Αφηρημένο

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η επίδραση κατά των όγκων και των πιθανών μηχανισμών της ε.π. υπερθερμία σε συνδυασμό με α-γαλακτοζυλκεραμίδιο (α-GalCer) για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Σε αυτή τη μελέτη, τα μοντέλα όγκων ανοσο-ικανά καθιερώθηκαν χρησιμοποιώντας ποντικού κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών και έλαβαν θεραπεία με ϊ.ρ. υπερθερμία συνδυάζοντας α-GalCer. Th1 /προφίλ έκφρασης κυτοκίνης Th2 στον ορό, κυτταρική κυτταροτοξικότητα ΝΚ και φαγοκυτταρική δραστηριότητα των δενδριτικών κυττάρων (DCs) αναλύθηκαν. Αναλύσαμε επίσης τον αριθμό των CD8

+ /IFN-γ

+ όγκου ειδικά κυτταροτοξικά Τ κύτταρα, καθώς και η ανάπτυξη του όγκου με βάση την εξάντληση των λεμφοκυττάρων υποπληθυσμού. Θεραπευτική επίδραση επί εκείνων των όγκων των ωοθηκών ελέγχθηκε με ένα μη επεμβατικό σύστημα φωταύγειας απεικόνισης. Ενδοπεριτοναϊκή υπερθερμία που προκαλείται σημαντική έκφραση προ-φλεγμονωδών κυτοκινών, και διατηρούμενες την ανταπόκριση των ΝΚ και DCs επάγεται από την αγωγή α-GalCer. Η θεραπεία συνδυασμού ενίσχυσε την κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων (CTL) ανοσοαπόκριση σε μοντέλα καρκίνου των ωοθηκών δύο ποντίκι. Αυτή η νέα μέθοδος θεραπείας με συνδυασμό υπερθερμίας και γλυκολιπιδίου παρέχει μια έντονη αντινεοπλασματική ανοσοαπόκριση και καλύτερη επιβίωση. Εν κατακλείδι, ενδο-περιτοναϊκή υπερθερμία ενίσχυσε την προ-φλεγμονώδη έκκριση κυτοκίνης και φαγοκυτταρική δραστηριότητα των DCs διεγείρεται από α-GalCer. Η επακόλουθη CTL ανοσολογική απάντηση που προκαλείται από α-GalCer ενισχύθηκε περαιτέρω με το συνδυασμό με ε.π. υπερθερμία. Τόσο έμφυτη και προσαρμοστική ασυλίες συμμετείχαν και οδήγησε σε μια ανώτερη θεραπευτική δράση στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Wu C-C, Chuang Υ-Τ, Hsu Υ-Τ, Huang J-T, Wu Τ-C, Hung C-F, et al. (2013) ενδοπεριτονεακή Υπερθερμία Συνδυάζοντας α-γαλακτοζυλκεραμίδιο στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 8 (7): e69336. doi: 10.1371 /journal.pone.0069336

Επιμέλεια: Moriya Tsuji, Aaron Diamond AIDS Research Center με το Πανεπιστήμιο Rockefeller, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Φεβ 2013? Δεκτές: 7 Ιουνίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Ιούλη του 2013

Copyright: © 2013 Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από την Ταϊβάν Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο (NSC 98 – 2314-B-195-008-my3). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αν και ωοθηκών λογαριασμούς του καρκίνου για μόνο το 3% όλων των κακοηθειών στις γυναίκες, είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια σε όλο τον κόσμο [1]. Λόγω της απουσίας συγκεκριμένων συμπτωμάτων ή σημείων και της έλλειψης αξιόπιστων τρόπων ελέγχου σε πρώιμο στάδιο της νόσου, του καρκίνου των ωοθηκών είναι ως επί το πλείστον διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο [2] – [4]. Επί του παρόντος, το πρότυπο εκ των προτέρων θεραπεία για επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών αποτελείται από τη μέγιστη χειρουργική επέμβαση κυτταρομειωτικών ακολουθούμενη από επικουρική χημειοθεραπεία με σχήμα συνδυασμού πλατίνας-ταξάνιο. Αν και τα ποσοστά απόκρισης είναι περίπου 70-80%, η πλειοψηφία αυτών των ασθενών θα υποτροπιάσουν τελικά. Παρά την αύξηση του αριθμού των διαθέσιμων για υποτροπιάζουσας νόσου χημειοθεραπευτικά φάρμακα, η πορεία του καρκίνου των ωοθηκών χαρακτηρίζεται συνήθως από επαναλαμβανόμενες περιόδους ύφεσης και υποτροπής, και στις περισσότερες περιπτώσεις η ασθένεια τελικά θα αναπτύξουν αντίσταση σε όλους τους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και να γίνει ανίατη [5]. Με βάση την βιολογική συμπεριφορά και εξάπλωση μοτίβο των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, αρκετές ε.π. Οι μέθοδοι θεραπείας έχουν υποστηρίξει για να επιτευχθεί καλύτερος έλεγχος της νόσου [6]. Μεταξύ αυτών, ε.π. υπερθερμία, ειδικά όταν συνδυάζεται με χημειοθεραπεία, έχει αποδειχθεί ότι βελτιώνει την θεραπευτική αποτελεσματικότητα είτε για βέλτιστα ή υπο-βέλτιστα debulked καρκίνο των ωοθηκών [7], [8]. Έχει αναφερθεί ότι η υψηλή θερμοκρασία θα μπορούσε να προκαλέσει άμεση θερμική κυτταροτοξικότητα και επίσης να φέρει «θερμική χημειο-ευαισθητοποίηση» [9]. Πιστεύεται γενικά ότι η ευαισθητοποίηση αποτελέσματα από την αυξημένη αιμάτωση των ιστών και η διείσδυση του ιστού των κυτταροτοξικών παραγόντων. Αν και οι βασικοί μηχανισμοί της υπερθερμίας έχουν γενικά καλά αποδεκτή, η εφαρμογή της θεραπευτικής υπερθερμία σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία για τους ασθενείς είναι πολύ πιο περίπλοκη [10]. Υπερθερμικής χημειοθεραπεία (42-43 ° C), έχει γνωστό ότι σχετίζονται με μεγαλύτερη κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, υπάρχουν και ορισμένα μειονεκτήματα που περιορίζουν τη χρήση του στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών, όπως πιθανές κακή επούλωση των αναστόμωσης του εντέρου, ο κίνδυνος μόλυνσης χημειοθεραπευτικών μεταβολιτών με τις χειρουργικές προσωπικό μέσω σωματικό υγρό ή εισπνοή εξάτμιση παραγόντων χημειοθεραπείας [11]. Επιπλέον, δεν μπορεί να εφαρμοστεί επανειλημμένα χωρίς εξερεύνηση της περιτοναϊκής κοιλότητας.

