Αφηρημένο

Ιστορικό

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) έχει μια θλιβερή πρόγνωση . Ο υψηλός κίνδυνος υποτροπής μετά από χειρουργική εκτομή παρέχει τη λογική για επικουρική θεραπεία. Ωστόσο, μόνο ένα υποσύνολο των ασθενών να επωφεληθούν από επικουρική θεραπεία. Προσδιορισμός των μοριακών δεικτών για την πρόβλεψη έκβαση της θεραπείας είναι, συνεπώς, δικαιολογημένη. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογήσει κατά πόσον η έκφραση των νέων υποψήφιων βιοδεικτών, συμπεριλαμβανομένων των microRNAs, μπορεί να προβλέψει την κλινική έκβαση σε PDAC ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με επικουρική θεραπεία.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

φορμόλη-σταθερό ενσωματωμένα σε παραφίνη δείγματα από μία κοόρτη 82 εκτομή Κορέας PDAC περιπτώσεις αναλύθηκαν για έκφραση πρωτεΐνης με ανοσοϊστοχημεία και για έκφραση microRNA χρησιμοποιώντας ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. Αναλογικών κινδύνων κατά Cox μοντέλο ανάλυσης στην υποομάδα των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με επικουρική θεραπεία (Ν = 52) έδειξε ότι η χαμηλότερη από διάμεση miR-21 έκφραση συσχετίστηκε με σημαντικά χαμηλότερη αναλογία κινδύνου (HR) για θάνατο (HR = 0,316? 95% CI = 0,166 έως 0,600? P = 0.0004) και στην επανάληψη (HR = 0,521? 95% CI = 0,280 – 0,967? P = 0.04). κατάσταση έκφρασης MiR-21 αναδείχθηκε ως η πιο έξυπνη βιοδείκτη για την έκβαση της θεραπείας μεταξύ όλων των 27 βιολογικές και 9 κλινικοπαθολογικών παράγοντες που αξιολογούνται. Καμία σημαντική συσχέτιση ανιχνεύθηκε σε ασθενείς που δεν έλαβαν θεραπεία με επικουρική θεραπεία. Σε μια ανεξάρτητη επικύρωση ομάδα των 45 κατεψυγμένων PDAC ιστούς από την ιταλική περιπτώσεις, όλα αντιμετωπίζονται με επικουρική θεραπεία, χαμηλότερες από διάμεση έκφραση του miR-21 επιβεβαιώθηκε να συσχετίζεται με μεγαλύτερη συνολική, καθώς και την ελεύθερη νόσου επιβίωση. Επιπλέον, η επιμόλυνση με αντι-miR-21 ενισχύεται το χημειοευαισθησία των κυττάρων PDAC.

Συμπεράσματα Σημασία

miR-21 έκφρασης Χαμηλή συσχετίστηκε με όφελος από την επικουρική θεραπεία σε δύο ανεξάρτητες ομάδες των PDAC περιπτώσεις, και αντι-miR-21 αυξημένη δραστηριότητα αντικαρκινικό φάρμακο

in vitro

. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν ενδείξεις ότι το miR-21 μπορεί να επιτρέψει διαστρωμάτωση για επικουρική θεραπεία, και αντιπροσωπεύει ένα νέο δυνητικό στόχο για θεραπεία σε PDAC

Παράθεση:. Hwang JH, Voortman J, Giovannetti Ε, Steinberg SM, Leon LG, Κιμ YT, et al. (2010) Ταυτοποίηση των microRNA-21 ως βιοδεικτών για χημειοαντίσταση και της κλινικής έκβασης Μετά Επικουρική θεραπεία με χειρουργήσιμο καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 5 (5): e10630. doi: 10.1371 /journal.pone.0010630

Επιμέλεια: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Γερμανία

Ελήφθη: 23 Γενάρη του 2010? Αποδεκτές: 20, Απρίλη του 2010? Δημοσιεύθηκε: 14, Μάη 2010

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της δήλωσης Creative Commons Public Domain που ορίζει ότι, μόλις τοποθετηθεί στο δημόσιο τομέα, το έργο αυτό μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο σκοπό

Χρηματοδότηση:. Εν μέρει χρηματοδοτήθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, το πρόγραμμα των τειχών Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος είναι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου που σχετίζονται με τον καρκίνο και τις τελευταίες δεκαετίες μικρή βελτίωση στην επιβίωση έχει παρατηρηθεί παρά τις εκτεταμένες ερευνητικές προσπάθειες [1]. Περίπου το 95% των εξωκρινών παγκρεατικών καρκίνων είναι παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα (PDAC), εκ των οποίων συχνότητα έχει αυξηθεί σταθερά κατά τις τελευταίες δεκαετίες [1], [2]. Η χειρουργική επέμβαση είναι εφικτή σε 15-20% των ασθενών, αλλά, ακόμη και μετά την πλήρη εκτομή, η πρόγνωση παραμένει ζοφερή, με ένα ποσοστό επιβίωσης 5 ετών υστερεί σε 10-20% [3].

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι εμφανώς ανθεκτικό σε χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία. Επικουρική θεραπεία είναι συγκρατημένα αποτελεσματική και μπορεί να έχει σημαντικές τοξικότητες. Ως εκ τούτου, ο ρόλος της επικουρικής θεραπείας σε χειρουργήσιμη καρκίνο του παγκρέατος είναι ακόμα ασαφής, αν και γενικά πιστεύεται ότι ωφελήσει ένα υποσύνολο των ασθενών [4], [5]. Να είσαι σε θέση να εντοπίσει αυτό το υποσύνολο θα ήταν μια μεγάλη πρόοδος στη διαχείριση της ασθένειας αυτής, δεδομένου ότι θα επιτρέψει τη διαστρωμάτωση των ασθενών για την επικουρική θεραπεία [6]. Ως εκ τούτου, η έξυπνη δείκτες ευαισθησίας σε επικουρική θεραπεία, καθώς και νέων θεραπευτικών στόχων χρειάζονται επειγόντως σε αυτή τη νόσο [7], [8].

