης Foxp3, TILs πρώτα χρωματίστηκαν με αντι αντι-CD4-PECY7, αντι-CD25-PECY5 και αντι-ΤΙΜ-3-ΡΕ ή -PD-1-ΡΕ, μετά από στερέωση και διαπερατοποίηση, τα κύτταρα επωάστηκαν με FITC-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο FoxP3 (259D, BioLegend, San Diego, CA, USA), με βάση τις συστάσεις του κατασκευαστή, και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

Στατιστική ανάλυση

οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism πακέτο 5,0 λογισμικού (GraphPad Software, Inc., San Diego, USA). έλεγχος τ, μονόδρομη ANOVA και δοκιμή -t ελάχιστη σημαντική διαφορά (LSD) χρησιμοποιήθηκαν όπου ενδείκνυται. P-τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

Από TIM-3 εμπλέκεται στην εξάντληση των Τ κυττάρων, αποφασίσαμε να ερευνήσουμε την έκφρασή της σε TILs σε δείγματα καρκίνου του πνεύμονα. Λευκοκύτταρα από ιστούς όγκων, περιφερικό φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων, και PBMC αναλύθηκαν για ΤΙΜ-3 επιφανειακή έκφραση με κυτταρομετρία ροής. Η μη ειδική χρώση ελέγχθηκε από το αντίσωμα IgG ελέγχου ισοτύπου (σχήμα S1). Περισσότερο από το 90% των κυττάρων CD4 +

ήταν θετικά για CD3 μετά διαδικασία καθαρισμού μας και την επιλογή των λεμφοκυτταρική πύλη κατά τη διάρκεια της ανάλυσης κυτταρομετρίας ροής. Στον καρκίνο του πνεύμονα ομάδα ασθενών μας, έχουμε βρει ότι ο Tim-3 εκφράστηκε κατά μέσο όρο σε περίπου 30% του CD4

+ και CD8 TILs

+ TILs (Σχήμα 1Α και 1Β). Το ποσοστό των ΤΙΜ-3

+ CD4

+ και TIM-3

+ CD8

+ TILs στα άπω φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων μειώνεται στο περίπου 18% και 15% αντίστοιχα (Σχήμα 1Α και 1Β) . Σε αντίθεση, υπήρξε αμελητέα έκφραση του ΤΙΜ-3 επί των Τ κυττάρων στο αίμα από αυτούς τους ασθενείς (Σχήμα 1Α και 1Β). Ως εκ τούτου, ΤΙΜ-3 έκφραση ήταν ειδικά τα πάνω ρυθμισμένη σε Τ κύτταρα στους φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων και περαιτέρω αυξήθηκε στον καρκινικό ιστό. Μια πρόσφατη έκθεση έδειξε ότι, σε PBMC που απομονώθηκαν από προηγμένα ασθενών με μελάνωμα, ένα κλάσμα του PD-1

+ NY-ESO-1-ειδικών CD8

+ Τ κύτταρα συν-εκφράζεται TIM-3 και PD-1 και αυτά κύτταρα ήταν πιο δυσλειτουργική από TIM-3

-PD-1

+ και TIM-3

-PD-1

– ομολόγους [4]. Στη συνέχεια μελετήθηκε η έκφραση PD-1 και ΤΙΜ-3 επί TILs από τους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. PD-1 εκφράστηκε σε περισσότερο από το 65% των TILs από τόσο φυσιολογικών και καρκινικών ιστών του πνεύμονα (Σχήμα 1 C). Πλειοψηφία της TIM-3

+ TILs ήταν PD-1

+ στους ιστούς των πνευμόνων. Σε αντίθεση, το 10% των Τ κυττάρων στο περιφερικό αίμα ήταν θετικά για PD-1 (Σχήμα 1C). Έτσι, βρήκαμε ότι μεγάλοι αριθμοί ΤΙΜ-3

+ PD-1

+ Τ κύτταρα εμπλουτίζονται σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. Αυτό είναι συνεπές με το γεγονός ότι πολλοί των Τ κυττάρων στους ιστούς του καρκίνου είναι δυσλειτουργικά πιθανό να οφείλεται στην εξάντληση ή ανέργειας.

