Αφηρημένο

μη κωδικοποιητικού RNA (ncRNAs) είναι το κυρίαρχο προϊόν της ευκαρυωτικών μεταγραφής. Τα προϊόντα αυτά κυμαίνονται από σύντομες microRNAs (miRNAs) σε μεγάλες διαγονιδιακές μη κωδικοποιητική RNAs (lincRNAs). Εγκύκλιος RNAs που αποτελείται από εξονικό ακολουθίες αποτελούν μελετημένο μορφή ncRNA που ανακαλύφθηκε πάνω από 20 χρόνια πριν. Χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία ανάστροφης μεταγραφάσης αντίδραση αλύσου πολυμεράσης TaqMan-based, αναλύσαμε τη σχέση μεταξύ

CIR-φαγούρα

έκφραση και του παχέος εντέρου (CRC) σε ένα σύνολο 45 CRCs και αντιστοιχισμένο γειτονικών δειγμάτων μη καρκινικό ιστό. Βρήκαμε ότι

CIR-φαγούρα

έκφρασης τυπικά κάτω-ρυθμίζονται σε CRC σε σύγκριση με περινεοπλαστικό ιστό. Το αποτέλεσμα αυτό, καθώς επίσης και διάφορα πειράματα παρακολούθησης, έδειξε ότι

CIR-φαγούρα

θα μπορούσε να αυξήσει το επίπεδο του

ITCH

, η οποία εμπλέκεται στην αναστολή του μονοπατιού /β-κατενίνης Wnt . Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το

CIR-φαγούρα

παίζει ένα ρόλο στη CRC με τη ρύθμιση της οδού Wnt /β-κατενίνης

Παράθεση:. Huang G, Zhu Η, Shi Υ, Wu W, Cai η, Chen X (2015)

CIR-φαγούρα

Παίζει Ανασταλτικό ρόλο στον καρκίνο του παχέος εντέρου με τη ρύθμιση της Wnt /β-κατενίνης Pathway. PLoS ONE 10 (6): e0131225. doi: 10.1371 /journal.pone.0131225

Επιμέλεια: Yifeng Zhou, Ιατρικό Κολέγιο του Πανεπιστημίου Soochow, ΚΙΝΑ

Ελήφθη: 24 του Απρίλη, 2015? Αποδεκτές: 30η Μαΐου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιουνίου 2015

Copyright: © 2015 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από Wenzhou Ίδρυμα Επιστήμης και Τεχνολογίας του Προεδρείου Φυσικών Επιστημών (Y20140700 Δρ XC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια κακοήθης νεοπλασία που βρίσκεται στο παχύ έντερο ή του ορθού [1, 2]. CRC παραμένει μια σημαντική αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στον ανεπτυγμένο κόσμο, σε μεγάλο βαθμό λόγω της τάσης του να κάνουν μετάσταση [3]. CRC αποτελεί σημαντικό πρόβλημα δημόσιας υγείας, δεδομένου ότι είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος στους άνδρες και η δεύτερη πιο συχνή στις γυναίκες. Έχουν υπάρξει πολλές συγκριτικές μελέτες που αποδεικνύουν επιγενετικές αλλαγές που συνδέονται στενά με την εμφάνιση και την ανάπτυξη της CRC. Παρά το γεγονός ότι οι ερευνητικές CRC επιτεύγματα είναι αξιοσημείωτη, οι παράγοντες αιτιολογικό και τους μηχανισμούς παθογένειας που διέπουν την ανάπτυξη CRC φαίνεται να είναι πολύπλοκη και ετερογενής.

