Αφηρημένο

αντικαρκινικές ιδιότητες και τους μηχανισμούς της mimulone (MML),

C

-geranylflavonoid απομονωθεί από το

αυτοκρατορικό δέντρο

φρούτα, είχαν κατ ‘αρχάς διευκρινιστεί σε αυτή τη μελέτη. MML εμπόδισε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε μια δόση και το χρόνο που εξαρτάται από τον τρόπο και ενεργοποιείται απόπτωση μέσω της εξωγενούς οδού σε κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα Α549 ανθρώπινα. Επιπλέον, MML-κατεργασμένα κύτταρα εμφανίζονται χαρακτηριστικά αυτοφαγικά, όπως ο σχηματισμός του αυτοφαγικά κενοτόπια, ένα πρωτεύον μορφολογικό χαρακτηριστικό του αυτοφαγία, και τη συσσώρευση των μικροσωληνίσκων που σχετίζονται ελαφριάς αλυσίδας 3 (LC3) puncta πρωτεΐνη 1, ένα άλλο τυπικό κατασκευαστή της αυτοφαγία, όπως προσδιορίζεται με FITC-συζευγμένο ανοσοχρώσης και monodansylcadaverine χρώσης (MDC), αντίστοιχα. Τα επίπεδα έκφρασης του LC3-Ι και LC3-ΙΙ, ειδικούς δείκτες αυτοφαγία, επίσης αυξάνεται με αγωγή MML. αναστολή αυτοφαγία από 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ), φαρμακολογικές αναστολέα αυτοφαγία, και shRNA νοκ ντάουν της Beclin-1 μειώνεται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από MML. Αυτοφαγικά ροή δεν επηρεάστηκε σημαντικά από τη θεραπεία MML και αναστολέας λυσοσωμικής, χλωροκίνη (CQ) κατέστειλε MML που προκαλείται από αυτοφαγία και την απόπτωση. MML επαγόμενη autophagy προήχθη από μειώσεις στα επίπεδα ρ53 και ρ-mTOR και αύξηση του ρ-ΑΜΡΚ. Επιπλέον, η αναστολή της ρ53 μετενεργοποίηση με pifithrin-α (PFT-α) και knockdown του ρ53 ενισχυμένη επαγωγή αυτοφαγία και τελικά προωθείται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Συνολικά, τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι αυτοφαγία συμβάλλει στην κυτταροτοξικότητα του MML σε καρκινικά κύτταρα που φιλοξενούν άγριου τύπου ρ53. Η μελέτη αυτή υποδηλώνει σαφώς ότι MML είναι ένας πιθανός υποψήφιος για ένα αντικαρκινικό παράγοντα που στοχεύει τόσο αυτοφαγία και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα. Επιπλέον, συν-θεραπεία MML και αναστολέα της p53 θα είναι πιο αποτελεσματική στη θεραπεία του ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Μια H-K, Kim K-S, Lee J-W, Πάρκο Μ-Η, η Σελήνη Η-Ι, Πάρκο S-J, et al. (2014) Mimulone-Induced Autophagy μέσω p53-διαμεσολαβείται ΑΜΡΚ /mTOR Pathway Αυξάνει κασπάσης-διαμεσολαβούμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα Α549 Ανθρώπινου καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (12): e114607. doi: 10.1371 /journal.pone.0114607

Επιμέλεια: Ilya Ulasov, σουηδική Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 του Ιούλη 2014? Αποδεκτές: 10 Νοεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 9 Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Μια et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή υποστηρίζεται από την Dong-A Ταμείο Έρευνας του Πανεπιστημίου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή καρκίνο

του πνεύμονα είναι η πιο διαδεδομένη κακοήθης όγκος που αντιπροσωπεύει μία από τις κύριες αιτίες της παγκόσμιας θανάτου που σχετίζεται με καρκίνο και μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) καταγράφει σχεδόν το 85% όλων των καρκίνων του πνεύμονα [1], [ ,,,0],2]. Παρά τις σημαντικές προόδους στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένων χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και τη χημειοθεραπεία, η πρόγνωση για τους ασθενείς που έχουν καρκίνο του πνεύμονα εξακολουθεί να είναι κακή, με λιγότερο από το 15% του συνολικού ποσοστού επιβίωσης 5 ετών [1]. Ειδικά, η χημειοθεραπεία με πλατίνα ενώσεις ή συνδυασμούς με βάση την πλατίνα είναι το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα και θεωρείται ότι είναι η βέλτιστη θεραπεία σε ασθενείς που έχουν προχωρημένο στάδιο NSCLC [2], [3]. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα είναι εξαιρετικά περιορισμένη, λόγω της ανθεκτικότητας στα φάρμακα και τοξικές παρενέργειες των φαρμάκων [2], [3]. Έτσι, είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη λιγότερο τοξικών και περισσότερο αποτελεσματικών χημειοθεραπευτικών παραγόντων για την αγωγή ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα.