Tumor διηθητικά λεμφοκύτταρα (TILs) συλλέχθηκαν από τους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα, δίπλα φυσιολογικούς ιστούς, και το περιφερικό αίμα κύτταρα monouclear (PBMCs) από ολικό αίμα των ασθενών. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν για CD4, CD8, ΤΙΜ-3 και PD-1. Α Αντιπροσωπευτικές dot-γραφικές παραστάσεις δείχνουν ΤΙΜ-3 έκφραση σε

+ Τ κυττάρων σε διάφορους ιστούς από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα CD4

+ και CD8. Τα λεμφοκύτταρα περιφραγμένη για περαιτέρω ανάλυση των κυττάρων CD4 και CD8 Τ. Περισσότερο από το 90% των CD4

+ ή CD8

+ κυττάρων ήταν CD3

+. B. συνοπτικά αποτελέσματα του ποσοστού (%) του ΤΙΜ-3 έκφραση σε CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα δείχνονται. Οριζόντιες γραμμές απεικονίζουν το μέσο ποσοστό της ΤΙΜ-3 έκφραση στο

+ Τ κυττάρων CD4

+ και CD8. Οι μπάρες σφάλματος: s.e.m. Γ Διπλή έκφραση της TIM-3 και PD-1 σε περιφραγμένο CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα φαίνεται. Οι p-τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση της μονόδρομης ANOVA.

Η

Δεδομένου ότι έχει αποδειχθεί ότι τα αντιγόνου-ειδικά TIM-3

+ CD8

+ Τ κύτταρα είναι λειτουργικά εξαντληθεί σε χρόνιες μόλυνση και ασθενείς με καρκίνο, αποφασίσαμε να μελετήσουμε εάν ΤΙΜ-3 σημειώνονται επίσης δυσλειτουργικά κύτταρα Τ σε TILs σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. TILs διεγέρθηκαν με αντι-CD3 και αντι-CD28 επί 16 ώρες και αναλύθηκαν για την παραγωγή ΙΡΝ-γ με κυτταρομετρία ροής. Έχουμε βρει ότι, κατά μέσο όρο 5% ΤΙΜ-3

-CD8

+ TILs Οι ΙΡΝ-γ

+ κατόπιν ex-vivo διέγερση με αντι-CD3 (Εικόνα 2Α, 2C). Αντιθέτως, η συχνότητα των παραγωγών ΙΡΝ-γ ήταν σημαντικά μειωμένη σε ΤΙΜ-3

+ CD8

+ TILs (Σχήμα 2Α, 2C). Έτσι, τα δεδομένα μας είναι σύμφωνες με την ιδέα ότι ο Tim-3 σήματα λειτουργική εξάντληση των CD8 Τ κυττάρων σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου, σε κρατήσει με το πρόσφατο εύρημα, χρησιμοποιώντας το μοντέλο όγκου ποντικού μεταμόσχευσης [5].

TILs συλλέχθηκαν από πνευμονικό ιστό καρκίνου. Τα κύτταρα στη συνέχεια διεγέρθηκαν με συνδεδεμένο στην πλάκα αντι-CD3 mAbs (1 μg /ml) και δεσμευμένο στην πλάκα αντι-CD28 mAbs (2 μg /ml) για 16 ώρες και επωάζονται για τις τελευταίες 3 ώρες με Brefeldin Α (10 μg /ml ). Τα κύτταρα που παράγουν ΙΡΝ-γ εξετάστηκαν με χρώση ενδοκυτταρικής κυτοκίνης και κυτταρομετρία ροής. (Α και Β). Εκπρόσωπος οικόπεδα dot από έναν ασθενή έδειξε το ποσοστό της ΤΙΜ-3

+ IFN-γ

+ και TIM-3

-IFN-γ

+ μέσα CD8

+ ή CD4

+ διαμέρισμα Τ κυττάρων. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά έξι ανεξάρτητων πειραμάτων. Γ Το μέσο ποσοστό της IFN-γ που παράγουν CD8

+ ή CD4

+ Τ κύτταρα μεταξύ TIM-3

+ και TIM-3

– κλάσματα εμφανίζεται

Η.