η ίδια έχει αποδειχθεί ότι ασκεί μια σειρά κυτταρικών και μοριακών επιπτώσεων, ιδιαίτερα στην πρόκληση των πολύπλοκων ανοσολογικές μεταβολές στον ξενιστή [12] υπερθερμία, [ ,,,0],13]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, υπερθερμία είναι σε θέση να ρυθμίζουν την έκφραση της πρωτεΐνης θερμικού σοκ στα κύτταρα του όγκου, και οι οποίες συνδέονται με την παρουσίαση αντιγόνου, cross παρουσίαση και αντικαρκινικής ανοσίας [14]. Όλα αυτά τα δεδομένα παρέχουν τη λογική κατά την ενίσχυση των κατά του όγκου αποτελέσματα των υπερθερμία με το συνδυασμό με παράγοντες του ανοσοποιητικού ρυθμιστικά.

γλυκολιπίδιο, όπως α-γαλακτοζυλκεραμίδιο (KRN7000, α-GalCer, ένα γλυκοσφιγγολιπίδιο) έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου και παρατείνει την επιβίωση σε λίγα μοντέλα όγκου ποντικού μέσω της ενεργοποίησης έμφυτης και προσαρμοστικής ανοσοαποκρίσεις [15], [16]. Αρκετές κλινικές μελέτες έχουν επίσης τεκμηριωθεί η ασφάλειά του και βιολογικές επιδράσεις σε ασθενείς με συμπαγείς όγκους, μέσω παρεντερικής χορήγησης [17], [18]. Αυτή η ίδια η ένωση δεν είναι ένας κυτταροτοξικός παράγοντας, αλλά μπορεί να παρουσιαστεί σε κύτταρα ΝΚΤ από CD1d [19], [20]. α-GalCer ενεργοποιημένα κύτταρα ΝΚΤ έχουν αναφερθεί να εκκρίνουν μεγάλες ποσότητες κυτοκινών, συμπεριλαμβανομένων των ΙΡΝ-γ και IL-4, και με αυτόν τον τρόπο την ενεργοποίηση άλλων τελεστών κύτταρα, όπως τα κύτταρα ΝΚ, Τ κύτταρα, Β κύτταρα, δενδριτικά κύτταρα και μακροφάγα [16]. Η χορήγηση του α-GalCer σε ζώα θα μπορούσαν επίσης να επάγουν την παραγωγή άλλων κυτοκινών, όπως IL-2, IL-6, IL-12, και GM-CSF, το οποίο θα μπορούσε επίσης να ενισχύσει το ανοσοποιητικό σύστημα [21].

Υποθέσαμε ότι υπερθερμία δεν είναι μόνο κυτταροτοξική αλλά επίσης σε θέση να παρουσιάσει την ανοσογονικότητα των καρκινικών κυττάρων, κατευθύνοντας την ανοσολογική απόκριση πάνω από το μικροπεριβάλλον τόσο οδούς Th1 /Th2. Προτείναμε ότι η προσθήκη α-GalCer μπορεί να προκαλέσει την ενεργοποίηση των κυττάρων ΝΚΤ, καθώς και την ωρίμανση των DCs. Μετά από θεραπεία με α-GalCer, ένα ισχυρό καταρράκτη κυτοκίνης ακολούθως προκαλείται, ενισχύοντας έτσι την cross-talk μεταξύ των έμφυτη και προσαρμοστική αντικαρκινικές ανοσοαπαντήσεις.

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε διάφορα ποντικού ωοθηκών καρκινικά κύτταρα ως μοντέλα για έλεγχο υποθέσεων μας και να διερευνηθεί η επίδραση κατά των όγκων και των υποκείμενων μηχανισμών της ip υπερθερμία σε συνδυασμό με α-GalCer στην αγωγή του καρκίνου των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Ποντίκι και Κυτταρική Γραμμή

C57BL /6 ποντίκια και BC3F1 (C57BL /6 × C3H F1) ποντικοί αγοράστηκαν από BioLASCO, Ταϊβάν. Τα ζώα φροντίζονται υπό ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων. Το ποντίκι ωοθηκών κυτταρική σειρά καρκίνου MOSEC-Luc (C57BL /6 προέλευσης και μηχανικής έκφραση της λουσιφεράσης πυγολαμπίδας), ID8-Luc (που προέρχεται από MOSEC-Luc με VEGF υπερ-έκφραση), και ΗΜ-1 (BC3F1 προέλευσης) καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 μέσο (Gibco) συμπληρωμένο με 10% FBS (Biological Industrial, Ισραήλ), 100 U /ml πενικιλίνη (Gibco) και 100 pg /ml στρεπτομυκίνη (Gibco) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα αέρα 5% CO

2/95% σε 37 ° C.

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα πειράματα ακολούθησαν τις κατευθυντήριες γραμμές όσον αφορά τις πειραματικές συνθήκες διαβίωσης των ζώων και επιτρέπεται από IUAUC του Memorial Hospital Mackay (MMH-AS-97030).

