Αφηρημένο

Ιστορικό

ΡΝάσες σήμερα μελετηθεί ως μη-μεταλλαξιογόνες εναλλακτικές λύσεις για τις βλαβερές προκαλούν βλάβη στο DNA αντικαρκινικών φαρμάκων που συνήθως που χρησιμοποιούνται στην κλινική πρακτική. Πολλοί ΡΝάσες θηλαστικών δεν είναι ισχυρές τοξίνες λόγω της ισχυρής αναστολή από αναστολέα ριβονουκλεάσης (RI) παρουσιάζονται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων των θηλαστικών.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Σε αναζήτηση νέων αποτελεσματικών αντικαρκινικών ΡΝάσες μας μελέτησαν τις επιδράσεις της μπαρνάσης, μια ριβονουκλεάση από

Bacillus amyloliquefaciens

, σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Βρήκαμε ότι barnase είναι ανθεκτικό σε RI. Σε ανάλυση κυτταρικής βιωσιμότητας ΜΤΤ, ήταν barnase κυτταροτοξική σε ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκινώματος με συγκεντρώσεις ημι-ανασταλτική (IC

50) που κυμαίνονται από 0,2 έως 13 μΜ και σε κυτταρικές σειρές λευχαιμίας με IC

50 τιμές που κυμαίνονται από 2,4 έως 82 μΜ . Επίσης, χαρακτηρίζεται από τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του μπαρνάσης που βασίζονται immunoRNase scFv 4D5-dibarnase, το οποίο αποτελείται από δύο μόρια μπαρνάσης σειριακά συντήκεται προς το μεταβλητό θραύσμα μονής αλυσίδας (scFv) του εξανθρωπισμένου αντισώματος 4D5 το οποίο αναγνωρίζει την εξωκυτταρική περιοχή του καρκινικού δείκτη HER2. Το scFv 4D5-dibarnase δεσμεύεται ειδικά με HER2-θετικά κύτταρα και εσωτερικοποιείται μέσω προκαλούμενης από υποδοχέα ενδοκυττάρωσης. Η ενδοκυτταρική εντόπιση του εσωτερικεύεται scFv 4D5-dibarnase προσδιορίστηκε με ηλεκτρονική μικροσκοπία. Η κυτταροτοξική δράση του scFv 4D5-dibarnase επί HER2-θετικά ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος ωοθηκών SKOV-3 (IC

50 = 1.8 ηΜ) ήταν τρεις τάξεις μεγέθους μεγαλύτερη από εκείνη των μόνος μπαρνάσης. Τόσο μπαρνάσης και scFv 4D5-dibarnase επαγόμενη απόπτωση σε SKOV-3 κύτταρα που συνοδεύεται από κατάτμησης μεσονουκλεοσωμικού χρωματίνης, διόγκωση της μεμβράνης, την εμφάνιση του φωσφατιδυλοσερίνη στην εξωτερική φύλλο της μεμβράνης πλάσματος, και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3.

συμπεράσματα /Σημασία

Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι είναι barnase ένα ισχυρό τοξικό παράγοντα για τη στόχευση σε καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Edelweiss E, Balandin TG, Ivanova JL, Lutsenko GV, Leonova OG, Popenko VI , et al. (2008) Βαρνάση ως μια νέα θεραπευτική παράγοντας έναυσης απόπτωση στα ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 3 (6): e2434. doi: 10.1371 /journal.pone.0002434

Επιμέλεια: Γεδεών Schreiber, Weizmann Institute of Science, το Ισραήλ

Ελήφθη: 22 του Αυγούστου 2007? Αποδεκτές: 13η Μάη 2008? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιούν, 2008

Copyright: © 2008 Edelweiss et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το ρωσικό Ίδρυμα για τη βασική έρευνα (αριθ. 07-02-00649, 07-04-00584, 06-04-49686-α), SNSF (Αρ IB73AO-110842/1), και το Πρόγραμμα » μοριακή και Κυτταρική Βιολογία «RAS

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Βαρνάση, η ριβονουκλεάση από

Bacillus amyloliquefaciens

, συντίθεται ως ενεργό προένζυμο, υποβάλλονται σε επεξεργασία με την απομάκρυνση της αμινο-τερματικό πεπτίδιο σήματος, και εκκρίνεται στο εξωκυτταρικό χώρο. Σε αυτό το βακτηριακό είδος, barstar, ένας ειδικός αναστολέας του ενδοκυτταρική βαρνάσης, παράγεται. Barstar δεσμεύεται σφικτά στην barnase και έτσι αναστέλλει την ενδοκυτταρική ενζυματική δραστικότητα της και προστατεύει τα κύτταρα-ξενιστές από τις βλαβερές συνέπειες της παρούσας ΚΝάσης. Βαρνάση είναι ένα μικρό (110 αα) πρωτεΐνη μονής αλυσίδας. Δεν έχει δισουλφιδικούς δεσμούς και δεν απαιτεί μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, δισθενή κατιόντα, ή άλλα μη πεπτιδικά συστατικά για τη λειτουργία του [1], [2]. Λόγω αυτών των ευνοϊκών χαρακτηριστικών, barnase είναι ενεργό σε οποιοδήποτε τύπο κυττάρου στο οποίο εκφράζεται. Η ικανότητα των μπαρνάσης να διασπά το RNA έχει αξιοποιηθεί σε μία ευρεία ποικιλία βιολογικών εφαρμογών από την εισαγωγή αυτού του ενζύμου στα κύτταρα προκαλεί κυτταρικό θάνατο. Ειδική αφαίρεση των συγκεκριμένων κυττάρων είναι εφικτή κατευθύνοντας την έκφραση του γονιδίου βαρνάσης μέσω της χρήσης κυττάρου-ειδικών προαγωγών [3] – [5]. Εναλλακτικά, πρωτεΐνες που στοχεύουν barnase σε ειδικά κύτταρα αποκτήσει εξειδίκευση στην barnase δράση [6] – [8].