Εκτός CD8

+ TILs, ΤΙΜ-3 βρέθηκε εκφράζεται επί CD4

+ TILs σε ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα (Σχήμα 1), καθώς και στο μεταμοσχευμένο όγκου ποντικού [5]. Tim-3 επίσης εκφράζεται έντονα στα κύτταρα Th1 και Th17 και σημαντικές για την αναστολή της λειτουργίας των κυττάρων αυτών [10]. Είτε TIM-3 σήματα CD4

δυσλειτουργία + Τ κυττάρων δεν είναι, ωστόσο, βέβαιο. Στη συνέχεια παρατίθενται εξέταση της συχνότητας των IFN-γ που παράγουν CD4

+ TILs σε σχέση με το ΤΙΜ-3 έκφρασης επιφανείας. Έχουμε βρει περίπου 2% της TIM-3

-CD4

+ TILs ήταν παραγωγούς IFN-γ κατά την ex vivo διέγερση με αντι-CD3 (Εικόνα 2Β). Αντίθετα, το ποσοστό των IFN-γ

+ κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη σε TIM-3

+ CD4

+ TILs (Εικόνα 2Β και 2Γ).

Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η κανονιστική Τ κύτταρα είναι μια κυρίαρχη πληθυσμός CD4

+ Τ κύτταρα μεταξύ των TILs [3]. Επειδή Tregs είναι επίσης λειτουργικά ανενεργά, μπορούμε στη συνέχεια αποφάσισε να καθοριστεί αν TIM-3 εκφράζεται σε ρυθμιστικά Τ κύτταρα μεταξύ TILs χρησιμοποιώντας FoxP3 ως δείκτη. Προς έκπληξή μας, αν και περίπου το 17% των CD4

+ TILs ήταν FoxP3

+ Tregs, περίπου το 70% της TIM-3

+ CD4

+ TILs ήταν FoxP3

+ (Σχ. 3Α). Επιπλέον, περίπου το 60% του Foxp3

+ CD4

+ TILs εξέφρασε TIM-3 στην επιφάνειά τους (Εικ. 3Α). Έτσι, TIM-3

+ CD4

+ Τ κύτταρα ήταν κυρίως Tregs και οι περισσότεροι από Tregs στο καρκίνο του πνεύμονα TILs ιδιαίτερα up-ρυθμίζεται TIM-3 έκφρασης. Σύμφωνα με τα δεδομένα αυτά, το σύνολο FoxP3

+ CD4

+ TILs εκφράζουν PD1 (Σχ. 3Β). Σε αντίθεση με υψηλή έκφραση του ΤΙΜ-3 σε TILs, ελάχιστη έκφραση της ΤΙΜ-3 βρέθηκε στο ούτε συμβατικά Τ κύτταρα ούτε Tregs στο περιφερικό αίμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

TILs συλλέχθηκαν από ιστό καρκίνου του πνεύμονα. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν για CD4, ΤΙΜ-3, και FoxP3 (Α) ή CD4, PD-1, και FoxP3 (Β). Τα λεμφοκύτταρα περιφραγμένη για περαιτέρω ανάλυση των κυττάρων CD4 και CD8 Τ. Το ποσοστό του κάθε πληθυσμού εντός CD4 υποδείχθηκε

διαμέρισμα + Τ κυττάρων. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά των πέντε ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Από TIM-3 φαίνεται να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε Τ κύτταρα μετά από in vitro καλλιέργεια παρουσία του TCR διέγερση [10], αποφασίσαμε να εξετάσει αν Tregs θα μπορούσαν να διεγερθούν για να εκφράσουν TIM-3. Ως έλεγχος, τα ανθρώπινα CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα διεγέρθηκαν με αντι-CD3 και αντι-CD28 επί 72 ώρες. Κάθε 24 ώρες, εξετάσαμε ΤΙΜ-3 και PD-1 έκφρασης. Τόσο PD-1 και ΤΙΜ-3 απορυθμίζεται σε περίπου 48 ώρες και περαιτέρω προς τα πάνω ρυθμισμένα σε 72 ώρες και στις δύο CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα (Σχ. 4Α και 4Β). Στη συνέχεια εξετάστηκε εάν ΤΙΜ-3 θα μπορούσε να είναι παρομοίως επάνω ρυθμισμένη σε ρυθμιστικά Τ κύτταρα. Εμπλουτίσαμε ανθρώπινα Tregs με την απομόνωση CD4

+ CD25

υψηλή Τ κυττάρων χρησιμοποιώντας ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS). Στη συνέχεια, αυτά τα διεγερμένα Τ κυττάρων με αντι-CD3 και αντι-CD28 παρουσία IL-2 για 72 ώρες. Η έκφραση του ΤΙΜ-3 και FoxP3 εξετάστηκε στις 48 ώρες και 72 ώρες. ΤΙΜ-3 εκφράζεται σε αμελητέα επίπεδα τόσο μη διεγερμένα αφελή CD4

+ Τ κύτταρα και Tregs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε σύγκριση με μη διεγερμένα κύτταρα Τ, ΤΙΜ-3 έκφραση ήταν σημαντικά τα πάνω ρυθμισμένη στις 48 ώρες και αυξήθηκε περαιτέρω σε 72 ώρες (Εικ. 4C). Στις 72 ώρες περίπου 25% του Foxp3

+ Τ κύτταρα ήταν ΤΙΜ-3 θετικό (Εικ. 4C). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ΤΙΜ-3 ρυθμίζεται προς τα πάνω και στις δύο συμβατικά Τ κύτταρα και Tregs κατά τη διέγερση μέσω TCR.

