Αφηρημένο

H ανταπόκριση του όγκου στη θεραπεία αξιολογείται κυρίως στην κλινική από μειώσεις παρακολούθηση του μεγέθους του όγκου. Ωστόσο, αυτή η προσέγγιση δεν έχει την ευαισθησία δεδομένου ότι σε πολλές περιπτώσεις αρκετές εβδομάδες μπορεί να παρέλθει πριν υπάρχει ένδειξη συρρίκνωσης του όγκου. Υπάρχει επομένως μία ανάγκη για την ανάπτυξη μη επεμβατικές τεχνικές απεικόνισης για την ανταπόκριση στη θεραπεία παρακολούθηση του όγκου στην κλινική. Εδώ, αξιολογήσαμε την προ-κλινική χρησιμότητα της τομογραφίας εκπομπής

18F-ICMT-11 ποζιτρονίων – μια μέθοδο για την ανίχνευση της κασπάσης 3/7 ενεργοποίησης – σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC).

18F-ICMT-11 πρόσληψη συγκρίθηκε με μοριακό βιοχημικές μετρήσεις του κυτταρικού θανάτου σε PC9 και Α549 κύτταρα NSCLC μετά από θεραπεία με καρβοπλατίνη

in vitro

και

in vivo

. Η καρβοπλατίνη επαγόμενη απόπτωση στην ERCC1 χαμηλή /μεταλλαγμένου

EGFR

κύτταρα PC9 χαρακτηρίστηκε από το χρόνο και τη δόση που σχετίζονται με αυξημένη κασπάσης 3-/7 ενεργοποίησης, πολυ-ΑϋΡ-ριβόζη χρώση διάσπασης πολυμεράσης και αννεξίνης V.

18F-ICMT-11 πρόσληψη, κατά συνέπεια, αυξήθηκε έως και 14 φορές σε 200 μΜ καρβοπλατίνη σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν φορέα (

P

120 mg /kg? 0.012 mL /g σωματικού βάρους). 24 ώρες μετά την ένεση, καρβοπλατίνη επεξεργασία και έλεγχο του οχήματος ποντίκια απαθανατίστηκε από το

18F-ICMT-11 PET. Μια δεύτερη ομάδα ποντικών έλαβε δύο δόσεις είτε οχήματος ή καρβοπλατίνη, με τη δεύτερη ένεση χορηγήθηκε 24 ώρες μετά την αρχική δόση. Αυτά τα ποντίκια στη συνέχεια φωτογραφήθηκε από

18F-ICMT-11 PET 48 ώρες μετά την αρχική δόση.

PET που βασίζεται Voxel Ένταση Ταξινόμηση ιστογράμματα

Οι εντάσεις όλων των voxels εντός των ROIs όγκου υπολογίστηκαν και ταξινομούνται σύμφωνα με τη συχνότητα έντασή τους να δώσει το PET που βασίζεται σε ένταση voxel διαλογής (PVIS) ιστογράμματα [11]. Για κάθε ROI, όλα τα voxels, 30-60 λεπτά μετά την προσθήκη ραδιο-ιχνηθέτη και συνδέονται έντασή τους εξήχθησαν (-300 voxels ανά ROI). Οι διανομές εντάσεις voxel περαιτέρω επεξεργασία μέσω μιας στατιστικής ανάλυσης (λογισμικό v5.0 Prism, GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Εντός του στενού εύρους της απόπτωσης δει, εμείς αυθαίρετη επιλεγεί το 95

ο εκατοστημόριο cut-off σε βιολογικά περιγράψει τα 5% υψηλότερη ένταση voxels-πιθανό να περιέχουν αποπτωτικά κύτταρα – και όχι, για παράδειγμα, με βάση λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη ανάλυση.

