Αφηρημένο

Ιστορικό

Γονιδιωματική ανακατατάξεις που αφορούν την οικογένεια ETS των παραγόντων μεταγραφής εμφανίζονται σε 40-70% των περιπτώσεων καρκίνου του προστάτη. ERG και ETV1 είναι τα πιο κοινά μέλη ETS παρατηρείται σε αυτές τις γενετικές αλλοιώσεις. Η υψηλή επικράτηση αυτών των αναδιατάξεων και βιολογική σημασία τους αντιπροσωπεύει μια νέα θεραπευτική στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Μέθοδοι και Εκτίμηση

Έχουμε αναφερθεί πρόσφατα την ανάπτυξη του YK-4-279, ένα αναστολέα μικρού μορίου του EWS-FLI1 ογκοπρωτείνης στο σάρκωμα Ewing. Από ERG και ETV1 ανήκουν στην ίδια κατηγορία παραγόντων ETS ως FLI1, ελέγξαμε την ικανότητα του YK-4-279 για την αναστολή των βιολογικών λειτουργιών των πρωτεϊνών ERG και ETV1 στον καρκίνο του προστάτη. YK-4-279 ανέστειλε ERG και ETV1 μεσολάβηση μεταγραφική δραστικότητα σε μια δοκιμασία λουσιφεράσης. YK-4-279 επίσης μειώθηκε έκφρασης κατάντη του mRNA στόχου και της πρωτεΐνης ERG και ETV1 στο

ETV1

-σύντηξης θετική LNCaP και

ERG

σύντηξης θετικά κύτταρα vcap. YK-4-279 μείωσε την κινητικότητα των κυττάρων LNCaP σε μία δοκιμασία μηδέν και την επεμβατική φαινοτύπου των δύο κυττάρων LNCaP και vCap σε μία δοκιμασία εισβολής HUVEC. Fusion-αρνητικά κύτταρα PC3 ήταν αδιάφορη για YK-4-279. SiRNA μεσολαβεί ERG νοκ ντάουν στα κύτταρα vcap οδήγησε σε απώλεια της ανταπόκρισης των ναρκωτικών. Παράλληλα, η παροδική έκφραση ERG σε κύτταρα PC-3 οδήγησε σε αυξημένη επεμβατική δυναμικό, το οποίο μειώθηκε κατά YK-4-279.

Συμπέρασμα

Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι YK-4-279 αναστέλλει ERG και ETV1 βιολογική δραστικότητα σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη σύντηξης-θετικών που οδηγεί σε μειωμένη κινητικότητα και εισβολή. Ως εκ τούτου, YK-4-279 μπορεί να έχει αντίκτυπο στην μετάσταση στον καρκίνο του προστάτη και μπορεί να αξιολογηθεί περαιτέρω για κλινικές εφαρμογές της στον καρκίνο του προστάτη, εκτός από σάρκωμα Ewing

Παράθεση:. Ραχίμ S, Beauchamp EM, Κονγκ Υ, Μπράουν ML, Toretsky JA, Üren Α (2011) YK-4-279 Αναστέλλει ERG και ETV1 Mediated προστάτη Cancer Cell εισβολή. PLoS ONE 6 (4): e19343. doi: 10.1371 /journal.pone.0019343

Συντάκτης: James McCubrey, Καρολίνα Πανεπιστήμιο East, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 Δεκεμβρίου 2010? Αποδεκτές: 28 Μαρτίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 29 Απριλίου 2011

Copyright: © 2011 Rahim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο γενναιόδωρα υποστηρίζεται από το Κέντρο Καρκίνου επιχορήγηση υποστήριξης P30-CA051008 για χρήση Βιθοογθ Μοριακής αλληλεπίδρασης κοινόχρηστο πόρο. Υποστήριξη για το έργο προήλθε επίσης από την ίδρυση του Παιδικού Καρκίνου (Baltimore MD), Go4theGoal, Ίδρυμα του Dani, Λεμονάδα του Alex Stand Ιδρύματος, Liddy Shriver σάρκωμα Πρωτοβουλία, Burroughs Wellcome Κλινική Επιστήμονας Βραβείο στη μεταγραφική έρευνα (JT), και το ΝΙΗ R01CA133662 (JT) , R01CA138212 (JT), R01CA108641 (AU). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: Μια αίτηση για δίπλωμα ευρεσιτεχνίας έχει έχουν κατατεθεί από τους συγγραφείς για την ένωση YK-4-279. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου και η δεύτερη πιο κύρια αιτία του καρκίνου θνησιμότητα στους άνδρες. Χρωμοσωμικές μετατοπίσεις περιλαμβάνουν την οικογένεια ETS παραγόντων μεταγραφής είναι παρόντα σε 40-70% των καρκίνων του προστάτη, συμπεριλαμβανομένων των πιο κλινικά επιθετικές μορφές [1], [2], [3], [4], [5]. Αυτές οι μετατοπίσεις παράγουν χιμαιρικά γονίδια, τα οποία συντήκονται την περιοχή προαγωγού ενός γονιδίου αποκρίνεται ανδρογόνα, όπως

TMPRSS2

, προς την περιοχή κωδικοποίησης των παραγόντων ETS, πιο συχνά

ETV1

ή

ERG

[6], [7]. Αυτές οι ανακατατάξεις οδηγούν σε εξαρτώμενη από ανδρογόνα ρύθμιση των παραγόντων μεταγραφής ETS και υπερέκφραση τους. ETS πρωτεΐνες είναι τα πρωτο-ογκογονίδια που έχουν ενοχοποιηθεί στην παθογένεση [8]. Ελέγχουν την έκφραση των γονιδίων στόχων που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, την εισβολή και την αγγειογένεση. Υπερ-έκφραση των παραγόντων ETS σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη αυξάνουν κύτταρο εισβολή και προκαλεί προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ) σε διαγονιδιακά μοντέλα ποντικών [9]. Εξάντληση των παραγόντων ETS

in vitro

μειώνει την κινητικότητα και τη διεισδυτικότητα. ERG και ETV1 εξάντληση επίσης ως αποτέλεσμα μειωμένη ανάπτυξη του όγκου

in vivo

[7]. Πρόσφατα αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι

TMPRSS2-ERG

έκφραση ενεργοποιείται σε ανθεκτικούς ευνουχισμό καρκίνο του προστάτη [10]. Έτσι, πρωτεΐνες ETS αντιπροσωπεύουν μία νέα στόχο για την πρόληψη ή τη θεραπεία της μεταστατικής νόσου.