Η τοξική επίδραση της γονιδιακής έκφρασης μπαρνάσης χρησιμοποιήθηκε για το σχεδιασμό φορέων για τη θετική επιλογή των κλωνοποιημένων ενθέτων [9], [10], για να δημιουργήσει αρσενικά και θηλυκά στειρότητας σε φυτά [11], [12], για να προσδώσει αντίσταση των νηματωδών στις καλλιέργειες [13], για να παραχθεί ισχυροί παράγοντες για την θανάτωση του τρίτου σταδίου νύμφες του σκώληκος βάμβακος [14], για τη μελέτη οι ασθένειες που προκαλούνται από την απώλεια ενός συγκεκριμένου τύπου κυττάρου σε θηλαστικά, και για την εξάλειψη των καρκινικών κυττάρων [5]. Αυτά τα παραδείγματα απεικονίζουν σαφώς την αποτελεσματική και ειδική εξάλειψη των κυττάρων σε διαφορετικά είδη με τη χρήση της γονιδιακής έκφρασης μπαρνάσης? Ωστόσο, λίγη δουλειά έχει επικεντρωθεί στις επιδράσεις της εξωγενούς προσθήκης μπαρνάσης σε κακοήθη και φυσιολογικά κύτταρα θηλαστικών. Στην πραγματικότητα, η εξέταση του μπαρνάσης νεφροτοξικότητα είναι η μόνη που δημοσιεύθηκε παράδειγμα [15]. Ως εκ τούτου, ο στόχος αυτής της εργασίας ήταν να χαρακτηρίσει τα αποτελέσματα της μπαρνάσης ριβονουκλεάσης σε ανθρώπινα καρκινικά και φυσιολογικά κύτταρα.

ΡΝάσες βρίσκονται υπό έντονη έρευνα για την αντικαρκινική τους δυνητικούς [16], [17]. Η πιο ελπιδοφόρα ανάμεσά τους είναι ΡΝάσες ανθρώπινων παγκρεατικών τύπου καλά ανεκτό από το ανθρώπινο ανοσοποιητικό σύστημα. Όμως, η κυτταροτοξικό δυναμικό πολλών από αυτούς μειώνεται από την ευαισθησία τους στην αναστολή από κυτταροπλασματικό αναστολέα ριβονουκλεάσης (RI) βρίσκεται σε κάθε κύτταρο θηλαστικού που μελετήθηκαν [18]. Αρκετές προσεγγίσεις έχουν εξερευνηθεί για να μειωθεί η ευαισθησία του ΡΝάσες παγκρεατικού τύπου προς RI [19] – [22]. Η χρήση των ΡΝάσες εγγενώς ανθεκτικά στην RI παρέχει έναν άλλο τρόπο για να ξεπεραστεί αυτό το εμπόδιο. Εξετάσαμε την ευαισθησία του μπαρνάσης να RI και διαπίστωσε ότι είναι barnase ευτυχώς ευαίσθητη στην αναστολή από RI.

Τα καρκινικά κύτταρα είναι ένα ειδικό κυτταρικό πληθυσμό, η οποία χαρακτηρίζεται από την παρουσία προαγωγών όγκου-ειδικά και δείκτες καρκίνου. Ένας από αυτούς τους δείκτες είναι το αντιγόνο HER2 (που ονομάζεται επίσης HER-2, erbB2, p185HER-2), το οποίο υπερεκφράζεται σε μία ευρεία ποικιλία ανθρώπινων νεοπλασμάτων [23], ιδιαίτερα στην ωοθηκών και του μαστού καρκίνωμα [24], [25]. Εμείς συγχωνευμένο δύο μόρια barnase για μεταβλητό θραύσμα μονής αλυσίδας (scFv) του εξανθρωπισμένου αντισώματος 4D5, το οποίο αναγνωρίζει την εξωκυτταρική περιοχή του HER2, για να παράγουν scFv 4D5-dibarnase [8]. Κάναμε μια immunoRNase (IR) η οποία περιελάμβανε δύο ριβονουκλεάσες ανά φορέα, αφού ειδική κυτταροτοξικότητα περιορίζεται από την πυκνότητα της κυτταρικής επιφάνειας του αντιγόνου HER2. Αυτή η διαμόρφωση επέτρεψε την εισαγωγή δύο φορές τη δραστηριότητα ριβονουκλεάσης σε κύτταρα με ένα μόνο υποδοχέα HER2. Όπως φαίνεται προηγουμένως [26], ένα δυο-φορές αύξηση στον αριθμό των μορίων RNase στο ανοσοσύζευγμα αυτό ενισχύεται από δεκαπέντε φορές. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εξετάσει κατά πόσον scFv 4D5-dibarnase είναι σε θέση να αλληλεπιδρούν ειδικά με ανθρώπινα κύτταρα των ωοθηκών HER2-θετικό, να εσωτερικεύεται μέσα στα κύτταρα, και να ασκήσουν κυτταροτοξικότητα.

Κατά συνέπεια, στην παρούσα εργασία εκτιμάται πλεονεκτήματα της βαρνάσης για την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων και απέδειξε την ισχύ της βαρνάσης που βασίζεται immunoRNase για καρκίνο του ablation.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός της μπαρνάσης και scFv 4D5-dibarnase

ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες που παράγονται σε

Ε. coli

και καθαρίστηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι πρωτεΐνες που λαμβάνονται ήταν του αναμενόμενου μεγέθους και ομοιογενή σύμφωνα με SDS-PAGE (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Η ενζυματική δράση της βαρνάσης παρασκευασμένα ήταν 1,8 × 10

6 μονάδες /mg, το οποίο ήταν σύμφωνο με προγενέστερα δημοσιευθείσες τιμές [27]. Η δραστικότητα ριβονουκλεάσης κάθε ενζύμου βαρνάσης στην πρωτεΐνη σύντηξης 4D5-dibarnase scFv ήταν 75% του φυσικού μπαρνάσης (Σχήμα 1Α). Η δραστικότητα ριβονουκλεάσης του scFv 4D5-dibarnase ανεστάλη από barstar (Σχήμα 1Β, διακεκομμένη γραμμή). Έτσι, barnase ήμισυ του scFv 4D5-dibarnase διατήρησε τη λειτουργικότητά του.

(Α) Οι δραστηριότητες ριβονουκλεάση barnase του (διακεκομμένη γραμμή και τα διαμάντια) και scFv 4D5-dibarnase (διακεκομμένη γραμμή και κύκλους) προσδιορίστηκαν σύμφωνα με την μέθοδο του Rushizky et al. [58]. Το x-άξονας αντιπροσωπεύει τη συγκέντρωση της μπαρνάσης μόνο του ή τη μισή συγκέντρωση των scFv 4D5-dibarnase. Η απορρόφηση του 0,5 AU

260 αντιστοιχεί στη δραστηριότητα 2 ηΜ φυσικής μπαρνάσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. (Β) Ευαισθησία της barnase να HRI (συνεχής γραμμή και κύκλοι) και του scFv 4D5-dibarnase να barstar (διακεκομμένη γραμμή και τα τρίγωνα). Τα δεδομένα είναι μέσα ± SD τριπλών προσδιορισμών? οι καμπύλες είναι τα αποτελέσματα της παλινδρόμησης σιγμοειδές πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό SigmaPlot.