δραστική κασπάση-3 και TUNEL Ανοσοϊστοχημεία Δοκιμασία

Μετά απεικονιστικές μελέτες ΡΕΤ, ιστούς όγκων αποκόπηκαν, μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν (5 μm φέτες) και υποβάλλονται σε επεξεργασία για την ενεργό κασπάσης-3 και ΟΝΑ αποικοδόμηση τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης dUTP nick τέλος επισήμανση (TUNEL) δοκιμασίες ανίχνευσης φθορισμού χρησιμοποιώντας την διασπασμένη κασπάση 3 (Asp 175) μονοκλωνικό αντίσωμα (Cell Signaling Technology) σε συνδυασμό με την Alexa Fluor 594 αντι-κουνελιού αιγός (Invitrogen) και το In Situ κιτ ανίχνευσης κυτταρικού θανάτου (Roche), αντίστοιχα. Το διάλυμα στερέωσης παρατείνει Gold αντιξεθωριάσματος (Invitrogen) που περιέχει 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) προστέθηκε σε τμήματα ιστού πριν από τη συναρμολόγηση του καλυπτρίδες. Η δοκιμασία TUNEL διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, με κασπάση-3 κηλίδωση πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με [11], [13]. Εναλλακτικές τομές βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση. 10 τυχαίες «μη νεκρωτική« πεδίων ανά τμήμα (στα 400 χ μεγέθυνση) συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού της Olympus BX51 για κάθε όγκο και τις εντάσεις χρώσης (% χρώση ανά συνολική FOV) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health) . Για τα τμήματα PC9, επιλέχθηκαν τυχαία FOV από τις περιοχές που στερούνται εκτεταμένη νέκρωση.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). Η σημασία της σύγκρισης μεταξύ των δύο συνόλων δεδομένων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας 2-tailed t test του Student. ANOVA χρησιμοποιήθηκε για πολλαπλές συγκρίσεις (Prism λογισμικό v5.0 για Windows, GraphPad Software). Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων θεωρήθηκαν σημαντικές εάν p ≤ 0,05.

Διαφορικές Μηχανισμοί καρβοπλατίνη που προκαλείται θάνατος σε PC9 και Α549 κύτταρα

επιλέχθηκαν

Αποτελέσματα

κύτταρα PC9 και Α549 ανθρώπινο NSCLC για τη μοναδική γενετική προ-τους καθοριστικούς παράγοντες της απόκρισης: Ο πρώην χαρακτηρίζεται από βλάβη του DNA χαμηλή έκφραση της πρωτεΐνης επισκευής ERCC1 και μια μετάλλαξη στο

EGFR

(15 bp del των εξόνιο 19), με τα δύο χαρακτηριστικά ανεξάρτητα ικανό να ευαισθητοποιήσει κυττάρων σε θεραπείες με βάση την πλατίνα [20], [21]. Σε αντίθεση, τα κύτταρα Α549 έχουν υψηλή έκφραση ERCC1 (χαμηλής και υψηλής έκφρασης για PC9 και Α549 αντίστοιχα? Απευθείας σύνδεση πόρος 1) και να έχουν βάρος

EGFR

. Κυτταρικός θάνατος προκλήθηκε

in vitro

στην PC9 και Α549 ανθρώπινα κύτταρα NSCLC μετά από καρβοπλατίνη θεραπείας (0-200 μΜ). αναστολή δοσοεξαρτώμενες ανάπτυξη αξιολογήθηκε στις 72 ώρες μετά τη θεραπεία με μία δοκιμασία σουλφοροδαμίνης Β (SRB) έδειξε το ήμισυ της μέγιστης αναστολής της ανάπτυξης (GC

50) της 71,6 ± 9,5 μΜ και 136 ± 31.6 μΜ για PC9 και Α549 αντίστοιχα (

n = 3

? Εικ. 1Α). Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western. Επίπεδα διασπασμένης κασπάσης-3 και τη διάσπαση του υποστρώματος κατάντη της, PARP, έδειξε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στα κύτταρα PC9, ενώ δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές με Α549 (Εικ. 1Β). Μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής επιβεβαίωσε αποπτωτικό μηχανισμό κυτταρικού θανάτου σε PC9s (Σχήμα 1C)., με νέκρωση ο κύριος μηχανισμός του θανάτου σε A549s (Σχήμα 1ϋ.)