Έχουμε αναφερθεί πρόσφατα ένα μικρό μόριο αναστολέα της χιμαιρικής πρωτεΐνης EWS-FLI1 σε σάρκωμα Ewing [11]. YK-4-279 αναστέλλει δραστικότητα EWS-FLI1, επάγει την απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές σάρκωμα Ewing και επιβραδύνει την ανάπτυξη του όγκου σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού. FLI1, ERG και ETV1 είναι παράγοντες ETS Τάξης Ι και να μοιράζονται μεγαλύτερη από 60% ταυτότητα και 80% ομολογία στις αλληλουχίες αμινοξέων τους [12]. Λόγω της στενής ομολογίας των FLI1 με ERG και ETV1, ελέγξαμε την ικανότητα του YK-4-279 να αναστέλλουν δραστικότητα γονιδίου ETS σε κυτταρικές σειρές προστάτη που δείχνουν εξαρτώμενη από ανδρογόνο έκφραση ERG και ETV1. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι YK-4-279 μπορεί να αναστείλει την ERG και ETV1 εξαρτώμενη μεταγραφική δραστηριότητα και, κατά συνέπεια, οδηγεί σε μειωμένη κυτταρική κινητικότητα και την εισβολή.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

είναι

vcap και LNCaP κύτταρα που αποκρίνονται στο ανδρογόνο και το λιμάνι ERG και ETV1 αναδιατάξεις

προστάτη απαιτεί ανδρογόνα για να λειτουργήσει σωστά και ανδρογόνων ανταπόκριση μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βάση για την ομαδοποίηση κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη σε μία από δύο κατηγορίες: ανδρογόνο ευαίσθητα και ανδρογόνων ανθεκτικά. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων ETS αναδιάταξη, το γονίδιο ETS τοποθετείται κάτω από την άμεση ρύθμιση ενός γονιδίου υποκινητή που αποκρίνονται στο ανδρογόνο. Σε αυτές τις περιπτώσεις, ανδρογόνα μεσολαβεί υπερ-έκφραση του ογκογόνου παράγοντα ETS. Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση των αναστολέων ETS στον καρκίνο του προστάτη, επιλέξαμε να συνεργαστεί με κυτταρικές σειρές VCAP και LNCaP. Η VCAP κυτταρική σειρά φιλοξενεί ένα αναδιάταξη TMPRSS2-ERG, η οποία λαμβάνει χώρα μέσω διάμεσης διαγραφή της 3 Mb περιοχή μεταξύ TMPRSS2 και ERG στο χρωμόσωμα 21 (Σχ. 1α) [6]. Η LNCaP κυτταρική σειρά περιέχει μια γενετική μετατόπιση όπου ολόκληρη η locus ETV1 εισάγεται στο τελευταίο ιντρόνιο της περιοχής MIPOL1 ειδικού προστατικού στο χρωμόσωμα 14 (Σχ. 1α) [7]. Οι αναδιατάξεις ERG και ETV1 αλληλοαναιρούνται σε κύτταρα VCAP και LNCaP αντίστοιχα, και δεν είναι παρόντες στην κυτταρική σειρά PC-3. Έτσι, η PC-3 κυτταρική σειρά επελέγη ως αρνητικός μάρτυρας για τις μελέτες μας. Εμείς επικυρωμένες ότι τόσο VCAP και LNCaP κύτταρα είναι ευαίσθητο σε ανδρογόνο, όπως αποδεικνύεται από την αύξηση του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) έκφραση κατά τη διέγερση από την συνθετικό ανάλογο ανδρογόνου R1881 (Σχ. 1β). VCAP και LNCaP κύτταρα εκφράζουν ERG και πρωτεΐνες ETV1 υπό βασικές συνθήκες λόγω της παρουσίας του

ETS

αναδιατάξεις σε αυτά τα κύτταρα. Ανδρογόνων θεραπεία αυτών των κυτταρικών σειρών, αλλά όχι PC-3, οδηγεί σε αυξημένη ERG και ETV1 mRNA και πρωτεϊνών (Σχ. 1γ και δ). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι οι δύο κύτταρα vcap και LNCaP ανδρογόνων ανταποκρίνεται ενώ κύτταρα PC-3 δεν είναι. Ανδρογόνων ανταπόκριση των κυττάρων vcap και LNCaP μεταφράζεται σε αυξημένη ETV1 και την έκφραση ERG οφείλονται σε καρκίνο του προστάτη συγκεκριμένες χρωμοσωμικές αναδιατάξεις.