Η

Μετά διείσδυση μέσα στα κύτταρα, η εξωγενώς προστιθέμενη RNase μπορεί να αποτύχει να είναι ενεργός λόγω ευαισθησία στον αναστολέα ριβονουκλεάσης κυτταροπλασματική [18]. Ως εκ τούτου, πριν από τη δοκιμή της κυτταροτοξικότητα του scFv 4D5-dibarnase, εξετάσαμε την ευαισθησία της μπαρνάσης να ανθρώπινου αναστολέα ριβονουκλεάσης (HRI). Σε συγκέντρωση τέσσερις φορές μεγαλύτερη από αυτή που απαιτείται για την αναστολή της RNase Α κατά 50% (που προσδιορίζεται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή), HRI δεν αναστέλλει barnase (Σχήμα 1Β, συνεχής γραμμή).

Η πρόσδεση της μπαρνάσης και scFv 4D5-dibarnase σε κύτταρα

Η σύνδεση του μπαρνάσης και scFv 4D5-dibarnase να καρκίνωμα HER2-υπερεκφράζουν ανθρώπινο ωοθηκών SKOV-3 κύτταρα [28] και ποντικού CTLL-2 κυτταροτοξικά Τ-κύτταρα που δεν έχουν ανθρώπινο HER2 καθορίστηκε με φθορίζοντα μικροσκοπία. Ο φθορισμός της μεμβράνης του SKOV-3 κύτταρα, αλλά όχι τα κύτταρα CTLL-2, χρωματίστηκαν με 20 ηΜ scFv 4D5-dibarnase παρατηρήθηκε (Εικόνα 2, Β και D). Σε ελέγχους, όταν scFv 4D5-dibarnase ή αντι-barnase αντιορό κουνελιού είχαν παραλειφθεί, δεν φθορισμός ανιχνεύθηκε σε SKOV-3 κύτταρα και τα κύτταρα CTLL-2 (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η προσθήκη του scFv 4D5 προς scFv 4D5-dibarnase οδήγησε σε αξιοσημείωτη απόσβεση του φθορισμού της κυτταρικής μεμβράνης (Σχήμα 2, συγκρίνετε Β και C), υποδεικνύοντας ότι το scFv 4D5-dibarnase δεσμεύονται με τον υποδοχέα HER2. Κανένας φθορισμός δεν ανιχνεύθηκε στα SKOV-3 κύτταρα ή κύτταρα CTLL-2 σε παρουσία 20 ηΜ μπαρνάσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε συγκέντρωση μπαρνάσης 20 μΜ, ένα φωτεινό κυτταροπλασματική χρώση των κυττάρων SKOV-3 παρατηρήθηκε (Σχήμα 2Ε), υποδηλώνοντας διείσδυση μπαρνάσης σε κύτταρα. Κατάλληλοι έλεγχοι χωρίς είτε barnase ή αντι-barnase αντιορό κουνελιού ήταν αρνητικές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η ικανότητα των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών αποδεικνύεται από μικροσκοπία φθορισμού δέσμευσης κυττάρων. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 4 ° C για 1 ώρα είτε με 20 ηΜ scFv 4D5-dibarnase (Α, Β και D), ή ένα μίγμα από 20 ηΜ scFv 4D5-dibarnase και 20 ηΜ scFv 4D5 (C), ή 20 μΜ barnase ( ΜΙ). Χωρίς περιορισμούς πρωτεΐνες απομακρύνθηκαν, και στη συνέχεια, που ζουν (Α-Δ) ή σταθεροποιημένα κύτταρα (Ε) βάφτηκαν με αντι-μπαρνάσης αντιορό κουνελιού και GAR-TR όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Το scFv 4D5-dibarnase συνδεδεμένο με HER2-θετικά κύτταρα SKOV-3 (Α και Β), αυτή η ειδική δέσμευση παρεμποδίστηκε από scFv 4D5 (C). Το scFv 4D5-dibarnase δεν συνδέεται προς κύτταρα HER2-αρνητικού CTLL-2 (Δ). Κυτταροπλασματική χρώση του SKOV-3 κύτταρα με 20 μΜ μπαρνάσης παρατηρήθηκε (Ε). Η μεγέθυνση, 400 ×.

Η

Η αλληλεπίδραση του scFv 4D5-dibarnase με ανθρώπινο καρκίνωμα μαστού HER2-κύτταρα που υπερεκφράζουν ΒΤ-474 [25] μελετήθηκε με συνεστιακή μικροσκόπηση. ΒΤ-474 κύτταρα επωάστηκαν με 20 ηΜ scFv 4D5-dibarnase είτε στους 4 ° C για να καταστείλει την εσωτερίκευση ή 37 ° C για να αφήσει την εσωτερίκευση και χρωματίστηκαν με αντιορό αντι-barnase κουνελιού που ακολουθείται από IgG αντι-κουνελιού συζευγμένη με φυκοερυθρίνη κατσίκα. Ο φθορισμός παρατηρήθηκε κυρίως στην επιφάνεια των κυττάρων επωάστηκαν στους 4 ° C (Σχήμα 3Α) και στο εσωτερικό των κυττάρων επωάστηκαν στους 37 ° C (Εικόνα 3Β), δεικνύοντας ότι το scFv 4D5-dibarnase συνδέεται με και διεισδύει σε ΒΤ-474 κύτταρα. Σε ελέγχους, όταν παραλείφθηκαν scFv 4D5-dibarnase ή αντι-βαρνάσης αντιορό κουνελιού, δεν φθορισμός ανιχνεύθηκε σε ΒΤ-474 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Τα κύτταρα επωάστηκαν με scFv 4D5-dibarnase στο 4 ° C ή (Β) στους 37 ° C. Το scFv 4D5-dibarnase ανιχνεύτηκε με αντιορό αντι-barnase κουνελιού που ακολουθείται από GAR-ΡΕ. Ο φθορισμός παρατηρήθηκε κυρίως στην επιφάνεια των κυττάρων που επωάστηκαν στους 4 ° C και στο εσωτερικό των κυττάρων επωάστηκαν στους 37 ° C. Αυτή η διαφορά στον εντοπισμό του φθορίζοντος σήματος υποδηλώνει εσωτερικοποίηση του scFv 4D5-dibarnase στους 37 ° C σε ΒΤ-474 κύτταρα.

