Αφηρημένο

Ιστορικό

Μια μεγάλη πρόκληση για τη θεραπεία του πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος είναι η αποτυχία της χημειοθεραπείας, η οποία είναι πιθανό να οφείλεται στην παρουσία των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ).

Στόχος

για να προσδιορίσετε την πλευρά του πληθυσμού (SP) κύτταρα και χαρακτηρίζουν s-όπως ιδιότητες στον ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές (h-PCCLs) και να εκμεταλλευτούν την αποτελεσματικότητα της ταυτόχρονης στόχευσης πολλαπλών βασικών παραγόντων μεταγραφής διέπουν τη βλαστική ικανότητα των παγκρεατικών ΚΕΠ στην καταστολή της CSC-όπως φαινοτύπων.

Μέθοδοι

η κυτταρομετρία ροής και Hoechst 33342 δοκιμασία εκροής χρωστική δέσμευσης του DNA χρησιμοποιήθηκαν για να ταξινομήσετε SP και κύτταρα μη-SP (NSP) από τρία h-PCCLs: PANC-1, SW1990, και BxPc-3. Η ικανότητα αυτο-ανανέωση, διεισδυτικότητα, η μετανάστευση και φαρμάκου αντοχή του SP κύτταρα αξιολογήθηκαν. Η έκφραση των γονιδίων δεικτών CSC αναλύθηκε. Ογκογονικότητα εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια. Επιπτώσεις ενός σύνθετου ολιγονουκλεοτίδιο δόλωμα (cdODN-SCO) με στόχο την ταυτόχρονη στόχευση Sox2, Oct4 και αξιολογήθηκαν c-Myc.

Αποτελέσματα

ΚΕΠ εμπλουτίστηκαν στην πλευρά αναλογία (SP) κυττάρων που περιέχονται στα h-PCCLs και κατείχαν επιθετική ανάπτυξη, την εισβολή, τη μετανάστευση και της ανθεκτικότητας στα φάρμακα ιδιότητες, σε σύγκριση με τα κύτταρα NSP. κύτταρα SP υπερεκφράζεται δείκτες βλαστικών κυττάρων CD133 και ΑΙ_ϋΗ1, πλειοδυναμία διατηρώντας παράγοντες Nanog, Sox2 και Oct4, ογκογόνο παράγοντα μεταγραφής c-myc, σηματοδότησης μόριο Notch1 και ανθεκτικών στα φάρμακα γονιδιακής ABCG2. Επιπλέον, τα κύτταρα SP αποδείξει με συνέπεια σημαντικά μεγαλύτερη από ό, τι ογκογενετικότητας κύτταρα NSP στο μοντέλο ξενομοσχεύματος γυμνών ποντικών. CdODN-SOC κατέστειλε αποτελεσματικά όλες τις ιδιότητες CSC και φαινοτύπων, και ελαχιστοποιείται το ογκογόνο ικανότητα των κυττάρων SP και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία. Συγκριτικά, ο αρνητικός μάρτυρας αποτύχει να το πράξει.

Συμπέρασμα

Τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η στόχευση των βασικών γονιδίων που παρέχουν τη βλαστική ικανότητα των ΚΕΠ μπορεί να εξαλείψει αποτελεσματικά CSC-όπως φαινοτύπων, και ως εκ τούτου μπορεί να θεωρηθεί μια νέα προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου. Συγκεκριμένα, η παρούσα μελέτη καθορίζει το συνδυασμό των Sox2 /Oct4 /c-Myc στόχευση ως πιθανή αντι-παγκρέατος παράγοντας του καρκίνου του αξίζει περαιτέρω μελέτες σε προκλινικές ρυθμίσεις

Παράθεση:. Wang Χ, Liu Q, Χου Β, Zhang W, Γιαν Μ, Jia Η, et al. (2013) Η ταυτόχρονη στόχευση των πολλαπλών Βασικοί παράγοντες μεταγραφής διαταράσσουν αποτελεσματικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα Εμπλουτισμένο σε Side Πληθυσμός ανθρώπινα κύτταρα καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 8 (9): e73942. doi: 10.1371 /journal.pone.0073942

Επιμέλεια: Kamyar Afarinkia, Πανεπιστήμιο του Μπράντφορντ, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 19 Απρίλη 2013? Αποδεκτές: 24 Ιούλη 2013? Δημοσιεύθηκε: 11 του Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC), γνωστός από τους επιθετικότητα στη φύση, είναι μια ιδιαίτερα θανατηφόρα κακοήθεια που συνήθως διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο για την οποία έχουν βέλτιστη θεραπευτικές επιλογές έχουν παραλειφθεί [1]. Η κακή πρόγνωση μπορεί να εξηγηθεί από την καθυστερημένη ανίχνευση της νεοπλαστικής διαδικασίας, έλλειψη αποτελεσματικής θεραπεία και περιορισμένες γνώσεις των βιολογικών χαρακτηριστικών του. Ως εκ τούτου, η καλύτερη κατανόηση των κυτταρικών /μοριακών ιδιοτήτων που συνδέονται με αυτή την κατάσταση είναι επείγουσα ανάγκη να εξερευνήσουν νέες χώρους της διάγνωσης και της θεραπείας αυτής της μελαγχολική νόσου.

Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι οι κακοήθεις όγκοι αποτελούνται από ένα μικρό υποσύνολο των διακριτών καρκινικά κύτταρα, που ονομάζονται «καρκινικά βλαστικά κύτταρα» (ΚΕΠ), τυπικά λιγότερο από 5% των συνολικών καρκινικών κυττάρων με βάση την έκφραση δείκτη επιφανείας κυττάρου [2-6]. Τα ΚΕΠ που βρέθηκαν σε ένα υπο-πληθυσμό κυττάρων που είναι διαφορετική από την κύρια πληθυσμού εντός όγκων ή αιματολογικών καρκίνων, που ονομάζονται κύτταρα «πλευρά πληθυσμός» (κύτταρα SP) που εμφανίζουν χαρακτηριστικά βλαστικού κυττάρου-όπως. ΚΕΠ διαθέτουν την ικανότητα να αυτο-ανανέωση και για τη δημιουργία των ετερογενών καταγωγές των καρκινικών κυττάρων που περιλαμβάνουν τον όγκο? είναι ως εκ τούτου ογκογονικά, σε αντίθεση με άλλες μη ογκογόνα καρκινικά κύτταρα, και είναι απαραίτητα για την εξέλιξη των οδηγών και μετάσταση όγκων. Κλινικά ακόμη πιο σημαντικό, ωστόσο, είναι το γεγονός ότι τα ΚΕΠ προσδίδουν επίσης μολυσματικότητα μέσω του ανοσοποιητικού συστήματος και διαφυγή πολυφαρμάκου αντίσταση στη χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία με αποτέλεσμα σχετική εμπλουτισμό τους κατά τη διάρκεια της θεραπείας και την ταχεία υποτροπή της νόσου [2-6]. Η αποτελεσματικότητα των θεραπειών του καρκίνου είναι συχνά μετράται με την εκτομή κλάσμα της μάζας του όγκου, και τα συμβατικά χημειοθεραπείες σκοτώνουν διαφοροποιημένα ή διαφοροποίηση κυττάρων, τα οποία αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος του όγκου, αλλά δεν είναι σε θέση να παράγουν νέα κύτταρα. Όπως ΚΕΠ σχηματίζουν ένα μάλλον μικρό ποσοστό του όγκου, θα μπορούσαν να παραμένουν un-επιτέθηκαν, προκαλώντας μια υποτροπή της νόσου. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη ειδικών θεραπειών που απευθύνονται σε ΚΕΠ κατέχει τεράστια ελπίδα για βελτίωση της επιβίωσης και της ποιότητας ζωής των ασθενών με καρκίνο, ειδικά για τους πάσχοντες από μεταστατική νόσο.

έχουν CSCs έχουν ταυτοποιηθεί σε PDAC και παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές από διάφορους εργαστήρια [7-14]. Ανθρώπινων παγκρεατικών ΚΕΠ εκφράζουν υψηλά επίπεδα CD133, CD24, CD44, ESA, και αφυδρογονάση αλδεΰδη (ΑΙ_ϋΗ1) έχουν επίσης πιο άφθονη Nanog, Oct4, Notch1, MDR1 και ABCG2 από το κανονικό του παγκρέατος ιστούς και τα πρωτογενή καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος [10-12,14, 15]. Φαίνεται ότι PDAC δεν περιέχει μόνο μία ομοιογενή πληθυσμό ΚΕΠ αντί ποικιλόμορφη υποπληθυσμών που μπορεί να έχουν εξελιχθεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου, με βάση τη χρήση συνδυασμών δεικτών επιφανείας που επιτρέπουν απομόνωση, τον πολλαπλασιασμό, και περαιτέρω χαρακτηρισμό τους. Ένας από αυτούς τους πληθυσμούς καλείται μετεγκατάσταση ΚΕΠ και αυτά τα κύτταρα είναι ικανά να αποφύγει την πρωτοπαθή όγκο και τα ταξίδια σε μακρινές περιοχές όπως το ήπαρ, όπως η προτιμώμενη ιστοσελίδα της μεταστατικής εξάπλωσης.

Ως εκ τούτου, επιτυχημένες θεραπείες καρκίνου βασίζονται όχι μόνο για τον εντοπισμό της πηγής των καρκινικών κυττάρων και αντικαρκινική θεραπεία για τα διαφοροποιημένα καρκινικά κύτταρα, αλλά και για την εξεύρεση δυνητικού πληθυσμού CSC και την επίτευξη επαρκούς καταστροφή των ΚΕΠ στον όγκο. Πράγματι, CSC στοχευμένες προσεγγίσεις έχουν δείξει μεγάλη υπόσχεση σε προκλινικά μοντέλα [2-6]. Αυτές οι προσεγγίσεις περιλαμβάνουν την άμεση στρατηγικές, όπως η κατάλυση με στόχευση μοριακών δεικτών των ΚΕΠ ή CSC-συγκεκριμένες οδούς, αντιστροφή των μηχανισμών αντοχής, και η θεραπεία της διαφοροποίησης, και έμμεσες στρατηγικές, όπως αντιαγγειογενετικές θεραπεία, ανοσοθεραπευτικές προσεγγίσεις, και η διατάραξη των protumorigenic αλληλεπιδράσεις μεταξύ ΚΕΠ και μικροπεριβάλλον τους.

Η παρούσα μελέτη διεξήχθη στην επίτευξη των ακόλουθων δύο πρωταρχικούς στόχους. Πρώτον, για να έχει μια ολοκληρωμένη χαρακτηρισμός των πληθυσμών CSC σε ανθρώπινη παγκρεατική καρκινικές κυτταρικές σειρές, συγκρίναμε τα κύτταρα SP σε BxPc-3, PANC-1 και SW1990 κυτταρικές σειρές. Δεύτερον, για να εκμεταλλευτούν τη δυνατότητα ταυτόχρονης στόχευσης πολλαπλών παραγόντων μεταγραφής που διέπουν τη βλαστική ικανότητα των παγκρεατικών ΚΕΠ να διαταράξει ΚΕΠ έτσι ογκογένεση και τη μετάσταση, σχεδιάσαμε ένα δόλωμα ολιγονουκλεοτίδια θραύσμα από το «ένα μέσο, ​​πολλαπλούς στόχους» έννοια και δοκιμαστεί η αποτελεσματικότητα αυτού του μορίου σε σιωπή η βλαστική ικανότητα των παγκρεατικών ΚΕΠ.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

η χρησιμοποιούμενη όλων των ζώων στη μελέτη αυτή εγκρίθηκε από, και όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις και τη φροντίδα των ζώων αυστηρά σύμφωνη με τις κατευθυντήριες γραμμές που έθεσε η Επιτροπή Δεοντολογίας ζώων του Xinjiang Ιατρικό Πανεπιστήμιο και η Sun Yat-sen University.