Α:. καρβοπλατίνη επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης σε PC9 και Α549 κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα σουλφοροδαμίνης Β δοκιμασίας 72 ώρες μετά τη θεραπεία. Β: ανάλυση στυπώματος Western των επιπέδων μη διασπασμένης PARP, διασπασμένη PARP και διασπάται (ενεργά) κασπάσης 3 72 ώρες μετά τη θεραπεία καρβοπλατίνη (0-200 μΜ) σε PC9 και Α549 κύτταρα. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. C, D: Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της PC9 (C) και τα κύτταρα Α549 (D) που έλαβαν θεραπεία με καρβοπλατίνη (100 μΜ) ή όχημα. Αποπτωτικά κύτταρα ταυτοποιήθηκαν με αννεξίνη V-Alexafluor488 (λ Ex /Em = 495/519 nm) και νεκρωτικές κύτταρα με 7-AAD (λ Ex /Em = 546/647 nm). Q4 πληθυσμός αντιπροσωπεύει βιώσιμα κύτταρα, ενώ πληθυσμού Q3 αντιπροσωπεύει αποπτωτικών κυττάρων που έχουν χαμηλό φθορισμό 7-AAD και λεκέ με Q2 Annexin V. πληθυσμού αποτελεί δευτερεύουσα αποπτωτικών νεκρωτική κύτταρα /.

Η

18F-ICMT- 11 κυττάρων πρόσληψη συσχετίζεται με κασπάσης-3 ενεργοποίησης

in vitro

η

δοσοεξαρτώμενες αλλαγές.

η καρβοπλατίνη που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο που είχε εκτιμηθεί αρχικά με

18F-ICMT- 11

in vitro

(Εικ. 2Α). θεραπεία καρβοπλατίνη κυττάρων PC9 οδήγησε σε δοσοεξαρτώμενη ενεργοποίηση της κασπάσης-3/7 Δράση (δοκιμασία κασπάση-Glo? Εικ. 2Β), μέχρι και 87 ± 19 φορές στα 200 μΜ (

P = 0.001

,

n

= 3). Αυτά τα δεδομένα περαιτέρω στηρίγματα αποτελέσματα που προέκυψαν από την κηλίδα western και κυτταρομετρίας ροής (Εικ. 1Β και Γ αντίστοιχα). Αλλαγές στο κασπάσης-3/7 δραστηριότητα δεν ανιχνεύθηκαν σε Α549 σε παρόμοιες συγκεντρώσεις του φαρμάκου (Σχήμα 2Β).

Α:. Χημική δομή της

18F-ICMT-11. Β: Δόση εξαρτώμενη αλλαγές στη δραστηριότητα της κασπάσης 3/7 εξής καρβοπλατίνη θεραπεία. C: Δόση μεταβολές που εξαρτώνται από

πρόσληψη 18F-ICMT-11 σε κύτταρα μετά από καρβοπλατίνη θεραπεία. D: Συσχέτιση μεταξύ της δραστηριότητας της κασπάσης 3 και

18F-ICMT-11 πρόσληψη στα κύτταρα PC9

Η

Η προσθήκη 0,74 MBq (20 μCi)

18F-ICMT-11 στα κύτταρα 72 ώρες μετά. επεξεργασία καρβοπλατίνη (0-200 μΜ) οδήγησε σε ανιχνεύσιμη πρόσληψη και διατήρηση του ραδιο-ιχνηθέτη μετά από 1 ώρα παλμού με τη ραδιενεργό ιχνηθέτη. Μια αύξηση στην κυτταρική πρόσληψη, ανάλογη με καρβοπλατίνη δόση μετρήθηκε σε κύτταρα PC9? φθάνοντας στατιστική σημαντικότητα σε 100 μΜ, η αύξηση από 28,8% ± 6,7% της ραδιενέργειας /mg πρωτεΐνης για τους ελέγχους υπό αγωγή με όχημα σε 414,4% ± 20,1% της ραδιενέργειας /mg πρωτεΐνης στα 200 μΜ (

n

= 3? Ρ & lt? 0,01 ), ένα 14,4-πλάσια αύξηση (Εικ. 2C). Υπήρχε μια εξαιρετική συσχέτιση μεταξύ της δραστικότητας της κυτταρικής κασπάσης-3.7 και

18F-ICMT-11 πρόσληψη σε αυτή τη γραμμή (Σχήμα 2D?. Ε

2 = 0,954). Καμία σημαντική αλλαγή στην

18F-ICMT-11 πρόσληψη ανιχνεύτηκε με Α549 κύτταρα μετά την προσθήκη του καρβοπλατίνη (Σχ. 2C).