α) τα κύτταρα του προστάτη αναλύθηκαν για το καθεστώς ETS αναδιάταξη εκτελώντας PCR χρησιμοποιώντας αναδιάταξη ειδικό εκκινητή. κύτταρα vcap φιλοξενούν την αναδιάταξη TMPRSS-ERG ενώ τα κύτταρα LNCaP περιέχουν αναδιαταχθεί ETV1. Vcap και LNCaP κύτταρα εκφράζουν ERG και πρωτεΐνη ETV1 αντίστοιχα, υπό βασικές συνθήκες. PC-3 κύτταρα δεν περιέχουν είτε αναδιάταξη και δεν εκφράζουν ERG ή ETV1. β) VCAP και LNCaP κύτταρα εκφράζουν PSA σε απόκριση σε θεραπεία R1881. PC-3 κύτταρα δεν είναι ανδρογόνων ανταποκρίνεται. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ R1881 για 48 ώρες και η έκφραση PSA αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου qPCR. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν προς ακτίνη. *? p ασήμαντο. γ) R1881 διέγερση οδηγεί σε αυξημένη ERG και ETV1 mRNA σε κύτταρα VCAP και LNCaP αντίστοιχα, αλλά όχι σε κύτταρα PC3. RNA απομονώθηκε από διεγερμένα κύτταρα ανδρογόνων και χρησιμοποιούνται για την εκτέλεση σε πραγματικό χρόνο qPCR. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν στο επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης απουσία ανδρογόνων. δ) Οι πρωτεΐνες ERG και ETV1 εκφράζεται σε κύτταρα VCAP και LNCaP αντίστοιχα, αλλά όχι σε κύτταρα PC-3. Ανδρογόνων διέγερσης οδήγησε σε αυξημένη πρωτεΐνη ERG και ETV1 στα κύτταρα vcap και LNCaP. κύτταρα του προστάτη δεν εκφράζουν πρωτεΐνη FLI1 υπό βασικές ή ανδρογόνων διεγείρεται συνθήκες. ΜΟΙ.Τ4 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας κυτταρικής σειράς για την έκφραση FLI1.

Η

YK-4-279 αναστέλλει ERG και ETV1 μεταγραφική δραστηριότητα

YK-4-279 στοχεύει το EWS-FLI1 ογκοπρωτεΐνη σε σάρκωμα Ewing [11]. Ωστόσο, η ιστοσελίδα της αλληλεπίδρασης με EWS-FLI1 είναι άγνωστη. Λαμβάνοντας υπόψη τη στενή ομολογία μεταξύ FLI1, ERG και ETV1, μελετήσαμε τα αποτελέσματα της YK-4-279 για ERG και ETV1 λειτουργία. Αξιολογήσαμε πρώτα την έκφραση του FLI1 σε κύτταρα του προστάτη. Η ανθρώπινη οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία κυττάρων γραμμή MOLT4 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για έκφραση FLI1, υπό συνθήκες βασικά. Κανένα από τα προστατικά κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη εκφράζουν FLI1 (Σχ. 1 d). Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα της YK-4-279 επί των κυττάρων του προστάτη δεν θα συμβεί ως αποτέλεσμα της στόχευσης FLI1. Στη συνέχεια, επικύρωσε την άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ YK-4-279 και ανασυνδυασμένων ERG και πρωτεΐνες ETV1 χρήση επιφανειακών πλασμονίων (SPR). YK-4-279 συνδέεται προς ERG με συγγένεια (Κ

D) 11,7 μΜ και συνδεδεμένο με ETV1 με συγγένεια 17,4 μΜ (Σχ. 2α, S1). Αξιολογήσαμε YK-4-279 για αποτελέσματα επί μεταγραφική δραστικότητα ERG χρησιμοποιώντας ένα παροδικά επιμολυσμένα θραύσμα 207 bp του γονιδίου υποκινητή ID2 που κατευθύνει την έκφραση της πρωτεΐνης λουσιφεράσης. Αυτή η ελάχιστη περιοχή προωθητή ID2 περιέχει δύο θέσεις ETS και έχει προηγουμένως δειχθεί ότι συνδέεται ERG [13]. Η συν-επιμόλυνση του ERG και ID2 ρεπόρτερ είχε ως αποτέλεσμα μία αύξηση στη δραστικότητα λουσιφεράσης. δραστηριότητα Promoter μειώθηκε με ταυτόχρονη κατεργασία των κυττάρων με YK-4-279, χωρίς καμία αξιόλογη μείωση στα επίπεδα πρωτεΐνης ERG (Σχ. 2β).

α) Δέσμευση κινητική της YK-4-279 για ERG και ETV1 προσδιορίστηκε με συντονισμό επιφανειακών πλασμονίων. YK-4-279 δεσμεύεται να ERG και ETV1 με Κ

D 11,7 μΜ και 17,9 μΜ, αντίστοιχα. Οι SPR διαγραμμάτων αισθητήρα παρέχονται σε συμπληρωματική αριθμούς (Εικ. S1). β) Ένα διεξήχθη δοκιμασία λουσιφεράσης σε κύτταρα COS-7 συν-επιμολύνθηκαν με ERG και ένα κατασκεύασμα λουσιφεράσης Id-2. δραστηριότητα υποκινητή Id-2 μειώθηκε κατά YK-4-279 θεραπεία χωρίς να επηρεάζει τα επίπεδα της πρωτεΐνης ERG. *? p & lt? 0.001. γ) τα κύτταρα VCAP υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 ηΜ siERG ή 10 μΜ YK-4-279 για 48 ώρες και mRNA και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης των στόχων ERG αξιολογήθηκαν. YK-4-279 θεραπεία οδήγησε σε μειωμένη έκφραση του Plau, ADAM19 και ΠΛΑΤ mRNA. τα επίπεδα της πρωτεΐνης Plau και PLAT μειώθηκαν επίσης. Τα αποτελέσματα ήταν συγκρίσιμα με εκείνα που λαμβάνονται με siRNA μεσολαβεί ERG knockdown. δ) LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τα επίπεδα του γονιδίου στόχου 1 μΜ YK-4-279 και ETV1 αξιολογήθηκαν. YK-4-279 θεραπεία οδήγησε σε μειωμένη γονιδιακή έκφραση του ΜΜΡ13 χωρίς σημαντική μείωση των επιπέδων ETV1. *? p & lt?. 0.01