(Α και Β). Ανθρώπινα παρθένα κύτταρα Τ καθαρίστηκαν από PBMCs δοτών υγείας. Τα κύτταρα στη συνέχεια διεγέρθηκαν με συνδεδεμένο στην πλάκα αντι-CD3 συν αντι-CD28 mAb. 24, 48 και 72 ώρες αργότερα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν για CD4, CD8, ΤΙΜ-3 και PD-1. Η έκφραση του PD-1 και ΤΙΜ-3 αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής σε περιφραγμένο CD4

+ (Α) ή CD8

+ (Β) Τ κυττάρων. Γ CD4

+ CD25

υψηλή Τ κύτταρα απομονώθηκαν από περιφερικό αίμα με FACS. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια διεγέρθηκαν με αντι-CD3 και αντι-CD28 παρουσία IL-2 (200 U /mL). 24, 48 και 72 ώρες αργότερα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υπέστησαν χρώση για τα CD4, ΤΙΜ-3 και Foxp3. Η έκφραση της TIM-3 σε CD4

+ FoxP3

+ Τ κύτταρα φαίνεται. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Από ΤΙΜ-3 εκφράζεται έντονα σε TILs απομονωθεί από ιστούς του καρκίνου του πνεύμονα, μπορούμε στη συνέχεια προσδιορίζεται κατά πόσον ΤΙΜ-3 έκφραση είχε καμία κλινική σημασία συσχετίζοντας ΤΙΜ-3 έκφραση με κλινικές παθολογικές παραμέτρους. Έχουμε βρει το ποσοστό των CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα εντός TILs δεν συσχετίστηκε με οποιαδήποτε κλινικά παθολογικές παραμέτρους. Η αναλογία των CD4 έναντι CD8 επίσης απέτυχε να δείξει οποιαδήποτε κλινική σημασία (Πίνακας 1). Επιπλέον, η συχνότητα του ΤΙΜ-3 επί CD8 Τ κύτταρα δεν εμφάνισαν καμία κλινική σημασία (Πίνακας 2). Αντίθετα, η υψηλότερη συχνότητα του ΤΙΜ-3

+ CD4

+ TILs έδειξε σημαντική συσχέτιση με μετάσταση λεμφαδένα και πιο προχωρημένα στάδια καρκίνου (Πίνακας 2). Έτσι, η έκφραση TIM-3 σε CD4

+ TILs συνδέεται με την εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα.

Η

Εκτός από την ανθρώπινη FoxP3

+ TILs, εξετάσαμε την Tim-3 έκφραση στο ποντίκι Foxp3

+ TILs. Χρησιμοποιήσαμε το μοντέλο Β16, διότι Tim-3

+ CD4

+ TILs έχουν περιγραφεί πρόσφατα σε αυτό το μοντέλο [5]. Εντός του όγκου Β16, βρήκαμε περίπου το 50% του Foxp3

+ CD4

+ TILs εκφράζεται Tim-3 (Εικ. 5). Σε αντίθεση, Foxp3

-CD4

+ TILs εξέφρασε αμελητέα επίπεδα του Tim-3 (Εικ. 5). Tim-3 εκφράστηκε σε ελάχιστα επίπεδα στον σπλήνα και λεμφαδένα CD4

+ Τ κύτταρα ανεξάρτητα από την έκφραση Foxp3 (Εικ. 5). Έτσι, Tim-3 είναι κυρίως παρόν σε ένα υποσύνολο του Foxp3

+ CD4

+ ρυθμιστικά Τ κύτταρα σε δύο όγκους ανθρώπου και ποντικού.

