Αφηρημένο

Η σισπλατίνη βασίζεται σε θεραπευτική αγωγή σε συνδυασμό χημειοθεραπείας είναι μια λογική εναλλακτική λύση για κυστεκτομή σε προχωρημένο /μεταστατικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης, αλλά εξαγορά της σισπλατίνης αντίσταση είναι συχνή σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η απώλεια του ομοπεδίου-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης κινάση-2 (HIPK2) συμβάλλει στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ογκογένεση. Ωστόσο, ο ρόλος του στη ρύθμιση HIPK2 χημειοαντίσταση του καρκινικού κυττάρου δεν είναι πλήρως κατανοητός. Στην παρούσα μελέτη, βρέθηκε ότι HIPK2 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης μειώθηκαν σημαντικά σε σισπλατίνη ανθεκτικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρο

in vivo

και

in vitro

. Προς τα κάτω ρύθμιση της HIPK2 αυξάνει την βιωσιμότητα των κυττάρων σε μια δόση και το χρόνο τρόπο που εξαρτάται από τη διάρκεια της θεραπείας σισπλατίνη, ενώ η υπερέκφραση του HIPK2 μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. HIPK2 υπερέκφραση υπερνικά μερικώς αντίσταση σισπλατίνη σε RT4-άδΚ κυττάρων. Επιπλέον, δείξαμε ότι Wip1 (ρ53 προκαλούμενη φωσφατάση 1 άγριου τύπου) η έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά σε RT4-άδΚ κυττάρων σε σύγκριση με το RT4 κυττάρων, και HIPK2 ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση Wip1 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρο. HIPK2 και η έκφραση Wip1 επίσης συσχετίζεται αρνητικά μετά την σισπλατίνη βασίζεται σε συνδυασμό χημειοθεραπείας

in vivo

. Τέλος, αποδείξαμε ότι η υπερέκφραση του HIPK2 ευαισθητοποιεί στη χημειοθεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρου σε σισπλατίνη με τη ρύθμιση της έκφρασης Wip1.

Συμπεράσματα

Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι HIPK2 /Wip1 σηματοδότηση αντιπροσωπεύει ένα νέο μονοπάτι ρυθμίζει χημειοαντίσταση, προσφέροντας έτσι ένας νέος στόχος για τη χημειοθεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Lin J, Zhang Q, Lu Υ, Xue W, Xu Υ, Zhu Y, et al. (2014) Ελάττωση της HIPK2 αυξάνει την αντίσταση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρων στη σισπλατίνη με τη ρύθμιση Wip1. PLoS ONE 9 (5): e98418. doi: 10.1371 /journal.pone.0098418

Επιμέλεια: Θωμάς Γ Hofmann, γερμανικής Cancer Research Center, Γερμανία

Ελήφθη: 24, Ιανουαρίου, 2014? Αποδεκτές: 2 Μαΐου του 2014? Δημοσιεύθηκε: May 20, 2014

Copyright: © 2014 Hu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι το δέκατο πιο κοινή κακοήθεια σε. γυναίκες, και η τέταρτη πιο συχνή στους άνδρες [1], [2]. Παθολογικές μελέτες δείχνουν ότι ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης αποτελείται από δύο μεγάλες ομάδες. Η πιο κοινή μορφή καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι ουροθηλιακό καρκίνωμα (UC) που συνήθως επανεμφανίζεται αλλά σπανίως Progress [3], [4]. Επιπλέον, ο διηθητικός καρκίνος της ουροδόχου κύστης είναι πιο επιθετική, και το ήμισυ των ασθενών με διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης αναπτύξουν απόμακρη μετάσταση [5], [6]. Chemoradiation είναι μια λογική εναλλακτική λύση σε κυστεκτομή σε προχωρημένο /μεταστατικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης, αλλά η αντίσταση στη χημειοθεραπεία του καρκίνου είναι ένα κοινό φαινόμενο ιδιαίτερα σε μεταστατικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης [7]. Ωστόσο, οι πρόοδοι στη χημειοθεραπεία για τον σκοπό της θεραπείας του καρκίνου της ουροδόχου κύστης ήταν περιορισμένες, επειδή οι υποκείμενοι μηχανισμοί που προκαλούν χημειοαντίσταση δεν είναι γνωστές. Η αποκάλυψη του μοριακού μηχανισμού του χημειοαντίσταση είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη αποτελεσματικών χημειοθεραπευτικών παραγόντων.