Η

Η εσωτερίκευση του scFv 4D5-dibarnase ερευνήθηκε με ηλεκτρονική μικροσκοπία

Η ενδοκυτταρική εντόπιση του scFv 4D5-dibarnase εξερευνήθηκε με μικροσκοπία ηλεκτρονίων. Το scFv 4D5-dibarnase ήταν σε σύμπλοκο με σωματίδια χρυσού (Au). Το σύμπλοκο scFv 4D5-dibarnase-Au συνδέεται προς SKOV-3 κύτταρα (Σχήμα 4), αλλά δεν δεσμεύτηκε ή να διεισδύσει κύτταρα CTLL-2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) στους 4 ° C και 37 ° C. Κατά την δέσμευση του συμπλέγματος στην κυτταρική επιφάνεια των κυττάρων SKOV-3, τα σωματίδια χρυσού κατατέθηκαν στις προεξοχές και ομαλή τμήματα της κυτταρικής μεμβράνης (Εικόνα 4, A-D). Η διείσδυση του scFv 4D5-dibarnase-Au σε SKOV-3 κύτταρα παρατηρήθηκε στους 37 ° C αλλά όχι στους 4 ° C, υπονοώντας ότι η διείσδυση είναι μία διαδικασία εξαρτώμενη από τη θερμοκρασία. Η εσωτερίκευση του scFv 4D5-dibarnase-Au εμπλέκεται το σχηματισμό των επικαλυμμένων λάκκους (Εικόνα 4D), που βλάστησε από την κυτταρική μεμβράνη και μετασχηματίζεται σε επικαλυμμένα κυστίδια (Εικόνα 4Ε). Μέσα στα κύτταρα, τα περισσότερα από τα σωματίδια χρυσού που βρίσκονται σε ενδοσώματα (Σχήμα 4, F και G). Λίγα σωματίδια χρυσού βρέθηκαν ελεύθερες στο κυτόπλασμα δίπλα στις ενδοσώματα (Σχήμα 4, F και G, αιχμές βελών). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι το scFv 4D5-dibarnase μπορεί να απελευθερωθεί από ενδοσωμάτων στο κυτταρόπλασμα. Τα σωματίδια χρυσού σημειώθηκαν επίσης σε πολυκυψελιδωτών φορείς (Σχήμα 4Η). Οι πυρήνες δεν είχαν επισημανθεί (Σχήμα 4F).

SKOV-3 κύτταρα επωάστηκαν με 20 ηΜ scFv 4D5-dibarnase-Au για 1 ώρα στους 4 ° C ή στους 37 ° C. (Α και Β) στους 4 ° C, η ετικέτα χρυσός κατατέθηκε στην κυτταροπλασματική μεμβράνη (m) και προεξοχές (αστερίσκοι), αλλά όχι στο εσωτερικό του κυττάρου. (C-H) στους 37 ° C, scFv 4D5-dibarnase-Au συνδέεται προς την επιφάνεια του κυττάρου με τον ίδιο τρόπο όπως στους 4 ° C, αλλά βρέθηκε επίσης στο εσωτερικό των κυττάρων σε επικαλυμμένα κοιλώματα (κθ) (D), επικαλυμμένα κυστίδια ( cv) (ε), ενδοσώματα (ε) (F και G), κυτόπλασμα (c) (F και G, αιχμές βελών) και πολυκυστικά φορείς (MVB) (Η). Το scFv 4D5-dibarnase-Au δεν βρέθηκε στον πυρήνα (Ν) (F). Bar, 200 nm.

Η

Επίδραση της μπαρνάσης και scFv 4D5-dibarnase στην κυτταρική επιβίωση

Εμείς ερεύνησε τις επιπτώσεις της ανασυνδυασμένης μπαρνάσης και scFv 4D5-dibarnase για την επιβίωση των διαφόρων ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικές γραμμές. Ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (hPBMCs) απομονώθηκαν από το περιφερικό αίμα υγιών δοτών και αμέσως χρησιμοποιήθηκε για την εξέταση της κυτταροτοξικότητος των μπαρνάσης και scFv 4D5-dibarnase σε φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα. Ποντικού CTLL-2 κυτταροτοξικά Τ-κύτταρα που δεν έχουν ανθρώπινο HER2 χρησιμοποιήθηκαν επίσης. Όλες οι κυτταρικές σειρές και hPBMCs επωάστηκαν με πρωτεΐνες σε διάφορες συγκεντρώσεις σε πλήρες μέσο καλλιέργειας για 72 ώρες και η κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε σε ΜΤΤ δοκιμασία (Πίνακας 1). Οι καρκίνωμα ανθρώπινου μαστού ΒΤ-474 κύτταρα έδειξαν την υψηλότερη ευαισθησία στην barnase (IC

50 = 0,21 μΜ), η χαμηλότερη ένας δείχθηκε από την μυελοκυτταρική λευχαιμία HL-60 κύτταρα (IC

50 = 82 μΜ). Για άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές, barnase ήταν τοξική με IC

50 κυμαίνεται 2,4 έως 13 μΜ. Οι καμπύλες δόσης-απόκρισης δεν έφθασαν περιοχή κορεσμού, γεγονός που υποδηλώνει μη ειδική αλληλεπίδραση των μπαρνάσης με κύτταρα. Τα κύτταρα SKOV-3 έδειξε μέτρια ευαισθησία (IC

50 = 5 μΜ), αποδεικνύοντας γενικότερη ανταπόκριση στην barnase επαγόμενη κυτταροτοξικότητα από ΒΤ-474 κύτταρα. Ως εκ τούτου, SKOV-3 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω χαρακτηρισμό των scFv 4D5-dibarnase επιδράσεις σε κύτταρα που υπερεκφράζουν το HER2-. Για hPBMCs, η μέγιστη κυτταροτοξική δράση (27%) επιτεύχθηκε σε 110 μΜ barnase (Σχήμα 5Α, σύντομη διακεκομμένη γραμμή) ενώ για SKOV-3 κύτταρα, 1,2 μΜ μπαρνάσης ήταν επαρκή για να παραχθεί το ίδιο αποτέλεσμα. Έτσι, barnase τοξικότητα ήταν δυο τάξεις μεγέθους μεγαλύτερη για ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα SKOV-3 απ ‘ότι για hPBMCs.