Τα τελευταία χρόνια, φυτικής προέλευσης φυσικά προϊόντα έχουν λάβει εκτεταμένες προσοχή ως κύριες πηγές νέων φαρμάκων για τη μείωση χημειοθεραπεία συνδέονται παρενέργειες και ασκούν αντικαρκινικές επιδράσεις τους πυροδοτώντας την απόπτωση και autophagy [4] – [7]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι διάφορα φυτικής προέλευσης φυσικά προϊόντα, συμπεριλαμβανομένων πλουμπαγκίνη [8], glossogin [9], η κουρκουμίνη [10], celastrol [11], isolinderalactone [12] και η γλυκυρριζίνη [13], polydatin [14], 6- σογκαόλη [15], γλυκυρροχητινικό οξύ [16] και embelin [17], διεγείρουν απόπτωση μέσω της ενδογενούς και /ή εξωγενούς οδού και ενεργοποίηση του μονοπατιού ρ38 /ΙΝΚ σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Επιπλέον, η 6-σογκαόλη προκάλεσε κυτταρικό θάνατο μέσω επαγωγής autophagy από την αναστολή της οδού ΑΚΤ /mTOR σε ανθρώπινα κύτταρα NSCLC Α549 [18] και η πακλιταξέλη και feroniellin A εξασκείται κυτταροτοξικά αποτελέσματά τους μέσω επαγωγής τόσο αυτοφαγία και απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα πνεύμονα καρκίνος Α549 [19], [20].

αυτοκρατορικό δέντρο

Steud. (Scrophulariaceae) είναι φυλλοβόλο δέντρο που διανέμονται σε όλη την Κίνα, την Κορέα και την Ιαπωνία [21], καθώς και αποσπάσματα από

P

.

tomentosa

έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανακούφιση του βρογχίτιδα, ασθματικές κρίσεις και φλέγμα στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική [22]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι το

C

-geranylated φλαβονοειδή, τα κύρια βιοενεργά συστατικά του

P. tomentosa

, έχουν νευροπροστατευτικές επιδράσεις, αντιοξειδωτικό και αντιβακτηριακές δραστηριότητες [23] – [26]. Επιπλέον,

C

-geranylated φλαβανόνες από

αυτοκρατορικό δέντρο

φρούτα εμφάνισαν ισχυρή κυτταροτοξική δράση σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές του ανθρώπου [27], [28]. Έχει επίσης αναφερθεί πρόσφατα ότι geranylated φλαβανόνη tomentodiplacone Β αναστέλλει άμεσα τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με ρύθμιση προς τα κάτω της δραστικότητας εξαρτώμενων από κυκλίνη κινάση 2, οδηγώντας σε συσσώρευση φάση G1 σε ΤΗΡ-1 μονοκυτταρικά κύτταρα ανθρώπινης λευχαιμίας [29]. Ωστόσο, ο υποκείμενος μηχανισμός υπεύθυνος για την αντικαρκινική δράση των φλαβονοειδών geranylated δεν είναι καλά διευκρινιστεί.

Έχουμε απομονωθεί πρόσφατα μια ένωση που ανήκει στην

C

-geranylated φλαβονοειδή, mimulone (MML), από το

αυτοκρατορικό δέντρο

φρούτα. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε πρώτα τα αντικαρκινικά αποτελέσματα της MML σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και διευκρίνισε επίσης το μηχανισμό δράσης του. Έχουμε αποδείξει εδώ ότι MML προκαλεί αυτοφαγία προηγούμενες απόπτωση στα ανθρώπινα κύτταρα Α549 NSCLC, και η αναστολή αυτοφαγία μειώνει την απόπτωση σε MML-επεξεργασμένα κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Monodansylcadaverine ( MDC), 4 ‘, 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ), χλωροκίνη (CQ), η ένωση Γ (συνθ C) και 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης διυδροχλωρίδιο (ϋΑΡΙ) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ , ΗΠΑ). Z-VAD-FMK (αναστολέας παν-κασπάσης), Ζ-DEVD-FMK (κασπάσης-3 αναστολέα), Ζ-IETD-FMK (κασπάσης-8 αναστολέα) και Ζ-LEHD-FMK (κασπάσης-9 αναστολέα) ελήφθησαν από Calbiochem (EMD Biosciences, San Diego, CA, USA). 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ), ϋΑΡΙ, πουρομυκίνη-διυδροχλωρίδιο και χλωροκίνη (CQ) διαλύθηκαν σε dH

2O. 3-ΜΑ (100 mM), πολυ-L-Λυσίνη (0,1%) και πολυβρένιο (20 mg /ml) διαλυμένο σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Pifithrin-α (PFT-α), η ένωση Γ (συνθ C) και MDC διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). Αντισώματα για ATG7, Beclin-1, LC3, κασπάσης-3, κασπάσης-8, κασπάσης-9, Bid, π-p38, p38, π-ΑΜΡΚ-α, ΑΜΡΚ-α, π-ACC, ACC, π-mTOR, mTOR ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (χορευτές, Mass, USA)? αντισώματα για ΡΑΚΡ-1/2, p53 (DO-1), ρ-ERK και ERK αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)? αντίσωμα για Ρ62 /SQSTM1 αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA)? αντισώματος για αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) ελήφθη από την Millipore (Milford, ΜΑ, USA)? Η υπεροξειδάση χράνου (HRP) δευτερογενή αντισώματα αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (χορευτές, Mass, USA) και Enzo Life Science (Farmingdale, ΝΥ, USA), αντίστοιχα? Ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), συζευγμένης δευτερεύον αντίσωμα ελήφθη από Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA). κιτ ανίχνευσης απόπτωσης αννεξίνης V-FITC και κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης BCA αγοράσθηκαν από BD Biosciences (San Jose, CA, USA) και Θέρμο (Rockford, IL, USA), αντίστοιχα. MML (Εικ. 1Α) που απομονώνεται από

P. tomentosa

φρούτα παρασκευάστηκε όπως περιγράφεται στην προηγούμενη έκθεση [25], διαλυμένα σε DMSO σε 40 mM για τη συγκέντρωση υλικού, και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C.