Πρόσφατα, κυκλικό RNA, ένα είδος μη κωδικοποιητική RNA που συνήθως δεν δρουν με κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη, βρέθηκε να είναι στενά συνδεδεμένη με την ανάπτυξη του όγκου [4]. Εγκύκλιος RNA είναι συνήθως αποτελείται από περισσότερα από ένα εξόνιο και συνήθως εμπλουτισμένο με λειτουργικό microRNA (miRNA) θέσεις πρόσδεσης? για παράδειγμα,

CDR 1

περιέχει αρκετές συντηρημένες θέσεις δέσμευσης για miRNA-7 (miR-7). Πρόσφατα, μια μελέτη ανέφερε ότι

CIR-φαγούρα

είναι ένα κυκλικό RNA που εκτείνεται σε διάφορα εξώνια του ουμπικουϊτίνη (Ub) πρωτεΐνη λιγάση (Ε3) (κνησμός) [5-7]. Το άρθρο ανέφερε ότι

CIR-φαγούρα

φιλοξενεί πολλές θέσεις πρόσδεσης miRNA που μπορεί να συνδεθεί με το 3′-UTR του

ITCH

, συμπεριλαμβανομένων εκείνων για τα miR-7, miR-17, miR-214 , miR-128 και miR-216b [5, 8]. Η μελέτη των miRNAs είναι πιο ώριμη από αυτή του κυκλικού RNA? miRNAs είναι 21-νουκλεοτιδίων-μήκους μη-κωδικοποίησης RNAs που έχουν σημαντικούς ρόλους σε πολλές βιολογικές διεργασίες στις δύο φυτά και ζώα [9]. Ώριμη miRNAs παίζουν σημαντικό ρυθμιστικούς ρόλους στην κυτταρική ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, και θάνατο των κυττάρων.

CIR-φαγούρα

παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την πρόοδο της ESCC [7].

ITCH

‘s στόχους, συμπεριλαμβανομένων των p63, p73, και Notch1, συνήθως συνδέονται με το σχηματισμό όγκων και χημειοευαισθησία, καταδεικνύοντας τη σύνδεση των ITCH στη βιολογία του καρκίνου [10]. Προηγούμενη έρευνα συζητηθεί κυκλικές RNA αντικαρκινικές δραστηριότητες σε κακοήθεις κυτταρικές σειρές μελανώματος [11]. Ωστόσο, δεν υπάρχουν δημοσιευμένες μελέτες σχετικά με τις λειτουργικές τους ρόλους του κυκλικού RNA στο CRC.

Σε αυτή τη μελέτη, υποθέσαμε ότι

CIR-φαγούρα

παίζει παρόμοιο ρόλο στη CRC. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, έχουμε αναπτύξει μια μέθοδο για να οριοθετηθούν τα μεταγραφικά διαφορές στο

CIR-φαγούρα

μεταξύ CRC και ζεύγη γειτονικών μη νεοπλασματικών ιστών.

Υλικά και Μέθοδοι

Μελέτη θέματα

Όλα τα θέματα σε αυτή τη μελέτη ήταν ομοιογενής Κινέζων Χαν. Σαράντα-πέντε CRC και τα αντίστοιχα δείγματα paracancerous ιστών ελήφθησαν από ασθενείς στο πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο του Wenzhou Medical College (Wenzhou). Δεν υπήρχαν περιορισμοί στην ηλικία, το στάδιο της CRC, το φύλο ή την ιστολογία. Κατά την πρόσληψη, κάθε υποκείμενο έδωσαν γραπτή συγκατάθεση από τον προγραμματισμό μια συνέντευξη στην οποία έλαβαν ένα δομημένο ερωτηματολόγιο. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Wenzhou Ιατρικό Κολέγιο. Τα κλινικά χαρακτηριστικά του συνόλου των ασθενών που παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Η

καλλιέργειας κυττάρων

Το ανθρώπινο CRC κυτταρικές σειρές HCT116 και SW480 αγοράστηκαν από την Τράπεζα Κυττάρων του Type Culture Collection του κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Σαγκάη Ινστιτούτο Βιολογίας Κυττάρου και περάστηκαν για λιγότερο από 6 μήνες.

η κατασκευή του κυκλικού πλασμιδίου RNA

Κατασκευάσαμε το κυκλικό πλασμίδιο RNA χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Η μέθοδος κατασκεύασμα προηγουμένως δημοσιευθεί [8]. Το προκύπτον κατασκεύασμα (

pcDNA3

.

1-CIR-φαγούρα

) επιβεβαιώθηκε με άμεση αλληλούχιση.