Ώρα διάρκεια της αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.

Η χρονική πορεία αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου αξιολογήθηκε περαιτέρω σε 50 μΜ καρβοπλατίνη, μία δόση κοντά στο GC

50 κυττάρων PC9 (Εικ. 1Α). Η έναρξη της απόπτωσης σε PC9s ήταν ανιχνεύσιμη στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία, μετρήθηκε με ένα 7.8 ± 4.6-πλάσια αύξηση στην κασπάσης-3/7 Δράση (

P

= 0,03?

n = 4

? Σχ. 3Α), με κασπάση-3 και διάσπαση PARP επίσης εμφανές με κηλίδα western (Σχήμα 3Β (ii.)). Μια χρονική αύξηση διασπασμένης κασπάσης-3 ανιχνεύθηκε έως και 96 ώρες μετά τη θεραπεία σε κύτταρα PC9 ωστόσο, υπήρξε μια μείωση της δραστηριότητας της κασπάσης-3 μεταξύ 72 h και 96 h, πέφτοντας από 19,1 ± 3,4-φορές έως 11,1 ± 0,8-φορές αύξηση σε σχέση με την αρχική τιμή, αντίστοιχα (

n

= 4?

P

= 0,036). Το μέγεθος της αποπτωτική απόκριση ήταν 7,9 φορές χαμηλότερη με κύτταρα επεξεργασμένα με 50 μΜ για 96 ώρες σε σύγκριση με μία συγκέντρωση 200 μΜ στο ίδιο χρονικό σημείο.

18F-ICMT-11 ενδοκυτταρική συσσώρευση αντικατοπτρίζεται η χρονική αύξηση της διασπασμένης κασπάσης-3 σε αυτήν την κυτταρική σειρά (Σχ. 3Β, C), αυξήθηκε από 15,8% ± 4,2% της ραδιενέργειας /mg πρωτεΐνης έως 64% ± 8,1% της ραδιενέργειας /mg πρωτεΐνης σε κύτταρα κατεργασμένα στα 50 μΜ για 96 ώρες σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (

P

= 0,009). Παρά την εξαιρετική συσχέτιση μεταξύ της κασπάσης-3 και

18F-ICMT-11 κυτταρική πρόσληψη διασπώνται σε αυτή την κυτταρική γραμμή, η συσχέτιση μεταξύ

18F-ICMT-11 πρόσληψη και κασπάσης-3/7 δραστηριότητα ήταν λιγότερο σαφώς καθορισμένες (Εικ. 3D ? R

2 = 0,3314). Παρά την ανίχνευση ασθενείς λωρίδες που αντιστοιχούν σε διασπασμένη κασπάση-3 και PARP με κύτταρα Α549 σε επεξεργασία είτε 48 ώρες ή 72 ώρες (Σχ. 3Β (ii)), δεν υπήρξε καμία αύξηση στην κασπάσης 3-/7 δραστηριότητα ανιχνεύσιμη (Εικ. 3Α) . Παράλληλα, δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή στην

18F-ICMT-11 πάνω από το σύνολο του χρόνου αυτού μαθήματος (Σχήμα 3C).

Α:. Χρονική πορεία των αλλαγών στη δράση της κασπάσης 3/7 παρακάτω καρβοπλατίνη θεραπεία. Β: Ανάλυση Western blot των επιπέδων μη διασπασμένης PARP, διασπασμένη PARP και διασπάται (ενεργά) κασπάσης 3 μετά 50 μΜ θεραπεία καρβοπλατίνη (0-96 h) σε PC9 (i) και τα κύτταρα Α549 (ii). C: Χρονική αλλαγές στο

πρόσληψη 18F-ICMT-11 σε κύτταρα μετά από καρβοπλατίνη θεραπεία. D: Συσχέτιση μεταξύ της δραστηριότητας της κασπάσης 3 και

18F-ICMT-11 πρόσληψη στα κύτταρα PC9

Η

18F-ICMT-11 μπορούν να διακρίνουν αποπτωτικά από νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο

in vivo.