κυτταρική καλλιέργεια

Τα ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές BxPc-3, PANC-1 και SW1990 αρχικά ιδρύθηκε από την πρωτοβάθμια παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα του ανθρώπου από την ATCC αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Τράπεζας κυττάρων (Σαγκάη, Κίνα) και πολλαπλασιάζονται στο εργαστήριο μας. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο Eagle Medium του Dulbecco (DMEM). Το μέσο συμπληρωμένο με 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, 3 mM L-γλουταμίνη, και 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Gibco). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C που περιέχει 5% CO

2.

κυτταρομετρία ροής και κυτταρική διαλογή

Cells SP είναι μια μικρή ομάδα κυττάρων που λεκιάζουν αχνά ή δεν είναι καθόλου όταν έλαβαν θεραπεία με χρωστική Hoechst 33342. Αυτά τα κύτταρα μπορούν να απομονωθούν χρησιμοποιώντας πρωτόκολλα κυτταρομετρίας ροής αρχικά συστάθηκε με Goodell et al. σε μια μελέτη του μυελού των οστών ποντικού [16,17]. H-PCCLs αποκολλήθηκαν από το τρυβλίο καλλιέργειας με 0.25% θρυψίνη, πλύθηκαν με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), και διακόπτεται στη 1 × 10

6 κύτταρα /ml σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει 2% FBS. Τα καρκινικά κύτταρα και κυτταρικές σειρές επωάστηκαν με χρωστική Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) σε τελική συγκέντρωση 5 μg /ml, με ή χωρίς βεραπαμίλη (100 μΜ? Sigma-Aldrich) στους 37 ° C για 90 λεπτά με διακοπτόμενη ανατάραξη κάθε 15 min. Verapamil χρησιμοποιήθηκε για την επιβεβαίωση του φαινοτύπου SP, καθώς μπορεί να μειώσει την πλευρική διακλάδωση με το φράξιμο των μεταφορέων πολυφαρμάκου. Μετά πλύση δύο φορές με PBS, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο PBS που περιείχε 2% FBS, πέρασε διαμέσου ενός φίλτρου πλέγματος 40 μm για να ληφθεί εναιωρήματα μονού κυττάρου, και διατηρούνται σε πάγο μέχρι ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ? 2 μg /ml? Sigma-Aldrich) προστέθηκε για την επισήμανση και αποκλείουν τα νεκρά κύτταρα. ανάλυση κυττάρων και ενεργοποιημένων με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας FACS Vantage SE εφοδιασμένο με την έκδοση του λογισμικού 6.0 FACS DIVA (BD Biosciences, Erembodegem, Belgium). Hoechst 33342 χρωστική διεγείρεται από υπεριώδες λέιζερ 350 nm, και εκπομπή φθορισμού ήταν διπλού μήκους κύματος που αναλύθηκαν (Hoechst μπλε με φίλτρο 402-450 nm? Hoechst κόκκινο με φίλτρο 650-670 nm).

κυτταρικού πολλαπλασιασμού και δοκιμασίες κυτταρικού κύκλου

χίλια ταξινομημένο SP και μη SP κύτταρα (NSP) σπάρθηκαν σε ξεχωριστά φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων εις τριπλούν και καλλιεργούνται σε μέσο L-15 με 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη Leibovitz και 10 % FBS για 3 ημέρες. Η ανάπτυξη μετρήθηκε με τη χρήση της μεθόδου 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ). Εν συντομία, 20 μΐ διαλύματος ΜΤΤ (5 mg /ml σε PBS? Sigma) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάζονται στους 37 ° C για 4 ώρες. Μια 150-μΙ υποπολλαπλάσιο DMSO προστέθηκε στη συνέχεια, και η απορρόφηση μετρήθηκε με Microplate Reader (Multiscan MK3, Θέρμο Labsystem, USA) σε μήκος κύματος 490 nm.

Για την ανίχνευση του κυτταρικού κύκλου, 5 × 10

5 προσφάτως ταξινομημένα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 2 ml 70% παγωμένης αιθανόλης στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε PBS, χρωματίστηκαν με 20 μg /ml ΡΙ και 1 mg /ml RNase, και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου.

δοκιμασίες σχηματισμού Clone

Τα ακόλουθα στάδια εφαρμόστηκαν για τις δοκιμασίες (1). Άγαρ (10 g /l? Βαθμός DNA) ετάκη σε μικροκύματα και 2 χ DMEM συμπληρωμένο με 200 ml /l FBS θερμάνθηκε στους 40

oC σε υδατόλουτρο. Ίσοι όγκοι αυτών των δύο διαλύματα κατόπιν αναμιγνύονται για να δώσει ένα νέο διάλυμα 5 g /l άγαρ + 1 × ϋΜΕΜ + 100 ml /l FBS (2). Στη συνέχεια, 1 ml του μικτού διαλύματος προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας 6-φρεατίων για να σχηματίσει το άγαρ βάσης (3). Στη συνέχεια, 7 g /l άγαρ (βαθμός DNA) ετάκη στο φούρνο μικροκυμάτων και ψύχεται στους 40

oC σε υδατόλουτρο, και 2 χ DMEM και 200 ​​ml /l FBS θερμάνθηκαν στην ίδια θερμοκρασία (4). Προσφάτως ταξινομημένο SP και μη SP κύτταρα διήλθαν μέσω ενός φίλτρου 40 μm για να παρέχει ένα αιώρημα μονών κυττάρων και μετρήθηκαν. Τρία ml DMEM, 1.5 ml 2 χ DMEM που περιέχει 200 ​​ml /l FBS και 1,5 ml άγαρ συμπεριλαμβανομένων 500 ταξινομημένα κύτταρα στη συνέχεια αναμιγνύονται μαζί, και ένα 1.5 ml αιώρημα κυττάρων του διαλύματος αυτού τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο ενός πλακιδίου των 6 φρεάτων και η άγαρ κορυφής (5). Τέλος, 100 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο, και επωάστηκαν στους 37

oC σε υγροποιημένο επωαστή για 2-3 εβδομάδες. Οι αποικίες ήσαν είτε αριστερά χωρίς χρώση, ή βάφτηκαν με 5 g /l ΜΤΤ (Sigma-Aldrich) για 1 ώρα, και μετρήθηκαν υπό ανατομικό μικροσκόπιο (η διαδικασία επαναλήφθηκε τρεις φορές) (6). Αφού τα κύτταρα SP σπάρθηκαν σε προσδιορισμούς μαλακού άγαρ, οι αποικίες που περιέχουν περισσότερο από 50 κύτταρα (πρωτογενή αποικία) απομακρύνθηκαν από μαλακό άγαρ με αποστειρωμένα σιφώνια Pasteur, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με θρυψίνη και μηχανική διάσταση σε μεμονωμένα κύτταρα. Στη συνέχεια, το στάδιο (5) επαναλήφθηκε για το δευτερεύον αποικία.