Η αλλαγμένη έκφραση διαφόρων παραγόντων έχει συνδεθεί με PDAC επιθετική συμπεριφορά και την πρόγνωση. Για παράδειγμα, μεταξύ όλων των καρκίνων, PDAC έχει την υψηλότερη συχνότητα του

K-Ras

μεταλλάξεις, η οποία οδήγησε σε υποθέσεις σχετικά με την εφαρμογή της ως διαγνωστικό, καθώς και ένα προγνωστικό δείκτη [7]. Το προϊόν πρωτεΐνης του

K-Ras

είναι ένα GTP πρωτεΐνης δέσμευσης μεσολαβεί μια σειρά από κρίσιμες κυτταρικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού, των κυττάρων επιβίωση και κινητικότητα. Ωστόσο, τα περισσότερα από τα στοιχεία, μέχρι στιγμής, δείχνει ότι

K-ras μεταλλάξεις

δεν σχετίζονται με την επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος [9], [10]. Άλλες μελέτες πρότειναν την προγνωστική σημασία αλλοιωμένης έκφρασης των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης Ras, όπως Akt. Παρ ‘όλα αυτά, φωσφορυλιωμένο Akt επίπεδα έκφρασης συσχετίστηκαν με τόσο μικρότερες και μεγαλύτερες επιβίωση σε ασθενείς PDAC χειρουργήσιμη [11], [12]. Άλλοι δείκτες αναφέρονται ως ανεξάρτητοι προγνωστικοί του PDAC πρόγνωση περιλαμβάνουν ρ16, μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας 7 (ΜΜΡ-7) και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) έκφραση [13]. Ακόμα, πολλές βιολογικές πτυχές που διέπουν την ασθένεια αυτή είναι ακόμη πλήρως κατανοητό και κανένας μεμονωμένος δείκτης έχει αποδειχθεί για να προβλέψει με ακρίβεια την κλινική έκβαση.

Τα τελευταία χρόνια, έχει γίνει σαφές ότι η έκφραση της πρωτεΐνης μπορεί επίσης να ρυθμίζεται από microRNAs (miRNAs ) [14]. Τα microRNAs είναι μια κατηγορία από μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs που αλληλεπιδρούν με τα mRNAs που κωδικοποιούν τα γονίδια του να κατευθύνουν μεταγραφικούς καταστολή τους [15]. MicroRNA έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκονται στην ογκογένεση και ανάπτυξη όγκου, και επίσης να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην χημειοαντίσταση [16] – [19]

Επιπλέον, η έκφραση του microRNAs είναι ειδικό ιστό, και ορισμένες histotypes καρκίνου. μπορούν να ταξινομηθούν με βάση τα προφίλ έκφρασης microRNA [20], [21]. Στον καρκίνο του παγκρέατος, αρκετές miRNAs αναφερθεί ότι εκφράζεται ανωμάλως, συμπεριλαμβανομένων microRNAs με βασικούς ρόλους στον καρκίνο, όπως «ογκο (γονιδιακή) -miRs», miR-21 και miR-155, και «Mirs ογκοκατασταλτικών», ΜΙΚ 29β και το miR-34 και Ας-7 οικογένειες [22] – [29]. Προκλινικές μελέτες σε κύτταρα PDAC έδειξαν ότι η εξωγενής miR-34 υπερέκφραση συνδέθηκε με την ανασύσταση του ρ53-εξαρτώμενη λειτουργία καταστολέα όγκου σε ρ53-ελλειπή κύτταρα καθώς και την αναστολή της παγκρεατικής αυτο-ανανέωσης των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου [30]. Up-ρύθμιση του Let-7 συνδέεται με αντιστροφή των επιθηλιακών να μεσεγχυματικών μετάβαση (ΕΜΤ) σε γεμσιταβίνη-ανθεκτικά κύτταρα [31]. MicroRNA-29b μπορούν να στοχεύσουν de ηονο DNA μεθυλοτρανσφεράση 3Α και 3Β (Dnmt3a και DNMT3B) και να οδηγήσει σε παγκόσμια υπομεθυλίωση και υπερέκφραση διαφόρων ογκοκατασταλτικών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των ρ16 [32]. έκφραση microRNA-21 συσχετίζεται με αυξημένο πολλαπλασιασμό, επεμβατική ιδιότητες, και gemcitabine χημειοαντίσταση και μία προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι οι υψηλές miR-21 έκφραση, όπως προσδιορίζεται με in situ υβριδοποίηση, ήταν προβλεπτική βραχύτερη επιβίωση σε ασθενείς αρνητικούς λεμφαδένες PDAC [28], [33]. MicroRNA-155 εμπλέκεται στην καταστολή του

πρωτεΐνης όγκου 53 επαγόμενη πυρηνική πρωτεΐνη 1

, η οποία είναι ένα προ-αποπτωτικών γονίδιο στόχος ρ53 στρες που προκαλείται και μια αρνητική προγνωστική επίδραση της υψηλής έκφρασης miR-155 παρατηρήθηκε σε μία κοόρτη της PDAC περιπτώσεις συμπεριλαμβανομένων των ασθενών με προχωρημένη νόσο και /ή τοπικό R2-εκτομή [34], [35].