ομοπεδίου-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης κινάση-2 (HIPK2) είναι μία κινάση σερίνης /θρεονίνης η οποία όπως έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκονται σε ογκοκατασταλτικά [8], [9], [10]. HIPK2 ενεργοποιείται σε απόκριση σε διάφορους τύπους παραγόντων προκαλούν βλάβη στο DNA, όπως η σισπλατίνη, η υπεριώδης και η ροσκοβιτίνη χημειοθεραπευτικά [9] ναρκωτικά. HIPK2 φωσφορυλιώνει ρ53 για ειδική ενεργοποίηση των προ-αποπτωτικών γονιδίων στόχων, συμπεριλαμβανομένων p53AIP1, PIG3, Βαχ και Noxa και συμβάλλει στη ρύθμιση της ρ53 απόπτωση [11], [12], [13]. Puca

κ.ά.

απέδειξαν ότι HIPK2 είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της δραστικότητας της ρ53 σε απόκριση σε ένα χημειοθεραπευτικό φάρμακο [14]. HIPK2 εκφράζεται διαφορετικά σε ευαίσθητες έναντι χημειοθεραπεία κυττάρων σε απόκριση σε διάφορα χημειοθεραπευτικά φάρμακα (δηλαδή, η σισπλατίνη και αντριαμυκίνη). αναστολή HIPK2 καταστέλλει την αδριαμυκίνη επαγόμενη απόπτωση σε χημειοθεραπεία καρκινικών κυττάρων, ενώ η υπερέκφραση του HIPK2 πυροδοτεί απόπτωση σε χημειοθεραπεία κύτταρα, που σχετίζεται με την επαγωγή του γονιδίου AIP1 p53Ser46-στόχου [14], [15], [16]. Lazzari

κ.ά.

έδειξε ότι HIPK2 knockdown επάγει αντίσταση σε διαφορετικά αντικαρκινικά φάρμακα ακόμη και από targetingΔNp63α σε ρ53-ηυΙΙ κύτταρα [17].

άγριου τύπου ρ53 προκαλούμενη φωσφατάση 1 (Wip1) είναι ένα p53-διεγέρσιμο σερίνης /θρεονίνης φωσφατάσης που σβήνει αποκρίσεις οδοφράγματος βλάβης του DNA από το αποφωσφορυλίωση ορισμένων πρωτεϊνών, όπως η ρ38 ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση, ρ53, οδοφράγματος κινάση 1 και κινάση 2 σημείου ελέγχου [18], [19]. Wip1 έχει ως στόχο από HIPK2 για την υποβάθμιση [20]. Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν επίσης ότι Wip1 υπερεκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους όγκους, και συνδέεται με χημειοαντίσταση [19]. Wang

et al

έδειξε ότι Wip1 νοκ ντάουν αυξάνει τη σηματοδότηση βλάβης του DNA και την εκ νέου ευαισθητοποιεί καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SCC) κύτταρα του στόματος με σισπλατίνη [21]. Χρησιμοποιώντας μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου, απέδειξαν ότι η υπερέκφραση του Wip1 προωθεί ογκογένεσης και η αναστολή του βελτιώνει την ανταπόκριση του όγκου στη σισπλατίνη [21]. Με αντίθετο, Goloudina

κ.ά.