η

Χρονικά αλλαγές στην ανταπόκριση στη θεραπεία.

PC9 και Α549 όγκοι αναπτύσσονται ως ξενομοσχεύματα, με τις μετρήσεις δαγκάνα του μεγέθους του όγκου μετρώνται μετά οχήματος, 24 ώρες και επεξεργασία καρβοπλατίνη 48 h (120 mg /kg ΙΡ ημερησίως) και σε σύγκριση με την αρχική τιμή. Και για τις δύο όγκους, η θεραπεία καρβοπλατίνης είχε σαν αποτέλεσμα την διακοπή της ανάπτυξης. Για όγκους PC9, μια σημαντική διαφορά στο μέγεθος του όγκου μετρήθηκε 48 ώρες επεξεργασία μετά καρβοπλατίνη σε σύγκριση με τους ελέγχους οχήματος, το οποίο αυξήθηκε σε 143 ± 18% βασικής γραμμής όγκου, με καρβοπλατίνη επεξεργασμένο όγκους που απομένει στους 96 βασική γραμμή όγκος ± 13% (

P

= 0.013?

n

= 4? Εικ. 4Α). Μια σημαντική καθυστέρηση στην ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε τόσο 24 ώρες και 48 ώρες μετά τη θεραπεία καρβοπλατίνης σε όγκους Α549 σε σύγκριση με τους ελέγχους οχήματος (Εικόνα 4Β).? μεταγενέστερα χρονικά σημεία δεν μετρήθηκαν

Α, Β:. Οι όγκοι του όγκου καταγράφεται από μετρήσεις δαγκάνα του PC9 (Α) και όγκων Α549 (Β) πριν και μετά τη θεραπεία καρβοπλατίνη όπως υποδεικνύεται. Τα δεδομένα που δεικνύονται είναι μέση τιμή ± SD του όγκου% σε σύγκριση με την αρχική τιμή (

n

= 4). *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01. C, D: Εκπρόσωπος αξονική PET-CT εικόνες (30-60 λεπτά αθροίζονται δραστηριότητα) για PC9 (C) και Α549 (D) όγκους. τα περιθώρια του όγκου, που υποδεικνύεται από την εικόνα CT, είναι με κόκκινο περίγραμμα. Η μέση ± SD (

n

= 4-6 ζώα ανά ομάδα). E, F: Ο όγκος TAC αντιπροσωπεύει μέσες μετρήσεις από μια δυναμική σάρωση 60 λεπτών για PC9 (Ε) και ξενομοσχεύματα Α549 (F) μετά καρβοπλατίνη θεραπεία (όχημα, 24 ώρες ή 48 ώρες καρβοπλατίνη επεξεργασμένο?

n =

4-6 ζώα ανά ομάδα).

η

επόμενο αξιολογούνται

18F-ICMT-11 ως ευαίσθητος δείκτης των καρκινικών κυττάρων θανάτου

in vivo

. Σχετιζόμενη με τον όγκο

18F-ICMT-11 ραδιενέργεια προσδιορίστηκε με δυναμική απεικόνιση ΡΕΤ 60 λεπτά με τα πόδια. Αντιπροσωπευτικά αξονική εικόνων που απεικονίζουν σχετίζονται με όγκους

18F-ICMT-11 απεικονίζονται στα σχήματα 4C και 4D για PC9 και Α549 όγκων, αντίστοιχα. 3D περιοχές ενδιαφέροντος ορίστηκαν για τις δύο PC9 και Α549 όγκους, με μέσο όρο μετρήσεις χρησιμοποιούνται για να ληφθεί μια φορά έναντι της καμπύλης ραδιενέργεια (ROI? Εικ. 4Ε και 4ΣΤ αντίστοιχα). Και για τις δύο γραμμές όγκου, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο μέσο όρο που σχετίζονται με όγκους

18F-ICMT-11 ραδιενέργεια σε 24 ώρες και 48 ώρες μετά τη θεραπεία καρβοπλατίνης σε σύγκριση με τους ελέγχους οχήματος όπως ορίζεται από την περιοχή κάτω από την TAC (30-60 min) ή κανονικοποιημένες τιμές πρόσληψης σε 60 λεπτά μετά την έγχυση ραδιο-ιχνηθέτη (% ID /mL

60).