δοκιμασίες σχηματισμού Σφαίρα

ταξινόμηση SP και NSP κύτταρα από τις τρεις h-PCCLs διήλθαν μέσω ενός φίλτρου 40 μm για να ληφθεί εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων. Στη συνέχεια, 4 ml μέσου που περιέχει 100 κύτταρα προστέθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων με καλλιέργεια χωρίς ορό μέσο DMEM-F12 (Invitrogen-Life Technologies), συμπληρωμένο με επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (10 μg /l), ινσουλίνη (20 mg /L) και bFGF (10 μg /l). Δείγματα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, ινσουλίνη και βασικό παράγοντα ανάπτυξης ινοβλάστης προστέθηκαν δύο φορές την εβδομάδα. Μετά από 10 d, οι πλάκες οπτικά προσδιορίστηκαν για το σχηματισμό των πλωτών σφαιρών και σφαίρες μετρήθηκαν υπό ανατομικό μικροσκόπιο.

δοκιμασία Invasion

εισβολής ταξινομημένα SP και κυττάρων NSP προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας 6-φρεατίων θαλάμους Matrigel εισβολής (BD Biosciences Discovery Labware). Τα κύτταρα σπάρθηκαν στον άνω θάλαμο πάνω στο Matrigel επικαλυμμένη μεμβράνη (24-φρεατίων ένθετο? Μέγεθος πόρου σε απόσταση 8 mm? Corning Costar) στα 2 × 10

5 ανά ένθετο σε DMEM ελεύθερο ορού σε 37

oC με 5 % CO

2 για 48 ώρες. Εξωτερική φρεάτια πληρώθηκαν με DMEM που περιέχει 5% FBS ως χημειο-προσελκυστικό. Τα μη εισβάλλοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν με επιχρισμάτων ανώτερο στρώμα του Matrigel με Q-tip. Η μεμβράνη που περιέχει εισβάλλοντα κύτταρα χρωματίστηκε με αιματοξυλίνη για 3 λεπτά, και στη συνέχεια πλύθηκαν και τοποθετήθηκαν επάνω σε πλάκες. Οι εισβάλλοντας κύτταρα σε ολόκληρο μεμβράνης μετρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός σε 40 × στόχος.

Transwell δοκιμασία μετανάστευσης

κυττάρων

Κατάταξη σύμφωνα SP ή NSP σε 1 × 10

5 απλώθηκαν στην άνω θάλαμο πάνω στο μη επικαλυμμένο μεμβράνη (24-φρεατίων ένθετο? μέγεθος πόρου σε απόσταση 8 mm? Corning Costar) και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν προς μέσο που περιέχει ορό στο κατώτερο θάλαμο. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν μετά από 24 ώρες επώασης με μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες (2 mg /ml, Sigma-Aldrich). Ο αριθμός των κυττάρων που εισβάλλουν μέσω της μεμβράνης μετρήθηκε υπό μικροσκόπιο φωτός (40 ×, τρία τυχαία πεδία ανά φρεάτιο).

αντίσταση Drug ανάλυση

Κλάσματα των 2 × 10

3 προσφάτως ταξινομημένο SP και τα κύτταρα NSP σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων εις τριπλούν με 200 μΙ ϋΜΕΜ ανά φρέαρ. Μετά από μία περίοδο ανάνηψης 12-h, τα κύτταρα εκτίθενται σε διάφορες συγκεντρώσεις της γεμσιταβίνης για 72 ώρες. Οι επιδράσεις στην κυτταρική ανάπτυξη εξετάστηκαν με τη δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφηκε παραπάνω. Το ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων (SR) υπολογίσθηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο: SR = (μέση απορρόφηση της δοκιμής και /μέση απορρόφηση του ελέγχου) χ 100%? το ποσοστό αντίστασης των κυττάρων (RR) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο:. RR = 100% -SR

κύτταρα αποπτωτικά προσδιορίστηκαν με μεθόδους ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) -Annexin-V. Εν συντομία, προσφάτως ταξινομημένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από 12 ώρες ανάκτησης, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις της γεμσιταβίνης για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Annexin-V και ΡΙ χρησιμοποιώντας το ApoAlert ™ αννεξίνης V Apoptosis Kit (Clontech, Cosete Tech, Jinan) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS. Τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης 100 μΙ 1 χ αννεξίνης και 5 μΙ FITC-Annexin-V. Α 1-μl διαλύματος εργασίας του ΡΙ στα 100 μg /ml προστέθηκε σε κάθε 100 μΐ κυτταρικού αιωρήματος. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε πάγο για 1 ώρα, πλύθηκαν και πάλι με ψυχρό PBS και επαναιωρήθηκαν σε 300 μΐ 1 χ ρυθμιστικού αννεξίνης-δέσμευσης. Τα βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν αμέσως με κυτταρομετρία ροής.

In vitro διαφοροποίηση μελέτη

Φρέσκο ​​ταξινομημένα SP και τα κύτταρα NSP καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε ένα πλάκα καλλιέργειας 6 φρεατίων σε μέσο L-15 Leibovitz με 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και 10% FBS και επωάζονται στους 37 ° C με 5% CO

2. Μετά από 7 ημέρες, SP- και μη SP προερχόμενα κύτταρα επανα-αναλύθηκαν για την παρουσία ενός κλάσματος SP χρησιμοποιώντας τις μεθόδους που περιγράφονται παραπάνω.