έδειξε ότι Wip1 υπερέκφραση ευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα κόλου HCT116 (ρ53

– /-) για να σισπλατίνη σε RUNX2 εξαρτώμενη μεταγραφική επαγωγή της προαποπτωτική πρωτεΐνη Bax [22]. Ωστόσο, ο ρόλος της Wip1 στη ρύθμιση ευαισθησίας σισπλατίνη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρων δεν είναι πλήρως κατανοητός.

Με βάση αυτά τα ευρήματα, ερευνήσαμε αν HIPK2 ρυθμίζει χημειοευαισθησία στοχεύοντας Wip1 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυττάρων. Εδώ βρήκαμε ότι προς τα πάνω ρύθμιση HIPK2 αναστέλλει την έκφραση Wip1, η οποία ευαισθητοποιεί στη χημειοθεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρων στη σισπλατίνη.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και δείγματα ιστών

Τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται στο η μελέτη εγκρίθηκε από την προστασία του Νοσοκομείου για τα Ανθρώπινα Θέματα επιτροπής. δείγματα αίματος αποκτήθηκαν με τη γραπτή συγκατάθεση από το Πεκίνο Φιλίας Νοσοκομείο Ενταγμένο στο Πανεπιστήμιο Capital Ιατρικών Επιστημών. Συνολικά 31 ασθενείς ανεγχείρητο /μεταστατικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη, και όλοι οι ασθενείς έλαβαν σισπλατίνη με βάση το συνδυασμό χημειοθεραπείας μεταξύ 12/2011 και 08/2013 (μέση ηλικία 62,3, εύρος 51-80).

λήφθηκαν και διατηρήθηκαν Ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρικές γραμμές με άγριου τύπου ρ53 (RT4 και 253J), όπως συνιστάται από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Η σισπλατίνη ανθεκτική υπογραμμή RT4-αντίστασης (RT4-άδΚ) συστάθηκε με συνεχή έκθεση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης σε χρονική περίοδο 12 μηνών, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [23].

Real-time PCR

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα ή ιστούς χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA), και αντίστροφη μεταγραφή (RT) οι αντιδράσεις διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο πρωτόκολλο από το SYBR Green PCR kit (Toyobo, Osaka, Japan). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως αναφορές για mRNAs. τιμές ΔCt ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη επίπεδα. Το 2

-ΔΔCt μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σχετική ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν.

ανάλυση Western ανάλυση κηλίδος

Western blot για την αξιολόγηση HIPK2, Wip1 και έκφραση β-ακτίνης διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. HIPK2 (ab28507) και Wip1 (ab72000) πρωτογενή αντισώματα αγοράστηκαν από Abcam (Cambridge, MA, USA). Τα πρωτογενή αντισώματα β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Sigma (ΜΟ, USA).

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν και αναπτύχθηκαν σε πλάκα 96-φρεατίων σε 0,1 ml μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco που περιέχει 10 % (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου στους 37 ° C για 24 ώρες. Στη συνέχεια, το μέσο αλλάχθηκε και προστέθηκαν 0.1 ml φρέσκου μέσου που περιέχει υποδεικνύεται φάρμακο και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 48 ώρες. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε με την χρησιμοποίηση της δοκιμασίας 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) όπως περιγράφεται [25].

RNAi και υπερέκφραση

RNAi έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26], [27]. Τα siRNAs που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν μίγματα τριών siRNAs και αγοράστηκαν από Genepharm (Shanghai, Κίνα). pcDNA-HIPK2 και ροϋΝΑ-Wip1 κατασκευάστηκαν ώστε να υπερεκφράζουν HIPK2 ή Wip1 με την εισαγωγή ενός θραύσματος που περιέχει το HIPK2 ή πρόδρομο Wip1 σε pcDNA πλασμίδιο.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) από τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

test του Student. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

έκφραση HIPK2 μειώνεται στο χημειο-ανθεκτικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυττάρων

Η σισπλατίνη είναι σήμερα ο πιο αποτελεσματικός αντικαρκινικός παράγοντας κατά προχωρημένο καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Ωστόσο, η αντίσταση στη σισπλατίνη που βασίζεται συνδυασμένη χημειοθεραπεία είναι ένα σύνηθες φαινόμενο ειδικά σε μεταστατικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Να διευκρινιστούν οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν την αντίσταση σισπλατίνη στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, συμπεριλήφθηκαν συνολικά 31 ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης, και το επίπεδο έκφρασης HIPK2 προσδιορίστηκε μετά από σισπλατίνη βασίζεται σε συνδυασμό χημειοθεραπείας. Σχήμα 1Α έδειξε ότι η έκφραση HIPK2 σε ασθενείς οι οποίοι είναι χημειο-ανθεκτικού είναι σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τους ασθενείς χημειο-ευαίσθητα. Στη συνέχεια δημιουργήσαμε ένα cisplatin ανθεκτική υπογραμμή από τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης ανθρώπινη κυτταρική σειρά RT4 (RT4-άδΚ), και προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασης του HIPK2. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, τα επίπεδα mRNA HIPK2 ήταν χαμηλότερα στα κύτταρα RT4-άδΚ σύγκριση με τα κύτταρα RT4. Ομοίως, τα επίπεδα της πρωτεΐνης HIPK2 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε κύτταρα RT4-άδΚ (Σχήμα 1 C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι προς τα κάτω ρύθμιση HIPK2 μπορεί να σχετίζεται με σισπλατίνη αντίσταση των καρκινικών κυττάρων κύστης.

(Α) Η ανάλυση του επιπέδου έκφρασης HIPK2 πραγματοποιήθηκε σε δείγματα αίματος με τους ασθενείς σισπλατίνη ευαίσθητα (n = 19) και ασθενείς σισπλατίνη ανθεκτικά (n = 12). Ολικό RNA εκχυλίστηκε και υποβλήθηκε σε πραγματικό χρόνο RT-PCR για την ανάλυση το σχετικό επίπεδο HIPK2 σε κάθε δείγμα. Σχετική έκφραση υπολογίστηκε και κανονικοποιούνται σε σχέση με το β-ακτίνης mRNA. Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως φορές μεταβολής σε σχέση με έναν ιστό (έλεγχος, έκφραση = 1). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως Log10 (2

-ΔΔCt). *

σ

& lt? 0,05. (Β) Η σισπλατίνη ανθεκτική υπογραμμή RT4-άδΚ ιδρύθηκε από συνεχή έκθεση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης σε χρονική περίοδο 12 μηνών, και τα επίπεδα HIPK2 αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR. Σχετικά επίπεδα HIPK2 υπολογίστηκαν σε σχέση με το μάρτυρα. *

σ

& lt? 0,05. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των πρωτεϊνών επίπεδο HIPK2 σε RT4-άδΚ και τα κύτταρα RT4 (επάνω). Δείξαμε επίσης σχετική ποσοτικοποίηση του επιπέδου της πρωτεΐνης HIPK2 (κάτω μέρος, η = 3). *