συγχέει της ετερογένειας των όγκων.

Η αξονική εικόνες από 30-60 λεπτά αθροίζονται δραστηριότητας αποκάλυψε ένα ετερογενές πρότυπο

διανομής 18F-ICMT-11 σε όγκους PC9 (Εικ. 4C), ενώ Α549 ραδιενέργεια ήταν πιο ομοιογενή κατανομή του (Εικ. 4D). Παρά το γεγονός ότι η μερική επίδραση του όγκου μπορεί να συμβάλει σε αυτή την φαινομενική ανομοιογένεια, voxel-σοφός ανάλυση των δεδομένων PET από PVIS (30-60 λεπτά) επιβεβαίωσε μη ομοιόμορφη κατανομή των

18F-ICMT-11 ραδιενέργεια όγκου (Σχ. 5Α και 5Β για PC9 και Α549 αντίστοιχα). Για PC9s, υπήρξε μια σαφής μετατόπιση PVIS ιστογράμματα κατά τη χρονική πορεία 48 ώρες, με μια 1.5-πλάσια ομάδα μέση αύξηση στον αριθμό των voxels με υψηλής έντασης σε ROI που PC9 όγκου της καρβοπλατίνης με ένεση ποντικούς σε σύγκριση με όχημα, όπως απεικονίζεται από το 95

ο εκατοστημόριο (

P

= 0,01? Σχ. 5C). Δεν υπάρχουν σημαντικές εντάσεις ή διανομή διαφορά voxel παρατηρήθηκαν σε όγκους Α549 πάροδο του χρόνου θεραπείας πορεία (Εικ. 5D).

Οι εντάσεις όλων των voxels εντός των ROIs όγκου υπολογίζεται και εκφράζεται ως οικόπεδα ιστόγραμμα της κανονικοποιημένης έντασης voxel έναντι ο αριθμός των voxels. Α, Β: Τυπικά δεδομένα από τρία αντιπροσωπευτικά ζώα (όχημα, 24 ώρες ή 48 ώρες καρβοπλατίνη-θεραπεία) για PC9 (Α) και Α549 (Β) δείχνονται. C, D: Η στατιστική σύγκριση των 95

ου εντάσεις εκατοστημόριο voxel για PC9 (C) και Α549 (D) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό Prism έκδοση 5.0 (GraphPad). Η μέση ± SD (

n

= 4-6 ζώα ανά ομάδα) *,

P

& lt?. 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

H & amp? Ε χρώση των όγκων φορμόλη σταθερό επιβεβαίωσε ετερογένεια PC9 όγκου, η οποία χαρακτηρίζεται από εκτεταμένες περιοχές της προϋπάρχουσας νέκρωση πριν από τη θεραπεία ( Σχ. 6Α) σύμφωνο με εκείνο των δειγμάτων ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα του ασθενούς [22]. Στα μη-νεκρωτικές, «υγιεινά» περιοχές των όγκων PC9, θεραπεία καρβοπλατίνη αυξήθηκε σημαντικά την απόπτωση, που ορίζεται από την αύξηση της διασπασμένης κασπάσης-3 και χρώση TUNEL (Σχ. 6Β και 6C αντίστοιχα). Διασπασμένη κασπάση-3 χρώση των τμημάτων του όγκου PC9 ήταν 5,4 φορές υψηλότερη μετά από καρβοπλατίνη θεραπεία, από 0,76% ± 0,22% σε ελέγχους του οχήματος, με 4,11% ± 0,88% χρώση 24 ώρες θεραπείας μετά καρβοπλατίνη (

P

= 0,002 )? 3,5% ± 0,70% διασπάται χρώσης κασπάσης-3 μετρήθηκε 48 ώρες μετά τη θεραπεία, σημαντικά υψηλότερη από ό, τι οι έλεγχοι οχήματος (4,6-φορές αύξηση?