Η

Στη συνέχεια, θα αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της YK-4-279 για την έκφραση των ενδογενών γονιδίων στόχων ERG και ETV1 σε κυτταρικές γραμμές vcap και LNCaP. Εστιάσαμε σε πολλά μέλη της οδού ενεργοποιητή πλασμινογόνου, όπως Plau, PLAT, ΜΜΡ13 και ADAM19. Αυτά τα γονίδια μεσολαβούν ένα επεμβατική φαινότυπο σε αρκετούς καρκίνους και έχουν αναφερθεί ως άμεσοι στόχοι των παραγόντων μεταγραφής ETS [9], [14], [15]. Η έκθεση των κυττάρων Vcap έως 10 μΜ YK-4-279 για 48 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη σε σημαντικά mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης πολλών γονιδίων στόχων ERG, όπως Plau, ΠΛΑΤ και ADAM29. Το επίπεδο της ρύθμισης προς τα κάτω ήταν συγκρίσιμη με εκείνη που λαμβάνεται με siRNA μεσολαβεί ERG knock-down στα κύτταρα vcap (Εικ. 2γ). Παρομοίως, YK-4-279 οδήγησε σε κάτω ρύθμιση ETV1 γονιδίου στόχου ΜΜΡ-13 σε κύτταρα LNCaP (Εικ. 2d). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτή η αναστολή της δραστικότητας της πρωτεΐνης ERG και ETV1 λήφθηκε χωρίς οποιαδήποτε σημαντική μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης ERG ή ETV1. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι YK-4 – 279 είναι ικανή να αναστείλει ERG και ETV1 μεταγραφική δραστικότητα σε καρκινικά κύτταρα προστάτη, οδηγώντας σε μειωμένη έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην διάσπαση εξωκυτταρικής μήτρας και της μετάστασης.

YK-4- 279 αναστέλλει τη μεσολάβηση ETS καρκίνου του προστάτη κυτταρική εισβολή

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι

ETS

γονίδιο αναδιατάξεις μεσολαβούν εισβολή του καρκίνου του προστάτη [7], [9]. Για να αντιμετωπιστεί το ζήτημα αν YK-4-279 είναι σε θέση να αναστείλουν ERG και ETV1 μεσολάβηση εισβολή, χρησιμοποιήσαμε μια σύνθετη αντίσταση δοκιμασία βασίζεται ενδοθηλιακών κυττάρων εισβολή [16]. Αυτή η τεχνική περιλαμβάνει την προσβολή ενός συρρέουσα μονοστιβάδα ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων ομφάλιας φλέβας (HUVECs) με ένα δεύτερο στρώμα των μεταστατικών κυττάρων που αποδίδουν, και εισβάλλουν στην μονοστιβάδα HUVEC. Η ανάκληση κόμβων ενδοθηλιακών κυττάρων και εισβολή των καρκινικών κυττάρων του προστάτη μπορεί να παρακολουθείται σε πραγματικό χρόνο με μέτρηση της μείωσης στην ηλεκτρική αντίσταση σε ηλεκτρόδια χρυσού [17].

Μια δοκιμασία κυτοτοξικότητας πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η μέγιστη ανεκτή δόση του YK-4-279 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. YK-4-279 δεν παρουσίασαν καμία σημαντική μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων σε 1 μΜ για τα κύτταρα LNCaP και 10 μΜ για VCAP και PC3 κύτταρα μετά από 2 ημέρες θεραπείας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επελέγησαν Αυτές οι δόσεις για περαιτέρω λειτουργικές δοκιμασίες, προκειμένου να εξασφαλιστεί ότι οι ανασταλτικές επιδράσεις της YK-4-279 για εισβολή και κινητικότητα, δεν είναι ως αποτέλεσμα του κυτταρικού θανάτου. Όταν τα κύτταρα HUVEC προκλήθηκαν με κύτταρα LNCaP και vcap, οδήγησε σε απότομη μείωση στην ηλεκτρική αντίσταση ενδεικτικό της κυτταρικής εισβολής. Θεραπεία αυτών των κυττάρων με YK-4-279 είχε ως αποτέλεσμα σημαντικά μειωμένη εισβολή των κυττάρων HUVEC από κύτταρα LNCaP και vCap. Η ένωση μόνη δεν είχε καμία επίδραση επί της μονοστιβάδας κυττάρων HUVEC. YK-4-279 δεν αναστέλλει την εισβολή

ETS

-σύντηξης αρνητικά κύτταρα PC-3. (Σχ. 3α και β). Για να διασφαλιστεί ότι τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν ήταν λόγω της αναστολής των πρωτεϊνών ETS, μειώσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης ERG στα κύτταρα vcap χρήση siRNA. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την κατάργηση της YK-4-279 με τη μεσολάβηση της αναστολής της εισβολής (Σχ. 3c). Στη συνέχεια, παροδικά εκφραζόμενη ERG σε PC-3 κύτταρα και αναλύθηκε αυτά τα κύτταρα στον προσδιορισμό εισβολής ενδοθηλιακών κυττάρων. έκφραση ERG μόνη της σε PC-3 κύτταρα που προσδίδεται στα κύτταρα αυτά μια πιο επεμβατική φαινότυπο. Η θεραπεία με YK-4-279 ανέστειλε σημαντικά την αύξηση μεσολάβηση ERG σε εισβολή (Σχ. 3d). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι YK-4-279 είναι ικανή να αναστείλει ETS μεσολάβηση εισβολή των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, τόσο σε κύτταρα με ενδογενείς και εξωγενείς υψηλή έκφραση των πρωτεϊνών ETS.

α) HUVEC κύτταρα που σχηματίζουν μια συρροή μονοστιβάδα προκλήθηκαν με LNCaP, VCAP και PC-3 κύτταρα με ή χωρίς YK-4-279. YK-4-279 ανέστειλε VCAP (10 μΜ) και LNCaP (1 μΜ) κύτταρο εισβολή του HUVECs, ενώ PC-3 κύτταρα δεν επηρεάστηκαν. κύτταρα του προστάτη προ-αγωγή με YK-4-279. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν και αντίσταση κανονικοποιήθηκε προς το χρόνο της προσθήκης της εισβολής κυττάρων. β) Εισβολή ποσοτικοποιήθηκε σε 10 ώρες μετά την προσθήκη των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε σχέση με το μη επεξεργασμένο συνθήκες. *? p & lt? 0,01. γ) έκφραση ERG ήταν μειωμένη σε κύτταρα VCAP χρησιμοποιώντας στήλη C-τερματικό ανιχνευτή siRNA. ERG knockdown σε κύτταρα VCAP οδήγησε σε απώλεια της YK-4-279 μεσολαβεί αναστολή της εισβολής. κύτταρα vcap είχαν προ-επεξεργασία με 10 μΜ YK-4-279 για 2 ημέρες πριν από την αμφισβήτηση του μονοστοιβάδα HUVEC. *? ρ & lt? 0,01, d) έκφραση Παροδική ERG σε PC-3 κύτταρα που προσδίδεται επί των κυττάρων ένας πιο επεμβατική φαινότυπο. Στη συνέχεια, YK-4-279 θεραπεία οδήγησε σε μειωμένη εισβολή. κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με YK-4-279 για 24 ώρες πριν από την αμφισβήτηση του μονοστοιβάδα HUVEC.