Ογκογονικότητα δοκιμασία in vivo

αθυμικούς 4- έως 5 -Εβδομάδα ποντικών ηλικίας (BALB /c γυμνά ποντίκια) παρασχέθηκαν από Slac Laboratory Animal (Shanghai). Οι ποντικοί στεγάστηκαν και διατηρήθηκαν σε στρωτή ροή ντουλάπια υπό συνθήκες χωρίς παθογόνα. Ομάδες ποντικών ορθοτοπικά εμβολιάστηκαν s.c. στο αριστερό πλευρό ραχιαία των ποντικών με πρόσφατα ταξινομημένα κύτταρα SP σε 1 × 10

3, 1 × 10

4, 1 × 10

5, και 1 × 10

6 ή NSP κύτταρα σε 1 × 10

3, 1 × 10

4, 1 × 10

5, και 1 × 10

6 (τέσσερα ποντίκια ανά ομάδα). Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε κάθε 2 ημέρες μετά από τη δεύτερη εβδομάδα του εμβολιασμού. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν κατά την ημέρα 50 ή όταν οι όγκοι αναπτύσσονται σε ένα μέγιστο 1.000 mm

3. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε από τον τύπο 0.52 x μήκος x πλάτος

2. Πλάσια διαφορά σε ογκογονικότητας υπολογίστηκε από τον ακόλουθο τύπο: NSP

min /SP

min, όπου NSP

min είναι ο ελάχιστος αριθμός των κυττάρων που NSP που απαιτούνται για τη δημιουργία ενός όγκου και SP

min είναι το ελάχιστο αριθμός των SP κυττάρων που απαιτούνται για την παραγωγή ενός όγκου. Τέλος, οι όγκοι επίσης σε πέψη για να κάνει εναιώρημα μονοκύτταροι για SP εκ νέου ανάλυση με την δοκιμασία χρωστικής εκροής Hoechst33342 όπως περιγράφεται παραπάνω.

Όταν οι h-με PLCC επαγόμενη όγκοι έφθασαν έναν όγκο περίπου 200 mm

3, μία ομάδα ποντικών έλαβε γεμσιταβίνης (200 mg /kg ίρ βάρους σώματος, 1 ένεση κάθε 3 ημέρες, 6 ενέσεις συνολικά) και η άλλη ομάδα (που φέρουν τα αντίστοιχα όγκους) εγχύθηκε με όχημα (0,9% NaCl? ομάδα ελέγχου ). διάμετρος του όγκου μετρήθηκε κάθε 3 ημέρες μετά την πρώτη ένεση. Η γεμσιταβίνη θεωρήθηκε αποτελεσματική όταν ο όγκος του όγκου μειώνεται κατά τουλάχιστον 50%. Τρεις ημέρες μετά την τελευταία ένεση, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι όγκοι αναλύθηκαν για να προσδιοριστεί η αναλογία των κυττάρων SP όπως περιγράφεται παραπάνω.

εκχύλιση RNA και PCR πραγματικού χρόνου ανάλυση

ταξινόμηση κυττάρων και καλλιεργημένα κύτταρα ήσαν αγωγή με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen Κίνα Limited, Σαγκάη) και αναμειγνύεται καλά με πιπέτα. Οι ΤπζοΙ-προϊόντα λύσης στη συνέχεια αναμιγνύεται με χλωροφόρμιο και φυγοκεντρήθηκε στα 15.000 χ g για 15 λεπτά. Μετά τη φυγοκέντρηση, το ολικό RNA λήφθηκαν με καθίζηση ισοπροπανόλης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

cDNA Single κλώνος μεταγράφεται αντίστροφα από ολικό RNA χρησιμοποιώντας τυχαίο εναρκτήρα υπό πρότυπες συνθήκες με το cDNA υψηλής χωρητικότητας ανάστροφης κιτ μεταγραφής (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου με συνολικό cDNA διεξήχθη με SYBR Green Master Mix Real-Time Πυρήνα αντιδραστήρια σε έναν ΑΒΙ 7500 (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι ενισχύσεις διεξήχθησαν στους 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 5 s, 60 ° C για 30 s. Να ποσοτικοποιηθεί η σχετική έκφραση κάθε γονιδίου, οι τιμές (κύκλος κατωφλίου) Ct κανονικοποιήθηκαν για ενδογενή αναφοράς (

ΔCt = Ct-στόχο Ct β-ακτίνη) και σε σύγκριση με βαθμονομητή, χρησιμοποιώντας την «

ΔΔCt μέθοδος «(

ΔΔCt =

ΔΟΙ

δείγματος –

ΔΟΙ

βαθμονόμησης). Χρησιμοποιώντας την τιμή

ΔΔCt, σε σχέση με την έκφραση υπολογίστηκε (

2-ΔΔCt). Καθώς το

μέθοδος ΔΟΙ ισχύει μόνο όταν οι αποδόσεις ενίσχυση του στόχου και της αναφοράς είναι ουσιαστικά ίσα, προσδιορίσαμε τις αποδόσεις για 5 αραιώσεις, και το δέλτα τιμές Ct (Ct

στόχου-Ct

β- ακτίνη) σχεδιάστηκαν έναντι της αραίωσης (log). Η κλίση της γραμμής τοποθετηθεί στη συνέχεια προσδιορίστηκε. Όλα τα δείγματα εξετάστηκαν εις τριπλούν, και οι μέσες τιμές χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση.