Intra-περιτοναϊκή Υπερθερμία και α-GalCer Θεραπεία

Για να εκτελέσετε ip υπερθερμία, διερευνητική λαπαροτομία πραγματοποιήθηκε μετά τα ποντίκια αναισθητοποιούνται με Zoletil (VIRBAC, Γαλλία) και Rompun (Bayer Vital GmbH, Leverkusen) για πρώτη φορά. Η περιτοναϊκή κοιλότητα του κάθε ποντικού συνεχώς γεμάτη με 45 ° C 1 χ PBS. Θερμαινόμενη PBS ήταν ξαναγεμίζει για να αντικαταστήσει ψύχεται PBS από τη συχνότητα του 20~30 δευτ /κύκλο για ένα σύνολο 10 λεπτών. Στην ομάδα συνδυασμένης θεραπείας, 2 μg α-GalCer (επιστήμη Enzo Life, USA) προστέθηκε στην περιτοναϊκή κοιλότητα αμέσως μετά την ολοκλήρωση της υπερθερμίας. Η περιτοναϊκή κοιλότητα επίσης ανοίχθηκε για 10 λεπτά σε ομάδα ελέγχου των ποντικών. Τα ποντίκια διατηρούνται ζεστά κάτω από τα φώτα του θερμαντήρα έως ότου ανακτηθεί από την αναισθησία.

Multiplex Serum ανίχνευσης κυτοκίνης

Το φλεβικό αίμα συλλέγεται από την ουρά κάθε ποντικού επωάστηκε σε 37 ° C για 30 λεπτά κατόπιν φυγοκεντρήθηκε στα 1500 × g για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο ορού μεταφέρεται σε άλλο καθαρό σωλήνα και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C πριν από την ανάλυση. Η συγκέντρωση της IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, ΙΝΡ-α, και TNF-α στον ορό κάθε ποντικού ανιχνεύθηκε με BD κυτταρομετρίας Bead κιτ Array (BD Bioscience), όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή.

πρωτογενή απομόνωση κυττάρων και ΝΚ /ΝΚΤ κυττάρων Ανίχνευση

Για την απομόνωση των λευκών αιμοσφαιρίων (WBC), το περιφερικό αίμα συλλέχθηκε από την φλέβα της ουράς ποντικών. Τα ερυθρά αιμοσφαίρια στο αίμα απομακρύνθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ACK (Invitrogen) και τα λευκά αιμοσφαίρια μετά επαναιωρήθηκαν σε RPMI 1640 πριν από την ανάλυση. Για την απομόνωση των κυττάρων εντός της περιτοναϊκής κοιλότητας, οι ποντικοί θυσιάστηκαν με CO

2 ευθανασία. Τα κύτταρα εντός της περιτοναϊκής κοιλότητας συλλέχθηκαν με περιτοναϊκή πλύση με 3% BSA σε ψυχρό 1 × PBS. Κύτταρα ανακτήθηκαν από πλύση πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-αντι-CD3 και αντίσωμα ΡΕ-αντι-ΝΚ1.1, καθώς η παρασκευή περιγράφεται (eBioscience). Οι πληθυσμοί των κυττάρων ΝΚ και ΝΚΤ ανιχνεύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Calibur, BD Bioscience). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με FACS ρητή λογισμικό.

διάγνωση του καρκίνου κυτταρικής απόπτωσης

Ένα εκατομμύριο από ID8-Luc κύτταρα ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς σε κάθε C57BL /6 ποντίκι στην πειραματική ομάδα. Τρεις ημέρες αργότερα, ε.π. υπερθερμία δόθηκε στα ποντίκια που φέρουν όγκο όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Δεν παρέμβαση πραγματοποιήθηκε στην ομάδα ελέγχου των ποντικών εκτός ανοίγματος /κλεισίματος της περιτοναϊκής κοιλότητας. Μία ημέρα αργότερα, οι ποντικοί θυσιάστηκαν με CO

2 ευθανασία. Τα κύτταρα μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα ήταν πλένονται και βάφονται με Annexin V-APC και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ, BD Bioscience), και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε ανάλυση με κυτταρομετρία ροής.

κυτταροτοξικότητα της περιτοναϊκής τελεστές Cells

Είκοσι χιλιάδες ID8-Luc κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο με στρογγυλό πυθμένα των 96 φρεατίων ως κύτταρα-στόχοι. Αυτές οι πλάκες σφραγίστηκαν με παραφίνη και να διατεθεί στην υγρή επιφάνεια του λουτρού C ύδατος 42 ° και επωάστηκε για 20 λεπτά. Τα πλυμένο κύτταρα (από την ομάδα ελέγχου ή α-GalCer αγωγή ομάδα ποντικών) ως τελεστές κύτταρα προστέθηκαν στη συνέχεια στο ID8-Luc κύτταρο που περιέχει καλά με την τελεστές /στόχο (Ε /Τ) αναλογία 5:01 και 10:01 , και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Μετά την προσθήκη λουσιφερίνη (δαγκάνα), το ποσό των επέζησε ID8-Luc κύτταρα παρουσιάστηκε ως η ένταση της χημειοφωταύγειας ανιχνεύεται από το σύστημα απεικόνισης IVIS. (Xenogen).

δενδριτικά κύτταρα φαγοκυττάρωση Δοκιμασία

in vitro

Η

Δύο μικρογραμμάρια α-GalCer ήταν ε.π. εγχέεται C57BL /6 ποντίκια και αφέθηκε για μια νύχτα. Τα ποντίκια με και χωρίς αγωγή α-GalCer θανατώθηκαν και οι σπλήνες μεταφέρονται σε RPMI 1640. Τα σπληνοκύτταρα απομονώθηκαν από τη θραύση των σπληνών σε σουρωτήρι κύτταρο 100 μm σε 6 cm τρυβλίου περιέχει 5 ml μέσου RPMI1640. Τα αιωρούμενα κύτταρα πλύθηκαν και τα RBCs απομακρύνθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ACK (Invitrogen). Τα DCs σε αυτές σπληνοκύτταρα καθαρίστηκαν με αντι-Οϋ11ο μαγνητικά σφαιρίδια (MACS, Germany). Για τη δοκιμασία φαγοκυττάρωσης, ID8-Luc κύτταρα χρωματίστηκαν με 25 μΜ του CFSE (Sigma) και στη συνέχεια τους δόθηκε θερμική επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Καθαρισμένα DCs από την ομάδα ελέγχου ή α-GalCer αγωγή ομάδα ποντικών στη συνέχεια συν-καλλιεργήθηκαν με 1 χ 10

5 είτε θερμαίνεται ή μη θερμαινόμενο CFSE χρώση ID8-Luc κύτταρα για 6 ώρες. ΑΧ ήταν η επισήμανση με χρώση με αντίσωμα APC-αντι-CD 11 c (eBioscience). Το ποσοστό των θετικών CFSE-DCs αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής με τον ηλεκτρονικό περιορισμό των CD11c θετικά κύτταρα.