6-8 εβδομάδων C57BL /6 ποντικοί ήταν εμβολιάστηκαν με 2 χ 10

5 Β 16F0 κύτταρα id, δείγματα όγκων, σπλήνες, και οι λεμφαδένες απομακρύνθηκαν όταν τα μεγέθη των όγκων έφθασε περίπου 15 mm σε διάμετρο κατά την ημέρα 20. TILs, σπληνοκύτταρα και κύτταρα λεμφαδένων απομονώθηκαν για ανάλυση με τη ροή κυτταρομετρία. Tim-3 έκφραση στο ποντίκι CD4

+ Foxp3

+ ή CD4

+ Foxp3

– Τ κύτταρα φαίνεται. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά των πέντε ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε TIM-3 έκφρασης σε TILs από δείγματα NSCLC. Βρήκαμε τα υψηλά επίπεδα της TIM-3 έκφραση τόσο CD4

+ και CD8

+ TILs. Είναι σημαντικό ότι, αν και η έκφραση της ΤΙΜ-3 επιφάνεια έχει αναφερθεί για να υποδείξει μια λειτουργικά ανεργικά κατάσταση του CD8

+ TILs, βρήκαμε ότι ΤΙΜ-3 έκφραση σε CD8

+ TILs απέτυχε να συνδέσει με κλινικοπαθολογικών παραμέτρων στον καρκίνο του πνεύμονα, ωστόσο, η συχνότητα της TIM-3 έκφραση CD4

+ TILs είχε συνδέσει με λεμφαδένα μετάσταση και πιο προχωρημένα στάδια του καρκίνου. Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε ότι TIM-3

+ CD4

+ Τ κύτταρα ήταν κυρίως FoxP3

+ και την πλειοψηφία των Foxp3

+ CD4

+ Τ κύτταρα εξέφρασαν TIM-3. Η μελέτη μας αποκαλύπτει ένα νέο ρόλο της TIM-3 στο μικροπεριβάλλον του όγκου μέσω κυρίαρχη έκφραση του σε ρυθμιστικά Τ κύτταρα.

Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι έχουμε βρει την έκφραση της TIM-3 σε ένα μεγάλο ποσοστό των Tregs στο εσωτερικό του καρκίνου του πνεύμονα ιστούς. εξόρυξη δεδομένων μας έδειξαν επίσης ότι ο Tim-3 mRNA εκφράστηκε σε φυσικό Foxp3

+ CD4

+ Τ κύτταρα τα οποία έχουν επίκτητα μεταφερθεί σε ποντίκια με έλλειψη RAG1 και Foxp3 απαιτείται για Tim-3 έκφραση σε αυτά τα κύτταρα Treg (Εικόνα S2) [17], γεγονός που υποδηλώνει Tim-3 έκφρασης σε Tregs μπορεί να είναι ένα αναπόσπαστο μέρος της Foxp3 ρυθμιζόμενων δικτύου εντός φυσικά Tregs. Δείξαμε επίσης ότι ΤΙΜ-3 δεν εκφράζεται ιδιοσυστατικώς από Tregs στο ανθρώπινο περιφερικό αίμα, αλλά μπορεί να επαχθεί κατά TCR διέγερση. Ο λόγος που TIM-3 εκφράζεται έντονα στο FoxP3

+ CD4

+ TILs μπορεί να οφείλεται σε συνεχή διέγερση από αντιγόνα που σχετίζονται με όγκο μέσα στην περιοχή του όγκου.

Ο ακριβής ρόλος της TIM-3 ο όγκος διεισδύοντας Tregs δεν είναι ακόμα γνωστός. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η TIM-3

+ Tregs στην πνευμονική ιστούς του καρκίνου θα μπορούσαν να προέρχονται από φυσικές Tregs κατά την χρόνια διέγερση του TCR από τα αντιγόνα του όγκου. PD-1 συνδέτη B7-H1 και ΤΙΜ-3 συνδέτες όπως γαλεκτίνης-9 και αποπτωτικών κυττάρων εντός του ιστού του όγκου μπορεί να είναι σημαντική για τη διατήρηση του αριθμού και της λειτουργίας των ΤΙΜ-3

+ PD-1

+ Tregs. Στη ρύθμιση μεταμόσχευσης, Tim-3 δείχθηκε να ρυθμίσει αλλοειδική ενεργοποίηση Treg [14]. Αποδείχθηκε ότι Tim-3-Tim-3L ευαίσθητη μονοπάτι συμμετείχε στη λειτουργική δημιουργία δότη-ειδικών Tregs κατά τη χορήγηση καθίσταται ανεκτικό θεραπείες [14]. Συνεπής με αυτή την ιδέα, Tim-3 έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι εκφράζεται σε περίπου 15% των Foxp3