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογήσει τους πιθανούς βιολογικούς δείκτες για να προβλέψετε το αποτέλεσμα από την επικουρική χημειοθεραπεία. Ως εκ τούτου, έχουμε διενεργήσει ολοκληρωμένη ανάλυση της έκφρασης του miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, miR-155 και αφήστε-7α-2 σε μια σειρά ασθενών PDAC, με γνωστή παθολογική και τη θεραπεία χαρακτηριστικά . Επιπρόσθετα, ερευνήσαμε την έκφραση του 20 γνωστό δυναμικό πρωτεϊνικών δεικτών και στόχων για τη θεραπεία, που εμπλέκονται στην PDAC εξέλιξη και πρόγνωση (Βλέπε Πίνακα S1 για μια πλήρη επισκόπηση των 27 βιολογικών και 9 κλινικοπαθολογικών παράγοντες που χρησιμοποιούνται στη μελέτη) [6], [13 ]. Δεδομένου ότι το καθεστώς έκφραση miR-21 αναδείχθηκε ως η πιο προγνωστική βιοδείκτη για την έκβαση της θεραπείας από όλους τους παράγοντες που αξιολογούνται σε ασθενείς που έλαβαν έκδοχο, περαιτέρω ανάλυση του miR-21 έκφραση εκτελέστηκε σε μία δεύτερη ομάδα από 45 ασθενείς, οι οποίοι λάμβαναν επικουρική θεραπεία. Αυτό το ανεξάρτητο σύνολο επιβεβαίωσε τη σημαντική συσχέτιση του miR-21 κατάσταση έκφραση τόσο με την επιβίωση και την επιβίωση ελεύθερη νόσου. Επιπλέον, η σύνδεση της χαμηλής miR-21 έκφρασης με όφελος από την επικουρική θεραπεία υποστηρίχθηκε από

in vitro

δεδομένα που δείχνουν την αυξημένη χημειοευαισθησία των κυττάρων PDAC μετά από επιμόλυνση με αντι-miR-21.

μέθοδοι

οι συμμετέχοντες, κέντρα μελέτης, λεπτομέρειες της θεραπείας

διακόσια σαράντα πέντε ασθενείς που υποβλήθηκαν σε εκτομή του παγκρέατος καρκίνου με την τελική διάγνωση του καρκίνου του παγκρέατος ήταν αναδρομικά χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικά ιατρικά αρχεία κατά τη διάρκεια της περιόδου 1999-2007 στο Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ Νοσοκομείο και το Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ Bundang Νοσοκομείο. Μεταξύ αυτών, ογδόντα δύο ασθενείς είχαν υποστεί εκτομή εντελώς (R0) αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος και συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Παθολογικό στάδιο του όγκου προσδιορίστηκε σύμφωνα με την αμερικανική μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο (AJCC) σταδιοποίηση του καρκίνου, 6

η έκδοση [36]. Εν συντομία, σε παθολογικές στάδια T1-2 (pT1-2) ανάμειξη του όγκου περιορίζεται στο πάγκρεας, το μέγεθος του όγκου είναι μικρότερη ή μεγαλύτερη από 2 cm για τα στάδια ρΤ1 και ρΤ2, αντίστοιχα. Παθολογικές Τ3 (ρΤ3) όγκοι στάδιο εκτείνονται πέρα ​​από το πάγκρεας, χωρίς τη συμμετοχή του άξονα κοιλιοκάκη ή ανώτερη μεσεντέρια αρτηρία, ενώ οι pT4 όγκοι χαρακτηρίζονται από τη συμμετοχή του άξονα κοιλιοκάκη ή την ανώτερη μεσεντέρια αρτηρία. Όσον αφορά το κομβικό στάδιο λέμφου, παθολογική κομβικών στάδιο 1 (ρΝ1) δείχνει την περιφερειακή μετάσταση λεμφαδένα. Τέλος, Μ1 υποδεικνύει παρουσία απομακρυσμένων μεταστάσεων. στάδια της νόσου Ι, ΙΙΑ, ΙΙΒ, III και IV δείχνουν «pT1-2 PN0 M0», «ρΤ3 N0 M0», «pT1-3 ρΝ1 M0», «pT4 οποιαδήποτε Ν M0» και «οποιαδήποτε pT οποιαδήποτε pN Μ1″, αντίστοιχα . Οι ασθενείς έλαβαν συμπληρωματική χημειοθεραπεία, σε συνδυασμό χημειοακτινοθεραπεία (CCRT) ή και τα δύο (n = 52), ή δεν έλαβαν θεραπεία (n = 27). κατάσταση Θεραπεία τριών ασθενών ήταν άγνωστη. Επικουρική χημειοθεραπεία και χημειο-ακτινοθεραπεία αποτελούνταν από συνδυασμούς gemcitabine ή 5-φθοριοουρακίλη (5-FU). δείγματα FFPE εξετάστηκαν για τη διάγνωση και το περιεχόμενο των όγκων στο Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ Νοσοκομείο, καθώς και στο Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, ΝΙΗ, Bethesda, MD. Η ομάδα επικύρωσης αποτελείτο από κατεψυγμένα δείγματα από 45 συνεχόμενες ιταλική ασθενών αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος διαγιγνώσκονται κατά την περίοδο 2001-2004 στο Περιφερειακό Παραπομπή Κέντρο του παγκρέατος θεραπεία της νόσου, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Πίζας, Πίζα, Ιταλία [37]. Επικουρική θεραπεία αποτελείτο από συνδυασμένη θεραπεία τροπικότητα γεμσιταβίνη-based. Οι λεπτομέρειες του επικουρικού σχήματα που παρατίθενται στον Πίνακα S2.

Ηθική

έγκρισης συναίνεση και τη μελέτη των ασθενών λήφθηκε από τις τοπικές Institutional Review Boards σύμφωνα με τις νομικές διατάξεις των συμμετεχουσών χωρών. Ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από Κορέας ασθενείς που ήταν ακόμη εν ζωή κατά το χρόνο της μελέτης μέσω της τράπεζας ανθρώπινου ιστού. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Ανθρώπου Clinical Research Center. Όσον αφορά την ιταλική ασθενείς, λήφθηκε γραπτή συγκατάθεση. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο της Πίζας Επιτροπής Δεοντολογίας.