Δοκιμασία φαγοκυττάρωση δενδριτικά κύτταρα

in vivo

Η

Ένα εκατομμύριο από CFSE χρώση (25 μΜ) ID8-Luc κύτταρα ip εγχέεται C57BL /6 ποντίκια. Στις επόμενες ημέρες, όλα τα ποντίκια χωρίστηκαν σε 4 ομάδες και δόθηκε ε.π. υπερθερμία και /ή 2 μg α-GalCer. Τα ποντίκια έλαβαν λαπαροτομία μόνο (χωρίς φαρμακευτική αγωγή) ιδρύθηκε ως ομάδα ελέγχου. Μετά από 24 ώρες, οι ενδο-περιτοναϊκά κύτταρα πλένονται και χρωματίστηκαν με ΡΕ-αντι-ποντικού CD11b και αντισώματα CD11c APC-αντι-ποντικού (eBioscience). Το ποσοστό των CFSE-θετικά δενδριτικά κύτταρα αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής με την περίφραξη του CD11b

+ /CD11c

+ θετικών κυττάρων.

όγκου Ειδικές CD8

+ Τ κυττάρων Immunoassay

Ένα εκατομμύριο του HM-1 κύτταρα ήταν ip ένεση σε ποντικούς B6C3F1 και 3 × 10

5 ID8-Luc κύτταρα ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς σε ποντικούς C57BL /6. Τρεις ημέρες αργότερα, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν και έλαβαν ε.π. με ή χωρίς α-GalCer. Μετά από μία ή τρεις εβδομάδες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν για την απομόνωση των σπληνοκυττάρων. Σπληνοκύτταρα (1 × 10

7) καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς 1 × 10

5 των συνγενετικών καρκινικά κύτταρα (εκείνα που είχαν εγχυθεί εντός της περιτοναϊκής κοιλότητας των ποντικών) με 1 μg του Golgi βύσμα (BD Pharmingen ) σε πλάκες 24 φρεατίων. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΑΡΟ-συζευγμένο μονοκλωνικό αρουραίου-αντι-ποντικού CD8a (eBioscience) για 20 λεπτά, και σταθεροποιήθηκαν με κιτ Cytofix /Cytoperm (BD Pharmingen), ακολουθούμενο από χρώση με ιντερφερόνη αντι-ποντικού συζευγμένο με FITC αρουραίου -γ (eBioscience) όπως περιγράφεται κατασκευή. Ο αριθμός των CD8 /Ιντερφερόνη-γ θετικών κυττάρων αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής.

Μη επεμβατική Ανάπτυξης Όγκου

Μέτρηση

Ένα εκατομμύριο από MOSEC-Luc κύτταρα ήταν ε.π. εγχέεται C57BL /6 ποντίκια. Μετά από μία εβδομάδα, ε.π. υπερθερμίας πραγματοποιήθηκε με ή χωρίς αγωγή α-GalCer. αύξηση του όγκου των MOSEC-Luc κύτταρα σε ποντίκια εντοπίστηκε από μη-επεμβατικό σύστημα απεικόνισης χημειοφωταύγειας (IVIS, Xenogen).

Η μείωση των λεμφοκυττάρων Υπο-πληθυσμοί

Ένα εκατομμύριο MOSEC-Luc κύτταρα ε.π. εγχέεται C57BL /6 ποντίκια. Πέντε ημέρες αργότερα, τα ποντίκια χωρίστηκαν σε 4 ομάδες και έλαβαν ε.π. ένεση είτε 100 μα αντι-ποντικού CD4 (GK1.5 κλώνος), CD8 αντι-ποντικού (κλώνος TIB210) ή ελέγχου IgG αρουραίου (Millipore) αντισωμάτων σε ένα διάστημα 2 ημερών. Όλα τα ποντίκια έλαβαν ε.π. υπερθερμία σε συνδυασμό με 2 μg α-GalCer μία εβδομάδα μετά τον εμβολιασμό του όγκου. Η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε με μη επεμβατικό σύστημα απεικόνισης IVIS όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

Στατιστικά

Όλα τα αποτελέσματα που αντιπροσωπεύεται από μέση τιμή ± SE (τυπικό σφάλμα) από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα. Οι συγκρίσεις μεταξύ των διαφόρων σημείων δεδομένων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της δοκιμής ANOVA ή η δοκιμή Τ ενός μαθητή. Η επιβίωση εκπροσωπήθηκε από την καμπύλη Kaplan-Meier και συγκρίθηκαν με χρήση ανάλυσης μεγάλης αξίας.

Αποτελέσματα

Intra-περιτοναϊκή Υπερθερμία Ενισχυμένη η έκκριση προφλεγμονωδών κυτοκινών Προκαλούμενη από α-GalCer

τα βασικά αποτελέσματα κατά των όγκων α-GalCer πιστεύεται ότι είναι μέσα από τη διαμόρφωση των κατάντη ανοσοποιητικό καταρράκτες, διεγείροντας την παραγωγή κυτοκινών Th1 /Th2 από τα κύτταρα ΝΚΤ. Εκτός από την IL-5, ε.π. υπερθερμία ενίσχυσε περαιτέρω την έκκριση αυτών των έξι κυτοκινών αρχικά προκαλείται από ε.π. α-GalCer θεραπεία. Εξετάσαμε πρώτα εάν η προσθήκη ε.π. υπερθερμία είναι σε θέση να επηρεάσει την έκφραση αυτών των κυτοκινών που διεγείρεται από εγκατάσταση α-GalCer. Το Σχήμα 1 δείχνει ότι ε.π. υπερθερμία μόνο δεν μετέβαλε τα επίπεδα των Th1 /Th2 κυτοκινών, ενώ ε.π. χορήγηση α-GalCer πυροδότησε την έκκριση διαφόρων κυτοκινών, η οποία έφθασε υψηλότερα επίπεδα τους σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Επίπεδα IL-2 (ρ = 0.0003, α-GalCer