(Α) μοριακή δομή του mimulone. Διάφορα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Α549 (Β), ο καρκίνος του μαστού MCF7 (C), HCT116 καρκίνου του παχέος εντέρου (D) και οστεοσαρκώματος U2OS κύτταρα (Ε) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το MML όπως υποδεικνύεται συγκεντρώσεις (0-80 μΜ) για 12 ώρες ή 24 ώρες και στη συνέχεια η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. ιστογράμματα δείχνουν το ποσοστό της βιωσιμότητας. (F) Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το MML σε διάφορες συγκεντρώσεις (0-80 μΜ) για 24 ώρες και τα βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν με βαφή κυανούν τρυπανίου. Τα ζωντανά κύτταρα (μη χρωσμένα κύτταρα) υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο και ραβδογράφημα υποδεικνύει το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων. Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Ρ & lt? 0.05 και ** ρ & lt?. 0.01 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

κυτταροκαλλιέργειες

Ανθρώπινα Α549 καρκίνωμα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου μαστού MCF-7, καρκίνωμα ανθρώπινου ορθοκολικού HCT116 και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές οστεοσαρκώματος U2OS αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ? WelGENE Co., Daegu, Κορέα) που περιέχει 10% (ν /ν) αδρανοποιημένο με θερμότητα ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και 1% PSA (WelGENE Co., Daegu, Κορέα) σε 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 σε αέρα.

κυτταρική βιωσιμότητα

για την ανάλυση της βιωσιμότητας των κυττάρων, ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη με μία διαδικασία παρόμοια με αυτή που περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 24 φρεατίων (5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) και αναπτύχθηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με MML σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0-80 μΜ) για 24 ώρες ή επεξεργασία με 60 μΜ του MML για διαφορετικές χρονικές πορείες (0-24 h). Μετά την επεξεργασία MML, τα κύτταρα επωάστηκαν με μέσο /ΜΤΤ (0,5 mg /ml) μίγματος επί 3 ώρες. DMSO προστέθηκε για να διαλύσει το μειωμένο φορμαζάνης κρύσταλλο από ΜΤΤ και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 540 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλάκας ELISA (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Για να επιβεβαιωθεί η επίδραση των MML στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ζώντα κύτταρα μετρήθηκαν με βαφή κυανούν τρυπανίου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε πλάκα 12 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με MML όπως υποδεικνύεται συγκεντρώσεις για 24 ώρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας τρυψίνη-ΕϋΤΑ (WelGENE Co., Daegu, Κορέα) και χρωματίστηκαν με 0,4% trypan blue διάλυμα (Gibco, Carlsbad, CA). Ζωντανά κύτταρα μετρήθηκαν με αιμοκυτταρόμετρο. Η βιωσιμότητα των κυττάρων δείχθηκε σε σχέση με το μάρτυρα.

εκχύλιση πρωτεϊνών και Western Blot ανάλυση

πρωτεΐνη ολόκληρου κυττάρου εκχυλίσματα από κύτταρα Α549 παρασκευάστηκαν με ένα ρυθμιστικό RIPA (Pierce, Rockford, IL, USA) που περιέχει μείγμα αναστολέα πρωτεάσης (GE Healthcare, Piscataway, Η.Π.Α.) και αναστολέα φωσφατάσης κοκτέιλ (Thermo, Rockford, IL, USA). Πρωτεΐνες από λύματα ολόκληρων κυττάρων προσδιορίστηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας BCA κιτ προσδιορισμού πρωτεϊνών σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Ενισχυμένη χημειοφωταύγειας (ECL) σύστημα ανίχνευσης (Amersham Bioscience, NJ, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του σήματος και την ένταση του σήματος του ανιχνεύεται ζώνες πρωτεΐνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Scion Μέσο εικόνας (Scion Co., Frederick, MD, USA). Ίση φόρτωση αξιολογήθηκε από GAPDH ως εσωτερικοί έλεγχοι για κηλίδωση Western.

Η ανοσοκυτταροχημεία

χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη με μια παρόμοια διαδικασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Εν συντομία, τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε στείρες καλυπτρίδες και κατεργάζεται με MML για 24 ώρες, και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 3% παραφορμαλδεΰδη (PFA) επί 15 λεπτά στους 37 ° C. Στη συνέχεια, το βήμα διαπερατοποίηση διεξήχθη με ψυχρή μεθανόλη (100%) για 10 λεπτά στους -20 ° C και στη συνέχεια τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε διάλυμα δέσμευσης που περιέχει 5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) και 1% Triton-X 100 για 1 h στους 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με το αντίσωμα LC3 για 12 ώρες σε 4 ° C που ακολουθείται από FITC-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα στους 37 ° C. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (1 μg /ml) για 10 λεπτά στους 37 ° C. εικόνες φθορισμού συλλήφθηκαν από LSM 700 συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).