P

= 0,0003? Εικ. 6Β). Σε σύγκριση με τους όγκους ελέγχου PC9 αγωγή με όχημα, χρώση TUNEL ήταν 3,5 φορές υψηλότερη από 24 ώρες μετά τη θεραπεία, αυξήθηκε από 0,49% ± 0,17% χρώση για 1,74% ± 0,17%, (

P

= 0.047? Σχ. 6C). Καμία σημαντική αλλαγή στη χρώση TUNEL μετρήθηκε 48 ώρες μετά τη θεραπεία, λόγω των μεγάλων διακυμάνσεων στις τυχαία επιλεγμένο FOVs. Σε όγκους Α549, καρβοπλατίνη αγωγή είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια του κυτταρικότητα, που ορίζεται από Η &? Ε χρώση, και υψηλότερα TUNEL-θετικά κύτταρα? αυξάνεται από 0,14% ± 0,05% έως 0,87% ± 0,02% το όχημα και 24 ώρες οι όγκοι καρβοπλατίνη αγωγή, αντιστοίχως (

P

= 0,0015? Σχ. 6Α & amp? 6C). Μια μικρή ανύψωση σε σχάση χρώσης κασπάσης-3 μετρήθηκε 48 ώρες μετά τη θεραπεία καρβοπλατίνης σε όγκους Α549, αυξάνοντας από 0,34% ± 0,07% σε όγκους υπό αγωγή με όχημα σε 0,70 ± 0,13% αύξηση (2 φορές?

P

= 0.02?. Εικ. 6Β)

όγκου ιστοί απομακρύνθηκαν μετά από σάρωση απεικόνιση ΡΕΤ, σε επεξεργασία για ιστολογική ανάλυση και χρωματίστηκαν για ενεργή (διασπάται) κασπάση-3 και ΟΝΑ κατακερματισμό (TUNEL δοκιμασία) ανίχνευση, σε συνδυασμό με το Η & ? χρώση Ε. Α: Αντιπροσωπευτικά εικόνες των ιστολογικών τομών όγκου εμφανίζεται. Χρώση εντάσεις για διασπασμένης κασπάσης 3 (Β) και TUNEL (C) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ και εκφράζεται ως επί τοις εκατό χρώση ανά πεδίο. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SD. *,

P

& lt? 0,05? ***

P

& lt? 0.001.

n

= 3 τμήματα όγκου με 5 τυχαίες FOV ανά τμήμα. Φωτογραφικές εικόνες της H & amp? E-τομές αποκτήθηκαν στα 100 ×, με όλα τα άλλα εικόνες που αποκτήθηκαν στα 400 ×. Κλίμακα bar = 200 μm. Συντομογραφίες: Ν, νεκρωτική? V, βιώσιμο.

Η

Συζήτηση

θεραπεία βασίζεται σε πλατίνα παραμένει η πιο αποτελεσματική θεραπευτική αγωγή για προχωρημένο NSCLC με ποσοστά ανταπόκρισης 15-30% σε μη επιλεγμένους ασθενείς (μέση επιβίωση, 10- 12 μήνες) [23]. Αρκετοί μηχανισμοί έχουν περιγραφεί για να υπογραμμίσει έμφυτη και επίκτητη αντίσταση σε θεραπεία με βάση την πλατίνα που περιλαμβάνουν μεταβολές στη νουκλεοτιδική επισκευή εκτομής [21]. έκφραση ERCC1 διαδραματίζει κεντρικό ρόλο σε αυτές τις DNA υποστεί βλάβη διαμεσολαβούμενη οδούς επιδιόρθωσης [24]. Πιο πρόσφατα, άλλοι μηχανισμοί που περιλαμβάνουν

EGFR

έχουν περιγραφεί. Ειδικότερα, επιστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ FANCD2 και μεταλλαγμένων

EGFR

κύτταρα έχουν αποδειχθεί ότι επηρεάζει την ομόλογο ανασυνδυασμό επισκευή και ευαισθητοποίηση κυττάρων σε θεραπεία με βάση την πλατίνα [20].