εκχύλιση RNA και σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτής αντίδρασης ποσοτικής πολυμεράσης

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα και ιστούς χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η σχετική έκφραση γονιδίου του

CIR-φαγούρα

προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας qPCR, η οποία βασίζεται στη μέθοδο TaqMan.

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο ελέγχου, και όλες οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν [12, 13]. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για qPCR ενίσχυση είναι η προς τα εμπρός GCAGAGGCCAACACTGGAA, η αντίστροφη TCCTTGAAGCTGACTACGCTGAG, ο CCGTCCGGAACTATGAACAACAATGGCA καθετήρα.

RNase Ρ πέψη

Η αντίδραση πέψης ΚΝάσης R εκτελέσθηκε ακολουθώντας προηγουμένως δημοσιευμένες μεθόδους. Οι αντιδράσεις πέψης και κατακρήμνιση επαναλήφθηκαν δύο φορές με αναλογία 3 U ενζύμου /mg του RNA [14].

παροδικές επιμολύνσεις και προσδιορισμούς λουσιφεράσης

HCT116 και SW480 κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον ανταποκριτή πλασμίδια που περιγράφονται παραπάνω χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000. τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με τα miRNAs σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή [15]. Κάθε ομάδα περιελάμβανε 6 επαναλήψεων, και τριπλούν ανεξάρτητα πειράματα.

ακτινομυκίνη D δοκιμασία

HCT116 και SW480 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 και συν-επιμολύνθηκαν με mRNAs όπως υποδεικνύεται για 24 ώρες . Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτίθενται σε ακτινομυκίνη D. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, και η σταθερότητα του

CIR-φαγούρα

mRNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής (qRT-PCR). Η δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με το προηγούμενο άρθρο.

κηλίδος Western

ανάλυση στυπώματος Western για την αξιολόγηση Wnt3A, β-κατενίνης και της έκφρασης β-δράση διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16].

κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κινητό Μετρώντας Kit-8 (CCK-8) του συστήματος σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Υπήρχαν 6 επαναλήψεις για κάθε ομάδα, και τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές.

Στατιστικές αναλύσεις

Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του

CIR-φαγούρα

και το

ITCH

γονίδιο σε ιστούς CRC προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης και γραμμικά πρότυπα παλινδρόμησης. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων εκτιμήθηκαν με t-test σε αντιστοίχιση, 2-tailed Student. Ένα

P

-τιμή του & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Αναγνώριση του κυκλικού RNA

Δύο σετ

ITCH

εκκινητές σχεδιάστηκαν για αυτή τη μελέτη: μια αποκλίνουσα δέσμη για να ενισχύσει μόνο την κυκλική μορφή και μια συγκλίνουσα που να ενισχύσει τις γραμμικές μορφές. Επιβεβαιώσαμε ότι το κυκλικό σχήμα ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τους εκκινητές αποκλίνοντα. cDNA και γονιδιωματικό DNA χρησιμοποιήθηκαν ως οι έλεγχοι. Όπως αναμενόταν, δεν παρατηρήθηκε ενίσχυση χρησιμοποιώντας τις αποκλίνουσες εκκινητές επί γενωμικού DNA. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως γραμμικό έλεγχο (Εικόνα 1Α).

(Α) εναρκτήρες Συγκλίνουσες μπορεί να ενισχύσει κυκλικό RNAs και γραμμικό RNA. Αποκλίνουσες εναύσματα ενισχύουν κυκλική RNAs μόνο σε cDNA σε σύγκριση με το γονιδιακό DNA (gDNA). GAPDH είναι γραμμικό έλεγχο. (Β) Το

CIR-φαγούρα

εκφράστηκε σε υψηλότερο επίπεδο σε περίπου 75,6% των CRC παρακείμενους ιστούς σε σύγκριση με ταιριάζει CRC ιστούς. Το επίπεδο έκφρασης του