Western ανάλυση κηλίδος

μεμβράνης και κυτοσολίου δείγματα πρωτεΐνης που εξάγεται από SP και NSP κύτταρα από τις τρεις h-PCCLs. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε με κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA χρησιμοποιώντας αλβουμίνη βόειου ορού ως πρότυπο (Pierce, USA). Ίσες ποσότητες των δειγμάτων πρωτεΐνης (~ 50 μg) κλασματώθηκαν με SDS-PAGE (πηκτές πολυακρυλαμιδίου 12%) και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνη PVDF (Millipore, Bedford, ΜΑ) χρησιμοποιώντας ένα Mini Trans-blot (Bio-Rad Laboratories, Shanghai). Τα δείγματα πρωτεΐνης (δείγμα μεμβράνης για ABCG2 και CD133? Κυτοσολικές δείγματος για ΑΙ_ϋΗ1, Oct4, Sox2 και Nanog) επωάστηκαν με τα πρωτεύοντα αντισώματα σε 1: 200 εις 4 ° C όλη τη νύκτα. Συγγένεια πολυκλωνικά καθαρισμένο κουνελιού αντι-ABCG2 (Shanghai Ruiqi Βιολογική Technology Co. Ltd), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-CD133 (Shanghai XiangSheng Biotech ΣΙΑ Ε.Π.Ε.), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-Oct4 (Cell Signaling Σαγκάη), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-Sox2 (Shanghai Excell Bio Co. LTD), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-ΑΙ_ϋΗ1 (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA), και πολυκλωνικά κουνελιού αντι-Nanog (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA) χρησιμοποιήθηκαν ως τα πρωτεύοντα αντισώματα. Την επόμενη ημέρα, η μεμβράνη επωάστηκε με δευτερεύοντα αντισώματα (Molecular Probes) αραιωμένο σε PBS για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, η μεμβράνη ξεπλύθηκε με PBS πριν από τη σάρωση χρησιμοποιώντας το σύστημα απεικόνισης υπερύθρων (LI-COR Biosciences). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για την ίση εισόδου των δειγμάτων πρωτεΐνης, χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-GAPDH. λωρίδες στυπώματος Western ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό QuantityOne μετρώντας την ένταση ζώνης (περιοχή Χ OD) για κάθε ομάδα και για την εξομάλυνση για GAPDH. Τα τελικά αποτελέσματα εκφράζονται ως φορές οι αλλαγές από την κανονικοποίηση των δεδομένων με τις τιμές ελέγχου.

Παρασκευή συμπλόκου δολωμάτων ολιγοδεοξυνουκλεοτιδίου (cdODN)

Σχεδιάσαμε ένα cdODN φέρουν αλληλουχίες συναίνεσης για τέσσερις παράγοντες μεταγραφής Sox2, Oct4, και c-myc, σύμφωνα με την αρχή ιδρύθηκε από τον Gao et al. [18]. Μονόκλωνο φωσφοροθειοϊκά ολιγοδεοξυνουκλεοτίδια συντέθηκαν από IDT ενσωμάτωση (Coralville, ΙΑ). Τα ODNs πλύθηκαν σε 70% αιθανόλη, ξηραίνεται και διαλύεται σε αποστειρωμένο ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA (10 mM Tris + 1 mM EDTA). Το υπερκείμενο καθαρίζεται με τη χρήση Micro στήλες Bio-spin30 (BioRad, Σαγκάη) και ποσοτικοποιούνται με φασματοφωτομετρία. Τα διπλής έλικας dODNs παρασκευάστηκαν στη συνέχεια με αναδιάταξη συμπληρωματικών κλώνου ολιγοδεοξυνουκλεοτίδια ενιαία με θέρμανση στους 95

oC για 10 λεπτά ακολουθούμενη από ψύξη σε θερμοκρασία δωματίου (RT) βραδέως επί 2 ώρες. Για λόγους ευκολίας, έχουμε ορίσει αυτή cdODN-SOC. Ένα αρνητικό κομμάτι ελέγχου (NC-cdODN) που μεταφέρουν αντικατάσταση ζευγών βάσης συνετέθη επίσης.

δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA)

EMSA διεξήχθη σύμφωνα με τις διαδικασίες που περιγράφονται στο Gao et al. [18]. Εν συντομία, cdODN-SOC ή NC-ODN σημάνθηκε με [γ-

32Ρ] ΑΤΡ. Το δείγμα στη συνέχεια φορτώνεται σε στήλη G-25 και φυγοκεντρείται στα 7000

g

για 2 λεπτά. Οι ανασυνδυασμένες ανθρώπινες πρωτεΐνες Sox2, Oct4 και c-Myc ήταν (Santa Cruz Biotechnology) επωάστηκαν χωριστά cdODN-SOC ή NC-ODN σε RT για 15 λεπτά σε 10 μΐ H

2O και 8 μΙ κύριου μίγματος (12 × ) που περιείχε 1 Μ Tris-HCl, ρΗ 7,5, 0,5 Μ EDTA, 5 Μ NaCl, 1 Μ διθειοθρεϊτόλης, 50% γλυκερόλη, 100 μg /μl βόεια λευκωματίνη ορού, και 1 μg /μl πολυ (dIdC). Για πειράματα υπερμετατόπισης, τα αντισώματα (1 μg) συμπεριλήφθηκαν στην αντίδραση. Για τα πειράματα ανταγωνισμού, μη επισημασμένη cdODN-SOC σε 100-πλάσια περίσσεια των επισημασμένων dODNs προστέθηκε στις αντιδράσεις σύνδεσης. συμπλέγματα ϋΝΑ-πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με όχι-μετουσίωσης γέλη πολυακρυλαμιδίου (7,5% σε 0,4 χ Τρις-βορικού /ΕϋΤΑ) ηλεκτροφόρηση. Τζελ στέγνωσαν και κινηματογράφησε.

Η επιμόλυνση των cdODN-SOC σε κυτταρικές σειρές

Η ταξινομημένη SP ή κύτταρα NSP ήταν επιμολυσμένα με cdODN-SOC χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen Κίνα Limited, Σαγκάη). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 96 φρεατίων. Στους 50% συρροή, τα κύτταρα πλύθηκαν με μέσο χωρίς ορό φορά και στη συνέχεια επωάστηκαν με 50 μλ φρέσκο ​​βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS) -δωρεάν μέσο. ODNs Decoy διαφόρων συγκεντρώσεων και lipofectamine (0.25 μΙ) αναμίχθηκαν χωριστά με 25 μΙ Ορίί-MEM® Ι μειωμένου ορού Medium (Invitrogen Κίνα Limited, Σαγκάη) για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, τα δύο μίγματα συνδυάστηκαν και επωάστηκαν για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το lipofectamine: μίγμα cdODN προστέθηκε στάγδην στα κύτταρα και επωάζονται στους 37 ° C για 5 ώρες. Ακολούθως, 25 μΙ φρέσκο ​​μέσο που περιείχε 30% FBS προστέθηκε στο φρεάτιο και τα κύτταρα διατηρήθηκαν στην καλλιέργεια μέχρι τη χρήση.