Η ανοσοϊστοχημεία

Η έκφραση των 20 δεικτών και στόχων για θεραπεία πρωτεΐνης μελετήθηκαν με ανοσοϊστοχημεία (IHC). Όπως αναφέρεται στον Πίνακα S1 αξιολογήσαμε τα επίπεδα έκφρασης των ακόλουθων δεικτών: αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), μεταλλοπρωτεϊνάση-2 μήτρας (ΜΜΡ2), μεταλλοπρωτεϊνάση-7 μήτρας (ΜΜΡ7), μεταλλοπρωτεϊνάση-9 μήτρας (ΜΜΡ9), αναστολέα ιστού μεταλλοπρωτεϊνάσης-3 (Timp3), υποδοχέα επιδερμικού παράγοντα ανάπτυξης (EGFR), επιδιόρθωση εκτομής ομάδα εγκάρσια συμπληρώσεως 1 (ERCC1), χημειοκίνης (CXC μοτίβο) των υποδοχέων 3 (CXCR3), χημειοκίνης (CXC μοτίβο) των υποδοχέων 4 (CXCR4), αμφιρεγουλίνη, επιρεγουλίνη, ο αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων (HGF), νευροπιλίνη, ινσουλινοειδής αυξητικός παράγοντας 1 βήτα υποδοχέα (IGF-1 R), Ron β, c-Met, φωσφορυλιωμένη-c-Met (Pc-Met), θυμιδυλική συνθάση (TS), Ε -cadherin, και ριβονουκλεοτιδική υπομονάδα αναγωγάσης M1 (RRM1). Tissue μικροσυστοιχία (TMA) τμήματα κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας βιοψίες πυρήνα ιστού (διαμέτρου 2 mm) ελήφθη από άτομο Κορέας δείγματα καρκίνου του παγκρέατος ενσωματωμένες σε παραφίνη. Βιοψίες που περιλαμβάνονται στο νέο μπλοκ παραλήπτη παραφίνης χρησιμοποιώντας μια συσκευή τρυπάνι (Superbiochips Laboratories, Σεούλ, Δημοκρατία της Κορέας). Κάθε μπλοκ ιστικού πίνακα περιέχονται μέχρι 50 πυρήνες και 2 τετράγωνα συστοιχία παρασκευάστηκαν κατά τη διάρκεια της μελέτης.

τομές TMA αποπαραφινοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν σε αλκοόλη και χρωματίζονται με ειδικά αντισώματα, όπως παρατίθενται στον Πίνακα S3. Για ERCC1, το H-βαθμολογία υποδεικνύει ένταση χρώσης (0 έως 3) πολλαπλασιαζόμενη με τον συντελεστή που καθορίζεται από την αναλογία των θετικών κυττάρων: 0 αν 0% θετικά κύτταρα, 0,1 εάν 1-9%, 0,5 εάν 10-49%, 1 αν & gt? 50% θετικά κύτταρα. Για όλους τους άλλους παράγοντες, θετική χρώση εννοείται μια ένταση του σήματος είναι ίση ή μεγαλύτερη από 2 και περισσότερο από το 20% των θετικών κυττάρων.

έκφραση microRNA

RNA απομονώθηκε από τομές FFPE χρησιμοποιώντας το RecoverAll Σύνολο Nucleic οξύ κιτ απομόνωσης (Ambion, Austin, ΤΧ) και από κατεψυγμένες τομές ιστού όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [38]. RNA (10-100 ng) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της έκφρασης του miR-21 (ιταλική ομάδα) ή miR-21, miR-29, miR-34a /b /c, αφήστε-7α-2, και miR-155 (κορεατική ομάδα ) με ποσοτική Real-Time PCR (qRT-PCR) με αναλύσεις TaqMan-microRNA και τα 7900 HT-Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιώντας μικρές U66 πυρηνικά RNA ή RNU43, καθώς οι ενδογενείς ελέγχους εξομάλυνση για οι Κορέας και ιταλικά δείγματα, αντίστοιχα. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα αποτελέσματα τα οποία δεν πληρούσαν μεθοδολογικά κριτήρια ποιοτικού ελέγχου παραλείφθηκαν. Ποσοτικοποίηση της σχετική έκφραση microRNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας την μέθοδο δέλτα Ct. Έκφραση προσδιορίστηκε ως υψηλή όταν το επίπεδο έκφρασης ήταν ίση ή πάνω από τη μέση της κλάσης και χαμηλή όταν ήταν κάτω από τη μέση της κλάσης.

In vitro μελέτες

Τα ανθρώπινα κύτταρα PDAC γραμμές BxPC3 , ΗΡΑΡ-ΙΙ, HPAC, PANC-1 και PL45 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), και καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640, συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% πενικιλίνη (50 IU /ml) και στρεπτομυκίνη (50 μg /mL) (Gibco, Gaithersburg, MD). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C υπό ατμόσφαιρα 5% CO

2 σε 75-cm

2 φιάλες καλλιέργειας ιστού (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany) και συλλέχθηκαν με τρυψίνη-ΕϋΤΑ σε τους εκθετικά αυξανόμενη φάση. RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο ΤπζοΙ-χλωροφόρμιο (Sigma, St. Louis, ΜΟ). RNA αποδόσεις και ακεραιότητα ελέγχθηκαν με μέτρηση της οπτικής πυκνότητας στα 260/280 nm με φασματοφωτόμετρο Nanodrop®.

Η βασική έκφραση του miR-21 εκτιμήθηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR, όπως περιγράφεται ανωτέρω για τους ιστούς PDAC . Ποσοτικοποίηση της έκφρασης miR-21 πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το δέλτα μέθοδο Ct, κανονικοποίηση των δεδομένων ενίσχυση Ct με RNU43. Σχετικά επίπεδα έκφρασης miR-21 εκφράσθηκαν σε αυθαίρετες μονάδες (AU).

αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων από την 5-FU (0.1-1000 μΜ), και γεμσιταβίνη (0,1-1000 ηΜ) συν ακτινοβολία (100 cGy), προσδιορίστηκε από τρία ξεχωριστά πειράματα χρησιμοποιώντας το SRB (σουλφοροδαμίνη Β) δοκιμασία, και εκφράστηκε ως το ποσοστό ελέγχου (κύτταρα υπό αγωγή με όχημα) απορρόφησης, διορθωμένη για απορρόφηση, πριν από την προσθήκη του φαρμάκου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [39]. Για την ακτινοβόληση, εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα απλώθηκαν σε δίσκους των 100 mm καλλιέργειας ιστού (Costar), αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες, και ακτινοβολείται με τη χρησιμοποίηση ενός 6 MV φωτόνιο γραμμικό επιταχυντή (General Electric, Buckinghamshire, UK). Μετά την ακτινοβολία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και 10

4 κύτταρα /φρεάτιο απλώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και αφέθηκαν να αναπτυχθούν επί άλλες 48 ώρες σε μέσο χωρίς φάρμακο ή αγωγή με γεμσιταβίνη, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [40]. Η 50% ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) της κυτταρικής ανάπτυξης για κάθε κυτταρική γραμμή προσδιορίσθηκε με μη γραμμική ελαχίστων τετραγώνων προσαρμογής καμπύλης των καμπυλών δόσης-απόκρισης (GraphPad PRISM έκδοση 5, έξυπνο λογισμικό για την επιστήμη, San Diego, CA ). Η επίδραση της miR-21 στην κυτταρική ανάπτυξη και χημειοευαισθησία αξιολογήθηκε με επιμόλυνση των κυττάρων με τα αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια (αντι-miR-21) αγοράστηκε από την Ambion-Applied Biosystems (Δοκιμασία ID, AM10206), στα 30 ηΜ τελική συγκέντρωση. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε 200 000 κύτταρα /φρεάτιο σε 3 ml RPMI με 10% FBS και 1% αντιβιοτικά. Μετά από 24 ώρες τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 9 μΙ Oligofectamine (Invitrogen, Paisley, UK) σε μέσο ελεύθερο ορού, αναμίχθηκαν για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από την προσθήκη 3 μΐ 6.25 μΜ miR-21 προδρόμου ή αναστολέα. Τα κύτταρα επωάστηκαν επίσης με miRNA αρνητικούς μάρτυρες και FAM-επισημασμένο αντι-Mir (Ambion). Μετά από 24 ώρες το μέσο απομακρύνθηκε από τα φρεάτια και αντικαταστάθηκε με RPMI με 10% FBS, χωρίς αντιβιοτικά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και μεταφέρθηκαν σε μια πλάκα 96 φρεατίων, όπου αφέθηκαν να αναπτυχθούν επί άλλες 48 ώρες σε μέσο χωρίς φάρμακο ή θεραπεία με 5-FU, όπως περιγράφεται παραπάνω. Πρόσθετες φρεάτια ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν για την εκχύλιση του RNA, όπως περιγράφεται παραπάνω, ενώ η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης με FAM-επισημασμένο ελέγχους αντι-mir αξιολογήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού.

Στατιστικές μέθοδοι

Συγκρίσεις διχοτομικής παράμετροι ήταν μεταξύ δύο ομάδες χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher. Μια γενικευμένη εκδοχή του ακριβές τεστ του Fisher χρησιμοποιήθηκε για συγκρίσεις ηλικία, το στάδιο του όγκου και τον βαθμό διαφοροποίησης όταν διαιρεθεί σε τρεις κατηγορίες [41]. Η πιθανότητα συνολική επιβίωση (OS) ή ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) ως συνάρτηση του χρόνου προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο Kaplan-Meier, με ένα τεστ log-rank χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της στατιστικής σημαντικότητας της διαφοράς των καμπυλών Kaplan-Meier [42], [43] Για τους μονομεταβλητών προγνωστικούς παράγοντες αναλύσεις, τις περιπτώσεις στις οποίες οι ασθενείς τελικά ομαδοποιούνται σε δύο κατηγορίες, που καθορίζεται μετά από προκαταρκτική αξιολόγηση των τεσσάρων κατηγοριών χρησιμοποιώντας τα τεταρτημόρια της κατανομής της παραμέτρου ομαδοποίηση, είχε την τιμή p ρυθμίζεται από πολλαπλασιάζοντας την αδιόρθωτη p-value από τρεις. Αυτό θα αντιπροσωπεύουν την έμμεση δοκιμή η οποία κατέληξε σε απόφαση να τοποθετήσει τους ασθενείς σε δύο κατηγορίες με μεγαλύτερη προγνωστική διαφορά μεταξύ των ομάδων. Μια αναλογικών κινδύνων κατά Cox μοντέλο ανάλυση έγινε για να καθορίσει την κοινή ένωση των παραγόντων που αρχικά βρέθηκε να έχει πιθανή συσχέτιση με την έκβαση των μονομεταβλητών αναλύσεις (αξιολόγηση σε αυτό το

τελικό μοντέλο

μόνο εκείνες τις παραμέτρους με μη διορθωμένη p & lt? 0.10 από ένα αρχείο καταγραφής -rank δοκιμή) [44]. Όλες οι p-τιμές είναι δύο-ουρά, και εκτός από όπως σημειώνεται παραπάνω, παρουσιάζονται χωρίς προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις.

Όλα

in vitro

πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσες τιμές ± SE και αναλύθηκαν με δοκιμή t του Student και /ή δοκιμή Mann Whitney. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο p & lt? 0,05

Αποτελέσματα

χαρακτηριστικά των ασθενών

Ο Πίνακας 1 συνοψίζει κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικά.. Στα Κορέας ασθενείς, διάμεση OS και DFS ήταν 18,1 και 9,1 μήνες αντίστοιχα. Σε αυτή την ομάδα OS ήταν σημαντικά μεγαλύτερη για τους ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με επικουρική χημειοθεραπεία και /ή CCRT (n = 52): διάμεση επιβίωση ήταν 21,3 έναντι 14,7 μήνες για τους ασθενείς που έλαβαν θεραπεία εναντίον δεν αντιμετωπίζονται με επικουρική θεραπεία (n = 27)? p = 0,017. Δείτε το Σχήμα S1 για Kaplan-Meier οικόπεδα.