(Α) Τα αποτελέσματα της μπαρνάσης και scFv 4D5-dibarnase στη βιωσιμότητα των ανθρώπινων καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων. SKOV-3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 72 ώρες με barnase (μακρύ διακεκομμένη γραμμή) ή scFv 4D5-dibarnase (συνεχής γραμμή), και hPBMCs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με barnase (σύντομη διακεκομμένη γραμμή) ή scFv 4D5-dibarnase (διακεκομμένη-διακεκομμένη γραμμή). (Β) Η ανταγωνιστική αναστολή της scFv 4D5-dibarnase κυτταροτοξικότητα από scFv 4D5. SKOV-3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 72 ώρες με scFv 4D5-dibarnase απουσία (μαύροι κύκλοι) ή παρουσία (λευκές τρίγωνα) 300 ηΜ scFv 4D5 ή με scFv 4D5 μόνο (λευκά τετράγωνα). (Γ) Η αναστολή της μπαρνάσης κυτταροτοξικότητα και scFv 4D5-dibarnase κυτταροτοξικότητα από barstar. SKOV-3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 72 ώρες με barnase (λευκοί κύκλοι), barnase και ισογραμμομοριακές ποσότητες barstar (λευκό τρίγωνα), scFv 4D5-dibarnase (μαύροι κύκλοι), scFv 4D5-dibarnase με τριπλάσια μοριακή περίσσεια του barstar (μαύρο τρίγωνα), ή barstar μόνο (μαύρα τετράγωνα). (D) Τα αποτελέσματα του HRI στην κυτταροτοξικότητα του scFv 4D5-dibarnase. SKOV-3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 72 ώρες με είτε scFv 4D5-dibarnase απουσία HRI (μαύροι κύκλοι), scFv 4D5-dibarnase παρουσία HRI (λευκά διαμάντια), ή HRI μόνο (μαύρα διαμάντια). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράζεται ως το ποσοστό της μεταβολικής δραστηριότητας των επεξεργασμένων κυττάρων σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (σταυρόνημα). Κάθε καμπύλη παλινδρόμησης στο πάνελ Α (με 95% διαστήματα εμπιστοσύνης υποδεικνύεται με διακεκομμένες γραμμές) αντιπροσωπεύει τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Σιγμοειδούς παλινδρόμησης πραγματοποιήθηκε με λογισμικό SigmaPlot. Καμπύλες B-D αντιπροσωπεύουν τυπικά πειράματα. Οι ράβδοι σφάλματος (Β-D) ελήφθησαν από μετρήσεις εις τριπλούν.

Η

Η έκθεση του HER2-υπερεκφράζουν SKOV-3 κύτταρα για να scFv 4D5-dibarnase για 72 ώρες έδειξαν μια δοσοεξαρτώμενη κυτταροτοξικότητα από 0,1 ηΜ έως 20 ηΜ (Σχήμα 5Α, συνεχής γραμμή). Περαιτέρω αυξήσεις στη συγκέντρωση ενίσχυσε την κυτταροτοξικότητα ελαφρώς, δείχνοντας ότι η επίδραση του scFv 4D5-dibarnase περιορίστηκε από την πυκνότητα κυτταρική επιφάνεια του υποδοχέα HER2. Το IC

50 scFv 4D5-dibarnase ήταν 1,8 nM, που ήταν 2800 φορές λιγότερο από ό, τι το IC

50 μπαρνάσης (Σχήμα 5Α, συγκρίνετε σταθερή και μακράς διακεκομμένες γραμμές). Τα κύτταρα ΒΤ-474 έδειξε το scFv ευαισθησία 4D5-dibarnase συγκρίσιμη με εκείνη του SKOV-3 κύτταρα. Όπως IC

50 και IC

30 του scFv 4D5-dibarnase ήταν 1,3 φορές υψηλότερο για τα κύτταρα ΒΤ-474 από ό, τι για SKOV-3 κύτταρα, αλλά IC

70 ήταν 1,5 φορές χαμηλότερη για τα κύτταρα ΒΤ-474 από ό, τι για SKOV -3 κύτταρα (Πίνακας 1). Αξίζει να σημειωθεί, ενώ επιδράσεις της barnase και μόνο για SKOV-3 και ΒΤ-474 κύτταρα διέφερε 25 φορές, η scFv 4D5-dibarnase έδειξαν παρόμοια αποτελέσματα σε αυτές τις HER2-θετικά κύτταρα. Ταυτόχρονα, HER2-αρνητικό hPBMCs δεν επηρεάστηκαν από scFv 4D5-dibarnase σε συγκεντρώσεις έως 2.600 ηΜ (Σχήμα 5Α, διακεκομμένη-εστιγμένη γραμμή). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η επίδραση του scFv 4D5-dibarnase ήταν ειδική και με τη μεσολάβηση υποδοχέων.

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι η κυτταροτοξικότητα του scFv 4D5-dibarnase έγινε μέσω της αλληλεπίδρασης του τμήματος scFv 4D5 με τον υποδοχέα HER2, εξετάσαμε την επίδραση του scFv 4D5-dibarnase επί κυττάρων SKOV-3 με την παρουσία scFv 4D5 σε συγκέντρωση 300 ηΜ. Ενώ το ίδιο scFv 4D5 δεν επηρέασε SKOV-3 κύτταρα (Σχήμα 5Β, λευκά τετράγωνα) σε συγκεντρώσεις από 0.1 ηΜ έως 2000 ηΜ, ο μικροαντισώματος μείωσε την κυτταροτοξικότητα του scFv 4D5-dibarnase με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 5Β, λευκό τρίγωνα) . Αυτή η εξάρτηση υποδηλώνει ότι scFv 4D5 και scFv 4D5-dibarnase ανταγωνίζονται για την ίδια θέση δέσμευσης και περαιτέρω επιβεβαίωσε την ειδική αλληλεπίδραση των scFv 4D5-dibarnase με τον υποδοχέα HER2.