έναντι του μάρτυρα

), IL-4 (p = 0.0012, α-GalCer

έναντι του μάρτυρα

), IL-6 (ρ & lt? 0.0001, α-GalCer

έναντι του μάρτυρα

), και ιστών νεκρωτικός παράγοντας άλφα (TNF-α) (p = 0.0007, α-GalCer

έναντι ελέγχου

) κορυφώθηκε σε 6 ώρες, ενώ IL- 5 και IL-13 κορυφώθηκε σε 12 ώρες (ρ = 0,0013, α-GalCer

έναντι ελέγχου

για IL-5? ρ & lt? 0,0001, α-GalCer

έναντι ελέγχου

για IL-13) . Χρειάστηκαν έως και 24 ώρες για την IFN-γto επίτευξη κορυφή της επίπεδο (p & lt? 0.0001, α-GalCer

σε σχέση με τον έλεγχο

). Εκτός IL-5, ε.π. υπερθερμία ενίσχυσε περαιτέρω την έκκριση αυτών των πέντε κυτοκινών αρχικά προκαλείται από ε.π. α-GalCer αγωγή (ρ = 0,0056, για την IL-2? p = 0.0041, για την IL-4? ρ & lt? 0,0001 για την IL-6? p = 0,0058, για ΙΡΝ-γ και ρ = 0,018 για τον TNF-α). Αυτός ο τρόπος θεραπείας ενισχυμένης επίσης την έκκριση της IL-13 (ρ & lt? 0,0001, υπερθερμία συν α-GalCer έναντι α-GalCer μόνο) που κορυφώθηκε νωρίτερα στις 6 ώρες μετά την αγωγή. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η α-GalCer θα μπορούσε να προκαλέσει ισχυρότερη αντικαρκινική ανοσολογική απόκριση, κυρίως μέσω της ενίσχυσης των Th1 /Th2 κυτοκινών έκφρασης συνδυάζοντας με ε.π. υπερθερμία.

C57BL /6 ποντίκια χωρίστηκαν σε 4 ομάδες με 5 ποντίκια για κάθε ομάδα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ε.π. υπερθερμία μόνο στους 43 ° C για 10 λεπτά, ε.π. προστίθενται 2 μg α-GalCer, και συνδυάζοντας τα δύο. Οι ποντικοί της ομάδας ελέγχου εκτελέστηκαν μόνο διερευνητική λαπαροτομία για 10 λεπτά. ορός ποντικιού συλλέχθηκε σε 6, 12, και 24 ώρες μετά τη θεραπεία. IL-2, IL-4, IL-5, Ιντερφερόνη-γ, TNF-α, IL-6 και IL-13 συγκεντρώσεις ορού ανιχνεύθηκαν με multiplex κιτ CBA. Ορισμένα επίπεδα κυτοκίνης αυξήθηκαν κατά α-GalCer και κορυφώθηκε στις 6 ώρες μετά την αγωγή (IL-2, ρ = 0.0003, α-GalCer μόνος

έναντι του μάρτυρα

), (IL-4, ρ = 0.0012, α -GalCer μόνος

έναντι του μάρτυρα

), (IL-6, ρ & lt? 0,0001, α-GalCer

έναντι του μάρτυρα

), (TNF-α, ρ = 0.0007, α-GalCer

σε σχέση με τον έλεγχο

)? Μερικά κορυφώθηκε σε 12 ώρες μετά τη θεραπεία (IL-5, ρ = 0.0013, α-GalCer

έναντι ελέγχου

) (IL-13, ρ & lt? 0,0001, α-GalCer

έναντι του μάρτυρα

)? ένα κορυφώθηκε σε 24 ώρες μετά τη θεραπεία (INF-γ, ρ & lt? 0.0001, α-GalCer

σε σχέση με τον έλεγχο

). Εκτός από την IL-5, τα επίπεδα κυτοκίνης Th1 /Th2 ήταν υψηλότερες στην ομάδα συνδυασμένης θεραπείας από ό, τι α-GalCer μόνη ομάδα (IL-2, ρ = 0,0056? IL-4, ρ = 0,0041? ΤΝΡ-α, ρ = 0.018? INF -γ, ρ = 0.0058). Το επίπεδο κορυφής της IL-13 επιτεύχθηκε νωρίτερα στην ομάδα συνδυασμένης θεραπείας και το επίπεδο της ήταν πολύ υψηλότερη από εκείνη του α-GalCer μόνο (ρ & lt? 0,0001). Τα αποτελέσματα αυτά συνεπάγεται ότι η θεραπεία με α-GalCer θα μπορούσε να προκαλέσει ανοσολογική ανταπόκριση προς την οδό των Th1 /Th2 και υπερθερμία, θα μπορούσε να ενισχύσει περαιτέρω το φαινόμενο αυτό. (# P & lt? 0,05? * Ρ & lt? 0,01? ** P & lt? 0.001? *** P & lt? 0.0001).

Η

α-GalCer θεραπεία παρουσίασαν Synergistic κυτταροτοξική δράση ως προς Θερμαινόμενη καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα

έχει δειχθεί ότι οι κύριες επιδράσεις κατά του όγκου που προκαλείται από α-GalCer είναι μέσω της απελευθέρωσης ορισμένων κυτοκινών, οι οποίες αυξάνουν τις δραστηριότητες των κυττάρων ΝΚ ή Τ. Για να διερευνηθεί αν η αγωγή α-GalCer έχει αντίκτυπο στη δραστηριότητα των ΝΚ κυττάρων, που παρακολουθείται ο πληθυσμός των ΝΚ κυττάρων σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά από ε.π. α-GalCer θεραπεία. Στο περιφερικό αίμα, ο πληθυσμός των κυττάρων ΝΚ δεν μεταβλήθηκε σημαντικά εντός πρώτες 24 ώρες. Ωστόσο, το ποσοστό των κυττάρων ΝΚ αυξηθεί δραματικά από 72 ώρες μετά την αγωγή (Σχήμα 2Α? Ρ & lt? 0.001, 72 ώρες

έναντι

άλλα χρονικά σημεία). Μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα, ο πληθυσμός των κυττάρων ΝΚ αυξήθηκε σε 3 ώρες μετά τη χορήγηση α-GalCer, και η προσθήκη του ε.π. υπερθερμία δεν επηρέασε τις αυξήσεις (Σχήμα 2Β).