CIR-φαγούρα

αναλύθηκε με qRT-PCR βασίζεται σε Taq-man και ομαλοποιήθηκε ως προς

GAPDH

. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (C) Τυχαία εκκινητές και oligodT εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα στα πειράματα αντίστροφης μεταγραφής. Η προβλεπόμενη

CIR-φαγούρα

είναι απούσα σε πολυ εμπλουτισμένα δείγματα (Α). (Δ) Η προβλεπόμενη

CIR-φαγούρα

είναι αντιδρούν ενάντια στη θεραπεία RNase Ρ. t-test 2-tailed σπουδαστή χρησιμοποιήθηκαν σε δοκιμή οι διαφορές μεταξύ των ομάδων * ρ & lt? 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο.

Η

Η έκφραση του

CIR-φαγούρα

στο CRC και οι περιβάλλοντες ιστούς

Χρησιμοποιήσαμε την αποκλίνουσα δέσμη των εκκινητών και να χρησιμοποιηθεί μια TaqMan με βάση δοκιμασία qRT-PCR για την επικύρωση της παρουσίας του κυκλικού RNA σε 45 ιστούς CRC και αντιστοιχισμένο μη καρκινικούς ιστούς.

CIR-φαγούρα

εκφράστηκε σε υψηλότερο επίπεδο σε περίπου 75,6% των ιστών CRC σε σύγκριση με εκείνη των αντιστοιχισμένων μη καρκινικά δείγματα (Σχήμα 1Β).

Χαρακτηρισμός

cir -ITCH

στα κύτταρα CRC

Έχουμε κατασκευάσει ένα φορέα για την έκφραση

CIR-φαγούρα

στα κύτταρα μετά την προηγούμενη μελέτη και στη συνέχεια να εκτελούνται πειράματα. Οι κατασκευασμένες πλασμίδια επιμολύνθηκαν παροδικά σε HCT116 και SW480 κυττάρων.

Στα πειράματα αντίστροφης μεταγραφής, χρησιμοποιήσαμε τυχαίων εκκινητών και ολιγο (dT) αρχικά τεμάχια. Οι κυκλικές προϊόντα εξαντλούνται στα πολυ-Α-εμπλουτισμένα δείγματα σε σύγκριση με τα γραμμικά προϊόντα. Κατά τη χρήση του ολιγο (dT) αρχικά τεμάχια, την ποσότητα έκφρασης (κανονικοποιημένη σε GAPDH) των γραμμικών

ITCH

ήταν σημαντικά υψηλότερη από αυτή της κυκλικής

ITCH

(Εικόνα 1 C) [11].

Χρησιμοποιήσαμε το ένζυμο RNase Ε, μια ιδιαίτερα επεξεργαστικό 3′-5 ‘exoribonuclease, για να ελέγξετε τις προβλέψεις μας για τα κυκλικά χαρακτηριστικά RNA. Αυτή η εξωνουκλεάση αποικοδομεί γραμμικά μόρια RNA σε μία κατεύθυνση 3’-5 ‘, αλλά δεν λειτουργεί σε κυκλική RNAs [17, 18]. Όπως ήταν αναμενόμενο, σε αντίθεση με τις γραμμικές RNAs ελέγχου, τα οποία αποικοδομούνται, η προβλεπόμενη κυκλική RNA ήταν ανθεκτικό στη θεραπεία RNase R (Σχήμα 1 D).

Αλληλεπίδραση

CIR-φαγούρα

και miRNA

Πρόσφατα, κυκλικό RNA έχει αναγνωριστεί ως μια πλούσια τάξη των ρυθμιστικών μεταγραφές που λειτουργούν ως σφουγγάρια miRNA [5, 8]. Το λογισμικό Miranda χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη του στόχου miRNA. Η ακολουθία των προβλεπόμενων microRNAs θέσεις δέσμευσης παρουσιάστηκαν στον Πίνακα 2. Βρήκαμε ότι miR-7, miR-20a, και miR-214 μπορεί να συνδεθεί με την 3′-αμετάφραστη περιοχή (UTR) του