Η

Αποτελέσματα ανάλυσης Έκφραση

Η έκφραση του miR-21, miR-34a, miR-155 και αφήστε-7α ήταν ανιχνεύσιμη σε όλες τις 82 περιπτώσεις και η έκφραση του miR-29b, miR-34b, και miR-34c σε 81, 73 και 80 περιπτώσεις, αντίστοιχα. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι το miR-34b και το μερίδιο miR-34γ το ίδιο υποκινητή μεταγραφής [45], οι τιμές έκφραση αυτών των miRNAs συσχετίστηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αποτελέσματα IHC ήταν διαθέσιμα για νευροπιλίνη και ΜΜΡ-9 σε 80 περιπτώσεις, για αμφιρεγουλίνη, HGF, EGFR και Timp3 σε 79 περιπτώσεις, για Ron, CXCR-3, Ε-καδερίνης, RRM1, IGF-1 R, TS, VEGF, ΜΜΡ-2 και MMP-7 σε 78 περιπτώσεις, για ΟΧΟΚ-4 στις 77 περιπτώσεις, για c-Met και Pc-Met σε 76 περιπτώσεις, για ERCC1 σε 75 περιπτώσεις και για επιρεγουλίνη σε 73 περιπτώσεις.

Όπως περιγράφεται στο τμήμα Μέθοδοι, για κάθε πρωτεΐνη που δέχεται την ένταση χρώσης και το ποσοστό των θετικώς χρωματισμένων κυττάρων. Στο Σχήμα S2, οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των ανοσοϊστοχημική χρώση για Ρ-c-Met απεικονίζεται. Ο Πίνακας 2 συνοψίζει τα αποτελέσματα των ανοσοϊστοχημική χρώση για όλες τις μελετηθεί πρωτεΐνες.

Η

μονοπαραγοντική ανάλυση

Ένα σύνολο των 36 κλινικοπαθολογοανατομικών, microRNA και πρωτεΐνη μεταβλητές αξιολογήθηκαν για την ένωσή τους με το λειτουργικό σύστημα ή DFS στην κορεατική ομάδα. Με βάση την μονοπαραγοντική ανάλυση, ένα σύνολο 10 και 12 παράμετροι ελήφθησαν υπόψη για την αξιολόγηση στα μοντέλα Cox για το OS και DFS, αντίστοιχα (βλέπε Πίνακα S4). Επιλεγμένες παραμέτρους ελέγχθηκαν επίσης σύμφωνα με την κατάσταση επικουρική θεραπεία (Πίνακας S4). Επιπλέον, για κάθε παράμετρο, ο πληθυσμός χωρίστηκε σε 4 ομάδες για σύγκριση: (1) αρνητικός παράμετρο, όχι εναντίον επικουρική θεραπεία (2) αρνητικός παράμετρο, ανοσοενισχυτικό εναντίον θεραπεία (3) θετική παράμετρο, όχι εναντίον επικουρική θεραπεία (4 ) θετική παράμετρο, επικουρική θεραπεία. Πίνακας S4 απαριθμεί μόνο οι συνδυασμοί με μια σχετική τιμή p & lt? 0.10. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η ισχυρή αλληλεπίδραση του miR-21 κατάσταση κατάσταση έκφρασης και επικουρική θεραπεία για το OS και DFS αποδείχθηκε. Χαμηλή miR-21 έκφραση συσχετίστηκε με μεγαλύτερο OS και DFS σε ασθενείς υπό θεραπεία ανοσοενισχυτικό, με ρ-τιμές των 0,016 και 0,02, αντίστοιχα, αλλά όχι σε ασθενείς που δεν έλαβαν θεραπεία με επικουρική θεραπεία (ρ-τιμές 0,49 και 0,93, αντίστοιχα). Αυτή η διαφορική σχέση μεταξύ miR-21 και η θεραπεία κατάσταση υποστηρίχθηκε από τη σύγκριση της υποομάδας της χαμηλής miR-21, ασθενείς που έλαβαν θεραπεία επικουρική εναντίον τους υπόλοιπους ασθενείς. Η ομάδα των ασθενών με χαμηλό miR-21 που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με επικουρική θεραπεία είχαν διάμεσο OS και DFS των 27,7 και 16,2 μήνες αντίστοιχα. Υπόλοιπους ασθενείς είχαν διάμεση OS 14.3 και DFS των 7,0 μηνών, με p-τιμές 0,002 για το OS, και 0.0095 για DFS. Βλέπε επίσης Σχήμα 1 και στο Σχήμα S3.

Η συνολική επιβίωση, σύμφωνα με miR-21 κατάσταση στο (Α) δεν επικουρική θεραπεία ασθενών και (Β) ασθενείς που έλαβαν έκδοχο. Ελεύθερη νόσου επιβίωση, σύμφωνα με miR-21 κατάσταση στο (C) δεν επικουρική ασθενείς που έλαβαν θεραπεία και (Δ) ασθενείς που έλαβαν θεραπεία ανοσοενισχυτικό.

CENS .: λογοκρίνεται

.

Η

μοντέλα Cox για τη συνολική επιβίωση και την ελεύθερη νόσου επιβίωση

Χρησιμοποιώντας ένα πίσω αλγόριθμο επιλογής, ένα μοντέλο Cox κατασκευάστηκε παραμέτρους που περιέχουν αυτή βρέθηκαν να συνδέονται από κοινού με το OS. Ένα δεύτερο μοντέλο ταυτοποιήθηκε για προγνωστικούς προσδιορισμό της DFS (Πίνακες 3 και 4). Από την πολυπαραγοντική ανάλυση μεταξύ όλων των ασθενών, ως την πιο σημαντική συσχέτιση παράμετρος τόσο για OS και DFS, οι ασθενείς με χαμηλή miR-21 που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με επικουρική θεραπεία έδειξαν να έχουν σημαντικά χαμηλότερη αναλογία κινδύνου (HR) για θάνατο (0.443, 95% CI: 0,263 – 0,748? p-value, 0.002) και για υποτροπή (0,358, 95% CI: 0,188 – 0,682? p-value: 0.002) σε σύγκριση με όλους τους υπόλοιπους ασθενείς. Αντίθετα, σε ασθενείς που δεν έλαβαν θεραπεία με επικουρική θεραπεία, χαμηλότερες από διάμεση miR-21 έκφραση δεν συσχετίστηκε με σημαντικά διαφορετική HR για το θάνατο ή την επανάληψη των 0.880, p-τιμές 0,76 και 0,30, αντίστοιχα.