σ

& lt? 0,05

Η

HIPK2 νοκ ντάουν αυξήσεις βιωσιμότητα των κυττάρων κατά τη διάρκεια της θεραπείας με σισπλατίνη στο κελί του καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Για να διερευνήσουν το ρόλο της HIPK2 στην αντίσταση σισπλατίνη, ξεχωριστά. υπερέκφραση και εκτομή πειράματα έγιναν χρησιμοποιώντας είτε pcDNA-HIPK2 ή HIPK2 siRNA κατά τη διάρκεια της θεραπείας με σισπλατίνη, και η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε. Σχήμα 2Α έδειξε ότι HIPK2 επίπεδα έκφρασης μειώθηκαν σε κύτταρα RT4 σε επεξεργασία με HIPK2-siRNA. Τότε RT4 κυττάρων επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις σισπλατίνης (0, 1, 2, 3, 4, 5 και 6 μΜ) για 48 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, η αναστολή HIPK2 αυξάνει σημαντικά η βιωσιμότητα των κυττάρων RT4 σύγκριση με αρνητικό έλεγχο (N.C). Όπως ήταν αναμενόμενο, knockdown του HIPK2 αυξάνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων RT4 εξής σισπλατίνη θεραπεία σε χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2C). Σε κύτταρα RT4-άδΚ, θεραπεία cisplatin είχε ως αποτέλεσμα σε μια μέτρια αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων, ενώ η υπερέκφραση του HIPK2 νέου ευαισθητοποιημένα κύτταρα RT4-άδΚ να σισπλατίνη (Εικόνα 2D και Ε). Ομοίως, η έκφραση HIPK2 αναστάλθηκε στα κύτταρα μετά την επεξεργασία 253J HIPK2-siRNA (Σχήμα S1), και η αναστολή HIPK2 αυξάνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων 253J σε χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2F). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι HIPK2 αυξάνει την ευαισθησία σισπλατίνη καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρων.

(Α) κύτταρα RT4 επιμολύνθηκαν με HIPK2-siRNAs και επίπεδο έκφρασης HIPK2 αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. N.C = αρνητικός έλεγχος (κωδικοποιημένο) siRNA. (Β) κύτταρα RT4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με HIPK2-siRNAs, και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη χρήση ΜΤΤ εξής σισπλατίνη θεραπεία (1 έως 6 μΜ). Τα αποτελέσματα δείχνουν δεδομένα από έξι ανεξάρτητα πειράματα, που εκφράζεται ως μέση ± SD. *

σ

& lt? 0,05. (C) τα κύτταρα RT4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με HIPK2-siRNAs, και στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη χρήση ΜΤΤ εξής σισπλατίνη επεξεργασίας (6 μΜ). Τα αποτελέσματα δείχνουν δεδομένα από έξι ανεξάρτητα πειράματα, που εκφράζεται ως μέση ± SD. *

σ

& lt? 0,05. (D) κύτταρα RT4-άδΚ επιμολύνθηκαν με pcDNA-HIPK2 και επίπεδο έκφρασης HIPK2 αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. (Ε) HIPK2 υπερεκφράστηκε σε κύτταρα RT4-άδΚ, και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη χρήση ΜΤΤ εξής σισπλατίνη θεραπεία (1 έως 6 μΜ). Τα αποτελέσματα δείχνουν δεδομένα από έξι ανεξάρτητα πειράματα, που εκφράζεται ως μέση ± SD. *

σ

& lt? 0,05. κύτταρα (F) 253J υποβλήθηκαν σε αγωγή με HIPK2-siRNAs, και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη χρήση ΜΤΤ εξής σισπλατίνη επεξεργασίας (6 μΜ). *

σ

& lt?. 0.05

Η

HIPK2 ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση Wip1

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι HIPK2 ρυθμίζει την εξέλιξη του όγκου και η αντίσταση των ναρκωτικών μέσω διαφόρων πιθανών γονιδίων στόχων, όπως ως Βαχ, p53AIP1, Noxa, κλπ [14]. HIPK2 διαδραματίζει επίσης κρίσιμο ρόλο στην έναρξη του διπλό σκέλος σηματοδότησης επισκευής διάλειμμα από τον έλεγχο των επιπέδων Wip1 σε απάντηση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία [20]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι Wip1 υπερεκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους όγκους, και συνδέεται με χημειοαντίσταση [19]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το αν HIPK2 ρυθμίζει την αντίσταση σισπλατίνη με στόχευση Wip1. Εμείς προσδιορίστηκε πρώτα το επίπεδο έκφρασης της Wip1 σε κύτταρα RT4 και RT4-άδΚ. Σχήμα 3Α και Β έδειξαν ότι Wip1 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε RT4-άδΚ σύγκριση με RT4 κύτταρο. Στη συνέχεια αναλύεται κατά πόσο HIPK2 ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση Wip1. HIPK2 knockdown αυξημένα επίπεδα έκφρασης Wip1 σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου της ουροδόχου κύστης (Σχήμα 4Α), ενώ η υπερέκφραση HIPK2 αξιοσημείωτα ανέστειλε επίπεδο Wip1 mRNA σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου της ουροδόχου κύστης (Σχήμα 4Β). Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι HIPK2 knockdown αυξάνει το επίπεδο της πρωτεΐνης Wip1 (Σχήμα 4C).