MDC χρώση

χρώση MDC πραγματοποιήθηκε επίσης με μία διαδικασία παρόμοια με αυτή που περιγράφηκε προηγουμένως [30 ]. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 3% PFA για 10 λεπτά στους 37 ° C, και στη συνέχεια επωάστηκαν με 50 μΜ monodansylcadaverine (MDC), μία ένωση αυτοφθορίζοντα ότι οι ετικέτες κενοτόπια αυτοφαγικά στους 37 ° C για 10 λεπτά. Φθορίζουσες εικόνες συλλήφθηκαν από την Olympus BX51 μικροσκόπιο φθορισμού (Κέντρο Valley, PA, USA).

Annexin V και ΡΙ χρώση

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία όπως επισημαίνεται συγκεντρώσεις MML και /ή αναστολείς (κασπάσης αναστολείς, 3-ΜΑ, PFT-α) για 24 ώρες, και συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας θρυψίνη-EDTA. Μετά από χρώση με ΡΙΤΟ-συζευγμένο Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), αποπτωτικά κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ροής Beckman Coulter-Cytomics FC500 κυτταρόμετρο (Beckman Coulter-, Miami, FL, USA).

παρεμβολή RNA

pLKO.1 λεντοϊού πλασμίδιο έκφρασης που περιέχει shRNA έναντι Beclin-1 (TRCN0000033552) και p53 (TRCN0000003753), (Beclin-1? 5′-CCGGCTCAAGTTCATGCTGACGAATCTCGAGATTCGTCAGCATGAACTTGAGTTTTTG-3 ‘, ρ53? 5′-CCGGCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGTTTTT-3’) αγοράστηκαν από Sigma-Aldrich (Mission shRNA). Τα ιικά σωματίδια παρήχθησαν σε 294T σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pLKO.1 shBeclin-1, VSVG και Gag φορείς. Viral σούπα στη συνέχεια εγχύθηκε σε κύτταρο Α549 και επωάστηκαν για 12 ώρες. Τα κύτταρα Α549 ιού μολυσμένα επιλέχθηκαν με επεξεργασία πουρομυκίνη διυδροχλωρίδιο και επιλεγμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα. pLKO.1 shRNA φορέας ελέγχου (Mission shRNA, SHC002) χρησιμοποιείται ως έλεγχος.

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων σε κάθε ομάδα. Οι διαφορές μεταξύ κάθε ομάδων αξιολογήθηκαν με Μαθητή

t-test

και * ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε για να δείξει τη στατιστική σημαντικότητα

Αποτελέσματα

Επίδραση του MML στην κυτταρική βιωσιμότητα. διάφορες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές

για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της MML στην κυτταρική ανάπτυξη διαφόρων κυτταρικών γραμμών καρκίνου ανθρώπων, ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα Α549 (Εικ. 1Β), ανθρώπινου καρκίνου του μαστού MCF-7 (Σχ. 1 C), τα ανθρώπινα καρκίνο του παχέος εντέρου HCT116 (Εικ. 1 D) και το ανθρώπινο U2OS οστεοσαρκώματος (Εικ. 1 Ε) κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MML σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 12 ώρες ή 24 ώρες και στη συνέχεια ακολουθείται από ποσοτικούς προσδιορισμούς ΜΤΤ. ΜΤΤ αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι η θεραπεία MML ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε μια δόση και το χρόνο που εξαρτάται από τον τρόπο σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Για τον έλεγχο περαιτέρω το αποτέλεσμα του MML για κυτταρικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MML σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβάλλεται σε μπλε χρώση trypan. Το αποτέλεσμα αποκάλυψε μια σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με κατεργασία MML κατά τρόπο εξαρτώμενο από την δόση (Εικ. 1 F).