ITCH

και

CIR-φαγούρα

. Ως εκ τούτου, έχουμε εισαχθεί το

ITCH

αλληλουχία δέσμευσης σε psiCHECK-2 και κατασκευάστηκε δημοσιογράφους λουσιφεράσης για αυτές τις 3 miRNAs από παροδικά συν-επιμόλυνση τους σε κύτταρα HCT116. Το κατασκεύασμα είχε μειώσει σημαντικά τη δραστικότητα λουσιφεράσης για miR-7, miR-20a, και miR-214 σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο στα κύτταρα HCT116 ελέγχου (1 pmol miRNA-7: 1,02 ± 0,028 έναντι 1,236 ± 0,068,

P

= 0,05? 40 pmol miRNA-7: 0,808 ± 0,052 έναντι 1,236 ± 0,068,

P

= 0,02? 1 pmol miRNA-20α: 2.09 ± 0.123 έναντι 2.498 ± 0.068,

P

= 0,02? 40 pmol miRNA-20α: 1.887 ± 0.11versus 2.498 ± 0.068,

P

= 0.006? 1 pmol miRNA-214: 1.511 ± 0.059 έναντι 1,88 ± 0,043,

P

= 0,03? 40 pmol miRNA-214: 1,38 ± 0,058 έναντι 1,88 ± 0,043,

P

= 0,006). Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν όταν επαναλάβαμε τα ίδια πειράματα στον έλεγχο SW480 κυττάρων.

Η

Πραγματοποιήσαμε το ίδιο πείραμα σε

CIR-φαγούρα

κύτταρα υπερ-έκφραση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στη δραστηριότητα λουσιφεράσης όταν η psiCHECK-2-

ITCH

θέση δέσμευσης με miR-7 και miR-20a μετασκευάστηκε σε HCT116 και SW480 κύτταρα, αλλά ότι υπήρχε σημαντική διαφορά για miR-214 (1 pmol miRNA-7: 1.147 ± 0.041 έναντι 1.236 ± 0.042,

P

= 0,069? 40 pmol miRNA-7: 1.138 ± 0.015 έναντι 1.236 ± 0.042,

P

= 0,12? 1 pmol miRNA-20α: 2.424 ± 0.017 έναντι 2.526 ± 0.058,

P

= 0,11? 40 pmol miRNA-20α: 2.345 ± 0.04 έναντι 2.526 ± 0.058,

P

= 0.069 ? 1 pmol miRNA-214: 1.539 ± 0.038 έναντι 1.877 ± 0.039,

P

= 0.001? 40 pmol miRNA-214: 1.407 ± 0.051 έναντι 1.877 ± 0.039,

P

= 0,004) ( Σχήμα 2Α).

(Α) δραστηριότητα Σχετική λουσιφεράσης της psiCHECK-2-φαγούρα κατασκευάσματα συν-επιμολύνθηκαν με miR-20a, miR-7, miR-214 και αναστολέα σε HCT116 και SW480 κυττάρων. Σε

CIR-φαγούρα

κύτταρα υπερ-έκφραση, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στη δραστηριότητα λουσιφεράσης όταν psiCHECK-2-

ITCH

θέση δέσμευσης με miRNAs συνδιαμολύνθηκαν σε HCT116 και SW480 κυττάρων. Έξι επαναλήψεις για κάθε ομάδα και το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SEM. (Β) HCT116 και SW480 κυττάρων μετά επιμολυσμένα με

CIR-φαγούρα

και Ελέγχου κύτταρα αντίστοιχα επιμολύνθηκαν με miR-20a, miR-7 και αναστολέα για 24 ώρες και στη συνέχεια περαιτέρω εκτέθηκαν σε ακτινομυκίνη D για 1, 2 και 3 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η σταθερότητα του

CIR-φαγούρα

mRNA αναλύθηκε με qRT-PCR σε σχέση με το χρόνο 0 μετά το κλείδωμα νέα σύνθεση RNA με ακτινομυκίνη D? Τα δεδομένα είναι μέσες ± SEM, κανονικοποιημένη σε

GAPDH

.