Η

Σύγκριση συμπαράγοντες σύμφωνα με την επικουρική θεραπεία εναντίον ανεπεξέργαστων ασθενείς

από τις περιπτώσεις που δεν τυχαιοποιήθηκαν για θεραπεία σε αυτή τη μελέτη, θελήσαμε να καθοριστεί εάν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην συμμεταβλητή κατανομή μεταξύ των ασθενών που έλαβαν θεραπεία και δεν αντιμετωπίζεται με επικουρική θεραπεία (Πίνακας S5). Η μόνη σημαντική διαφορά ήταν μικρότερη μέση ηλικία στην ομάδα θεραπείας με ανοσοενισχυτικό σε 61 έτη (εύρος: 45-75 έτη) έναντι 66 χρόνια (εύρος: 49-83 έτη) στην ομάδα χωρίς αγωγή (p-value: 0.002, Wilcoxon δύο δειγμάτων μήκους δοκιμή). Βλέπε Πίνακα S6 για διαφορική έκφραση της πρωτεΐνης. Επιπλέον, κατασκευάσαμε ξεχωριστά μοντέλα Cox για τους ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με επικουρική θεραπεία εναντίον ασθενείς που δεν έλαβαν θεραπεία με επικουρική θεραπεία. Πρώτον, κάναμε μια μονοπαραγοντική ανάλυση και στις δύο ομάδες (Πίνακες S7 και S8). Μοντέλου Cox ανάλυση καταδεικνύει ότι μόνο στην υποομάδα των ασθενών που έλαβαν επικουρική χαμηλή miR-21 κατάσταση σχετίστηκε με σημαντικά χαμηλότερη HR για το θάνατο και την επανάληψη (Πίνακας 5, Πίνακας 6, Πίνακας 7 και Πίνακας 8). Στην υποομάδα των μη επικουρική θεραπεία ασθενών θετικών angiolymphatic εισβολή και την έκφραση του miR-34a πάνω από τη μέση συνδέθηκαν με αυξημένο Ανθρώπινου Δυναμικού για το θάνατο και την επανάληψη, αντίστοιχα, ενώ miR-21 δεν έχουν επαρκώς χαμηλή τιμή p για ένταξη στο τελικό μοντέλο.

η

η

σύγκριση των συμμεταβλητών σύμφωνα με miR-21 έκφρασης

Διανομή κλινικοπαθολογοανατομικών και IHC συμπαράγοντες συγκρίθηκε μεταξύ χαμηλής miR-21 και miR-21 ασθενείς υψηλού, όπως αναφέρεται στον πίνακα 9 και στον πίνακα S9. Η μέση ηλικία στην ομάδα χαμηλού miR-21 ήταν 63 έτη (εύρος: 45 έως 83 ετών), δεν διαφέρει σημαντικά από την υψηλή ομάδα miR-21, μέση ηλικία 64 χρόνια (εύρος: 46-78 έτη), p-value: 0,94 . Ωστόσο, υπήρξε μια τάση προς ένα πιο προχωρημένο στάδιο AJCC (ΙΙα vs IIb) στην ομάδα του υψηλού έκφραση του miR-21 (p-value: 0,07). Ομοίως, υπήρχαν περισσότερες περιπτώσεις με κακή βαθμό διαφοροποίησης στην ομάδα του υψηλού miR-21, αν και αυτή η ομάδα επίσης περιείχε περισσότερες υποθέσεις με καλά διαφοροποιημένο όγκους (Πίνακας 5). Εμείς δεν θα μπορούσε να επιβεβαιώσει μια προηγουμένως αναφερθεί συσχέτιση των miR-21 και της έκφρασης Timp3 [46], ενώ βρήκαμε ότι Pc-Met και της έκφρασης του VEGF ήταν σημαντικά πιο συχνή σε miR-21 υψηλής περιπτώσεις (Πίνακας S9).

Η

Όπως υψηλή έκφραση του miR-34a αποδείχθηκε να σχετίζεται με μειωμένη DFS έχουμε επιπλέον σε σύγκριση με τη διανομή των κλινικοπαθολογοανατομικών και IHC συμπαράγοντες μεταξύ χαμηλής miR-34a και υψηλής ασθενείς miR-34a. Υψηλή έκφραση του miR-34a έντονα σχετίζεται με υψηλή έκφραση της φωσφο-c-Met (p-value: 1x10E-6). Επιπλέον, η υψηλή έκφραση του miR-34a σχετίστηκε με χαμηλή έκφραση του HGF (p-value: 0.01), καθώς και υψηλή έκφραση του VEGF (p-value: 0.01). Τέλος, χαμηλή έκφραση του miR-21 παρατηρήθηκε συχνότερα σε miR-34a χαμηλή περιπτώσεις. (P-value: 3x10E-8)

Υψηλή miR-21 έκφρασης παρουσιάζει συσχέτιση με αυξημένο μακρινό ποσοστό υποτροπής

στη συνέχεια, σε σύγκριση με το ποσοστό των τοπικών εναντίον απομακρυσμένη υποτροπή της νόσου στη χαμηλή έναντι υψηλής ομάδα έκφραση του miR-21. Στην ομάδα έκφραση υψηλού miR-21 25 από 41 ασθενείς (61%) είχαν υποτροπιάζουσα νόσο σε μία απομακρυσμένη θέση η οποία ήταν σημαντικά διαφορετική από την ομάδα έκφραση χαμηλού miR-21 στο οποίο μόνο 12 από 38 ασθενείς (32%? Με 3 ασθενείς έχασαν για παρακολούθηση) αντιμετωπίζουν απομακρυσμένη υποτροπή (p-value: 0.013). Για σύγκριση, στην ομάδα που έλαβε θεραπεία με επικουρική 25 από τους 51 ασθενείς (49%) είχαν υποτροπιάζουσα νόσο. Αυτό δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από την ομάδα που δεν αντιμετωπίζεται με επικουρική θεραπεία με 11 από τους 26 ασθενείς (42%) παρουσίασαν απομακρυσμένη υποτροπή (p-value: 0,63? Με 5/82 ασθενείς που λείπουν λόγω ανεπαρκών στοιχείων)

Αν και δεν είναι στατιστικά σημαντική, υψηλή έκφραση του miR-21 έδειξε επίσης μια τάση προς υψηλότερο στάδιο και η θετική κατάσταση των λεμφαδένων (Πίνακας 5).