Χορήγηση cdODN-SOC να BALB /c γυμνά ποντίκια

Όταν το μέγεθος του όγκου έφθασε ~ 200 mm

3 (περίπου 7 ημέρες μετά τον εμβολιασμό), cdODN-SOC χορηγήθηκε καθημερινά από μια ενιαία ενδοογκική ένεση (20 μΙ 100 ηΜ cdODN-SOC αναμιγνύεται με Lipofectamine 2000). Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθείται τακτικά, και ο όγκος (V) των όγκων κατά την ημέρα 5 μετά την αγωγή cdODN-SOC υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο V = 1/2 × μήκος × (πλάτος)

2.

Δεδομένα ανάλυση

τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM για όλα τα πειραματικά δεδομένα. συγκρίσεις Ομάδα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA. Post hoc αναλύσεις σημαντικές κύριες επιδράσεις περαιτέρω εξετάζονται με τη βοήθεια τεστ PLSD του Fisher. Ένα δύο-ουρά

P

& lt? Λήφθηκε 0,05 αξία για να δείξει μια στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με SPSS 11.5 και προσαρμογής καμπύλης διεξήχθη σε λογισμικό Graphpad Prism.

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά της ανθρώπινης παγκρεατικής καρκινικών κυτταρικών σειρών σε καλλιέργεια

Σε κανονική καλλιέργεια οξυγόνο μέσο, ​​τα ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (h-PCCLs) PANC-1, SW1990, και BxPc-3 όλες καταδειχθεί σαφής κύτταρο όρια, πλούσια κυτταρόπλασμα, διακριτή πυρήνα, και ορατή πυρηνίσκους, πολλές εν εξελίξει διαιρούμενα κύτταρα με ακόμα κύτταρο μορφολογία κυρίως στην επιθηλιακά-όπως πολυγωνικό σχήμα και σπανίως στην άτρακτο σχήμα υπό ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Εικόνα 1Α). Υπό υποξικές συνθήκες καλλιέργειας, ωστόσο, τα όρια των κυττάρων έγινε θολό και το μέγεθος των κυττάρων έγινε μεγαλύτερο, αλλά με συρρικνωμένη κυτταρόπλασμα, διευρυμένη πυρήνα και ασαφής πυρηνίσκος με λιγότερη διαιρούμενα κύτταρα και περισσότερο ατρακτοειδή κύτταρα.

(Α) Αντιπροσωπευτική μικροφωτογραφίες PANC-1 και BxPc-3 κύτταρα 72 ώρες μετά την σπορά. (Β) & amp? (Γ) Καμπύλες ανάπτυξης του PANC-1 και BxPc-3 κύτταρα. Τα σύμβολα είναι τα πειραματικά δεδομένα και οι καμπύλες αντιπροσωπεύουν τις καλύτερες ταιριάζει με εκθετική εξίσωση ανάπτυξης: Υ = Y0 × exp (k × Χ), όπου Y0 είναι η αξία Υ όταν Χ (χρόνος) είναι μηδέν και Κ είναι η σταθερά ρυθμού. τ είναι η σταθερά χρόνου (ημέρα) και η DT (διπλασιασμός χρόνου) είναι στα χρονικά μονάδες του άξονα Χ, υπολογίζεται ως ln

2 /K.

Η

Η ανάπτυξη της PANC-1 και BxPc-3 κύτταρα αξιολογήθηκε. Με την αρχική ίση πυκνότητα σποράς, τα κύτταρα αυτά έδειξαν παρόμοια ποσοστά αύξησης κάτω ορθοξικές συνθήκες. Τρεις ημέρες μετά τη σπορά, τα κύτταρα εισήλθε στην λογαριθμική φάση ανάπτυξης και σχημάτισε μία ζώνη ανάπτυξης, η οποία σταδιακά επεκτείνεται ακτινωτά. Τα κύτταρα είχαν ομοιόμορφη μορφολογία και ομαλή στοίχιση (Σχήμα 1Β). Συγκριτικά, κάτω από υποξικές συνθήκες καλλιέργειας, η κυτταρική ανάπτυξη επιβραδύνθηκε σημαντικά, χωρίς εμφανή λογαριθμική φάση ανάπτυξης (Εικόνα 1 C). Τα κύτταρα disarranged και τα κύτταρα εντός της ζώνης ανάπτυξης έδειξε ανομοιογενή μορφολογία.

Αναγνώριση των κυττάρων SP από ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές και τα αποτελέσματα της cdODN-SOC

Σύμφωνα με την ανάλυση Hoechst33342-FACS μας, η h-PCCLs PANC-1, SW1990, και BxPc-3 όλες περιείχαν ένα μικρό υποπληθυσμό κυττάρων SP με αναλογίες 8.7 ± 0.8, 4.6 ± 0.6, και 2.2 ± 0.4%, αντίστοιχα (Σχήμα 2Α, Β). Το κλάσμα SP σε κυτταρικές σειρές ουσιαστικά μειώθηκε με την παρουσία βεραπαμίλης.

(Α) Παραδείγματα παγετώνας ανάλυση κυτταρομετρίας κυττάρων SP παρουσία ή απουσία 30 μΜ βεραπαμίλη, cdODN-SOC (ένα σύμπλοκο ολιγοδεοξυνουκλεοτιδίου δόλωμα που μεταφέρουν

cis

-Στοιχεία για Sox2, Oct4 και c-Myc), ή NC-ODN (αρνητικός μάρτυρας cdODN). (Β) Οι αναλογίες SP ως ποσοστό του συνολικού πληθυσμού. ***

σ

& lt? 0.001

vs

ελέγχου? n = 4.