+ κύτταρα Treg στον σπλήνα κατά τη διάρκεια της αλλο-μεταμόσχευσης [18]. Η μελέτη μας, αποκαλύπτοντας τα υψηλά επίπεδα της TIM-3 έκφραση Tregs εντός όγκου ανθρώπου, δείχνει ότι TIM-3 μπορεί να παίζει άμεσο ρόλο στην λειτουργική ωρίμανση των διηθούν όγκο Tregs παρέχοντας ένα σήμα μέσα Tregs ή μπορεί να είναι σημαντική για τη διατήρηση της ανοσοκατασταλτικής λειτουργία αυτών των Tregs στο μικροπεριβάλλον του όγκου.

Εκτός από τα φυσικά Tregs, TIM-3 και PD-1 μπορεί επίσης να διαδραματίσει έναν ρόλο στην παραγωγή της προσαρμοστικής Tregs. Στην πραγματικότητα, PD-1 συνδέτη δείχθηκε ότι εμπλέκεται στην παραγωγή της προσαρμοστικής Tregs στον όγκο λεμφαδένες παροχέτευσης [19]. Γαλεκτίνης-9 αποδείχθηκε ότι αυξάνει ελαφρώς την έκφραση Foxp3 in vitro μοντέλο της επαγωγής Tregs από τον TGF-β [18], [20]. Είτε το Tregs βρέθηκαν στις μελέτες μας είναι προσαρμοστική ή φυσικά Treg θα αποτελέσει αντικείμενο περαιτέρω μελέτης.

TIM-3 έχει αναδειχθεί ως ένα υποσχόμενο στόχο για την ανοσοθεραπεία του καρκίνου [21]. Πρόσφατες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στο ρόλο της ΤΙΜ-3 έκφραση σε CD8

+ Τ κυττάρων στο περιφερικό αίμα, καθώς και στους όγκους [4], [5]. Αυτά μελέτη κομψά έδειξε ότι TIM-3 σήματα λειτουργικά εξαντληθεί CD8

+ Τ κυττάρων και είναι πιθανόν υπεύθυνο για την αποτυχία της ανοσολογικής και του όγκου του εμβολιασμού. Η μελέτη μας δείχνει ότι η έκφραση του ΤΙΜ-3 επί CD4

+ κύτταρα TILs σχετίζονται σημαντικά με χειρότερο κλινικό παθολογικές παράμετροι στον καρκίνο του πνεύμονα. Ως εκ τούτου, ΤΙΜ-3 πιθανόν παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην πρόοδο του όγκου με διατήρηση της ανοσοκατασταλτικής όγκου περιβάλλον μέσω Tregs. Περαιτέρω χαρακτηρισμός της TIM-3 έκφρασης και λειτουργία μέσα σε διάφορα TILs υποσύνολα θα πρέπει να βελτιώσουν τις γνώσεις μας των υποκείμενων μηχανισμών της TIM-3-ανοσοκαταστολή στο μικροπεριβάλλον του όγκου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

TIM-3 έκφρασης με κυτταρομετρία ροής. Tumor διηθητικά λεμφοκύτταρα (TILs) συλλέχθηκαν από τους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα, δίπλα φυσιολογικούς ιστούς, και κυττάρων περιφερικού αίματος monouclear (PBMCs) από ολικό αίμα των ασθενών. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν για CD4 και ΤΙΜ-3 ή CD4 συν ένα αντίσωμα IgG ελέγχου. Τα κύτταρα στην λεμφοκυτταρική πύλη αναλύθηκαν περαιτέρω για CD4 και έκφραση ΤΙΜ-3

doi:. 10.1371 /journal.pone.0030676.s001

(ΡΡΤ)

Εικόνα S2.

Tim-3 έκφρασης στη μητρική Tregs και την εξάρτησή της από Foxp3. της βάσης δεδομένων προφίλ NCBI GEO είχε ερωτηθεί για Tim-3 έκφρασης σε Tregs. Ένα αποτέλεσμα έδειξε ότι Tim-3 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε Foxp3 ανεπαρκή εγγενή Tregs όπως φαίνεται εδώ. DataSet Εγγραφή GDS2525

doi:. 10.1371 /journal.pone.0030676.s002

(PPT)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω Δρ. Olivera Finn, ο Larry Kane, και Lujun Chen για την ανάγνωση του χειρογράφου και χρήσιμη συζήτηση.