Η

YK-4-279 αναστέλλει ETV1 μεσολάβηση κινητικότητα σε LNCaP κύτταρα

Επόμενο , εξετάσαμε τις επιδράσεις της YK-4-279 στην αναστολή της κινητικότητας των κυττάρων LNCaP σε μία δοκιμασία μηδέν. Όλα τα πειράματα σε προηγούμενα σχήματα διεξήχθησαν με χαμηλή κύτταρα LNCaP δίοδο (ρ & lt? 30). Ωστόσο, τα κύτταρα LNCaP χαμηλής διόδου δεν ήταν επιδεκτικά σε αυτήν την τεχνική, όπως αυτοί χαλαρά αποδίδουν στην επιφάνεια του πιάτου κυτταρικής καλλιέργειας. Παρομοίως, κύτταρα Vcap αυξάνονται στις μάζες και δεν σχηματίζουν συρρέουσα μονοστιβάδα. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις αρχή χρησιμοποιώντας υψηλής πέρασμα κύτταρα LNCaP (p & gt? 60). LNCaP κύτταρα High-πέρασμα αυξάνονται με πολύ ταχύτερο ρυθμό και είναι σε θέση να σχηματίσουν μια συρρέουσα μονοστιβάδα [18]. Μπορούν επίσης εκφράζουν υψηλά βασικά επίπεδα του ETV1 (Εικ. 4α) [19]. Πριν από την εκτέλεση του προσδιορισμού μηδέν, YK-4-279 ελέγχθηκε για κυτταροστατική φύση της και βρέθηκε να έχει καμία επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται για τη δοκιμασία μηδέν (Εικ. S2). YK-4-279 θεραπεία των κυττάρων LNCaP οδήγησε σε σημαντική μείωση στην κυτταρική κινητικότητα στην δοκιμασία μηδέν, ενώ δεν παρατηρήθηκαν επιδράσεις επί της κινητικότητας του αρνητικού ελέγχου κυτταρική γραμμή, PC-3 (Σχ. 4β). Η δοκιμασία μηδέν πραγματοποιήθηκε επίσης με προ-επεξεργασία των κυττάρων LNCaP με 10 μg /ml μιτομυκίνη C για 2 ώρες πριν από την ξύσιμο της επιφάνειας. YK-4-279 ήταν ικανή να αναστείλει LNCaP κυτταρική κινητικότητα σε συνθήκες αντιμετωπίζονται μιτομυκίνη, καθώς και (Εικ. S3) Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι επιδράσεις της YK-4-279 επί κυττάρων LNCaP σε δοκιμασία το μηδέν δεν οφείλεται σε κυτταροτοξικότητα, αλλά αποκλειστικά και μόνο λόγω με την αναστολή της κυτταρικής κινητικότητας.

α) LNCaP κύτταρα High-πέρασμα αναλύθηκαν για τα επίπεδα έκφρασης ETV1. κύτταρα ΗΡ-LNCaP εκφράζουν ιδιοσυστατικά υψηλότερες ποσότητες ETV1, σε σύγκριση με κύτταρα PC-3. β) YK-4 με 279 ανέστειλε κινητικότητα σε δοκιμασία το μηδέν στα κύτταρα LNCaP υψηλής διόδου, ενώ κύτταρα PC-3 ήταν αδιάφορη. Η κυτταρική κινητικότητα ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της απόστασης μεταξύ των μεταναστεύουν όρια κυττάρου. Κινητικότητα εκφράστηκε σε σχέση με τις συνθήκες που έλαβαν φορέα. *? p & lt?. 0.0001