(Α) 2 μg α-GalCer ήταν ip ένεση σε 5 C57BL /6 ποντίκια και το αίμα φλέβα της ουράς συλλέγεται σε 0.5, 1, 3, 6 , 24, και 72 ώρες μετά τη θεραπεία. Η διακύμανση αναλογία των κυττάρων ΝΚ στο περιφερικό αίμα αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής με φθορίζουσα CD3 και χρώση αντισώματος ΝΚ1.1. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι α-GalCer προσλαμβάνονται σημαντικά τον πληθυσμό των κυττάρων ΝΚ στο περιφερικό αίμα 72 ώρες μετά τη θεραπεία. (Ρ & lt? 0.001, 72 ώρες

έναντι

άλλα χρονικά σημεία) (Β) C57BL /6 ποντίκια χωρίστηκαν σε 4 ομάδες και κατεργασία με ενδοπεριτοναϊκή υπερθερμία στους 43 ° C, 2 μg α-GalCer, ή συνδυασμό. Οι ποντικοί ομάδας ελέγχου ανοίχθηκαν μόνο κοιλιά τους για 10 λεπτά. Ενδο-περιτοναϊκά κύτταρα συλλέχθηκαν με περιτοναϊκή πλύση 3 ώρες μετά τη θεραπεία. Παραλλαγή στις αναλογίες του ενδο-περιτοναϊκά κύτταρα ΝΚ αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής με φθορίζουσα CD3 και χρώση αντισώματος ΝΚ1.1. Το αποτέλεσμα σιωπηρή ε.π. χορήγηση α-GalCer αυξημένη τοπική αναλογία των κυττάρων ΝΚ μέσα σε λίγες ώρες. Συνδυασμός της υπερθερμίας δεν θέτει σε κίνδυνο αυτό το αποτέλεσμα. (P = 0.0007, α-GalCer

σε σχέση με τον έλεγχο

? P = 0,0009, α-GalCer

έναντι

υπερθερμία? Καμία σημαντική διαφορετική μεταξύ των α-GalCer μόνο και συνδυασμένη θεραπεία) (C) ID8 όγκου οποία φέρουν το C57BL /6 ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με ενδο-περιτοναϊκή υπερθερμία στους 43 ° C για 10 λεπτά. Μία ημέρα μετά την αγωγή, ενδο-περιτοναϊκή κύτταρα πλένονται και βάφονται με Annexin V και ΡΙ. Τα καρκινικά κύτταρα περιφραγμένη και το αποπτωτικό δείκτη αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων καρκίνου αυξήθηκε μετά ενδο-περιτοναϊκή υπερθερμία. (Ρ = 0,0084, υπερθερμία

έναντι ελέγχου

) (D) 2 × 10

4 ID8-Luc κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων στρογγυλού πλάκες κουμπί και θερμαίνεται σε υδατόλουτρο 42 ° C για 20 λεπτά . Διαφορετικές αναλογίες ενδοπεριτοναϊκή πλυμένο κύτταρα από ποντικούς ί.ρ ένεση με ή χωρίς α-GalCer συνέχεια προστέθηκαν στο πηγάδι ως τελεστές κύτταρα και συν-καλλιεργήθηκαν για μία νύχτα με θερμαινόμενα ή μη θερμαινόμενο ID8-Luc κύτταρα ως κύτταρα-στόχους. Μη θερμαινόμενο ID8-Luc κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με πλυμένο κύτταρα χωρίς κατεργασία α-GalCer χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Η κυτταροτοξικότητα που αντιπροσωπεύεται από την ένταση της chemoluminence ήταν το ανιχνεύθηκε με σύστημα απεικόνισης IVIS. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι συν-καλλιέργεια του θερμαινόμενου καρκινικών κυττάρων με ενδο-περιτοναϊκή πλύση κύτταρα από α-GalCer αγωγή ποντικούς επαγόμενη υψηλότερη κυτταροτοξικότητα του καρκινικού κυττάρου in vitro. (Σε αναλογία Ε /Τ = 5:01, σ & lt? 0,0001, θερμότητας συν α-GalCer

σε σχέση με τον έλεγχο

? P = 0,0162, θερμότητας συν α-GalCer

έναντι

θερμότητας? P = 0,0004 , θερμότητα συν α-GalCer

έναντι

α-GalCer). (# P & lt? 0,05? ** P & lt? 0.001? *** P & lt? 0.0001).

Η

Η υπερθερμία έχει αναφερθεί ότι προκαλεί τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων. Σε ID8 ποντίκια που φέρουν όγκο, περισσότερο αποπτωτικά κύτταρα ID8 (ip) βρέθηκε σε ποντίκια με αγωγή με υπερθερμία από εκείνα στα ποντίκια ελέγχου (Εικόνα 2C? P = 0,0084, υπερθερμία

έναντι ελέγχου

)

ο

ex-vivo

συν-καλλιέργεια, διαπιστώθηκε επίσης ότι τα κύτταρα θερμαίνονται ID8 ήταν περισσότερο επιρρεπή σε περιτοναϊκή πλυμένο κύτταρα που λαμβάνονται από ποντικούς α-GalCer αγωγή (Εικόνα 2D? p = 0,0004, θερμαινόμενη

έναντι

μη θερμαινόμενο ID8 κύτταρα σε αναλογία 5:01 Ε /Τ). Αυτά τα αποτελέσματα να εννοηθεί ότι ε.π. χορήγηση του α-GalCer μπορούσε προσλαμβάνουν περισσότερα κύτταρα ΝΚ, οδηγώντας σε μεγαλύτερη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων, και υπερθερμία επάγει ένα επιπλέον κυτταροτοξική επίδραση σε καρκινικά κύτταρα.