Η

Για να εκμεταλλευτεί το εάν τα κύτταρα SP θα μπορούσε να μετατραπεί σε NSP στοχεύοντας τα βασικά μόρια καθορισμό της βλαστική ικανότητα των ΚΕΠ, εξετάσαμε τις επιδράσεις ενός θραύσματος ολιγοδεοξυνουκλεοτιδίων συγκρότημα δολωμάτων (cdODN) στο SP κύτταρα. Το συγκρότημα ολιγοδεοξυνουκλεοτίδιο δόλωμα (cdODN-SOC) έχουν σχεδιαστεί για αυτή τη μελέτη περιείχε το τυπικό

cis-δράσης

στοιχεία για Sox2, Oct4, και c-Myc. Εντυπωσιακά, μετά προκαταρκτική αγωγή με cdODN-SOC για 48 ώρες, τα κύτταρα SP είχαν σχεδόν εξαφανιστεί στις τρεις h-PCCLs, με 0,05 ± 0,03, 0,03 ± 0,1 και 0,03 ± 0,2% για PANC-1, SW1990, και BxPc-3, αντίστοιχα (Σχήμα 2Α, Β). Ως αρνητικός έλεγχος, NC-cdODN δεν μετέβαλε σημαντικά τα κλάσματα SP σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές.

Η αλληλουχία αυτού του cdODN-SOC δείχνεται στο Σχήμα 3Α και η ικανότητα αυτού του CD-ODN-SOC δεσμεύοντας πρωτεΐνες Sox2, Oct4 και c-Myc επαληθεύτηκε με EMSA μας σε συνδυασμό με υπερμετατόπισης με χρήση αντισωμάτων που κατευθύνονται έναντι αυτών των παραγόντων μεταγραφής. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 3Β, οι μετατοπισμένες ζώνες υποδεικνύουν δέσμευσης cdODN-πρωτεΐνη και οι ζώνες supersfift έδειξε την ειδική σύνδεση cdODN-πρωτεΐνης.

(Α) Οι αλληλουχίες της cdODN-SOC μεταφέρουν

cis

-Στοιχεία για Sox2, Oct4 και c-Myc και του αρνητικού ελέγχου ODN με αντικαταστάσεις νουκλεοτιδίων (NC-ODN). (Β) Παραδείγματα EMSA εικόνες που δείχνουν την ικανότητα του cdODN-SOC να δεσμεύουν ανθρώπινο ανασυνδυασμένο Sox2, Oct4 ή πρωτεΐνη c-Myc. Οι ζώνες μετατόπισης υποδεικνύουν τις θέσεις των συμπλεγμάτων ϋΝΑ-πρωτεΐνης και οι ζώνες υπερμετατόπισης υποδηλώνει το συγκεκριμένο DNA δέσμευσης πρωτεϊνών παραλαμβάνεται από τον αντίστοιχο αντίσωμα. ετικέτες Lane: 1, ο έλεγχος χωρίς πρωτεΐνες? 2: παρουσία του κρύου ή μη επισημασμένου cdODN-SOC? 3: παρουσία cdODN-SOC? 4: παρουσία NC-ODN? και 5:. με αντίσωμα

Η

γονιδιακή έκφραση Διαφορικό μεταξύ SP και κυττάρων NSP

επόμενο συγκρίναμε την έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων CD133 και ΑΙ_ϋΗ1 (αλδεΰδη δεϋδρογενάση-1) [19, 20], πλειοδυναμία διατηρώντας παράγοντες Nanog, Sox2 και Oct4, ογκογόνο παράγοντα μεταγραφής c-myc, μόριο σηματοδότησης Notch 1 και ανθεκτικών στα φάρμακα γονιδιακής ABCG2 [21,22] σε ταξινομημένη SP και μη-SP (NSP) κύτταρα με qRT-PCR για την επίπεδο μεταγραφής και στύπωμα Western σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 4, τα κύτταρα SP από PANC-1 που εκφράζεται ουσιαστικά πιο άφθονα αντίγραφα από αυτά τα γονίδια σε σύγκριση με κύτταρα ΜΑΠ, αναφέροντας σαφώς τα χαρακτηριστικά βλαστικών κυττάρων των κυττάρων SP. Τα αποτελέσματα από την ανάλυση κηλίδος Western ήταν συνεπή με τις αλλαγές των επιπέδων mRNA (Σχήμα 4Β). SP κύτταρα από άλλα δύο h-PCCLs έδειξε ποσοτικά τα ίδια αποτελέσματα (Σχήμα S1 και S2 Εικόνα σε απευθείας σύνδεση).

(Α) Έκφραση του CD133, ΑΙ_ϋΗ1, ABCG2, Sox2, Oct4, Nanog, c-myc, και Notch 1 στο επίπεδο του mRNA, που προσδιορίζεται με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Οι τιμές ελήφθησαν από τον πρώτο κανονικοποιημένο προς GAPDH για τον εσωτερικό έλεγχο και στη συνέχεια παρουσιάζεται ως αναλογία του SP πάνω NSP. **

σ

& lt? 0,01 SP

vs

NSP? ***

σ

& lt? 0.001 SP

vs

NSP? n = 4. (Β) Έκφραση του CD133, ΑΙ_ϋΗ1, ABCG2, Sox2, Oct4, Nanog, c-Myc, και Notch 1 στο επίπεδο πρωτεΐνης, που προσδιορίζεται με ανάλυση κηλίδος Western. Οι τιμές ελήφθησαν από τον πρώτο κανονικοποιημένο προς GAPDH για τον εσωτερικό έλεγχο και στη συνέχεια παρουσιάζεται ως αναλογία του SP πάνω NSP. CD133: 120 kDa? ΑΙ_ϋΗ1: 55 kDa? ABCG2: 72 kDa? Sox2: 40 kDa? Oct4: 45 kDa? Nanog: 35 kDa? c-Myc: 62 kDa? Notch 1: 300 kDa. ** P & lt? 0,01 SP

vs

NSP?