Η

Το EWS-FLI1 ογκοπρωτεϊνης εξαρτάται από σύνδεση με RNA ελικάσης Α (RHA) για την ογκογόνο λειτουργία της [20]. YK-4-279 επάγει απόπτωση σε κύτταρα σάρκωμα Ewing μπλοκάροντας την αλληλεπίδραση μεταξύ EWS-FLI1 και RHA. Ως πιθανός μηχανισμός για τη δραστικότητα του YK-4-279 στον καρκίνο του προστάτη, ελέγξαμε κατά πόσο η αλληλεπίδραση ανάμεσα σε ένα μέλος της οικογένειας ETS και RHA είναι παρούσα στα κύτταρα του προστάτη καθώς και. Ενώ ERG δεν αλληλεπιδρά με RHA σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, YK-4-279 δεν είναι σε θέση να εμποδίσει αυτή την αλληλεπίδραση (Σχ. S4). Δοκιμάσαμε επίσης αν YK-4-279 είναι ικανή να μπλοκάρει ERG ή ETV1 δέσμευσης στους ETS επί του DNA χρησιμοποιώντας συντονισμό επιφανειακών πλασμονίων. YK-4-279 δεν ανέστειλε δέσμευση (Εικ. S5A) ERG ή ETV1 DNA. Επιπλέον, χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση διεξήχθη για να αξιολογηθεί σύνδεση προς ERG υποκινητή Plau παρουσία YK-4-279. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν Biacore ευρήματα που YK-4-279 δεν έρχεται σε αντίθεση με δεσμευτικό ERG DNA (Σχήμα S5B). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι τα κύτταρα του Ewing εκφράζουν μία κολοβωμένη πρωτεΐνη FLI1 περιέχει εξόνια 6-9 του μόνο FLI1. ETS μετατοπίσεις σε καρκίνο του προστάτη, από την άλλη πλευρά, έχει ως αποτέλεσμα την έκφραση ενός σχεδόν πλήρους μήκους μέλος της οικογένειας ETS. Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι YK-4-279 μπορεί να αναστείλουν ETV1 και λειτουργία του ERG σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη, εμποδίζοντας τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης που είναι διαφορετικά από ό, τι οι εταίροι EWS-FLI1 σε σάρκωμα Ewing. Ως εκ τούτου, η περαιτέρω έρευνα είναι απαραίτητη για να προσδιοριστεί η ακριβής μοριακός μηχανισμός της YK-4-279 μεσολαβεί αναστολή της ERG και λειτουργία ETV1 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Το αποτέλεσμα της αναστολής ETV1 φαίνεται να είναι πιο ισχυρό από αναστολή ERG, από την άποψη της κυτταρικής κινητικότητας και εισβολή. Ωστόσο, το φαινόμενο αυτό δεν μπορεί να αποδοθεί με βεβαιότητα για την καλύτερη αναστολή ETV1, ως μια δίκαιη σύγκριση των δεδομένων περιπλέκεται από το γεγονός ότι ERG και ETV1 εκφράζονται σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Έτσι, η ποιότητα της απόκρισης μπορεί επίσης να είναι ένας παράγοντας των διαφορών μεταξύ των κυττάρων LNCaP και vCap. Περαιτέρω πειράματα, όπως η μέτρηση του μεγέθους της ERG και ETV1 απάντηση στην ίδια κυτταρική γραμμή, θα πρέπει να αντιμετωπιστούν οριστικά αυτό το σημείο.

Πρόσφατες εκθέσεις έδειξαν ότι ETS knock-down σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα σε μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που εκφράζουν αυτές τις ογκοπρωτεΐνες [21], [22]. Αν και τα πειράματα σε αυτό το χειρόγραφο διεξήχθησαν σε δόσεις και χρονικά διαστήματα που δεν ήταν τοξικό για τα κύτταρα, δεν φαίνεται να είναι μια άμεση συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των πρωτεϊνών ETS και YK-4-279 κυτταροτοξικότητα εκεί. ETS-αναδιάταξη αρνητικών PC-3 και DU-145 κύτταρα δείχνουν ελάχιστη ανταπόκριση YK-4-279 θεραπείας (IC50 & gt? 100 μΜ). Αντιθέτως, YK-4-279 είναι πιο τοξικό για τόσο VCAP (IC50 = 9.55 μΜ μετά από 72 ώρες) και κύτταρα LNCaP (2,75 μΜ μετά από 72 ώρες). Ως εκ τούτου, YK-4-279 μπορούν επίσης να αξιολογηθούν για κυτταροτοξική δυνατότητες του σε ETS-αναδιάταξη θετικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη σε μελλοντικές μελέτες.

Η εξαρτώμενη από ανδρογόνα υπερ-έκφραση του ERG και ETV1 πρωτεΐνης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη ήταν απευθείας ενοχοποιηθεί στην αύξηση της εισβολής και της μετάστασης. Επιπλέον, πολλαπλές μελέτες έχουν συσχετίσει την αυξημένη έκφραση αυτών των πρωτεϊνών με κακή πρόγνωση, υψηλότερες βαθμολογίες Gleason και χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης υποτροπής επιβίωση χωρίς εξέλιξη. Επί του παρόντος, οι εξαρτώμενες από ανδρογόνο μονοπατιών σηματοδότησης στον καρκίνο του προστάτη στοχευμένη μέσω ευνουχισμού και υποδοχέα ανδρογόνων ανταγωνιστές. Τα αποτελέσματα αυτών των επεξεργασιών μπορεί να είναι εν μέρει αποδίδεται στην αρνητική ρύθμιση του αναδιατάχθηκαν παράγοντες ETS. Έτσι, η επιτυχής ανάπτυξη των μικρών μορίων αναστολέων της ERG και ETV1, όπως YK-4-279, θα αντιπροσωπεύει μια νέα γραμμή των θεραπευτικών στοχεύουν στην πρόληψη ή τη θεραπεία της μεταστατικής νόσου, με παράλληλη εξοικονόμηση ασθενείς τα μακροπρόθεσμα αποτελέσματα των θεραπειών που στοχεύουν στην ανδρογόνων μονοπάτι.

Υλικά και Μέθοδοι

Πολιτισμός τηλέφωνα

vcap, LNCaP, PC-3 και DU-145 κύτταρα ελήφθησαν από την ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA ). HUVECs ελήφθησαν από Lonza Biosciences (Allendale, NJ). κύτταρα VCAP διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. LNCaP, PC-3 και DU-145 κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% HEPES. HUVEC κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ΕΒΜ-2 μέσο (Lonza) συμπληρωμένο με EGM-2 kit bullet (Lonza) που περιέχει αυξητικούς παράγοντες, αντιβιοτικά και 5% FBS.

Western-Blots

προϊόντα λύσης πρωτεΐνης παρασκευάζονται και τη δυτική-στυπώματα διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. ERG (sc-354), ETV1 (sc-1953) FLI1 (sc-356), ΠΛΑΤ (sc-5241) και ακτίνη (sc-1615) αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Αντι-Plau αντίσωμα αγοράσθηκε από την Calbiochem (Gibbstown, NJ).

απομόνωση mRNA και qPCR

mRNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) και cDNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας transcriptor πρώτης κλώνου κιτ σύνθεσης cDNA (Roche, San Francisco, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. qRT-PCR διεξήχθη με τη χρήση πράσινου SYBR (Roche) σε Mastercycler realplex

4 όργανο (Eppendorf, New York, ΝΥ). Η γονιδιακή έκφραση κανονικοποιήθηκε προς ακτίνη. Τα ζεύγη εκκινητών που περιλαμβάνονται στο συμπληρωματικό πίνακα S1.