Για να καθοριστεί αν η ενζυμική δραστηριότητα της βαρνάσης ήταν απαραίτητη για την κυτταροτοξικότητα, barstar, ένας ειδικός αναστολέας της μπαρνάσης, χρησιμοποιήθηκε. Barstar μόνη της δεν αναστέλλουν την βιωσιμότητα του SKOV-3 κύτταρα σε συγκεντρώσεις μέχρι και 2000 ηΜ. (Σχήμα 5C, μαύρα τετράγωνα). Η προσθήκη του barstar στην barnase σε ισομοριακές ποσότητες, καταργούνται μπαρνάσης κυτταροτοξικότητα σε μια κλίμακα συγκεντρώσεων 0,4 έως 13 μΜ (Σχήμα 5C, λευκό τρίγωνα). Όταν προστίθεται σε τριπλάσια περίσσεια, barstar μείωσε την τοξική επίδραση του scFv 4D5-dibarnase σε συγκεντρώσεις 0.6 ηΜ έως 80 ηΜ (Σχήμα 5C, μαύρα τρίγωνα).

Η αναστολή της scFv 4D5-dibarnase κυτταροτοξικότητα με barstar και scFv 4D5 επιβεβαίωσε ότι και οι δύο 4D5 scFv και barnase συμβάλλουν στην κυτταροτοξικότητα του scFv 4D5-dibarnase να SKOV-3 κύτταρα.

για να ελεγχθεί αν HRI επηρεάζει τα αποτελέσματα του scFv 4D5-dibarnase σε καρκινικά κύτταρα, HRI και scFv 4D5-dibarnase επωάστηκαν σε αναλογία 100 μονάδες HRI σε 1 μg scFv 4D5-dibarnase για 30 λεπτά στους 4 ° C και στη συνέχεια προστέθηκαν στα κύτταρα. Το HRI μόνη της δεν επηρεάζεται SKOV-3 επιβίωση των κυττάρων (Σχήμα 5D, μαύρα διαμάντια), ούτε scFv 4D5-dibarnase κυτταροτοξικότητα (Σχήμα 5D, συγκρίνετε μαύρο κύκλο και λευκά διαμάντια).

αποδόμηση του RNA που προκαλείται από μπαρνάσης στο SKOV-3 κύτταρα

ανάλυση πηκτής πολυακρυλαμιδίου του συνολικού κυτταρικού RNA που απομονώθηκε από SKOV-3 κύτταρα έδειξαν ότι κυτταρικό RNA υφίσταται αποικοδόμηση σε κύτταρα επεξεργασμένα με 50 μΜ barnase (Σχήμα 6). Εκτεταμένη αποικοδόμηση RNA ήταν εμφανής 24 ώρες μετά την έκθεση των κυττάρων στην barnase (λωρίδα 3)? μετά από 48 ώρες, η υποβάθμιση του κυτταρικού RNA ήταν σχεδόν πλήρης (λωρίδα 4). Τόσο χαμηλού μοριακού βάρους tRNA και rRNA 5.8S, αλλά όχι 5S rRNA, φάνηκε πιο ευάλωτη σε αγωγή μπαρνάσης 24 h. Η εμφάνιση των πρόσθετων λωρίδων (lane 3, αστερίσκους) δείχνει την ενζυματική διάσπαση των υψηλού μοριακού βάρους rRNA από μπαρνάσης. Ψηφιακή ανάλυση εικόνας του πήγματος στο Σχήμα 6 (διαδρομές 2 και 3) δείχνει ότι η σχετική αφθονία των tRNA και rRNA 5.8S μειώθηκε σε 30% και 16% των κυττάρων ελέγχου, αντίστοιχα, ενώ τα επίπεδα του 5S, 18S, και 28S rRNA μειώθηκαν στο 60%, 43% και 54% των κυττάρων ελέγχου, αντίστοιχα.

SKOV-3 κύτταρα εκτέθηκαν σε 50 μΜ barnase για 24 ώρες (λωρίδα 3) ή 48 ώρες (λωρίδα 4). Ολικό RNA απομονώθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι και αναλύθηκαν σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 9% που περιείχε 7.5 Μ ουρία. Κάθε λωρίδα δείγμα φορτώθηκε με RNA από 2 × 10

5 αγωγή (+) ή χωρίς αγωγή (-) κύτταρα. Λωρίδα 2 αντιστοιχεί σε ψευδο-αγωγή ελέγχου. Οι θέσεις των προτύπων RNA μοριακού βάρους (διαδρομή 1) παρουσιάζονται ως ο αριθμός των βάσεων στα αριστερά του πλαισίου. Οι αστερίσκοι δείχνουν τις πιο κύριες λωρίδες που εμφανίζονται ως αποτέλεσμα της ενζυματικής διάσπασης του υψηλού μοριακού βάρους rRNA με barnase (λωρίδα 3).

Η

Μηχανισμός δράσης του μπαρνάσης και scFv 4D5-dibarnase επί κυττάρων SKOV-3

Για τον προσδιορισμό και τον χαρακτηρισμό της λειτουργίας του κυτταρικού θανάτου που προκαλούνται από barnase ή scFv 4D5-dibarnase θεραπεία, SKOV-3 κύτταρα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τόσο μπαρνάσης και scFv 4D5-dibarnase προκάλεσε μία χαρακτηριστική αποπτωτική διόγκωση της κυτταρικής μεμβράνης η οποία ήταν ανιχνεύσιμη σε ορισμένα κύτταρα ήδη από 6 ώρες μετά τη θεραπεία και συνέχισε να είναι εμφανές για τους ακόλουθους 72 h (Σχήμα 7).

(Α) Οι ψευδο-κατεργασμένα κύτταρα συνδέθηκαν με την πλάκα και ήταν επίπεδη. (Β και Γ) Κύτταρα επωάστηκαν είτε με 50 μΜ barnase ή 50 ηΜ scFv 4D5-dibarnase έγινε στρογγυλεμένες και αποστασιοποιημένος. Παρατηρήθηκαν διόγκωση μεμβράνης (Β και C, αστερίσκοι) και διασπασμένα κύτταρα (Β, κεφαλή βέλους). μικροσκοπία φάσης αντίθεσης ενός τυχαίου πεδίου με μεγέθυνση 400 Χ.