Επικύρωση ομάδα

μια σειρά από 45 εκτομή ασθενών αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος , όλα αντιμετωπίζονται με ανοσοενισχυτικό γεμσιταμπίνη, χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση της πρόβλεψης ρόλο του miR-21 έκφρασης σε Καυκάσιους. Διάμεση OS και DFS ήταν 20,4 και 18,7 μήνες, αντίστοιχα. Βλέπε Πίνακα 1 για κλινικοπαθολογικών παραμέτρων (ιταλική ομάδα). έκφραση MiR-21 ήταν ανιχνεύσιμο σε όλα τα δείγματα. Η μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε μια τάση προς σημαντική συσχέτιση μεταξύ της κακής διαφοροποίησης του όγκου και μικρότερη OS (p-value: 0,07), ενώ η εμφάνιση των νευρωνικών διείσδυσης ήταν οριακά συσχετίστηκε με σημαντικά μικρότερη DFS (p-value: 0.047), αλλά όχι OS (ρ τιμή: 0.90), όπως αναφέρεται στον πίνακα S10. Την ηλικία, το φύλο, το στάδιο, λεμφαδένες, και αγγειακή διήθηση δεν συσχετίστηκαν με την έκβαση. Ασθενείς με υψηλή έκφραση του miR-21 είχαν σημαντικά μικρότερη OS, δηλαδή διάμεση τιμή 15,6 έναντι 24,4 μήνες σε ασθενείς με miR-21 επίπεδο έκφρασης κατώτερη μέση (p-value: 0.006). Η διάμεση DFS των ασθενών με υψηλή έκφραση miR-21 ήταν 14,0 μήνες, σε σύγκριση προς 23,8 μήνες σε ασθενείς με την έκφραση χαμηλού miR-21 (τιμή-ρ: 0.0042). Δείτε το Σχήμα 2 για τις καμπύλες Kaplan-Meier. μοντέλα Cox κατασκευάστηκαν το οποίο επιβεβαίωσε τη σύνδεση της κατάστασης έκφρασης miR-21 και η διάρκεια επιβίωσης, με υψηλή έκφραση του miR-21, ως το μόνο που απομένει παράγοντας, σχετίζεται με αυξημένο Ανθρώπινου Δυναμικού για το θάνατο σε 3.538 (95% CI: 1,415 – 8,849? p -τιμή: 0.007) και στην επανάληψη σε 4.008 (95% CI: 1,385 έως 11,595? p-value: 0,01). Συγκεντρωτική ανάλυση των δύο ομάδες επιβεβαίωσαν τη σημαντική προγνωστική σημασία του miR-21 κατάσταση έκφρασης, όπως αναφέρεται στα σχήματα S4 και S5.

(Α) Η συνολική επιβίωση, σύμφωνα με miR-21 κατάσταση και (Β) ελεύθερη νόσου κατάσταση επιβίωσης, σύμφωνα με miR-21 κατάσταση.

CENS .: λογοκρίνεται

.

Η

MiR-21 και αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις της 5-FU σε κύτταρα PDAC

Η έκφραση του miR-21 ήταν ανιχνεύσιμη σε όλες τις κυτταρικές PDAC γραμμές, που κυμαίνονται από 4.5 σε κύτταρα PL45 σε 1,5 au στα κύτταρα BxPC-3 (Σχήμα 3Α). Μία δοσοεξαρτώμενη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης παρατηρήθηκε μετά από δύο 5-FU, και gemcitabine συν ακτινοθεραπεία θεραπεία, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β-C. Συγκεκριμένα, 5-FU θεραπεία οδήγησε σε μέτρια αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων σε PANC-1 και PL45 κύτταρα, με IC

’50 του 138.4 ± 23.4 μΜ και 174,2 ± 31,1 μΜ, αντιστοίχως. Μεταξύ των μελέτησε κυτταρικές σειρές, BxPC3 και ΗΡΑΡ-ΙΙ ήταν η πιο ευαίσθητη σε γεμσιταβίνης και 5-FU, αντίστοιχα, ενώ PL45 ήταν η πιο ανθεκτική σε δύο 5-FU και γεμσιταβίνη συν ακτινοθεραπεία.

(Α) MiR -21 έκφραση σε 5 κυτταρικές σειρές PDAC. Η έκφραση προσδιορίστηκε με ποσοτική PCR, με τη χρήση της δέλτα μέθοδο Ct με RNU-43 ως αναφορά και οι τιμές είναι σε au. (Β-Ο) αντιπροσωπευτικές καμπύλες των ανασταλτικών της ανάπτυξης επιδράσεις της 5-FU (Β) και γεμσιταβίνη συν ακτινοθεραπεία (C) , 48-ώρες έκθεσης στο φάρμακο. (ΡΕ). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 10

4 /φρεάτιο και τα αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την δοκιμασία SRB όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Η μέση IC

50 τιμές για 5-FU (48 ώρες συνεχούς έκθεσης) ήταν ως ακολούθως: 36,3 μΜ (BxPC-3), 30,9 μΜ (ΗΡΑΡ-ΙΙ), 138.4 μΜ (PANC-1) και 174,2 μΜ (PL45 )? ενώ οι τιμές IC50 για γεμσιταβίνη (σε κύτταρα προ-επεξεργασία με 100 cGray) ήταν 2,1 ηΜ (BxPC-3), 3,4 ηΜ (ΗΡΑΡ-ΙΙ), 10,2 ηΜ (PANC-1) και 11,4 ηΜ (PL45).