Αναδιάταξη

κατάσταση

Το γονιδιακό DNA απομονώθηκε από το PC-3, LNCaP και vcap κύτταρα χρησιμοποιώντας Οδηγός κιτ εκχύλισης γονιδιακό DNA (Promega, Madison, WI) σύμφωνα με με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές πλευρικές θέσεις αναδιάταξης. Primer αλληλουχίες μπορούν να βρεθούν στο συμπληρωματικό πίνακα S1.

Βιβλιοδεσία Κινητική

συγγένειες δέσμευσης σταθεροποιημένη κατάσταση μετρήθηκαν σε ένα όργανο Biacore T100. Η ανασυνδυασμένη ETV1 (ΟηΟεηε, Rockville, MD) πρωτεΐνες ERG και ακινητοποιήθηκαν επί CM5 τσιπ με σύζευξη αμίνης και 6 διαφορετικές συγκεντρώσεις YK-4-279 εγχύθηκαν πάνω από την επιφάνεια εις διπλούν. SPR διαγραμμάτων αισθητήρα και Κ

D τιμές ελήφθησαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Biacore T100.

Λουσιφεράσης Δοκιμασία

Cos-7 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο το οποίο εκφράζει λεντοϊού η πιο-βρίσκονται συνήθως κολοβωμένη ERG mRNA, και ένα φορέα που περιέχει γονίδιο προαγωγέα ID2 οδηγεί την έκφραση ενός γονιδίου λουσιφεράσης. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Fugene 6 (Roche) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Ένας φορέας που εκφράζει λεντοϊού LacZ χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Τα κύτταρα αφέθηκαν να εκφράσουν ERG για 48 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 μΜ YK-4-279. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε μετά από 24 ώρες χρησιμοποιώντας ένα κιτ διπλής δοκιμασίας λουσιφεράσης σύμφωνα πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Promega, Madison, WI). Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν για ολική συγκέντρωση πρωτεΐνης. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση GraphPad Prism 4.0.

ανδρογόνων και YK-4-279 αγωγή

Για τη θεραπεία των ανδρογόνων, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μέσο ελεύθερο ερυθρού φαινόλης που περιέχει 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FBS και αφήνονται να προσκολληθούν στο κύτταρο-καλλιέργειας πιάτο όλη τη νύκτα. Ακολούθως, τα κύτταρα στερήθηκαν τον ορό για 48 ώρες σε ελεύθερο ερυθρού φαινόλης μέσα και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 10 ηΜ R1881 (Sigma, St-Louis, ΜΟ) για 2 ημέρες.

YK-4-279 διαλύθηκε σε DMSO για την προετοιμασία 10 mM απόθεμα. Λογαριθμικά αναπτυσσόμενα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μΜ ή 10 μΜ YK-4-279 για 48 ώρες πριν από την εκτίμηση για την έκφραση του γονιδίου.

siRNA ERG knockdown

Παροδική ERG knockdown διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα προσαρμοσμένο siRNA (5′-CGACATCCTTCTCTCACAT-3 ‘) που κατευθύνονται έναντι του C-τελικό άκρο του ERG (Dharmacon, Lafayette, CO) [21]. 50 ηΜ siRNA διαμολύνθηκε χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Τα κύτταρα αναλύθηκαν για ERG knockdown 5 ημέρες μετά τη διαμόλυνση με siRNA.

παροδικής έκφρασης ERG

PC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο pLenti6 /V5-DEST (Invitrogen) που εκφράζουν το πιο κοινώς- βρέθηκε περικοπεί ERG ισομορφή. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Fugene 6 (Roche) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή για 48 ώρες.

HUVEC Invasion

Το αντι-επεμβατική δυναμικό της YK-4-279 μετρήθηκε με τη χρήση του η τεχνική του ηλεκτρικού ανίχνευσης κυττάρων αντίστασης (ECI) για ECIS Ζ όργανο (Εφαρμοσμένης Βιοφυσικής, Troy, Νέα Υόρκη) και το σύστημα xCELLigence (Roche). Εν συντομία, 250 000 κύτταρα HUVEC σπάρθηκαν σε 8W10E + συστοιχίες με κυκλώματα ηλεκτρόδιο σε καλά κάτω μέρος για να μετρηθεί ηλεκτρική αντίσταση. Μετά το σχηματισμό ενός συρρέουσα μονοστιβάδα HUVEC (app. 21-24 ώρες), τα εισβάλλοντα κύτταρα καρκίνου προστάτη προστέθηκαν σε πυκνότητα 100.000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μέσα DMEM ή RPMI που περιέχει τις αναφερόμενες συγκεντρώσεις του φαρμάκου. Τα καρκινικά κύτταρα προ-θεραπεία για 24-48 ώρες με YK-4-279 πριν από την προσθήκη. Αυτή τη φορά το σημείο της προσθήκης των καρκινικών κυττάρων έγινε δεκτή ως 0 ώρες της θεραπείας και της εισβολής παρακολουθήθηκε κατά τη διάρκεια των επόμενων 12 ωρών με τη μέτρηση των αλλαγών στην αντίσταση κατά την ενδιάμεση φάση κύτταρο-ηλεκτρόδιο. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν. Αντίσταση κανονικοποιήθηκε προς το χρόνο της προσθήκης της εισβολής κυττάρων.