In vivo

, μια σημαντική αρνητική συσχέτιση παρατηρείται επίσης μεταξύ των επιπέδων HIPK2 και τα επίπεδα Wip1 σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης μετά από σισπλατίνη βασίζεται σε συνδυασμό χημειοθεραπείας (

r

2 = 0,1507,

σ

= 0.0063, Εικόνα 4D). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι μειορύθμιση των HIPK2 οδηγεί σε αύξηση της έκφρασης Wip1.

(Α και Β) Wip1 mRNA και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης αναλύθηκαν σε κύτταρα RT4 και RT4-άδΚ, αντίστοιχα. *

σ

& lt?. 0.05

Η

(Α) επίπεδα Wip1 mRNA αξιολογήθηκαν με PCR πραγματικού χρόνου μετά την αναστολή HIPK2 στα κύτταρα RT4 και τα κύτταρα 253J. *

σ

& lt? 0,05. (Β) Σχετικό επίπεδο Wip1 mRNA μετά HIPK2 υπερέκφραση σε κύτταρα RT4 και τα κύτταρα 253J. *

σ

& lt? 0,05. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των επίπεδο Wip1 μετά αναστολή HIPK2 σε κύτταρα RT4 και 253J. (D) αρνητική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων HIPK2 και τα επίπεδα Wip1 σε 18 ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης μετά από σισπλατίνη βασίζεται σε συνδυασμό χημειοθεραπείας (

r

2 = 0,1507,

σ

= 0.0063) . Σχετική έκφραση Wip1 ή HIPK2 υπολογίστηκε και κανονικοποιήθηκε σε σχέση με την β-ακτίνη mRNA. Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως φορές μεταβολής σε σχέση με έναν ιστό (έλεγχος, έκφραση = 1).

Η

HIPK2 υπερέκφραση ευαισθητοποιεί στη χημειοθεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρου σε σισπλατίνη με τη ρύθμιση της έκφρασης Wip1

Στη συνέχεια ερευνήσαμε ο ρόλος του στη ρύθμιση Wip1 βιωσιμότητα των κυττάρων κατά τη διάρκεια της θεραπείας σισπλατίνη. Σχήμα 5Α έδειξαν ότι Wip1 υπερέκφραση αυξημένη βιωσιμότητα των κυττάρων σε κύτταρα RT4 κατά την διάρκεια της θεραπείας σισπλατίνης. HIPK2 αναστέλλει την έκφραση Wip1 και μειώνει την αντίσταση σισπλατίνη, και μια σημαντική αρνητική συσχέτιση παρατηρείται μεταξύ του HIPK2 και την Wip1. Ως εκ τούτου, εικάζεται ότι ο ρόλος του στη ρύθμιση HIPK2 αντίσταση σισπλατίνη διαμεσολαβείται από Wip1. Εικόνα 5Β έδειξαν ότι η αναστολή HIPK2 αυξάνει σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων RT4 σε σύγκριση με N.C, ενώ Wip1 αναστολή σε κύτταρα HIPK2-προς τα κάτω ρύθμιση μειώνει εν μέρει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Ομοίως, Wip1 αναστολή σε κύτταρα HIPK2-προς τα κάτω ρύθμιση μειώνει εν μέρει την κυτταρική βιωσιμότητα 253J (Σχήμα 5C). Πιο σημαντικό, η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε κατά HIPK2 υπερέκφραση, ενώ Wip1 υπερέκφραση αυξημένη HIPK2 υπερεκφράζουν κυτταρικής βιωσιμότητας (Σχήμα 5D). Τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώνουν ότι HIPK2 υπερέκφραση ευαισθητοποιεί στη χημειοθεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρων με σισπλατίνη με τη ρύθμιση της έκφρασης Wip1.