Η

HCT116 και SW480 κύτταρα επιμολυσμένα με το πλασμίδιο κατασκευάστηκε υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ακτινομυκίνη D σε παρουσία 1 ή 40 pmol του miR-7 και miR-20a, και το συνολικό RNA συλλέχθηκε στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι στα κύτταρα ελέγχου, η

CIR-φαγούρα

επίπεδα παρέμεινε στο 20-30%? Ωστόσο, υπήρξε μικρή αλλαγή στο

CIR-φαγούρα

επίπεδα στα κύτταρα HCT116 μετά την επώαση με ακτινομυκίνη D. Επαναλάβαμε αυτά τα πειράματα σε SW480 κύτταρα με τα ίδια αποτελέσματα (Σχήμα 2Β).

Σύνδεσμος

CIR-φαγούρα

και

ITCH

στο CRC

Πρόσφατα,

CIR-φαγούρα

αναφέρθηκε για τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω του ρόλου της ως miRNA σφουγγάρι, προστατεύοντας έτσι τα γονίδια-στόχους των miRNAs ». Ως εκ τούτου, ελέγξαμε την αντιστοιχία μεταξύ της

CIR-φαγούρα

και

ITCH

σε επιπλέον 15 ζεύγη CRC επικουρική μη καρκινικούς ιστούς. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ασθενείς με υψηλότερα

CIR-φαγούρα

επίπεδα έκφρασης στους ιστούς CRC είχε μια σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση της γραμμικής

ITCH

(R

2 = 0.32,

P

& lt? 0,01? Εικ. 3Α)

(Α) Οι γραμμικές συσχετίσεις μεταξύ των

CIR-φαγούρα

επίπεδα έκφρασης και γραμμική

ITCH

ελέγχθηκαν. Η σχετική αξία έκφραση ομαλοποιήθηκε με

GAPDH

επίπεδο έκφρασης. (Β) δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης Ένα TCF έγινε. Η δραστικότητα λουσιφεράσης κανονικοποιήθηκε στη δραστηριότητα λουσιφεράσης Renilla. (Γ) Τα επίπεδα πρωτεΐνης Wnt3A και β-κατενίνη αξιολογήθηκε σε κύτταρα CRC (κύτταρα HCT116 και τα κύτταρα SW480) με κηλίδα Western. (Δ) Το επίπεδο του mRNA της

c-myc

και

cyclinD1

ανιχνεύθηκε από ποσοτική RT-PCR μετά από επιμολυσμένα με

CIR-φαγούρα

ή ελέγχου κυττάρων σε κύτταρα CRC. (Η άνω είναι

c-myc

και το κατώτερο είναι

cyclinD1

) Τα στοιχεία είναι μέσες ± SEM και αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Ε) HCT116 και SW480 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων μετά επιμολυνθεί, και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων εκτελέστηκε ημερησίως για 3 ημέρες χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό CCK-8. Έξι αντίγραφα για κάθε ομάδα και το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SEM. *

P

& lt?. 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

CIR-φαγούρα

εμπλέκεται στη ρύθμιση του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης in vivo

πρωτεΐνης ITCH ubiquitinates τη φωσφορυλιωμένη μορφή της Dvl2 και προωθεί την υποβάθμιση της, αναστέλλοντας έτσι την κανονική Wnt σηματοδότηση [19]. Για να επαληθεύσετε περαιτέρω εάν

CIR-φαγούρα

ρυθμίζει την /β-κατενίνης σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt στα κύτταρα CRC, χρησιμοποιήσαμε μια δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης β-κατενίνης /TCF-απόκρισης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση του ITCH ανέστειλε την δραστηριότητα TOP φλας με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 3Β). Η β-κατενίνης και τα επίπεδα Wnt3A είχαν analysised χρησιμοποιώντας κηλίδα western σε κύτταρα με

ITCH

υπερέκφραση, και όπως φαίνεται στο Σχ 3C, όταν υπήρχε προφανής μείωση στα επίπεδα β-κατενίνης ενώ δεν υπήρχε μεταβολή στην έκφραση Wnt3A. Στη συνέχεια εξετάσαμε την έκφραση του

c-myc

και

cyclinD1

, δύο γονίδια στόχους του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης, σε κύτταρα επιμολυσμένα με

CIR-φαγούρα

. έκφρασή τους επίσης κατέστειλε (Σχήμα 3D).

