Αφηρημένο

θειαζολίου αντιβιοτικό, θειοστρεπτόνης πρόσφατα ταυτοποιήθηκε ως αναστολέας πρωτεασώματος. Ερευνήσαμε το θεραπευτικό δυναμικό του συνδυασμού της βορτεζομίμπης θειοστρεπτόνη και πρωτεοσώματος αναστολέα (Velcade) σε διάφορες κυτταρικές σειρές όγκων του ανθρώπου. Συνδυασμός υπο-θανατηφόρες συγκεντρώσεις του θειοστρεπτόνη και επάγεται bortezomib ισχυρή απόπτωση και αναστολή του σχηματισμού μακροχρόνιας αποικίας σε μια ευρεία ποικιλία ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών. Η συνεργική σχέση μεταξύ θειοστρεπτόνη και συνδυασμός bortezomib επίσης ποσοτικά αποδεικνύεται από τον υπολογισμό των τιμών δείκτη συνδυασμού τους, που ήταν πολύ χαμηλότερα από 1 σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν. Η συνέργεια μεταξύ αυτών των φαρμάκων βασίστηκε στην ανασταλτική δραστηριότητα πρωτεασώματος τους, γιατί η τροποποίηση της θειοστρεπτόνης, θειοστρεπτόνης μεθυλεστέρας, που δεν έχουν απρόσβλητο δακτύλιο κιναλδικό οξύ και δεν αναστέλλει τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος απέτυχε να δείξει συνέργεια σε συνδυασμό με βορτεζομίμπη.

Παράθεση: Pandit Β, Gartel AL (2011) θειαζόλη Αντιβιοτικό θειοστρεπτόνη Synergize με Μπορτέζομιμπ να επάγει απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 6 (2): e17110. doi: 10.1371 /journal.pone.0017110

Επιμέλεια: Ιωσήφ Bauer, Bauer Ίδρυμα Ερευνών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Σεπτεμβρίου 2010? Αποδεκτές: 20 Ιαν, 2011? Δημοσιεύθηκε: 18 του Φεβρουαρίου, 2011

Copyright: © 2011 Pandit, Gartel. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήταν που παρέχονται από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί 1RO1CA1294414 και 1R21CA134615 (AL Gartel). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Συνδυασμός των στοχευμένων φαρμάκων /παραγόντων έχει λάβει μια συναίνεση ως βιώσιμη δυναμικό στρατηγική για την αντιμετώπιση της κακοήθειας. Η θεραπεία με μια σύζευξη παραγόντων που στοχεύουν κλειδί κυτταρικός μηχανισμός ή πρωτεΐνες κρίσιμες για διάφορους καρκίνους που ερευνώνται έναντι ποικιλίας όγκων. Συνδυασμός φαρμάκων επιτρέπει τη χρήση τους σε υποτοξικές συγκεντρώσεις και μειώνει την πιθανότητα ανάπτυξης ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων.

Το πρωτεάσωμα είναι μια πολύπλοκη πρωτεΐνη που στοχεύουν ουμπικουϊτίνης-tagged πρωτεΐνες για αποικοδόμηση στο ΑΤΡ-εξαρτώμενο τρόπο. Πρόσφατες πρόοδοι στην κατανόηση των μηχανισμών της δραστηριότητας πρωτεασώματος οδήγησε στην ανάπτυξη των αναστολέων πρωτεασώματος ως αποτελεσματικά φάρμακα κατά του ανθρώπινου καρκίνου [1]. Δεδομένου ότι ορισμένα είδη καρκίνου βασίζονται σε μια λειτουργική πρωτεασώματος για την ανάπτυξη, αναστολή της δραστηριότητας του πρωτεασώματος θα σκότωνε επιλεκτικά αυτών των όγκων. Bortezomib (Velcade) είναι ένα από τα πρώτα στην αναστολέων πρωτεασώματος τάξη που αναστέλλει την 26S πρωτεασώματος δια συνδέσεως με Ν τερματικό θρεονίνης υπολείμματα στην δραστική θέση της καταλυτικής περιοχής πρωτεασώματος. Έχει εγκριθεί για κλινική χρήση σε περιπτώσεις υποτροπιάζον πολλαπλό μυέλωμα, αλλά έχει αποδείξει λίγο έως καθόλου δραστικότητα για θεραπεία στερεών όγκων ως μονοθεραπεία. Ωστόσο, με αναστολή της οδού του πρωτεασώματος και την επακόλουθη επίδραση των σημαντικών οδών, bortezomib επιδεικνύει συνεργική σχέση όταν συνδυάζεται με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα και ενισχύει την αποτελεσματικότητα των φαρμάκων κατά της κακοήθειας.