MML ενεργοποιεί κασπάση-εξαρτώμενη απόπτωση σε κύτταρα Α549

Για να καθοριστεί εάν MML- επαγόμενη κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα Α549 οφειλόταν σε απόπτωση, μετά τη θεραπεία MML σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 24 ώρες ή 60 μΜ της θεραπείας MML για διαφορετικές χρονικές περιόδους, αποπτωτικά πληθυσμός αναλύθηκε με διπλή χρώση αννεξίνης V /PI. Annexin V /ΡΙ-θετικά κύτταρα αυξήθηκαν σημαντικά σε μια δόση και το χρόνο που εξαρτάται από τον τρόπο (Σχ. 2Α-C) που δείχνει την αποπτωτική δράση του MML σε κύτταρα Α549. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε επίσης ότι η αγωγή MML αυξημένη συσσώρευση των κυττάρων στο αποπτωτικό φάση υπο-G1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Ο αριθμός των κυττάρων σε G2 /M φάση αυξήθηκε επίσης με δόση-εξαρτώμενο τρόπο (S1 Σχήμα). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η επίδραση του MML στην επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα Α549, κασπάσης-3 ενεργοποίησης και πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) διάσπαση ερευνήθηκαν με ανοσοκηλίδωση με αντισώματα τους. Caspase-3, ένα βασικό εκτελεστή στο αποπτωτικό μηχανήματα, διασπά πολλές πρωτεΐνες απαραίτητες για την επιβίωση των κυττάρων και ενεργοποιείται μέσω διάσπασης σε δύο θραύσματα (17 kDa και 19 kDa) με κασπάση-8 και /ή τη κασπάση-9 κατά τη διάρκεια της απόπτωσης [31], [32]. Η ενεργοποιημένη κασπάση-3, στη συνέχεια διασπά κυτταρικές πρωτεΐνες, περιλαμβανομένων των PARP, η οποία οδηγεί σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. PARP παίζει ζωτικό ρόλο στη διατήρηση γονιδιωματική ακεραιότητα και είναι η κύρια πρωτεΐνη που πρόκειται να πρωτεολύονται με κασπάσης-3 κατά τη διάρκεια της απόπτωσης [32]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2D, κασπάσης-3 και PARP σχάσεις ήταν σαφώς αυξημένη μετά από 60 μΜ της θεραπείας MML για 24 ώρες, υποδεικνύοντας ότι MML απόπτωση που επάγεται μέσω της κασπάσης-3 διάσπαση ενεργοποίηση και ΡΑΚΡ σε κύτταρα Α549. Κασπάση-8 και τη κασπάση-9 παίζουν σημαντικό ρόλο στην επαγωγή απόπτωσης μέσω του θανάτου με τη μεσολάβηση υποδοχέων (εξωγενής) και η μιτοχονδριακή (ενδογενές) μονοπάτια, αντίστοιχα [31], [32]. Η διάσπαση της προσφοράς απαιτείται για την στιχομυθία μεταξύ των εξωγενών και ενδογενών οδών [31], [32]. Για να ξετυλίξουν την οδό με την οποία MML επάγει απόπτωση σε κύτταρα Α549, πρωτεϊνικό περιεχόμενο της κασπάσης-8 και κασπάσης-9 αναλύθηκαν με ανάλυση ανοσοστυπώματος. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2D, η θεραπεία MML αύξησε τις διασπασμένης μορφές (18 kDa και 43 kDa) της κασπάσης-8, αλλά δεν ενεργοποιούν κασπάσης-9 και Bid διασπάσεις, υποδεικνύοντας ότι MML προκάλεσε την ενεργοποίηση της κασπάσης-8 σε κύτταρα Α549. Για την περαιτέρω επιβεβαιώσει αν το MML επαγόμενη απόπτωση ήταν κασπάσης-εξαρτώμενη, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων ελέγχθηκε με διπλή χρώση αννεξίνης V-ΡΙ μετά από μια θεραπεία 24 ώρες με διάφορες κασπάση αναστολείς όπως Z-VAD-FMK (αναστολέας παν-κασπάσης ), Ζ-DEVD-FMK (κασπάσης-3 αναστολέα), Ζ-IETD-FMK (κασπάσης-8 αναστολέα) και Ζ-LEHD-FMK (κασπάσης-9 αναστολέα). Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Ε, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι MML επαγόμενη απόπτωση διασώθηκε από αναστολέα κασπάσης-τηγάνι, κασπάσης-3 και κασπάσης-8 αναστολείς σε σύγκριση με τη θεραπεία MML μόνη της, αλλά όχι από αναστολέα κασπάσης-9. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα ελήφθη επίσης από ΜΤΤ δοκιμασία (Σχ. 2F). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι MML-επαγόμενη απόπτωση οδηγείται κυρίως από εξωγενή οδό αντί ενδογενούς οδού.

(Α) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με το MML όπως υποδεικνύεται συγκεντρώσεις (0-60 μΜ) για 24 ώρες και στη συνέχεια χρωματίζονται με FITC- συζευγμένο Annexin V και ΡΙ. Τα αποπτωτικά κύτταρα μετρήθηκαν με κυτταρόμετρο ροής. (Β) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 60 μΜ του MML για ένα διάστημα εξαρτώμενο τρόπο. Τα αποπτωτικά κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Annexin V και ΡΙ και ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας κυτταρομετρητή ροής. (Γ) Μπαρ γράφημα δείχνει το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων (δόση-εξαρτώμενο τρόπο? Κορυφή, χρονο-εξαρτώμενο τρόπο? Κάτω). Αποπτωτικών πληθυσμό αξιολογήθηκε με Αννεξίνη V θετική, PI αρνητικό (AV + /ΡΙ-, λευκή γραμμή) και Annexin V και διπλά θετικό PI (AV + /ΡΙ +, μαύρη γραμμή) αποπτωτικών κυττάρων. (D) Κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το MML όπως υποδεικνύεται συγκεντρώσεις (0-60 μΜ) για 24 ώρες και ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθη για να ελέγξει τον προσωπικό απόπτωση, κασπάσης-3, -8, -9, Bid και PARP-1/2, αντίστοιχα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης της ανάλυσης στυπώματος Western. (Ε) Κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ή χωρίς κάθε αναστολέα κασπάσης, Ζ-VAD-FMK (30 μΜ), Ζ-DEVD-FMK (30 μΜ), Ζ-IETD-FMK (30 μΜ) και Ζ-LEHD-FMK (30 μΜ) για 1 ώρα και στη συνέχεια κατεργάζεται με MML (60 μΜ) για 24 ώρες. Τα αποπτωτικά κύτταρα βάφτηκαν με Annexin V και ΡΙ και στη συνέχεια πληθυσμοί ανιχνεύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής. (F) Κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αναστολείς κασπάσης και MML υπό τις ίδιες συνθήκες όπως και η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και στη συνέχεια η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. γραφήματα Bar δείχνουν το ποσοστό των κυτταρικής βιωσιμότητας (άνω) και το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων (κάτω), αντίστοιχα. Αποπτωτικών πληθυσμό αξιολογήθηκε με Αννεξίνη V θετική, PI αρνητικό (AV + /ΡΙ-, λευκή γραμμή) και Annexin V και διπλά θετικό PI (AV + /ΡΙ +, μαύρη γραμμή) αποπτωτικών κυττάρων. Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,05 και ** p & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο?