CIR-φαγούρα

ρυθμίζει την ανάπτυξη των κυττάρων

Πραγματοποιήσαμε CCK-8 προσδιορισμούς για να δοκιμαστούν τα αποτελέσματα των

περιστά ITCH

στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα CRC. Παρατηρήσαμε μια συνεπή μείωση στο κυτταρικό πολλαπλασιασμό των HCT116 (28% -39% μείωση) και τα κύτταρα SW480 (15% -33% μείωση) όταν

CIR-φαγούρα

υπερεκφράστηκε σε φυσιολογικά επίπεδα, μέσω της CCK-8 αναλύσεις σε σύγκριση με εκείνη του ελέγχου (Σχήμα 3Ε).

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε

CIR-φαγούρα

στο CRC και διαπίστωσε ότι ήταν υποβαθμίσουν τα δραματικά ρυθμίζεται σε ιστούς CRC χρησιμοποιώντας δοκιμασία ανάστροφης μεταγραφάσης αντίδραση αλύσου πολυμεράσης TaqMan-based, επισημαίνοντας τις δυνατότητες λειτουργίας του

CIR-φαγούρα

σε CRC. Μια σειρά πειραμάτων απεικονίζονται ο συσχετισμός μεταξύ

CIR-φαγούρα

και miRNAs, αποδεικνύοντας ότι

CIR-φαγούρα

παίζει σημαντικό ρόλο ως σφουγγάρι miRNA στη διαδικασία της ανάπτυξης CRC.

Χιλιάδες lincRNAs έχουν ταυτοποιηθεί σε ανθρώπους και ποντίκια, και πολλοί είναι στενά συνδεδεμένη με την ανάπτυξη των διαφόρων τύπων καρκίνου, όπως οισοφαγικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (ESCC) και του ενδομητρίου καρκινώματος [20, 21]. Κυκλική RNA είναι ένας τύπος lincRNA που παίζει ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου. Για τις γνώσεις μας,

ITCH

είναι ένα από τα Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης πρωτεΐνη που στοχεύει ειδικά p73 [22], Dvl2 [19], και Notch 1 [23], τα οποία συνδέονται συνήθως με το σχηματισμό του όγκου και τηςχημειοευαισθησίας.

Αν και οι λειτουργίες της miRNAs απέχουν πολύ από το να είναι πλήρως κατανοητή, προβλέπεται ότι περίπου το 30% των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες ελέγχονται από miRNAs [24], και μερικές μελέτες έχουν υποδείξει ότι miRNA μπορεί να συνδεθεί με το 3 «-UTR του

ITCH

να μειώσει την έκφραση της [25]. Memczak et al. (2013) και Hansen et al. (2011) πρότεινε ότι η εκφύλιση της παρεγκεφαλίδας που σχετίζονται με πρωτεΐνη 1 (CDR1) locus ελλιμενίζει 70 συντηρημένη παιχνίδια στο σπόρο miR-7. Αυτό το εντυπωσιακό χαρακτηριστικό πρότεινε ότι κυκλικό RNA έχει μια πιθανή λειτουργία ως σπόγγος miRNA [5, 8, 26]. Προηγούμενη έρευνα έχει δείξει ότι το

CIR-φαγούρα

δρα σαν ένα σφουγγάρι για miR-7, miR-17, και miR-214, ενώ στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι στις κυτταρικές σειρές CRC, miR-7 και miR-20a κάτω-ρυθμίζουν

ITCH

έκφραση μέσω σύνδεσης με 3′-UTR της. Επιπλέον, αυτά τα miRNAs είναι πάντα έτρεφε από