Θεραπεία Συνδυάζοντας ε.π. Υπερθερμία με α-GalCer δημιουργήσει μια συνεργιστική δράση στην ΑΧ »φαγοκυτικός Δραστηριότητες

in vitro και in vivo

Η

Μία από τις δραστηριότητες αντι-καρκινικών κυττάρων ΝΚΤ περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της ΑΧ. Η κύρια λειτουργία του DCs στην ανοσία κατά του όγκου είναι να καταπιεί τα καρκινικά κύτταρα και αντιγόνα που υπάρχουν όγκου προς τις σχετικές τελεστές κύτταρα, όπως κυτταροτοξικά Τ κύτταρα. Ερευνήσαμε περαιτέρω τα προκύπτοντα αποτελέσματα της θεραπείας α-GalCer με υπερθερμία για φαγοκυτταρική δραστηριότητες της ΑΧ. Με βάση την συν-καλλιέργεια των καρκινικών κυττάρων με DCs που απομονώνονται από σπλήνα, έχει βρεθεί ότι θερμαίνεται καρκινικά κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα σε φαγοκυττάρωση DCs »(Σχήμα 3Α? Ρ = 0.005, υπερθερμία

έναντι ελέγχου

). Επιπλέον, δενδριτικά κύτταρα που απομονώνονται από α-GalCer αγωγή ποντίκια εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερη δραστηριότητα της φαγοκυττάρωσης (p = 0,0037, α-GalCer

σε σχέση με τον έλεγχο

). Κάνοντας μαζί, συν-καλλιέργεια των θερμαινόμενων καρκινικών κυττάρων με DCs που λαμβάνονται από α-GalCer αγωγή ποντικούς έδειξαν πολύ περισσότερο φαγοκυττάρωση (p = 0,0002, συνδυασμένη θεραπεία

έναντι του μάρτυρα

? Ρ = 0,0008, συνδυασμένη θεραπεία

έναντι

υπερθερμία? p = 0,005, συνδυασμένη θεραπεία

έναντι

α-GalCer). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία α-GalCer συν υπερθερμία που οδηγεί σε μια συνεργιστική επίδραση επί της φαγοκυττάρωσης DCs «

in vitro.

Δεδομένου ότι η συνδυασμένη θεραπεία χορηγήθηκε για στόχευση ενδο-περιτοναϊκή καρκινικά κύτταρα, αναλύσαμε τα φαγοκυτταρικά δραστηριότητες του ενδο -peritoneal ΑΧ λαμβάνονται μέσω περιτοναϊκή πλύση. Μετρώντας τον αριθμό των CFSE χρώση CD11b

+ /Οϋ11ο

+ DCs, σημειώνεται ότι α-GalCer ενίσχυσε τις φαγοκυτταρικής δραστηριότητες της ε.π. ΑΧ (p = 0.0289, α-GalCer

έναντι

Ελέγχου) και υπερθερμία συν α-GalCer ενισχυθεί περαιτέρω αυτό το αποτέλεσμα (p = .0.038, σε συνδυασμό

έναντι

α-GalCer μόνο). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν σαφώς ότι η θεραπεία α-GalCer συν υπερθερμία οδηγεί επίσης σε συνεργιστικό αποτέλεσμα επί της φαγοκυττάρωσης DCs »μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα.

(Α) C57BL /6 ποντίκια ήταν πρώτα ε.π. ένεση με 2 μα α-GalCer. Μετά από 18 ώρες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι DCs καθαρίστηκαν από σπλήνες από αντι-Οϋ11ο μαγνητικά σφαιρίδια. Για την ανίχνευση δενδριτικών κυττάρων φαγοκυττάρωση, τα κύτταρα ID8 πρώτα χρωματίστηκαν με CFSE και θερμαίνεται σε λουτρό ύδατος C 42 ° C για 20 λεπτά. Τα DCs από α-GalCer διεγερμένα (ή μη-διεγερμένα) ποντικούς συνκαλλιεργήθηκαν με θερμαινόμενα ή μη θερμανθέντα κύτταρα ID8 για 6 ώρες σε αναλογία 5:01. Το ποσοστό των DCs με φαγοκυτταρική δραστηριότητα παρουσιάστηκε ως CFSE θετικός σε περιφραγμένη CD11c εκφράζουν κύτταρα αναλύονται με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο

in vitro

θερμική επεξεργασία σε καρκινικά κύτταρα και

in vivo

διέγερση του DC με α-GalCer θα μπορούσαν να ενισχύσουν την φαγοκυτταρική δραστικότητα των DCs (p = 0.005, θερμότητα

σε σχέση με τον έλεγχο

? p = 0,0037, α-GalCer

σε σχέση με τον έλεγχο

). Η συνεργική δράση εμφανίστηκε στη συνδυασμένη θεραπεία (ρ = 0,0002, συνδυασμένη θεραπεία

έναντι του μάρτυρα

? Ρ = 0,0008 συνδυασμένη θεραπεία

έναντι

θερμότητας? Ρ = 0.005, η συνδυασμένη θεραπεία

έναντι

α-GalCer). (Β) C57BL /6 ποντίκια ήταν i.p. ένεση με 1 × 10

6 CFSE-χρωματισμένα κύτταρα ID8. Την επόμενη ημέρα, οι ποντικοί χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες με τη θεραπεία με ε.π. υπερθερμία και /ή α-GalCer όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Μία ημέρα αργότερα, ενδο-περιτοναϊκά κύτταρα συλλέχθηκαν μέσω ί.ρ. + Κύτταρα πλύσης και η αναλογία των CFSE θετικών CD11b

+ /CD11c

υποδεικνύοντας δραστηριότητες φαγοκυτταρικής των DC αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Έχει αποδειχθεί ότι η θεραπεία α-GalCer θα μπορούσαν να ενισχύσουν την φαγοκυττάρωση του DC

in vivo

(p = 0.0289, α-GalCer

έναντι ελέγχου

). Το αποτέλεσμα αυτό ενισχύεται περαιτέρω με επιπλέον υπερθερμία (p = 0,038, συνδυασμένη θεραπεία

έναντι

α-GalCer). (# Ρ & lt? 0,05? * Ρ & lt? 0,01? ** Ρ & lt? 0.001).