# p & lt?. 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα MML επεξεργασμένο

Η

MML προκαλεί αυτοφαγία στα κύτταρα Α549

Οι φυτών που προέρχονται από φυσικές ενώσεις είναι γνωστό ότι ασκούν αντικαρκινική τα αποτελέσματά τους με την πρόκληση αυτοφαγία σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [7]. Αυτοφαγία είναι μια καταβολική διαδικασία σχηματισμού διπλής μεμβράνης κυστίδια, που ονομάζεται αυτοφαγοσώματα [33]. Για να διερευνηθεί κατά πόσο MML προκαλεί αυτοφαγία στα κύτταρα Α549, ελέγχθηκαν οι μορφολογικές αλλαγές μετά τη θεραπεία MML. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, εκτεταμένες σχηματισμό κενοτοπίων κυτόπλασμα και σχηματισμούς autophagosome-όπως κενοτόπια σε MML επεξεργασμένα Α549 κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Για να επιβεβαιώσετε την επαγωγή αυτοφαγία από MML, χρώση MDC και σχετίζεται με τους μικροσωληνίσκους πρωτεΐνη 1 ελαφριά αλυσίδα 3 (LC3) ανοσοκηλιδώσεως με φθορίζοντα αντισώματα για LC3 έγιναν. MDC και LC3 είναι γνωστά ως ειδικοί δείκτες του αυτοφαγικά κενοτόπια και αυτοφαγοσώματα, αντίστοιχα, και το σχηματισμό του puncta LC3 στο autophagosome μπορεί να παρατηρηθεί με συνεστιακή μικροσκοπία, η οποία χρησιμοποιείται ευρέως ως αξιόπιστη μέθοδος ικανή να ανιχνεύει autophagy [33]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, MML-μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου έδειξαν διάχυτο MDC-χρώση, ενώ MML-επεξεργασμένα κύτταρα Α549 ως αποτέλεσμα μια αύξηση της έντασης φθορισμού που δείχνει εκτεταμένη MDC-θετικών κενοτόπια αυτοφαγικά. Επιπλέον, η αυξημένη υποκυτταρική εντόπιση του στικτή LC3 ανιχνεύθηκε επίσης σε MML επεξεργασμένα κύτταρα Α549 συγκριτικά με ακατέργαστα κύτταρα ελέγχου και σχηματισμός LC3 puncta αυξήθηκε σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 3Β). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση της σχηματισμός autophagosome σε MML-επεξεργασμένα κύτταρα, οι αλλαγές στις τρεις μεγάλες δείκτες αυτοφαγία σχετίζονται, LC3-ΙΙ, Beclin-1 και ATG7, αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. ATG7 και τα επίπεδα πρωτεΐνης LC3-ΙΙ αξιοσημείωτα αυξημένα σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με επεξεργασία MML, αλλά το επίπεδο Beclin-1 ήταν ελαφρώς επαυξημένη (Σχ. 3C). Μαζί, αυτά τα δεδομένα δείχνουν σαφώς ότι MML επάγει autophagosome σχηματισμό σε κύτταρα Α549.