CIR-φαγούρα

. Στη μελέτη μας,

CIR-φαγούρα

δεν ενεργεί ως σφουγγάρι για miR-214. Για τις γνώσεις μας, έκτοπη έκφραση του miR-214 καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή in vitro, ενώ miR-214 νοκ ντάουν προάγει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή σε κυτταρικές σειρές CRC [27].

miRNAs έχουν εδώ και καιρό σχετίζεται με τον καρκίνο. Αυξημένα miR-7 έκφραση έχει περιγραφεί σε μια ποικιλία τύπων όγκου, συμπεριλαμβανομένων CRC, και έχει εμπλακεί σε ογκογένεση, η ταξινόμηση και την πρόοδο του καρκίνου [28]. miR-20a συμβάλλει στη αυξημένο πολλαπλασιασμό και διεισδυτικότητα των κυττάρων CRC [29]. Με βάση αυτές τις πληροφορίες, τα δεδομένα μας ελέγχει εργασίες των προκατόχων μας ». Από τα παραπάνω στοιχεία, φάνηκε ότι

CIR-φαγούρα

συμμετέχει στην ανάπτυξη του ΣΔΠ μέσω της ρύθμισης της δραστηριότητας των miRNAs.

Η ανώμαλη ρύθμιση του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt έχει αναδειχθεί ως ένα διαδεδομένο θέμα στην βιολογία του καρκίνου, και είναι κρίσιμη για την εμφάνιση και την εξέλιξη των ανθρώπινων CRC. Περίπου το 90% των σποραδικών καρκίνων του παχέος εντέρου παρουσιάζουν παρεκκλίνουσα σηματοδότηση Wnt [30].

CIR-φαγούρα

λειτουργεί ως σφουγγάρι miRNA και αυξάνει το επίπεδο του

ITCH

, η οποία εμπλέκεται στο μονοπάτι /β-κατενίνης Wnt. Σύμφωνα με την προηγούμενη έρευνα, ITCH μπορεί να προωθήσει την ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση των φωσφορυλιωμένων Dvl2 και, ως εκ τούτου, αναστέλλουν κανονική σηματοδότηση Wnt [19]. Μία δοκιμασία αναφοράς λουσιφεράσης β-κατενίνης /TCF αποκρίνεται χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί αν ένα μόνο γονίδιο ρυθμίζει τη /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt. Η μελέτη μας και άλλα προηγούμενα αποτελέσματα ανέφερε ότι η υπερέκφραση του

CIR-φαγούρα

κατέστειλε σημαντικά την σχετική δραστηριότητα TCF μεταγραφική.

Τα ογκογονίδια

c-myc

και

cyclinD1

είναι τελεστή πρωτεΐνες του σήματος karyomitosis, η οποία μπορεί να προκαλέσει και να ρυθμίσει την μεταγραφή των γονιδίων που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό. Είναι συχνά υπερεκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους όγκους, συμπεριλαμβανομένου του CRC [31]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι σε κύτταρα επιμολυσμένα με

CIR-φαγούρα

, η έκφραση του

c-myc

και

cyclinD1

ήταν αισθητά μειωμένη. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι

CIR-φαγούρα

έχει ανασταλτική επίδραση στην κανονική μονοπάτι Wnt.

CIR-φαγούρα

παίζει ρόλο αντι-όγκου από τον έλεγχο της δραστηριότητας miRNA, και έχει ένα ανασταλτικό ρόλο στην κανονική Wnt μονοπάτι, αναστέλλοντας

c-myc

και

cyclinD1

έκφρασης.

Εν ολίγοις, παρούσα μελέτη μας δείχνει ότι το σφουγγάρι miRNA

CIR-φαγούρα

αντιπροσωπεύει μια νέα γενιά της τεχνολογίας για την αναστολή miRNA.

CIR-φαγούρα

εμπλέκεται στο μονοπάτι /β-κατενίνης Wnt, και αναστέλλοντας αυτό το μονοπάτι, αυτό παίζει ρόλο στην CRC.

Ευχαριστίες

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε με επιχορήγηση από Wenzhou Ίδρυμα Επιστήμης και Τεχνολογίας του Προεδρείου Φυσικών Επιστημών (Y20140700).