(Α) Wip1 ήταν υπερεκφράζεται σε κύτταρα RT4, και η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε με τη χρήση ΜΤΤ μετά από σισπλατίνη θεραπεία (6 μΜ). Τα αποτελέσματα δείχνουν δεδομένα από έξι ανεξάρτητα πειράματα, που εκφράζεται ως μέση ± SD. *

σ

& lt? 0,05. (Β και C) και τα κύτταρα RT4 253J υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με HIPK2-siRNA ή HIPK2-siRNA συν-Wip1 siRNA, και στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη χρήση ΜΤΤ εξής σισπλατίνη επεξεργασίας (6 μΜ). (D) HIPK2 ή HIPK2 συν Wip1 υπερεκφράστηκε σε κύτταρα RT4-άδΚ, και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη χρήση ΜΤΤ εξής σισπλατίνη επεξεργασίας (6 μΜ). *

σ

& lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι μια από τις πιο θανατηφόρου καρκίνου σε όλο τον κόσμο, και η συχνότητα εμφάνισης της αυξάνεται σε πολλές χώρες. Εκτός χειρουργικές θεραπείες, συστηματική χημειοθεραπεία, παίζουν σημαντικό ρόλο στη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης ιδιαίτερα για τους ασθενείς με προχωρημένο μεταστατικό και καρκίνου της ουροδόχου κύστης [28], [29]. Ωστόσο, παρά την ταχεία συρρίκνωση του όγκου σε μάζα ακόλουθους χημειοθεραπευτικούς κύκλους, η χημειοαντίσταση των καρκινικών κυττάρων συχνά καταλήγει στην επακόλουθη υποτροπή και μετάσταση του καρκίνου [30], [31]. Λαμβάνοντας υπόψη την κακή πρόγνωση για τους ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης, κυρίως λόγω της καθυστερημένης διάγνωσης και χαμηλή απόκριση στη χημειοθεραπεία, επιχειρήσαμε να προσδιορίσει προγνωστική δείκτες της θεραπευτικής απόκρισης και μοριακών στόχων για την αύξηση της ευαισθησίας στη θεραπεία.

Οι μελέτες μας παρέχει μια λογική για την πιθανή χρήση της μεταγωγής HIPK2 να ευαισθητοποιηθούν στη χημειοθεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα με σισπλατίνη. Δείξαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης HIPK2 μειωτικά σημαντικά σε σισπλατίνη ανθεκτικά RT4 κυττάρου (RT4-άδΚ) σε σύγκριση με RT4 κύτταρο. Προς τα κάτω ρύθμιση της HIPK2 αυξάνει την αντίσταση σισπλατίνη σε μία δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο σε RT4 κύτταρο, ενώ αναγκαστική έκφραση HIPK2 μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων κατά τη διάρκεια της θεραπείας σισπλατίνη. Επιπλέον, η υπερέκφραση του HIPK2 υπερνικά μερικώς αντίσταση σισπλατίνη σε RT4-άδΚ κυττάρων. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι HIPK2 ενεργοποιείται σε απόκριση σε διάφορους τύπους παραγόντων προκαλούν βλάβη στο DNA, όπως η σισπλατίνη, η υπεριώδης και η ροσκοβιτίνη χημειοθεραπευτικά φάρμακα [14], [32], και είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της δραστικότητας της ρ53 σε απόκριση σε ένα χημειοθεραπευτικό φάρμακο [ ,,,0],11], [14]. Η υπερέκφραση του HIPK2 στο ρ53 άγριου τύπου εκ νέου ευαισθητοποιεί χημειοθεραπεία ωοθηκών καρκινικά κύτταρα στη χημειοθεραπεία με τη μεσολάβηση φωσφορυλίωση ρ53. Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός του HIPK2 στη ρύθμιση χημειοαντίσταση καρκινικών κυττάρων δεν έχει κατανοηθεί πλήρως.