(Α) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 60 μΜ του MML για 24 ώρες και στη συνέχεια μορφολογικές εικόνες συλλήφθηκαν με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (400 ×, PC). Τα βέλη δείχνουν τις ενδογενείς κενοτόπια autophagosome-όπως (αριστερά) και ραβδόγραμμα δείχνει τον αριθμό των χυμοτόπια ανά κύτταρο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MML (60 μΜ, 24 ώρες) και στη συνέχεια τα κύτταρα χρωματίστηκαν με MDC και το αντίσωμα LC3, αντίστοιχα. MDC (φωτεινό χρώμα, μέση) εικόνες συλλήφθηκαν από μικροσκόπιο φθορισμού και LC3 (πράσινο, δεξιά) φθορίζουσες εικόνες εντοπίστηκαν από συνεστιακό μικροσκόπιο (bar? 10 μm). γράφημα Bar δείχνει την ένταση φθορισμού του LC3 FITC. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MML (60 μΜ) για διάφορες χρονικές περιόδους (0-24 ώρες) και χρώση LC3 ανοσοφθορισμός για την ανίχνευση αυτοφαγοσώματα. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακό μικροσκόπιο (bar? 10 μm). (Γ) Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις MML (0-60 μΜ) για 24 ώρες. Η ανάλυση στυπώματος Western στη συνέχεια διεξήχθη με αντισώματα έναντι ATG7, Beclin-1 και LC3, αντίστοιχα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. ραβδόγραμμα δείχνει την ανάλυση πυκνότητας των LC3-II /αναλογία GAPDH. Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις MML (0-60 μΜ) για 24 ώρες (D) ή 60 μΜ MML για τη διαφορετική χρονική πορεία (Ε) και, στη συνέχεια, ανοσοκηλίδας ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι ρ62 και LC3, αντίστοιχα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (F) Α549 κύτταρα προ-επωάστηκαν με ή χωρίς χλωροκίνη (CQ, 25 μΜ) για 1 ώρα, στη συνέχεια κατεργάζεται με MML (60 μΜ) για 24 ώρες. Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε χρησιμοποιώντας αντισώματα όπως αναφέρεται ανωτέρω. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης κηλίδωση Western. Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,05 και ** p & lt?. 0.01 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Είναι γνωστό ότι αυτοφαγοσώματα συσσωρεύονται, επίσης, όταν αυτοφαγικά ροής που δείχνει την όλη διαδικασία της αυτοφαγία είναι ανεπαρκής [35], [46]. Για να αξιολογηθεί το κατά πόσον MML επηρεάζει την αυτοφαγικά ροής σε κύτταρα Α549, το επίπεδο της πρωτεΐνης ρ62 η οποία χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση της ροής αυτοφαγικά [35], [46] ελέγχθηκε με ανοσοστύπωμα με αντίσωμα της. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3D και 3Ε, το επίπεδο ρ62 ήταν σημαντικά μειωμένη με κατεργασία MML σε μια δόση και το χρόνο που εξαρτάται από τον τρόπο. Επιπλέον, για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της MML για αυτοφαγικά κύκλου εργασιών κύστη, τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ62 και LC3 II ελέγχθηκαν με ανοσοαποτύπωση μετά από μια θεραπεία 24 ώρες με χλωροκίνη (CQ), γνωστό ως αναστολέας της υποβάθμισης λυσοσωμικής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3F, η προθεραπεία με CQ αύξησε σημαντικά τα επίπεδα του ρ62 και LC3 II σε σύγκριση με θεραπεία MML μόνο. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι η θεραπεία MML δεν παρεμβαίνει αυτοφαγικά κύκλο εργασιών κύστη. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα σίγουρα δείχνουν ότι MML προκαλείται από αυτοφαγία χωρίς απομείωση της αυτοφαγικά ροής σε κύτταρα Α549.

Η αναστολή της αυτοφαγία με αναστολέα αυτοφαγία ή εξουδετέρωση των Beclin-1 καταστέλλει MML μεσολάβηση αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο

έχει τεκμηριωθεί πρόσφατα ότι η αναστολή autophagy από ένα συγκεκριμένο αναστολέα αυτοφαγία, όπως 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ), μπορεί να προωθήσει την απόπτωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [35] – [38]. Έτσι, διερευνήσαμε την επίδραση της 3-MA στο σχηματισμό LC3 puncta και αυτοφαγικά κενοτόπια σε MML επεξεργασμένα κύτταρα Α549. Η κατανομή στικτή LC3 και το σχηματισμό του MDC-θετικών αυτοφαγοσώματα σε MML επαγόμενη κύτταρα αισθητά κατασταλεί από θεραπεία 3-ΜΑ (Σχ. 4Α). Επιπλέον, η συν-θεραπεία με MML και αναστέλλει σημαντικά όχι μόνο συσσώρευση 3-ΜΑ LC3-ΙΙ αλλά και κασπάσης-3 και διασπάσεις PARP (Εικ. 4Β). Στη συνέχεια, ελέγξαμε την επίδραση της 3-ΜΑ επί της διέγερσης απόπτωσης χρησιμοποιώντας διπλή χρώση αννεξίνης V /PI. Annexin V /ΡΙ-θετικά κύτταρα μειώθηκαν σημαντικά σε κύτταρα συν-επεξεργασία με MML και 3-ΜΑ, σε σύγκριση με εκείνους που έλαβαν θεραπεία με MML μόνο (Σχ. 4C). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με συν-επεξεργασία των MML με CQ (Εικ. 4D). Αυτά τα αποτελέσματα προφανώς δείχνουν ότι η αναστολή autophagy με 3-ΜΑ και CQ θα μπορούσε να καταστείλει MML-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα Α549.

(Α) Α549 κύτταρα προ-επωάστηκαν με ή χωρίς 3-ΜΑ (10 mM) για 3 h και στη συνέχεια επωάστηκαν με MML (60 μΜ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα βάφτηκαν με MDC (φωτεινό χρώμα) ή LC3 (πράσινο) αντίσωμα, αντιστοίχως. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (μπλε). Φθορισμού εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας συνεστιακό μικροσκόπιο (bar? 10 μm). (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ή χωρίς 3-MA για 3 ώρες πριν από την επεξεργασία του MML (60 μΜ) για 24 ώρες. Η ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε με αντισώματα ενάντια LC3, PARP-1/2 και κασπάσης-3, αντίστοιχα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. γραφήματα Bar δείχνουν την αναλογία της διασπασμένης κασπάσης-3 /GAPDH και LC3-II /GAPDH, αντίστοιχα. (C) κύτταρα Α549 προκατεργάστηκαν 3 ώρες με ή χωρίς 3-ΜΑ και κατεργάζεται με MML (60 μΜ) για 24 ώρες και τα κύτταρα βάφτηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο Annexin V /ΡΙ και στη συνέχεια μετρήθηκε με FACS. γράφημα Bar υποδεικνύει το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων. Ποσοστό αποπτωτικών κυττάρων εκτιμήθηκε με Αννεξίνη V θετική και αρνητική PI (AV + /ΡΙ-, λευκή γραμμή) και Annexin V και διπλά θετικό PI (AV + /ΡΙ +, μαύρη γραμμή) αποπτωτικών κυττάρων. (D) Κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ή χωρίς CQ για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκαν με MML για 24 ώρες. ανάλυση Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντισώματα όπως υποδεικνύεται προηγουμένως. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CQ και MML υπό τις ίδιες συνθήκες όπως αναφέρθηκε προηγουμένως και στη συνέχεια, η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με ΜΤΤ δοκιμασία (κάτω). γράφημα Bar δείχνει το ποσοστό βιωσιμότητας των κυττάρων. Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,05 και ** p & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο?