Η

Συνδυασμός ενδοπεριτοναϊκή Υπερθερμία και α-GalCer απόσπασε μια Tumor-ειδικών κυτταροτοξικών CD8

+ Τ Cell ανοσολογική απάντηση

από θεραπείας α-GalCer μπορεί να ενισχύσει τις φαγοκυτταρικής δραστηριότητες της ΑΧ και υπερθερμία μπορεί να ενισχύσει περαιτέρω το φαινόμενο αυτό, η επόμενη ερώτηση θα ήταν αν ο συνδυασμός των ip υπερθερμία και θεραπεία α-GalCer μπορούσε να επάγει όγκο-ειδική κυτταροτοξική Τ κυτταρική απόκριση. Για να εκτιμηθεί η παρουσία της κυτταρικής ανοσολογικής απόκρισης έναντι καρκινικών κυττάρων, δύο διαφορετικές ποντικού ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, ΗΜ-1 και ID8-Ιυο, χρησιμοποιήθηκαν ως μοντέλα όγκων ανοσο-ικανά. Επτά ημέρες μετά τη θεραπεία, η θεραπεία της HM-1 που φέρουν ποντικών με α-GalCer μόνη αυξάνει απλώς ένα μικρό αριθμό ογκο-ειδικών CD8

+ Τ κυττάρων εντός των σπληνοκυττάρων (p = 0.0033, α-GalCer μόνος

έναντι

ελέγχου). Ωστόσο, βρήκαμε μια σημαντική αύξηση του αριθμού των ογκο-ειδικών CD8

+ Τ κυττάρων σε ΗΜ-1 που φέρουν τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ϊ.ρ. υπερθερμία συν α-GalCer (p & lt? 0,0001, συνδυασμένη θεραπεία

σε σχέση με τον έλεγχο

? p & lt? 0,0001, συνδυασμένη θεραπεία

έναντι

υπερθερμία? p = 0,0026, συνδυασμένη θεραπεία

έναντι

α -GalCer μόνο, Σχήμα 4Α). Σε ID8-Ιυο μοντέλο, από όγκο ειδικά CD8

+ Τ κυττάρων άνοση απόκριση θα μπορούσε να ανιχνευθεί στην ομάδα που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με α-GalCer μόνο (ρ & lt? 0,0001, α-GalCer μόνος

έναντι ελέγχου

). Ωστόσο, η επίδραση αυτή βρέθηκε να είναι περισσότερο σημαντικά στην ομάδα που έλαβε με συνδυαστική θεραπεία (ρ & lt? 0,0001, συνδυασμένη θεραπεία

έναντι

άλλες ομάδες). Η ενίσχυση των συγκεκριμένων καρκινικών απόκριση CTL είχε μειωθεί κατά 21 ημέρες μετά τη θεραπεία (τα δεδομένα δεν δείχνουν). Αυτό μπορεί να οφείλεται σε υπερβολική αύξηση των καρκινικών κυττάρων τα οποία συγκρατούνται το κατά του όγκου ανοσοαπόκριση που επάγεται από μόνο το ένα χρόνο θεραπείας. Θεωρητικά θα ήταν πολύ αποτελεσματική, εάν υπερθερμία μπορεί να πραγματοποιηθεί κατ ‘επανάληψη, ή η ανάπτυξη του όγκου μπορεί τελικά να ξεπεράσει την κατά του όγκου ανοσοαπόκριση σε αυτήν την ταχεία αναπτυσσόμενη μοντέλο όγκου. Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι ε.π. υπερθερμία μπορεί να ενισχύσει περαιτέρω την κυτταροτοξική όγκου-ειδικά CD8

+ Τ κυττάρου ανοσοαπόκριση που επάγεται με αγωγή α-GalCer.

(Α) 1 × 10

6 κυττάρων HM-1 ip ένεση σε B6C3F1 ποντίκια και (Β) 3 × 10

5 ID8-Luc κύτταρα ip εγχέεται C57BL /6 ποντίκια. Τα ποντίκια χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες (μάρτυρας χωρίς θεραπεία, υπερθερμία μόνο, α-GalCer μόνο και συνδυασμένη θεραπεία με υπερθερμία συν α-GalCer) με πέντε ποντικούς ανά ομάδα και επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά από 7 ημέρες, τα σπληνοκύτταρα απομονώθηκαν και διεγέρθηκαν επί μία νύκτα με κύτταρα ID8 ή κύτταρα HM-1. Τα σπληνοκύτταρα από κάθε ομάδα χωρίς επαναδιεγείρονται με κύτταρα ID8 ή κύτταρα HM-1 επίσης καλλιεργήθηκαν για μία νύχτα ως έλεγχος. Το ποσοστό του καρκίνου ειδικών CTL που απεικονίζεται ως CD8

+ /IFN-γ

+ ανιχνεύθηκαν δια κυτταρομετρίας ροής με περίφραξη του 2 × 10

5 λεμφοκύτταρα. Έχει αποδειχθεί ότι, 7 ημέρες μετά την αγωγή, ε.π. αγωγή α-GalCer ελαφρώς αύξησε τον αριθμό των όγκων ειδικών CTL (p = 0,0033, έλεγχος

έναντι

α-GalCer για ΗΜ-1? ρ & lt? 0,0001, α-GalCer

έναντι ελέγχου

για ID8 ). Υπερθερμία συν α-GalCer παρουσίασαν ισχυρότερη επίδραση στην ενεργοποίηση ειδικών CTL (p = 0,0026, συνδυασμένη θεραπεία

έναντι

α-GalCer για HM-1? P & lt? 0,0001, συνδυασμένη θεραπεία

έναντι

α-GalCer για ID8). (* P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001).

Η

Intra-περιτοναϊκή Υπερθερμία Ενισχυμένη Τα θεραπευτικά αποτελέσματα του α-GalCer

in vivo

Η

είναι προφανές ότι ip υπερθερμία ενισχυθεί τόσο έμφυτη και προσαρμοστική αντικαρκινικές ανοσοαποκρίσεις επάγονται με αγωγή α-GalCer. Εμείς επικυρωθεί αν αυτή η συνδυαστική θεραπεία μπορεί να οδηγήσει σε καλύτερη θεραπευτική δράση

in vivo

. Σε MOSEC-luc που φέρουν όγκο C57BL /6 ποντίκια, ε.π. υπερθερμία συν α-GalCer επέδειξαν ισχυρότερη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου (Σχήμα 5Α? ρ & lt? 0,05, συνδυασμένη θεραπεία

έναντι

α-GalCer μόνο). Και αυτή η θεραπεία παρέτεινε επίσης το χρόνο επιβίωσης των ποντικών που φέρουν όγκο (Σχήμα 5Β? P = 0,0018, συνδυασμένη θεραπεία

έναντι ελέγχου

).