Wip1 είναι ένα ρ53-διεγέρσιμο φωσφατάσης σερίνης /θρεονίνης που σβήνει αποκρίσεις οδοφράγματος βλάβης του DNA από το αποφωσφορυλίωση ορισμένων πρωτεϊνών που εμπλέκονται στο DNA επισκευή και το σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου [19]. Το γονίδιο Wip1 ενισχύεται σε πολλούς τύπους όγκων [33]. Song

κ.ά.

έδειξε ότι Wip1 αλληλεπιδρά με και αποφωσφορυλιώνει ΒΑΧ να καταστείλει ΒΑΧ απόπτωση που διαμεσολαβείται σε απόκριση σε γ-ακτινοβολία σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη [19]. Ακτινοβολία-ανθεκτικά κύτταρα LNCaP έδειξε δραματικές αυξήσεις στα επίπεδα Wip1 και εξασθενημένη ΒΑΧ κίνηση προς τα μιτοχόνδρια μετά c-ακτινοβολία, και αυτές οι επιδράσεις επανήλθε από έναν αναστολέα Wip1 [19]. Wang

κ.ά.

έδειξε ότι Wip1 είναι ένα αποτελεσματικό φάρμακο στόχος για βελτιωμένη θεραπεία του καρκίνου [21]. αναστολή Wip1 αυξάνει τη σηματοδότηση βλάβης του DNA και επανα-ευαισθητοποιεί το στόμα κύτταρα SCC με σισπλατίνη. Wip1 ανοδική ρύθμιση προωθεί την ογκογένεση και inhbition της βελτιώνει την ανταπόκριση του όγκου στη σισπλατίνη. Σύμφωνα με ανωτέρω αποτελέσματα, βρήκαμε ότι το επίπεδο έκφρασης Wip1 ρυθμίζεται αυξητικά σε RT4-άδΚ κυττάρων σε σύγκριση με το RT4 κυττάρων, και Wip1 υπερέκφραση αυξάνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων κατά τη διάρκεια της θεραπείας σισπλατίνης σε κύτταρα RT4. Είναι σημαντικό ότι, αποδείξαμε ότι HIPK2 ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση Wip1 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρο. HIPK2 και η έκφραση Wip1 επίσης συσχετίζεται αρνητικά μετά την σισπλατίνη βασίζεται σε συνδυασμό χημειοθεραπείας

in vivo

. Αναγκαστική έκφραση HIPK2 ευαισθητοποιεί στη χημειοθεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρων με σισπλατίνη με τη ρύθμιση της έκφρασης Wip1. Συμπέρασμα: Τα δεδομένα έδειξαν ότι HIPK2 /Wip1 σηματοδότηση αντιπροσωπεύει μια νέα πορεία που ρυθμίζουν χημειοαντίσταση. Έτσι, αυτή η μελέτη αποκαλύπτει ότι HIPK2 /Wip1 είναι ένα αποτελεσματικό φάρμακο στόχος για την ενίσχυση της θεραπείας του καρκίνου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. επίπεδο έκφρασης

HIPK2 αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR σε κύτταρα 253J. N.C = αρνητικός έλεγχος (κωδικοποιημένο) siRNA. *

σ

& lt? 0,05

doi:. 10.1371 /journal.pone.0098418.s001

(ΔΕΘ)