Η

κατάτμηση του DNA σε κύτταρα που πεθαίνουν είναι μια γενική τελικό σημείο που είναι κοινά για τις δύο νεκρωτικό και αποπτωτικό μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου. Για να καθοριστεί εάν μπαρνάσης και scFv 4D5-dibarnase επάγουν διαλείμματα DNA σε SKOV-3 κύτταρα, ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν για μεταβολές στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου με τη χρήση μετρήσεων περιεχόμενο DNA μέσω κυτταρομετρίας ροής. Θεραπεία της SKOV-3 κύτταρα είτε με barnase ή scFv 4D5-dibarnase ως αποτέλεσμα τη σταδιακή ανύψωση της αναλογίας κυττάρων στην φάση υπο-G1 (κύτταρα που περιέχουν λιγότερο από DNA 2Ν), σε σύγκριση με μη κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 8Α). Βαρνάση-επεξεργασμένα κύτταρα SKOV-3 έδειξαν αυξήσεις του 2,1%, 4,5%, και 23,9% στον αριθμό των κυττάρων στην φάση υπο-G1 και μειώνεται σε 4,0%, 0,2%, και 19,5% στον αριθμό των κυττάρων στην φάση G1 του ο κυτταρικός κύκλος σύγκριση με τους μάρτυρες μετά από 24, 48, και 72 ώρες της θεραπείας, αντίστοιχα. Παρομοίως, scFv 4D5-dibarnase-κατεργασμένων κυττάρων SKOV-3 έδειξαν αυξήσεις του 8,5%, 8,1%, και 19,7% στον αριθμό των κυττάρων στην φάση υπο-G1 και οι μειώσεις 7,5%, 3,0%, και 20,6% στον αριθμό των κυττάρων σε φάση G1 σε σύγκριση με τις αντίστοιχες τους ελέγχους τους. Επιπλέον, ο αριθμός των κυττάρων σε φάση S μειώθηκε κατά 4,9% και 3,1% σε κύτταρα κατεργασμένα με barnase μετά από 48 και 72 ώρες, αντίστοιχα, και κατά 3,6% το scFv 4D5-dibarnase-επεξεργασμένα κύτταρα μετά από 48 ώρες. Από την άλλη πλευρά, η ανάλυση κυτταρικού κύκλου δεν αποκάλυψε σημαντικές διαφορές σε κύτταρα σε G2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου μεταξύ ελέγχου και επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 8Α). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι τόσο μπαρνάσης και scFv 4D5-dibarnase που προκαλείται από τα διαλείμματα του DNA κυρίως σε κύτταρα G1. Σε αντίθεση, τα κύτταρα SKOV-3 σε παντελή στέρηση ορού παρουσίασαν αύξηση στο ποσοστό των κυττάρων σε υπο-G1 φάσης (35,7%), τα συνοδευτικά μειώσεις στις άλλες τρεις φάσεις [G1 (12,7%), S (9,1%), και G2 /Μ (13,8%)] σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.

(Α) ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της κατανομής κύκλου κυττάρου διεξήχθη όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν τις διαφορές στα ποσοστά των κυττάρων μεταξύ barnase- ή scFv 4D5-dibarnase επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα για κάθε στάδιο του κυτταρικού κύκλου (υπο-G1, G1, S, και G2 /M) που μετράται μετά από 24 ώρες (μαύρες ράβδοι), 48 h (μπλε μπάρες), και 72 ώρες (πράσινο ράβδοι) της αγωγής. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση. Οι θετικοί μάρτυρες για κατακερματισμού του DNA ήταν οι SKOV-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες σε μέσο ελεύθερο ορού (πορτοκαλί μπάρες). δοκιμασία ηλεκτροφόρηση (Β) DNA. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με 50 μΜ barnase ή 50 ηΜ scFv 4D5-dibarnase. Εβδομήντα δύο ώρες αργότερα, γονιδιωματικό DNA και των δύο αγωγή (+) και χωρίς αγωγή (-) κύτταρα απομονώθηκε και το DNA από ίσο αριθμό κυττάρων λύθηκε σε μη αποδιατακτικά πηκτώματα αγαρόζης 1,5%. Το DNA οπτικοποιήθηκε με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου. Χρωματίνη θραυσμάτων που προκύπτουν από τη διάσπαση ενδοπυρηνοσωματική ήταν παρόντες σε δείγματα DNA από κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με barnase (λωρίδα 2) και scFv 4D5-dibarnase (λωρίδα 6). DNA των κυττάρων στερημένων ορού (ss) αποκόπηκαν ακανόνιστα (λωρίδα 7). Οι διαδρομές 3 και 5 αντιπροσωπεύουν δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής. Οι λωρίδες 1 και 4 είναι οι δείκτες μοριακού βάρους ((Μ) HyperLadder Ι, Bioline). (C) Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 50 ηΜ scFv 4D5-dibarnase για 72 ώρες και στη συνέχεια βάφονται με πορτοκαλί της ακριδίνης, αναλύθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού και φωτογραφήθηκαν. Μια αντιπροσωπευτική περίπτωση της πυρηνικής πύκνωση και του κατακερματισμού (karyorrhexis) παρουσιάζεται (ένθετο). Η μεγέθυνση, 400 × (1200 ×, ένθετο).

Η

Για να διευκρινιστεί ποια αποπτωτικών ή νεκρωτικών τρόπο κατάτμησης DNA πυροδοτήθηκε από μπαρνάσης και scFv 4D5-dibarnase, γονιδιωματικό DNA που απομονώθηκε από SKOV-3 κύτταρα θεραπεία είτε με 50 μΜ barnase ή 50 ηΜ scFv 4D5-dibarnase ηλεκτροφορήθηκε μέσω πηκτής αγαρόζης 1,5% (Σχήμα 8Β). Εβδομήντα δύο ώρες μετά barnase ή scFv 4D5-dibarnase θεραπεία, SKOV-3 κύτταρα εμφανίζονται χαρακτηριστικό διάσπασης ενδοπυρηνοσωματική χρωματίνη (Σχήμα 8Β, λωρίδες 2 και 6), που διαφέρει από το ακανόνιστο διάσπαση DNA των κυττάρων SKOV-3 σε παντελή στέρηση ορού (Σχήμα 8Β, λωρίδα 7). Επιπλέον, η θεραπεία του SKOV-3 κύτταρα με scFv 4D5-dibarnase επάγεται ένα σαφές σχέδιο των πυρηνικών πύκνωση και τον κατακερματισμό (karyorrhexis) όπως παρατηρείται με μικροσκοπία φθορισμού μετά από χρώση των κυττάρων με πορτοκαλί της ακριδίνης (Σχήμα 8C).