Σε προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι τα αντιβιοτικά θειαζόλης Siomycin Α και θειοστρεπτόνη διεγείρουν απόπτωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [2], [3] και δρουν ως αναστολείς πρωτεασώματος [4]. Έχει αποδειχθεί ότι πριν από συνδυασμό δύο αναστολέων πρωτεασώματος λακτακυστίνη και MG132 synergized έναντι καρκινικών κυττάρων του προστάτη in vitro [5]. Επιπρόσθετα, η συνέργεια αποδείχθηκε με το συνδυασμό bortezomib με κουρκουμίνη (η οποία αποδεικνύει πρωτεασώματος ανασταλτική δράση πέραν των άλλων επιδράσεων) έναντι κυττάρων πολλαπλού μυελώματος [6]. Παρομοίως, έχουμε επιδείξει ότι ο συνδυασμός του θειοστρεπτόνη και bortezomib κατέδειξε ισχυρή συνέργεια έναντι του καρκίνου του προστάτη [7]. Στη μελέτη αυτή επιβεβαίωσε ότι η συν-θεραπεία διαφόρων καρκινικών κυτταρικών γραμμών διαφορετικής προέλευσης με υπο-θανατηφόρες συγκεντρώσεις των αναστολέων πρωτεασώματος θειοστρεπτόνη και bortezomib αποκαλύπτει μια ισχυρή συνέργεια όπως αποδεικνύεται από την επαγωγή της απόπτωσης, τιμές δείκτη συνδυασμού και μακροπρόθεσμη κλωνογονική δοκιμασία.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Δείξαμε προηγουμένως ότι θειοστρεπτόνη αναστολέας πρωτεασώματος ανέστειλε την ανάπτυξη των διαφόρων καρκινικών κυτταρικών γραμμών με IC

50 τιμές του (1-5 μΜ /L) και απόπτωση που επάγεται [2 ], [3]. Bortezomib έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει την βιωσιμότητα των κυτταρικών γραμμών όγκου με IC

50 τιμή 10-100 ηΜ /L. Για να καθοριστεί εάν θειοστρεπτόνη μπορεί συνεργούν με bortezomib έναντι ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών διαφορετικής προέλευσης που αντιμετωπίζονται πολλαπλών ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών είτε με υπο-αποπτωτική συγκεντρώσεις θειοστρεπτόνη ή βορτεζομίμπης μόνο ή με συνδυασμούς των δύο για 24 ώρες και χρησιμοποιείται κασπάσης-3 για να εξυπηρετήσει ως δείκτης αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου (Σχήμα 1). Ενώ η θεραπεία με θειοστρεπτόνη ή bortezomib μόνος επαγόμενη μικρή ή καθόλου διάσπαση της κασπάσης-3 σε αυτά τα κύτταρα, η θεραπεία με συνδυασμό αυτών των φαρμάκων έδειξαν ισχυρή διάσπαση της κασπάσης-3 σε U2OS-C3 οστεοσάρκωμα, MIAPaCa-2 παγκρεατικού, ΡΑ-1 των ωοθηκών, κόλου HCT116 και MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού (Σχήμα 1), και τα επίπεδα της απόπτωσης αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση FOXM1 (Σχήμα S1). Από τότε που ιδρύθηκε νωρίτερα συνέργεια μεταξύ βορτεζομίμπης και θειοστρεπτόνης σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη [7], τα τρέχοντα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η επίδραση αυτή μπορεί να έχει γενική σημασία για τη θεραπεία του καρκίνου.

Α. Οστεοσάρκωμα, U2OS-C3, Β MIAPaCa-2 παγκρεατικού, C. ΡΑ-1 των ωοθηκών, D. HCT-116 του παχέος εντέρου, Ε MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού υποβλήθηκαν σε αγωγή με υπο-αποπτωτικά συγκεντρώσεις θειοστρεπτόνης, bortezomib ή και τα δύο όπως παρουσιάζεται για 24 ώρες, συνολικά κυτταρολύματα εκχυλίστηκαν και ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα για διασπασμένης κασπάσης-3 και β-ακτίνης.