ξυστό Δοκιμασία

Τα κύτταρα επιστρώνονται και αφήνονται να σχηματίσουν ένα συρρέουσα μονο-στοιβάδα. Η κυτταρική επιφάνεια ήταν γδαρμένο χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας ρ-200. Τα κύτταρα αφέθηκαν να γεμίσει το γδαρμένο περιοχή και παρακολουθείται κατά τη διάρκεια των 72 ωρών. Εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση μικροσκοπίου Nikon Eclipse Ti (Nikon, Melville, ΝΥ). Η κυτταρική κινητικότητα ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της απόστασης μεταξύ των μεταναστεύουν όρια των κελιών.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας)

PC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο pLenti6 /V5-DEST (Invitrogen) που εκφράζουν την συνηθέστερα βρέθηκε ακρωτηριασμένη ισομορφή ERG. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Fugene 6 (Roche) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή για 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή για 6 ώρες με όχημα 10 μΜ ή YK-4-279. ChIP διεξήχθη χρησιμοποιώντας EZMagna Protein ένα τσιπ Kit από την Millipore σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ανοσοκαταβύθιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας 2 μg του ERG αντισώματος (SC-354x, Santa Cruz Biotechnology), 2 μg Κανονική IgG κουνελιού (Sigma Aldrich) και 1 μg του Ροΐ II (Millipore). PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές προηγουμένως δημοσιευθεί για θετική ERG πρόσδεσης στον υποκινητή Plau στα κύτταρα του προστάτη [9]. Ένα προφίλ PCR των 94 ° C-5 min: 1 κύκλος, 94 ° C-30 sec, 55 ° C-30 sec, 72 ° C-1 min: 35 κύκλοι, 72 ° C-5 min: 1 κύκλος χρησιμοποιήθηκε για μια θερμοκυκλωτής Eppendorf Realplex4

Στατιστική Ανάλυση

Ομάδες συγκρίθηκαν με τη χρήση t-test δύο ουρών του Student (Prism 4, GraphPad Software, La Jolla, CA) και η p & lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική .

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

SPR διαγραμμάτων αισθητήρα για YK-4-279 σύνδεση με ERG και ETV1. συγγένειες δέσμευσης σταθερής κατάστασης μετρήθηκαν με ένεση 6 διαφορετικές συγκεντρώσεις YK-4-279 πάνω από ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ERG και ETV1 ακινητοποιημένη στην επιφάνεια του τσιπ CM5 σε ένα όργανο Biacore T100. SPR διαγραμμάτων αισθητήρα ελήφθησαν με τη χρήση του λογισμικού Biacore T100

doi:. 10.1371 /journal.pone.0019343.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

YK-4-279 δεν είναι ένας κυτταροστατικός παράγοντας. VCAP (10,000 κύτταρα /φρεάτιο), LNCaP-υψηλής διαβιβάσεως (10,000 κύτταρα /φρεάτιο), LNCaP-χαμηλής διόδου (10,000 κύτταρα /φρεάτιο) και PC-3 (5.000 κύτταρα /φρεάτιο) κύτταρα σπάρθηκαν όλη τη νύκτα σε xCELLigence E-16 πλάκες και αφέθηκαν να προσκολληθούν στην καλά-πυθμένα. Η xCELLigence E-16 φρεατίων πλάκες πυθμένα καλύπτεται με μικροσκοπικά χρυσά ηλεκτρόδια τα οποία μετρούν αλλαγές στην ηλεκτρική αντίσταση στην επιφάνεια των ηλεκτροδίων. Οι μεταβολές στην ηλεκτρική αντίσταση που απεικονίζεται ως μια αδιάστατη παράμετρος που ονομάζεται κύτταρο-δείκτη, και είναι ευθέως ανάλογη με το εμβαδόν του πυθμένα καλά καλύπτονται από ηλεκτρόδια. Περίπου 20 ώρες μετά την σπορά των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, μέσα καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 1 μΜ (LNCaP, PC-3) ή 10 μΜ (VCAP) YK-4-279. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων παρακολουθήθηκε για 72 ώρες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0019343.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

YK-4-279 αναστέλλει LNCaP κυτταρική κινητικότητα. Τα κύτταρα επιστρώνονται και αφήνονται να σχηματίσουν ένα συρρέουσα μονο-στοιβάδα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10 μg /ml μιτομυκίνη-C για 2 ώρες πριν από την δοκιμασία το μηδέν, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24], [25]. Μετά την επεξεργασία με μιτομυκίνη-C, φρέσκο ​​μέσο προστέθηκε και το κυτταρικής επιφάνειας ήταν γδαρμένο χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας ρ-200. Τα κύτταρα αφέθηκαν να γεμίσει το γδαρμένο περιοχή και παρακολουθείται κατά τη διάρκεια των 60 ωρών. Η κυτταρική κινητικότητα ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της περιοχής του μηδέν δεν καλύπτεται με κύτταρα που μεταναστεύουν .. Κινητικότητα εκφράστηκε σε σχέση με τις συνθήκες που έλαβαν φορέα. *? p & lt? 0,0001

doi: 10.1371 /journal.pone.0019343.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

ERG αλληλεπιδρά με RHA στα κύτταρα vcap. YK-4-279 δεν εμποδίζει την αλληλεπίδραση μεταξύ ERG και RHA. 9 × 10

7 κύτταρα VCAP σπάρθηκαν σε 15 πιάτα cm και αφέθηκαν να προσκολληθούν και εξαπλωθούν επί 48 ώρες. Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 10 μΜ YK-4-279 για 24 ώρες. Διεξήχθη ανοσοκαταβύθιση όπως περιγράφεται προηγουμένως [11]

doi:. 10.1371 /journal.pone.0019343.s004

(TIF)

Σχήμα S5.

YK-4-279 δεν αναστέλλει ERG ή ETV1 δέσμευσης στο DNA. α) ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ERG ή ETV1 ακινητοποιήθηκαν επί της επιφανείας του πλακιδίου Biacore CM5 με σύζευξη αμίνης. Άγριου-τύπου δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια (ATGTAGACCGGAAGTAACTA) που περιέχει τη θέση δεσμεύσεως «GGAA» συναίνεσης Ets εγχύθηκαν σε 5 μΜ τριπλούν πάνω από την επιφάνεια του τσιπ σε παρουσία ή απουσία 50 μΜ YK-4-279. Η σύνδεση του DNA σε ανασυνδυασμένη ERG ή ETV1 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό Biacore T100.