Επίσης μεταχειρισμένα Annexin-V-FITC χρώση /ΡΙ για να μετρηθεί η εμφάνιση της φωσφατιδυλοσερίνη, ένα δείκτη της απόπτωσης, στην εξωτερική φύλλο της μεμβράνης πλάσματος του SKOV-3 κύτταρα (Εικόνα 9, Α-ο). Τα κύτταρα σε αγωγή για 72 ώρες με είτε 50 μΜ barnase ή 50 ηΜ scFv 4D5-dibarnase βρέθηκαν να είναι Annexin-V-FITC θετικά και ΡΙ αρνητικός σε υψηλότερο ποσοστό (21,7% και 32,7%, αντίστοιχα) σε σχέση με μη επεξεργασμένα κύτταρα (1,5% ). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η φύση του θανάτου κυττάρων που προκαλείται τόσο από μπαρνάσης και scFv 4D5-dibarnase είναι αποπτωτικά. Μία αύξηση στην νεκρωτικά κύτταρα (Annexin-V-FITC θετικά και θετική PI) ήταν 2,0% για τα κύτταρα βαρνάση-θεραπεία και 2,6% για το scFv 4D5-dibarnase-κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, δέκα φορές μικρότερη από εκείνη για τα αποπτωτικά κύτταρα.

(Α-Ο) SKOV-3 κύτταρα ψευδο-αγωγή (Α) ή σε αγωγή είτε με 50 μΜ barnase (Β) ή 50 ηΜ scFv 4D5-dibarnase (C) για 72 ώρες. Τα κύτταρα αναλύθηκαν για πρώιμη απόπτωση με χρώση Annexin-V-FITC /ΡΙ. Το κάτω αριστερά τεταρτημόρια του κάθε πάνελ δείχνουν τα βιώσιμα κύτταρα, τα οποία εξαιρούν ΡΙ και είναι αρνητικά για δέσμευση αννεξίνης-ν-ΡΙΤΟ. Τα πάνω δεξιά τεταρτημόρια περιέχουν τα μη βιώσιμα, νεκρωτικό κύτταρα, τα οποία είναι θετικά για την πρόσδεση τόσο Annexin-V-FITC και πρόσληψη ΡΙ. Οι κάτω δεξιά τεταρτημόρια αντιπροσωπεύουν αποπτωτικά κύτταρα, αννεξίνη-V-FITC θετικές και αρνητικές PI. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία δείχνεται. (Δ και Ε) κασπάση-3-όπως ενζυματικές δραστηριότητες των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με είτε 50 μΜ μπαρνάσης (D, άδειο κορυφή) ή 50 ηΜ scFv 4D5-dibarnase (Ε, κενές κορυφή) για 72 ώρες αξιολογήθηκαν από τη διάσπαση του φθορογόνου υπόστρωμα PhiPhiLux-G

1D

2 και σε σύγκριση με εκείνη των μη επεξεργασμένων κυττάρων (γεμάτο κορυφές). Μ1 και Μ2 δείκτες αντιστοιχούν σε επίπεδα της κασπάσης-3 ενεργοποίησης σε μη επεξεργασμένα και επεξεργασμένα κύτταρα, αντίστοιχα.

Η

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η λειτουργία του κυτταρικού θανάτου που επάγεται από μπαρνάσης και scFv 4D5-dibarnase, μετρήθηκε η ενεργοποίηση ενός απόπτωση ειδικό κασπάσης-3 με δοκιμασία πρωτεολυτική διάσπαση PhiPhiLux-G

1D

2 υπόστρωμα (Σχήμα 9, D και Ε). Caspase-3-παρόμοια δραστικότητα αυξήθηκε κατά 13,1% για barnase- και κατά 11,6% για το scFv 4D5-dibarnase επεξεργασμένα SKOV-3 κύτταρα σε σύγκριση με μη κατεργασμένους μάρτυρες.

Εν κατακλείδι, η ικανότητα της μπαρνάσης και scFv 4D5 -dibarnase να επάγουν σχηματισμό φυσαλίδων μεμβράνης, την εμφάνιση της φωσφατιδυλσερίνης στην εξωτερική φύλλο της μεμβράνης πλάσματος, κατάτμησης μεσονουκλεοσωμικού χρωματίνης, και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 υποστηρίζουν την ιδέα ότι αυτές οι πρωτεΐνες ενεργοποιούν τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.

Συζήτηση

Βαρνάση έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε μια σειρά μελετών για την απομάκρυνση των κυττάρων σε διάφορα είδη [3] – [5 και 9-14]? Ωστόσο, τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του μπαρνάσης σε καρκινικά κύτταρα δεν έχουν διερευνηθεί επαρκώς. Εδώ, η ανασυνδυασμένη barnase δείχθηκε ότι είναι τοξικό για ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκινώματος με IC

50 τιμές που κυμαίνονται από 0,2 έως 13 μΜ και σε κυτταρικές σειρές λευχαιμίας με IC

50 τιμές που κυμαίνονται από 2,4 έως 82 μΜ (Πίνακας 1). Σε σύγκριση με άλλα ΡΝάσες [29], είναι barnase μετρίως τοξικό για τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα της μπαρνάσης σε διαφορετικές καρκινικές κυτταρικές σειρές ποικίλουν 400 φορές. Η πιο ευαίσθητη κυτταρική γραμμή ήταν BT-474 (IC

50 = 0,21 μΜ), και το λιγότερο ευαίσθητο ήταν HL-60 (IC

50 = 82 μΜ). Η ευρεία εξάπλωση στην IC

50 τιμές για διάφορες γραμμές κυττάρων είναι επίσης εγγενής στο βόειο σπερματικό ριβονουκλεάση (BS RNase) και ογκονάση, μια ριβονουκλεάση από

Rana pipiens

. Οι επιδράσεις της BS RNase σε κυτταρικές σειρές καρκινώματος ποικίλουν 570 φορές? και τα αποτελέσματα της ογκονάσης σε κυτταρικές σειρές καρκινώματος και λευχαιμίας ποικίλη 6000-φορές [30]. Η παρατηρούμενη ποικιλία ως προς την ευαισθησία των κυτταρικών σειρών σε barnase μπορεί να προκληθεί από διαφορές στις τροποποιήσεις ή /και η σύνθεση των μορίων κυτταρικής επιφάνειας που καθορίζουν την δέσμευση της βαρνάσης στην επιφάνεια του κυττάρου. Ο τρόπος και η δύναμη της επιρροής δέσμευσης η αποτελεσματικότητα της κυτταρικής πρόσληψης του RNase [31] ή την εσωτερίκευση μονοπάτι της ΚΝάσης.