η

για να καταδειχθεί περαιτέρω ότι η θεραπεία συνδυασμού θειοστρεπτόνη και bortezomib επάγει απόπτωση συνεργιστική, εμείς βάφονται αυτά τα κύτταρα (DMSO αγωγή, θειοστρεπτόνη αγωγή, bortezomib αγωγή και κατεργάζεται μαζί με τα δύο φάρμακα) με αννεξίνη V-ΡΕ /7ΑΑϋ και τους αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, η αγωγή των HCT-116 κυττάρων με 0.75 μΜ θειοστρεπτόνη ή 10 ηΜ επαγόμενης bortezomib απόπτωση μόνο 6,1% και 6,9% έναντι του ελέγχου, ενώ η θεραπεία με δύο φάρμακα στις ίδιες δόσεις προκάλεσε 35,2% των κυττάρων να υποστούν απόπτωση . Παρόμοια συνεργιστική δράση του συνδυασμού θειοστρεπτόνη /bortezomib παρατηρήθηκε με χρώση αννεξίνης-VPE-7ΑΑΌ σε ΜΟΑ-ΜΒ231 μαστού και MIAPaCa-2 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 2Β και C).

A. HCT-116, του παχέος εντέρου, Β MDA-MB-231, του μαστού και C. MIAPaCa-2, παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε επεξεργασία με υπο-αποπτωτικά συγκεντρώσεις θειοστρεπτόνη, bortezomib και θειοστρεπτόνης /συνδυασμός bortezomib για 24 ώρες, χρωματίστηκαν με AnnexinV-ΡΕ και 7-AAD και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

η

Για να επικυρώσετε ποσοτικά η συνεργιστική φύση της αλληλεπίδρασης μεταξύ θειοστρεπτόνης και bortezomib, εξετάσαμε τη βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από εφάπαξ και ο συνδυασμός φαρμακευτικές αγωγές χρησιμοποιώντας το Chou-Talalay Διάμε- μέθοδο εξίσωσης επίδραση [8]. Τιμές CI κάτω από 1 υποδεικνύουν μια συνεργική αντι-πολλαπλασιαστική δράση, και οι τιμές του εύρους CI για τις συνδυασμένες θεραπείες με θειοστρεπτόνη /βορτεζομίμπη σε HCT-116, Mia-Paca-2, MDA-ΜΒ231 και ΡΑ-1 ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών ήταν 0,1 έως 0.8 (Σχήμα 3Α, Β, C, D) για την κλασματική επίδραση που αντιστοιχεί σε 0,3 έως 0,9, γεγονός που υποδηλώνει μια ισχυρή συνεργική δράση. Οι μακροπρόθεσμες επιδράσεις της θεραπείας συνδυασμού με θειοστρεπτόνης και bortezomib αξιολογήθηκαν από κλωνογόνο δοκιμασία. Βρήκαμε ότι ο σχηματισμός αποικίας σε HCT-116 του παχέος εντέρου και ΜΟΑ-ΜΒ 231 κύτταρα καρκίνου του μαστού που έλαβαν θεραπεία με συνδυασμό αυτών των φαρμάκων για 24 ώρες κατεστάλη 5- έως 10-φορές (Σχήμα 4Α και Β)

δείκτη συνδυασμού. διάγραμμα για τον συνδυασμό φαρμάκων θειοστρεπτόνης /βορτεζομίμπη χαράσσεται με CI για y άξονα και κλασματική αποτέλεσμα (FI) επί του x-άξονα. Ποσοστιαία αναστολή του πολλαπλασιασμού προσδιορίστηκε μετά από θεραπεία με ένα μόνο παράγοντα ή συνδυασμού θειοστρεπτόνης /βορτεζομίμπης. δείκτη συνδυασμού (CI) τιμές των δύο παραγόντων χαράσσονται για HCT-116 (Α), MIAPaCa-2 (Β), MDA-ΜΒ231 (C) και ΡΑ-1 κύτταρα των ωοθηκών (D).

Η

Α. Κλωνογονική δοκιμασία του HCT-116 κύτταρα κατεργασμένα με ϋΜδΟ /ή συνδυασμός βορτεζομίμπη θειοστρεπτόνης για 24 ώρες και λεπτομερών? μια φωτογραφία τρυβλία Petri σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται. Β Κλωνογόνος δοκιμασία των κυττάρων MDA-MB231 αγωγή με DMSO ή θειοστρεπτόνης /συνδυασμούς βορτεζομίμπη για 24 ώρες.

Η

Μετά την επίδειξη της συνέργειας μεταξύ θειοστρεπτόνης και ο συνδυασμός βορτεζομίμπη, η σημασία του πρωτεασώματος ανασταλτική δράση της θειοστρεπτόνης χρησιμοποιηθεί στο συνδυασμό ερευνήθηκε. Η δραστικότητα του συνδυασμού θειοστρεπτόνης μεθυλεστέρα (ανοικτό δακτύλιο αδρανής δομικό ανάλογο του θειοστρεπτόνη) και ο συνδυασμός bortezomib συγκρίθηκε με θειοστρεπτόνη και bortezomib. Απεδείχθη προηγουμένως ότι ένα ανέπαφο κιναλδικό μακροκυκλικού δακτυλίου οξύ σε θειοστρεπτόνη απαιτείται για πρωτεασώματος ανασταλτική δράση των αντιβιοτικών θειαζόλης [9]. Απουσία αυτού του δακτυλίου ή την παρουσία ενός ανοικτού δακτυλίου καθίσταται το μόριο ανενεργό [10]. Σε αντίθεση με συνδυασμό θειοστρεπτόνη /bortezomib, bortezomib και θειοστρεπτόνης μεθυλεστέρα απέτυχε να αποδείξει την επαγωγή της απόπτωσης, επιβεβαιώνοντας την σημασία του πρωτεασώματος ανασταλτική δραστικότητα θειοστρεπτόνη που χρησιμοποιούνται στην συνδυασμό φαρμάκου (Σχήμα 5). Ορισμένες μελέτες έχουν καταδείξει μια συνεργία μετά την συν-θεραπεία με αναστολείς πρωτεασώματος, λακτακυστίνη και MG132 [5], botezomib και η κουρκουμίνη [6] κατά του καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη με τη χρήση διαφορετικών μεθόδων αναφέρουμε ότι θειοστρεπτόνη συνεργεί με bortezomib μετά την συν-θεραπεία με υπο-θανατηφόρες συγκεντρώσεις των δύο παραγόντων, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο συνδυασμός των δύο αναστολέων πρωτεασώματος ότι έχουν πιθανή αξία ως μια γενική στρατηγική κατά του καρκίνου.

η θεραπεία με συνδυασμό των αποτελεσμάτων θειοστρεπτόνη /bortezomib στην εμφάνιση του υπο-G

0 κορυφή η οποία μειώνει την ένταση φθορισμού σε HCT-116 κύτταρα, σε αντίθεση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου λόγω κατακερματισμού της χρωματίνης. Η μετατόπιση του FI ήταν συγκρίσιμη με το θετικό μάρτυρα που παρέχεται στο κιτ (σταυροσπορίνη, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Θειοστρεπτόνη-μεθυλεστέρα με ανοικτό δακτύλιο Β δεν επηρεάζει την ένταση φθορισμού, σε αντίθεση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (έλεγχος).

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

U2OS-C3 οστεοσάρκωμα, HCT116 του κόλου, των ωοθηκών ΡΑ1 και MIAPaCa-2 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM (Invitrogen). κύτταρα MDA-ΜΒ231 αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI-1640 (Invitrogen). Τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Atlanta Biologicals) και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (GIBCO) και τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2. Οι κυτταρικές γραμμές δοκιμάστηκαν για μόλυνση από μυκόπλασμα χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης MycoAlert Mycoplasma (Lonza Rockland) και βρέθηκαν να είναι αρνητικά. Θειοστρεπτόνη αγοράστηκε από την Sigma, bortezomib παρασχέθηκε ευγενώς από τα φαρμακευτικά Millennium /Takeda. Ανοίξτε το ανάλογο δαχτυλίδι θειοστρεπτόνης, θειοστρεπτόνης μεθυλεστέρας ευγενικά από τους Drs. Walsh και Bowers (Harvard University).

Συνδυασμός δοκιμασία δείκτη

δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη για να μετρηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από θεραπεία με απλούς παράγοντες ή συνδυασμό θειοστρεπτόνης και βορτεζομίμπης. Κάθε πείραμα περιλάμβανε τη θεραπεία με διάφορες συγκεντρώσεις της θειοστρεπτόνης, bortezomib, συνδυασμός θειοστρεπτόνη και bortezomib και μια θεραπεία χωρίς φάρμακο. Επιπλέον, οι υψηλότερες συγκεντρώσεις του θειοστρεπτόνη, bortezomib και ο συνδυασμός του φαρμάκου εξετάστηκαν σε απουσία κυττάρων και δεν επέδειξε καμία παρεμβολή με τα αντιδραστήρια δοκιμασίας ΜΤΤ.

3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ ) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιου (ΜΤΤ) που προμηθεύονται από την Sigma. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

4 ανά φρεάτιο σε 200 μΐ πλήρους μέσου καλλιέργειας και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με θειοστρεπτόνη μόνο, bortezomib μόνο και συνδυασμός θειοστρεπτόνη και bortezomib σε 96 φρεατίων μικρο πλάκες τίτλου. Μετά από επώαση για 72 ώρες στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή, 10 μL ΜΤΤ (5 mg /ml σε PBS) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, μετά την οποία η πλάκα φυγοκεντρήθηκε για λίγο. Μετά από προσεκτική απομάκρυνση του μέσου, 0,1 mL ρυθμιστικό DMSO προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Η απορρόφηση καταγράφηκε σε ένα αναγνώστη μικρο-πλάκας σε μήκος κύματος 540 nm. Στα πειράματά μας, το IC

30, IC

50, IC

70, IC

80 και IC

90 τιμές (δηλαδή, η συγκέντρωση του φαρμάκου που απαιτείται για να προκαλέσει 30%, 50% , 70%, 80%, και 90% μειώσεις της βιωσιμότητας των κυττάρων) επιλέχθηκαν για τη σύγκριση.

για να αξιολογηθεί η επίδραση της θεραπείας συνδυασμού με θειοστρεπτόνη και bortezomib, ο δείκτης συνδυασμού (CI) μέθοδος ισοβολόγραμμα των Chou και Talalay χρησιμοποιήθηκε [8]. Αυτή η μέθοδος περιλαμβάνει τη σχεδίαση καμπυλών δόσης-αποτελέσματος για κάθε παράγοντα και συνδυασμούς σε πολλαπλές συγκεντρώσεις αραιώνονται χρησιμοποιώντας την εξίσωση μέσου-αποτελέσματος και την εξίσωση δείκτη συνδυασμού. Οι τιμές του δείκτη συνδυασμός των 1, & lt? 1, και & gt? 1 δείχνουν μια αθροιστική δράση, συνέργεια και ανταγωνισμός, αντίστοιχα. Οι τιμές του δείκτη συνδυασμού προσδιορίστηκαν σε διάφορα επίπεδα αποτελέσματος, καθώς και τα ισοβολογράμματα απεικονίζονται.

Ανίχνευση απόπτωσης

Το κιτ χρώσης Αηηβχίην-ΡΕ (Roche Diagnostic Corp.) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των αποπτωτικών οργανισμούς σύμφωνα με το πρωτόκολλο του προμηθευτή. Αυτό το κιτ χρησιμοποιεί ένα πρωτόκολλο διπλής χρώσης στην οποία τα κύτταρα εμφανίζουν φθορισμό αννεξίνης V (αποπτωτικά κύτταρα) και ο φθορισμός του 7ΑΑΌ (νεκρωτικών κυττάρων ή καθυστερημένη αποπτωτικά κύτταρα). Εν συντομία τα κύτταρα του όγκου αναπτύχθηκαν σε πυκνότητα 50% συρροή σε δίσκους καλλιέργειας των 100 mm και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις των φαρμάκων για 24 ώρες. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν με PBS, και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για την επισήμανση με AnnexinV-7AAD. Τα επισημασμένα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

ανοσοαποτύπωσης

ενεργά διαιρούμενα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 100 mm σε πυκνότητα 7,5 × 10

5 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με bortezomib μόνο, θειοστρεπτόνη μόνο και συνδυασμός θειοστρεπτόνη και bortezomib για 24 ώρες ύστερα από την οποία λύθηκαν τα κύτταρα. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα ΙΡ (20 mM HEPES, 1% Triton Χ-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM Na

4P

2O

7, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 0.2 mM PMSF συμπληρωμένο με δισκίο αναστολέα πρωτεάσης (Roche Applied Sciences) και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο δοκιμασίας πρωτεΐνης Bio-Rad. Πενήντα μικρογραμμάρια των κυτταρικών προϊόντων λύσης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε SDS-πολυακρυλαμιδίου mini gel και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με ειδικά αντισώματα για διασπασμένης κασπάσης-3 (9.664 κυτταρική σηματοδότηση), FOXM1 (ευγενική προσφορά από Dr. εργαστήριο Costa) και β-ακτίνη (A5441, Sigma)

.

πυρηνικά ID Πράσινη συμπύκνωση της χρωματίνης

ανίχνευσης

τα κύτταρα βάφτηκαν χρησιμοποιώντας το

in vitro

απόπτωση κιτ ανίχνευσης (Cat # ENZ-51021-K200 Enzo Life Sciences), σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Εν συντομία 3-4 × 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας 60 mm και αφέθηκαν να αναπτυχθούν όλη τη νύχτα. τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υπο-θανατηφόρες συγκεντρώσεις του θειοστρεπτόνης, bortezomib ή θειοστρεπτόνη μεθυλεστέρας ή συνδυασμό θειοστρεπτόνη και bortezomib και θειοστρεπτόνη-μεθυλεστέρα και bortezomib. Μετά από ολονύκτια επώαση των κυττάρων φαρμάκων θρυψινοποιήθηκαν και υποβλήθηκαν για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Η ανάλυση έγινε με τη χρήση FL-1 κανάλι του κυτταρόμετρο ροής με μήκος κύματος διέγερσης 488 nm. Σταυροσπορίνη, που παρέχονται στο κιτ χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος.

κλωνογονιδιακή επιβίωση δοκιμασία

HCT-116 και MDA-ΜΒ231 κύτταρα επιστρώθηκαν σε μέσο πλακών στους 3 × 10

5 κυττάρων συρροή και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με συνδυασμό θειοστρεπτόνη και bortezomib για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη, αιωρούνται εκ νέου στα μέσα ενημέρωσης και μετρήθηκαν. Τα κύτταρα επανα-σπάρθηκαν (750 κύτταρα ανά πλάκα μέσου) και επωάζονται για 10 ημέρες. Νωπό μέσο προστίθεται την πέμπτη ημέρα. Την δέκατη ημέρα, τα μέσα απομακρύνθηκαν από τα πιάτα και πλύθηκε μία φορά με παγωμένο PBS. Οι αποικίες βάφτηκαν με 2 mls καθένα από 0,25% 1, 9-διμεθυλο-μεθυλενίου μπλε σε 50% αιθανόλη για 45 λεπτά σε μιά ταλαντούμενη βάση. Τα πιάτα ξεπλύθηκαν τρεις φορές με PBS και ξηραίνονται στον αέρα, και οι αποικίες μετρήθηκαν.

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με το Microsoft Excel χρησιμοποιώντας το Student

t

δοκιμή.

P

τιμές των & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1..

Σχετικά επίπεδα του FOXM1 μπορεί να επηρεάσουν την ευαισθησία στην θεραπεία συνδυασμού θειοστρεπτόνη /bortezomib σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. U2OS-C3 οστεοσάρκωμα και ΜΙΑ PaCa-2 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις θειοστρεπτόνης και borteozomib μαζί για 24 ώρες. Κυτταρολύματα ανοσοστυπώθηκαν για FOXM1, διασπασμένη κασπάση-3 και β-ακτίνης ως έλεγχος φόρτωσης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0017110.s001

(TIF)

Ευχαριστίες

θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον Δρ Albert Bowers και ο Δρ Christopher Walsh για την ευγενική παροχή θειοστρεπτόνης μεθυλεστέρας που χρησιμοποιείται στο παρόν έγγραφο.