# p & lt?. 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα MML επεξεργασμένο

Η

Πιο συγκεκριμένα η αναστολή της οδού αυτοφαγία μπορεί να επιτευχθεί με νοκ-άουτ ή εξουδετέρωση των αυτοφαγία που σχετίζονται με (

ATG

) γονίδια και

Beclin-1

γονίδιο. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αν αυτοφαγία μπορεί να ρυθμίσει την απόπτωση, Beclin-1, ένας κρίσιμος ρυθμιστής της αυτοφαγία, χτυπήθηκε κάτω χρησιμοποιώντας μικρά RNA φουρκέτας (shRNA) και, στη συνέχεια, τις αλλαγές των ενδογενών αυτοφαγοσώματα ελέγχθηκαν από LC3 ανοσοχρώση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, ενδογενής διανομή LC3 είναι αισθητά μειωμένη σε MML επεξεργασμένο Beclin-1 νοκ ντάουν κύτταρα (shBeclin-1) σε σύγκριση με το MML-επεξεργασμένα κύτταρα shControl. Επιπλέον, όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β, νοκ ντάουν του

Beclin-1

γονίδιο σημαντικά κατέστειλε Beclin-1 πρωτεϊνική έκφραση και τη συσσώρευση των LC3-II σε σύγκριση με shControl. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα χρησιμοποιώντας 3-ΜΑ και CQ, κασπάσης-3 και διασπάσεις PARP επίσης ανέστειλε σημαντικά από την καταστολή του autophagy μέσω knockdown του

Beclin-1

γονιδίου. ΜΤΤ αποτέλεσμα δοκιμασίας έδειξε επίσης ότι η κυτταροτοξική δράση του MML μειώθηκε σημαντικά από knockdown του

Beclin-1

γονιδίου (Σχ. 5C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν σαφώς ότι η αναστολή autophagy με 3-ΜΑ και CQ ή Beclin-1 knockdown εμπόδισε MML-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα Α549.

κύτταρα knockdown (Α) Έλεγχος και Beclin-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με MML (60 μΜ) για 24 ώρες και στη συνέχεια χρώση ανοσοφθορισμού LC3 διεξήχθη για την ανίχνευση αυτοφαγοσώματα. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. Εικόνες συνελήφθησαν από συνεστιακό μικροσκόπιο (bar? 10 μm). (Β) knockdown κυττάρων (shControl, shBeclin-1) υπέστησαν κατεργασία με MML (60 μΜ) για 24 ώρες. Η ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε με αντισώματα ενάντια Beclin-1, LC3, PARP-1/2 και κασπάσης-3, αντίστοιχα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. γραφήματα Bar αναφέρει την αναλογία του LC3-II /GAPDH και διασπασμένη κασπάση 3 /GAPDH, αντίστοιχα. (Γ) Έλεγχος και Beclin-1 κύτταρα knockdown υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MML (60 μΜ) για 24 ώρες και στη συνέχεια η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. γράφημα Bar αντιπροσωπεύει το ποσοστό της κυτταρικής βιωσιμότητας. Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,05 και ** p & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο?

# p & lt?. 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα MML επεξεργασμένο

Η

MML προκαλεί αυτοφαγία μέσα από μείωση των επιπέδων της p53

Έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι η p53 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ρύθμιση της αυτοφαγία [39] – [41]. Για να διερευνηθεί αν p53 εμπλέκεται στην MML μεσολάβηση αυτοφαγία, έτσι, τα επίπεδα του ρ53 και της πρωτεΐνης LC3-ΙΙ εξετάστηκαν με ανοσοκηλίδωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, θεραπεία MML μειωθεί εντυπωσιακά επίπεδα ρ53 σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, αλλά αυξημένα επίπεδα LC3-ΙΙ. Επιπλέον, κασπάσης-3 και PARP σχάσεις αυξήθηκαν επίσης κατά τη θεραπεία MML. Επιπλέον, τα επίπεδα LC3-ΙΙ και διασπάται επίπεδα κασπάσης-3 και PARP αυξήθηκαν σημαντικά σε κύτταρα συν-επεξεργασία με MML και pifithrin-α (PFT-α), μια φαρμακολογική αναστολέα ρ53, σε σύγκριση με εκείνους που έλαβαν θεραπεία με MML ή PFT-α μόνη . Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι η μείωση των επιπέδων ρ53 με MML θα μπορούσε να ενισχύσει την επαγωγή της αυτοφαγία και απόπτωσης σε κύτταρα Α549 που φιλοξενούν άγριου τύπου ρ53. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ο ρόλος της p53 στη MML που προκαλείται από αυτοφαγία, αυτοφαγοσώματα ερευνήθηκαν από LC3 ανοσοχρώση. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ.