Αφηρημένο

Τα εξωκυττάρια κυστίδια (ΕΕΥ) είναι βασικοί παράγοντες για τον καρκίνο όπου παίζουν ένα αναπόσπαστο ρόλο στην επικοινωνία κυττάρου-κυττάρου και μεταφέρει φιλο-ογκογόνο μόρια σε κύτταρα δέκτες παρέχοντας έτσι ένα καρκινικό φαινότυπο. Εδώ, θα καθαρίζεται ΕΕΥ χρησιμοποιώντας απλές βιοχημικές προσεγγίσεις από πολλαπλές καρκινικές κυτταρικές γραμμές και στη συνέχεια χαρακτηρίζεται αυτά τα EVs μέσω πολλαπλών βιοχημικών και βιοφυσικών μεθόδων. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε μικροσκοπία φθορισμού για να δείξει άμεσα εσωτερικοποίηση των ΗΟ εντός των κυττάρων δεκτών μέσα σε λίγα λεπτά μετά την προσθήκη των ΗΟ σε κύτταρα δέκτες. Επιβεβαιώσαμε ότι η διαμεμβρανική πρωτεΐνη EMMPRIN, τεκμηριωθεί ότι είναι ένας δείκτης των ΗΟ, πράγματι εκκρίνεται από όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν εδώ. Αξιολογήσαμε την απόκριση σε EV διέγερση σε αρκετούς διαφορετικούς τύπους κυττάρων δεκτών γραμμών και μέτρησε την ικανότητα αυτών των καθαρισμένων ΕΕΥ να επάγουν έκκριση διαφόρων παραγόντων υψηλά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε ανθρώπινους καρκίνους. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι καθαρισμένο ΕΕΥ διεγείρουν επιλεκτικά την έκκριση πολλών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην οδήγηση καρκίνου σε μονοκύτταρα, αλλά φιλοξενούν μόνο περιορισμένη δραστηριότητα στα επιθηλιακά κύτταρα. Συγκεκριμένα, δείχνουμε ότι τα ΗΟ είναι ισχυροί διεγέρτες της ΜΜΡ-9, IL-6, ΤΟΡ-β1 και επάγουν την έκκριση των εξωκυτταρικών EMMPRIN, τα οποία όλα διαδραματίζουν κάποιο ρόλο στην οδήγηση του ανοσοποιητικού φοροδιαφυγή, εισβολή και φλεγμονή στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Έτσι, χρησιμοποιώντας μια ολοκληρωμένη προσέγγιση που περιλαμβάνει βιοχημικές, βιολογικές και φασματοσκοπικές μεθόδους, έχουμε αρχίσει να φωτιστούν οι διεγερτικές ρόλους

Παράθεση:. Redzic JS, Kendrick ΑΑ, Bahmed Κ, Dahl KD, Pearson CG, Robinson WA, et al. (2013) Εξωκυτταρική κυστίδια εκκρίνεται από Cancer κυτταρικές γραμμές διεγείρουν την έκκριση των ΜΜΡ-9, IL-6, ΤΟΡ-β1 και EMMPRIN. PLoS ONE 8 (8): e71225. doi: 10.1371 /journal.pone.0071225

Επιμέλεια: Jialin Charles Zheng, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 του Αυγούστου 2012? Αποδεκτές: 30 Ιουν 2013? Δημοσιεύθηκε: 1 Αυγούστου του 2013

Copyright: © 2013 Redzic et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε μέσω ΝΙΗ αριθμό της αίτησης 1R01GM096019-01A1 σε Eze Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Cellular απόπτωση είναι μια διαδικασία που λαμβάνει χώρα σε όλα τα κύτταρα, ως μέσο για την εξάλειψη των περιττών κυτταρικά συστατικά, ακόμη τον κρίσιμο ρόλο της εκκρίνονται κυστιδίων στην επικοινωνία κυττάρου-κυττάρου αρχίζει να αναδύεται [1], [2]. Οι πρωτεΐνες μεμβράνης που αποβάλλονται μέσω ενός αριθμού διαφορετικών μηχανισμών που περιλαμβάνουν εξωτομέα απόπτωση και έκκριση πρωτεϊνών μεμβράνης πλήρους μήκους μέσω εκκρίνονται κυστίδια [3]. Φυσαλιδώδης απόπτωση λαμβάνει χώρα με προς τα έξω εκβλάστηση της μεμβράνης του πλάσματος με την απελευθέρωση ενός τύπου κυστιδίου γνωστό ως μικροκυστίδιο ή με προς τα μέσα εκβλάστηση της μεμβράνης με την ενδεχόμενη απελευθέρωση των κυστιδίων είναι γνωστή ως εξωσώματα [4]. Εδώ, θα αναφερθούμε συλλογικά σε δύο μικροκυστίδια και εξωσώματα ως εξωκυττάριο κυστίδια (ΕΕΥ). Αυτό το φαινόμενο της φυσαλιδώδους απόπτωση, δηλαδή, EV απόπτωση, έχει επίσης παρατηρηθεί σε έναν αριθμό διαφορετικών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων νευρολογικών διαταραχών, ιογενής λοίμωξη και καρκίνο [5] – [7]. Στην πραγματικότητα, EV απόπτωση λαμβάνει χώρα σε μεγαλύτερο βαθμό σε καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα υγιή κύτταρα και οδηγεί στην απελευθέρωση των προ-ογκογόνου μόρια που περιλαμβάνουν πρωτεΐνες, RNA και DNA [8], [9]. Πρόσφατα, διάφορους ρόλους των ΗΟ έχουν προκύψει που επιτρέπουν αυτά τα σωματίδια να οδηγούν διαδικασίες που απαιτούνται για την ανάπτυξη και την πρόοδο του καρκίνου, όπως η αγγειογένεση, η φλεγμονή και αντίστασης στα φάρμακα [10]. Υπάρχουν διάφοροι μηχανισμοί με τους οποίους τα ΗΟ μπορεί να ενεργεί για κύτταρα δέκτες. Για παράδειγμα, αυτές μπορούν να περιλαμβάνουν είτε άμεση διέγερση κυτταρικών υποδοχέων από πρωτεΐνες στην επιφάνεια EV ή εσωτερικοποίηση ΕΕΥ από τον αποδέκτη των κυττάρων, τα οποία αμφότερα οδηγούν σε μετέπειτα διέγερση των οδών σηματοδότησης [1], [11]. Τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζονται να χρησιμοποιούν EVs ως μέσο επικοινωνίας κυττάρου-κυττάρου με μεταφορά του περιεχομένου τους (DNA, RNA και πρωτεϊνών) σε ένα κύτταρο δέκτη, οδηγώντας έτσι σε ένα μετασχηματισμό από ένα μη-κακοήθη σε μία κακοήθη φαινότυπο του κυττάρου δέκτη [12 ] – [14]. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη της ΕΕΥ διαδραματίζει αναπόσπαστο ρόλο στην εσωτερίκευση και τη δραστηριότητα των ΕΕΥ. Για παράδειγμα, οι πρωτεΐνες EV εμπλέκουν τις κύτταρα δέκτες με αποτέλεσμα την πρόσληψη των ΗΟ [15], και ΕΕΥ δείχθηκαν να μεταφέρει ογκο-πρωτεΐνες καταλήγοντας σε φαινοτυπική μεταβολή του κυττάρου δέκτη [12] – [14]. Ωστόσο, ένα από τα υπόλοιπα ζητήματα σε σχέση με δραστηριότητα EV είναι αν υπάρχουν διαφορές στην παρατηρούμενη δραστηριότητα EV μεταξύ των διαφόρων τύπων κύτταρο δέκτη καθώς και η οποία πρωτεΐνες μπορούν να εκκρίνονται από τα ΗΟ. Για το σκοπό αυτό, αξιολογήσαμε τις διαφορές στη δραστηριότητα EV διεγερτική σε αρκετούς διαφορετικούς τύπους κυττάρου δέκτη με διερεύνηση EV-έκκριση πολλών διαφορετικών παραγόντων που έχουν δειχθεί ότι παίζουν σημαντικούς ρόλους σε ανθρώπινους καρκίνους.

Έχουμε καθαρισμένο ΕΕΥ από υγιή άτομα, ασθενείς με καρκίνο και από πολλές διαφορετικές καρκινικές κυτταρικές σειρές θηλαστικών. μέθοδος καθαρισμού μας έδωσε ένα ετερογενή πληθυσμό ΗΟ κυμαίνονται σε μέγεθος από 20-300 nm υποδεικνύοντας μία μίγμα εξωσωμάτων και μικροκυστιδίων [4]. Διαπιστώσαμε την πλήρη διαμεμβρανική πρωτεΐνη μήκους που ονομάζεται Εξωκυττάρια μεταλλοπρωτεϊνάσης επαγωγέα (EMMPRIN), ένα προτεινόμενο δείκτη της ΕΕΥ [16], στην ΕΕΥ καθαρίζεται από πολλά διαφορετικά βιολογικά υγρά δείγματα και από όλες τις διαφορετικές κυτταρικές σειρές που αξιολογούνται εδώ. Εμείς, ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται EMMPRIN ως δείκτης για καθαρισμένο ΗΟ μας. μικροσκοπία φθορισμού έδειξε ότι καθαρισμένη ΗΟ μας ήταν εσωτερικοποιείται από το κύτταρο δέκτη σε σχετικά σύντομο χρονικό διάστημα, (5-15 λεπτά), και εντοπίζεται γύρω από τον πυρήνα, επιβεβαιώνοντας έτσι ότι η μέθοδος καθαρισμού μας οδήγησε σε δραστική ΕΕΥ ικανό να μεταφέρει το περιεχόμενό τους σε κύτταρα-αποδέκτες . ευρεία αξιολόγησή μας αρκετές διαφορετικές κυτταρικές σειρές δέκτη δείχνει ότι ΗΟ καθαρίζεται από αυτούς τους διάφορους τύπους καρκίνου κύτταρα εμφανίζουν προτιμησιακή διεγερτική δραστικότητα εκκρινόμενων πρωτεϊνών προς μονοκύτταρα αλλά όχι επιθηλιακά κύτταρα. Στην πραγματικότητα, ενώ ανακαλύψαμε ότι ΕΕΥ που εκκρίνεται από όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν εδώ περιλαμβάνει όλο το μήκος EMMPRIN, EVs διεγείρει επίσης την έκκριση της πλήρους μήκους EMMPRIN τον εαυτό της σε ανθρώπινα μονοκύτταρα λευχαιμίας. Ανακαλύψαμε ότι τα ΗΟ είναι ισχυροί διεγέρτες της Transforming Growth Factor β-1 (TGF-β1), μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 (ΜΜΡ-9) και της ιντερλευκίνης-6 (IL-6). Αυτή η διεγερτική δράση της ΕΕΥ για να προκαλέσει την έκκριση του TGF-β1, MMP-9, IL-6 και EMMPRIN, υποδηλώνει ένα ρόλο των ΕΕΥ στην οδήγηση εξέλιξη του όγκου με παράγοντες διέγερσης σημαντική για το ανοσοποιητικό φοροδιαφυγής, την εισβολή και τη φλεγμονή [17] – [19 ]. τα δεδομένα μας, μας φέρνει πιο κοντά σε μια καλύτερη κατανόηση της βιολογίας της εκκρινόμενης ΕΕΥ, το προτιμησιακό τύπο κυττάρου που διεγείρεται από ΕΕΥ, και τα μόρια που εκκρίνονται από κύτταρα δέκτες μετά από διέγερση με εκκρινόμενη ΕΕΥ.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Δεοντολογίας για τα Ανθρώπινα (ασθενούς /δότη) Συλλογή Βιολογικών Ρευστών

δείγματα περιφερικού αίματος συλλέχθηκαν στο Πανεπιστήμιο του Κολοράντο Νοσοκομείου Δερματική Ογκολογική Κλινική. Vacutainers σωλήνες (κόκκινη κορυφή, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) χρησιμοποιήθηκαν για τη συλλογή του ορού. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν αμέσως στο εργαστήριο, φυγοκεντρήθηκε στα 1200 χ g για 10 λεπτά και στη συνέχεια καταψύχεται στους -80 ° C μέχρι να χρειαστεί. ηπαρίνη λιθίου που περιέχει vacutainers (πράσινο κορυφή, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) χρησιμοποιήθηκαν για τη συλλογή του πλάσματος, αμέσως μεταφέρονται στο εργαστήριο, φυγοκεντρείται στα 800 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Τα δείγματα πλάσματος καταψύχθηκαν στους -80 ° C μέχρι να χρειαστεί. ασκητικό υγρό συλλέχτηκε από πλευριτική συλλογή βρύσες στο Επεμβατικής Ακτινολογίας στο Πανεπιστήμιο του Νοσοκομείου Κολοράντο χρησιμοποιώντας ένα Vacutainer (κόκκινη κορυφή, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Τα δείγματα μεταφέρθηκαν αμέσως στο εργαστήριο επί πάγου, φυγοκεντρήθηκαν στα 800 χ g για 5 λεπτά στους 4 ° C για να απομακρυνθεί το κυτταρικό απόρριμμα. Τα δείγματα καταψύχθηκαν στους -80 ° C μέχρι να χρειαστεί. Η συλλογή των βιολογικών υγρών δειγμάτων εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο του Κολοράντο Multi-Institutional Review (COMIRB # 05-0309), και τα δείγματα συλλέχθηκαν μετά από ενημερώθηκαν γραπτή συγκατάθεση.

Ανίχνευση Full Length EMMPRIN στα Βιολογικά Υγρά

ανθρώπινο ορό, πλάσμα και ασκιτικό υγρό δείγματα διηθούνται χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο 0,22 μm για να απομακρυνθούν οποιαδήποτε κύτταρα και κυτταρικά θραύσματα. 10 μg πολυκλωνικό αντίσωμα Ανθρώπου EMMPRIN Βιοτινυλιωμένο (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) EMMPRIN από κάθε δείγμα. Η ΙΡ διεξήχθη επί 2 ώρες στους 4 ° C με περιστροφή που ακολουθείται από επώαση με 40 μΙ σφαιριδίων στρεπταβιδίνης (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) για 2 ώρες στους 4 ° C με περιστροφή. ΡΝΘάσηΡ (New England Biolabs, Ipswich, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε για την απογλυκοζυλίωση του κλάσματος iPed σε ένα ένζυμο 1:10 έως δοκιμάσουν αναλογία σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. 5 μΐ 10 Χ SDS ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης προστέθηκε στο δείγμα και έβρασαν για 10 λεπτά πριν από τη φόρτωση σε ένα 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE γέλης (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA) και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε ένα Immobilon Πολυβινυλυδενο φθορίδιο (PVDF) (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA) για ανάλυση στυπώματος Western. Η μεμβράνη αποκλείστηκε σε 2% γάλα για 30 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν σε ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα EMMPRIN (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA) παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας αραίωση 1:1000 σε 2% γάλα για 1 ώρα. Μετά την πρωτογενή επώαση αντίσωμα, η μεμβράνη πλύθηκε με 1 Χ Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) για 30 λεπτά. Αντι IgG ποντικού συζευγμένο με HRP (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA) παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας μία αραίωση 1:4000, εφαρμόζεται στη μεμβράνη και επωάστηκε για 1 ώρα ακολουθούμενη από μία πρόσθετη πλύση σε 1 Χ PBS για 30 λεπτά. ανίχνευση ζώνη πρωτεΐνης εκτελέστηκε με το κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας ECL χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης Perkin Elmer (Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ, USA).

καλλιέργεια κυττάρων

κύτταρα MCF-7 ήταν ένα είδος δώρο από τον Dr. Heide Ford (Τμήμα Φαρμακολογίας του Πανεπιστημίου του Κολοράντο Ντένβερ Σχολή Ιατρικής) [20]. MDA-MB-231 κύτταρα ήταν ένα είδος δώρο από τον Δρ Jennifer Richer (Τμήμα Παθολογίας, Πανεπιστήμιο του Κολοράντο Ντένβερ Σχολή Ιατρικής) [21]. U937, ΤΗΡ-1, Molm13 και Ανθρωπίνων ινοβλάστες ακροποσθίας (HFF) κυτταρικές σειρές ήταν ένα είδος δώρο από τον Δρ Τζέιμς Degregori (Τμήμα Βιοχημείας και Μοριακής Γενετικής, Πανεπιστήμιο του Κολοράντο Ντένβερ Σχολή Ιατρικής) [22] – [24]. κύτταρα L3.6pL ήταν ένα είδος δώρο από τον Δρ Ησαΐας J. Fidler (Τμήμα Βιολογίας του Καρκίνου, Το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Κέντρο) [25]. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2. MCF-7 και MDA-MB-231 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με υψηλή γλυκόζη, L-γλουταμίνη, πυροσταφυλικό νάτριο, 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη /αμφοτερικίνη-Β και 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). κύτταρα L3.6pL καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με L-γλουταμίνη, πυροσταφυλικό νάτριο, 5 mM μη-απαραίτητα αμινοξέα, 25 μg /mL plasmocin, 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη /αμφοτερικίνη-Β και 10% FBS. U937, Molm13, ΤΗΡ-1 και HFF κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με L-γλουταμίνη, 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη /αμφοτερικίνη-Β και 10% FBS.

Καθαρισμός των ΗΟ

Προσκολλητικά κυτταρικές σειρές (MCF-7, MDA-MB-231, L3.6pL και Hek293Fpl) που χρησιμοποιούνται για τον καθαρισμό των κυστιδίων καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 150 χιλιοστά μέχρι τα κύτταρα ήταν 70% συρρέοντα. Τα μέσα απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα πλύθηκαν με 1 Χ PBS δύο φορές. Κατάλληλα μέσα συμπληρωμένα 3% FBS εξαντλημένο των ΗΟ μέσω υπερφυγοκέντρησης προστέθηκε στα κύτταρα [26] με.

ΗΟ από 5 × 10

5 κύτταρα /mL των κυττάρων U937 καλλιεργήθηκαν σε φιάλες Τ-75 σε RPMI 1640 και 3% κύστη χωρίς FBS. Στο χρόνο συλλογή, τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις 1100 rpm και το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Το υπερκείμενο από όλα τα κύτταρα συλλέχθηκαν κάθε 48 ώρες και προστέθηκε στο υπερκείμενο αμέσως μετά τη συλλογή 4 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA) (Fisher Scientific, Pittsburgh, ΡΑ, USA). Το υπερκείμενο φυγοκεντρείται στις 8000 rpm για 10 λεπτά για την απομάκρυνση τυχόν κυτταρικών θραυσμάτων και κατόπιν διηθήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο 0,22 μm. Χρησιμοποιώντας μια 100 kDa μοριακού βάρους αποκοπής μεμβράνης φίλτρου (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA) το υπερκείμενο συγκεντρώθηκε σε ένα mL όγκο 1-2. ΗΟ από το συμπυκνωμένο δείγμα καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας μια προπαρασκευαστική Superose 6 χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους στήλης (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) εξισορροπημένη σε 1 Χ PBS, ρΗ 7,5. Συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες καθαρού ΕΕΥ μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ολικής πρωτεΐνης Bradford (BioRad, Hercules, CA, USA).

Αναγνώριση της πλήρους μήκους EMMPRIN μέσα καθαρισμένα ΕΕΥ

Τα κλάσματα κενού όγκου από η χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους συνενώθηκαν και συμπυκνώθηκαν σε 500 μΐ. 10 μg πολυκλωνικό αντίσωμα Ανθρώπου EMMPRIN Βιοτινυλιωμένο (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) EMMPRIN από κάθε δείγμα. Η ΙΡ διεξήχθη επί 2 ώρες στους 4 ° C με περιστροφή που ακολουθείται από επώαση με 40 μΙ σφαιριδίων στρεπταβιδίνης (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) για 2 ώρες στους 4 ° C με περιστροφή. ΡΝΘάσηΡ (New England Biolabs, Ipswich, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε για την απογλυκοζυλίωση του κλάσματος iPed σε ένα ένζυμο 1:10 έως δοκιμάσουν αναλογία σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. 5 μΐ 10 Χ SDS ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης προστέθηκε στο δείγμα και έβρασαν για 10 λεπτά πριν από τη φόρτωση σε ένα 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE γέλης (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA) και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε ένα Immobilon Πολυβινυλυδενο φθορίδιο (PVDF) (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA) για ανάλυση στυπώματος Western. Η μεμβράνη αποκλείστηκε σε 2% γάλα για 30 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν σε ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα EMMPRIN (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA) παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας αραίωση 1:1000 σε 2% γάλα για 1 ώρα. Μετά την πρωτογενή επώαση αντίσωμα, η μεμβράνη πλύθηκε με 1 Χ Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) για 30 λεπτά. Αντι IgG ποντικού συζευγμένο με HRP (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA) παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας μία αραίωση 1:4000, εφαρμόζεται στη μεμβράνη και επωάστηκε για 1 ώρα ακολουθούμενη από μία πρόσθετη πλύση σε 1 Χ PBS για 30 λεπτά. ανίχνευση ζώνη πρωτεΐνης εκτελέστηκε με το κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας ECL χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης Perkin Elmer (Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ, USA).

Ανάλυση Φασματομετρίας Μάζας της εκκρινόμενης ΗΟ

μετά την ΠΕ του EMMPRIN από τα δείγματα ορού, 10 μΐ δείγμα ηλεκτροφορήθηκε με χρήση 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE γέλη. ζώνες Gel για φασματομετρία μάζας έγιναν ορατά με Comassie μπλε χρωστική ουσία. Μια ζώνη στην περιοχή των 25-35 kDa αποκόπηκε από την πηκτή και κόβεται σε τετράγωνα 1 mm. Η ζώνη γέλη κατόπιν ξεπλύθηκε αρκετές φορές σε 25 mM αμμώνιο Διττανθρακικό /50% ακετονιτρίλιο διάλυμα (mM ABC /50% ACN 25) για να απομακρυνθεί η περίσσεια Comassie κυάνωση. Το δείγμα ανάγεται με 1 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT, Gold Biotechnology, St. Louis, ΜΟ, USA) για 30 λεπτά στους 70 ° C και στη συνέχεια αλκυλιώθηκε με 20 mM ιωδοακεταμίδιο (ΙΑ, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Τα δείγματα πλένονται σε διπλά αποσταγμένο νερό για 15 λεπτά ενώ η ανάμιξη (vortex), που ακολουθείται από 25 mM ABC /πλύση ACN 50% και τελικά 100% πλύση ACN. Τα δείγματα στη συνέχεια ξηραίνονται χρησιμοποιώντας ένα σύστημα κενού ταχύτητα τότε 10 μΐ 10 mg /mL θρυψίνης (Promega, Madison, WI, USA) προστέθηκε στα συγκροτήματα γέλης και πέψη αφέθηκε να προχωρήσει όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε φασματόμετρο μάζας Ultra υβρίδιο LTQ-FT (Thermo Fisher, Βρέμη, Γερμανία). αφαλάτωση πεπτιδίου και ο διαχωρισμός επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας ένα διπλό σύστημα αντλίας HPLC τριχοειδών /νανο (Agilent 1200, Palo Alto, CA, USA). Η κίνηση νανο-αντλία ήταν 60 λεπτά σε ένα ρυθμό ροής 350 ΝΙ /min. Μια κλίση 41 λεπτών με 12% ACN έως 35% ACN χρησιμοποιήθηκε για το διαχωρισμό των πεπτιδίων. Η κίνηση LC παρακολουθήθηκε με διαδοχική καταγραφή MS σαρώσεις, στο κύτταρο ICR, ενώ τρεις MS2 σαρώσεις ελήφθησαν στην παγίδα ιόντων μέσω CID. Πρώτες οινοπνευματοποιού (UCSF, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία de-isotoped, centroided λίστες κορυφή από την πρώτη φάσματα (.mgf μορφή). Οι κατάλογοι αυτοί κορυφή ερευνήθηκαν έναντι όλων των ανθρωπίνων καταχωρήσεις στη βάση δεδομένων πρωτεϊνών SwissProt με τη χρήση του server μασκότ ™ (Έκδοση 2.2, Matrix Science). Για αναζητήσεις, μάζα ανοχές ήταν +/- 10 ppm για τις κορυφές MS, και +/- 0,6 Da ιόντων θραύσματος MS /MS. Θρυψίνη ειδικότητα χρησιμοποιήθηκε επιτρέποντας 1 χαμένο διάσπαση. Οι τροποποιήσεις της οξείδωσης μεθειονίνης, πρωτεΐνης Ν-τελική ακετυλίωση και πεπτίδιο Ν-τελικό σχηματισμό πυρογλουταμικού οξέος αφέθηκαν για. Μια αναμένουμε αξία των & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

νανοσωματιδίων Παρακολούθηση Μέτρηση Ανάλυση

νανοσωματιδίων παρακολούθησης ανάλυση (ΝΤΑ) είναι μία από τις μεθόδους που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση εκκρινόμενη EVs σε ένα δεδομένο δείγμα.. Superose 6 μέγεθος χρωματογραφία αποκλεισμού κλάσματα υψηλού μοριακού βάρους αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ΝΤΑ Έκδοση 2.2 Build 0375 μέσου (NanoSight, Amesbury, Wiltshire, Ηνωμένο Βασίλειο). Τα δείγματα αναλύθηκαν σε 1:10,000 αραίωση και 1 ml του αραιωμένου δείγματος χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση.

μικροσκόπιο φθορισμού

1 × 10

6 κύτταρα /mL κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στα 1100 rpm για 5 λεπτά για να σφαιροποιηθούν τα κύτταρα. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 200 μΙ 1% φορμαλίνη (Fisher Scientific, Pittsburgh, ΡΑ, USA) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν όπως παραπάνω, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με 1 Χ PBS δύο φορές. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε 20 μΐ EMMPRIN-FITC συζευγμένο αντίσωμα (Ancell, Bayport, ΜΝ, USA) παρασκευάστηκαν σε 1:50 αραίωση και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν με 1 Χ PBS δύο φορές μετά την περίοδο επώασης. Πυρηνική χρώση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά με τη χρήση 1 μΐ /ml 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) χρώση (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA). Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με 1 Χ PBS και τοποθετήθηκαν επάνω σε πλάκες μικροσκοπίου.

Για να αξιολογηθεί η αλληλεπίδραση και ο εντοπισμός των ΗΟ με ΤΗΡ-1 κύτταρα, ΗΟ επωάστηκαν με Texas Red λεκέ για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. ΗΟ φυγοκεντρήθηκαν για 90 λεπτά σε 100.000 xg σε ρότορα TLA-55. Το υπερκείμενο αναρροφήθηκε και το σφαιρίδιο πλύθηκε σε 1 Χ PBS συνέχεια στροβιλίστηκε ξανά όπως παραπάνω 2 φορές. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 20 μΙ 1 Χ PBS. Χρωματισμένο ΗΟ συνέχεια προστέθηκαν στα κύτταρα και επωάστηκαν σε διάφορους χρόνους που κυμαίνονται από 5 λεπτά ως 24 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας ένα Nikon Eclipse Ti (Nikon Instruments Inc., Melville, ΝΥ, USA) ανεστραμμένο μικροσκόπιο με ένα αντικειμενικό 1,4 Nikon 100Χ PlanApo NA. Εικόνες συλλήφθηκαν με μια φωτογραφική μηχανή Andor ixon EMCCD 888E (Andor Technologies, South Windsor, CT, USA). ανάλυση εικόνας και ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό απεικόνισης NIS Στοιχείων (Nikon Instruments Inc., Melville, ΝΥ, USA). Όλες οι εικόνες που λαμβάνονται αποκτήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου. χρόνοι λήψης για εικόνες ήταν 80 msec, 500 msec και 300 msec για το μπλε, πράσινο και κόκκινο κανάλια, αντίστοιχα. Εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για τα στοιχεία που χρησιμοποιούν ImageJ και στη συνέχεια παράγονται με τη χρήση Corel Draw.

μετρώντας την αλλαγή EMMPRIN Έκφραση Μετά Κύστη διέγερση

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των ΤΗΡ-1 κύτταρα βάφονται με EMMPRIN-FITC συζευγμένο αντίσωμα πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί αν υπάρχουν τυχόν αλλαγές στο επίπεδο της έκφρασης EMMPRIN επιφάνεια των κυττάρων κατά την κατεργασία με ΕΕΥ. EMMPRIN μέση ένταση φθορισμού (MFI) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το Beckman Coulter ΟβΙΙ Lab Quanta SC κυτταρομετρητή ροής για τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, κύτταρα κατεργασμένα με 1 Χ PBS (ρυθμιστικό επεξεργασμένων κυττάρων) και EV επεξεργασμένα κύτταρα. Όλες οι μετρήσεις πάρθηκαν 24 ώρες μετά την διέγερση και διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το σύνολο του πληθυσμού των κυττάρων, δηλαδή 1 × 10

6 κύτταρα /mL διεγείρονται για 24 ώρες.

μέτρηση της αλλαγής στην EMMPRIN Έκκριση Κατά κυστιδίων Διέγερση

το υπερκείμενο από τον έλεγχο, ρυθμιστικό αντιμετωπίζονται και EV κατεργασμένα δείγματα συλλέχθηκαν για να προσδιοριστεί αν υπάρχουν οποιεσδήποτε αλλαγές στο ποσό των εκκρίνεται EMMPRIN κατά τη διέγερση. 100 μΙ του υπερκειμένου απογλυκοζυλιωμένη όπως περιγράφηκε νωρίτερα, και οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με χρήση ηλεκτροφόρησης SDS-PAGE. έκκριση EMMPRIN μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση στυπώματος Western όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

Δοκιμασίες Δραστηριότητας

Η έκκριση της MMP-9 και IL-6 μετρήθηκε σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας Ενζυμική Δοκιμασία ανοσοαπορρόφησης (ELISA) ανίχνευση κιτ (ELISA Tech, Aurora, CO, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Για κύτταρα σε εναιώρημα, 5 × 10

5 κύτταρα /ml χρησιμοποιήθηκαν ανά 0,5 ml μέσου σε μια 12 φρεατίων πλάκα. Για προσκολλημένα κύτταρα, διεγέρσεις διεξήχθησαν σε πλάκες 12 φρεατίων με κύτταρα σε 70-80% συρροή. Όλες οι δοκιμασίες δραστικότητας διεξήχθησαν εις μέσο ελεύθερο ορού. Το υπερκείμενο από τα διεγερμένα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 24 ώρες μετά τη διέγερση και αποθηκεύονται στο -20 ° C μέχρι να χρειαστούν. 100 μΙ του υπερκειμένου που εφαρμόζεται στην πλάκα ELISA. TGF-β1 εκκρίνεται στη λανθάνουσα μορφή, ως εκ τούτου, τα δείγματα οξινίστηκε σε ρΗ 2 χρησιμοποιώντας 1 Μ υδροχλωρικό οξύ (Fisher Scientific, Pittsburgh, ΡΑ, USA) και επωάστηκαν για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου για να παραχθεί το ανοσοαντιδραστικό μορφή του ΤΟΡ-β1 . Τα δείγματα στη συνέχεια εξουδετερώθηκε με 1 Μ υδροξείδιο του νατρίου (Fisher Scientific, Pittsburgh, ΡΑ, USA). 100 μΙ του ενεργοποιημένου δείγματος εφαρμόσθηκε στην πλάκα ELISA. Οι μετρήσεις διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (ELISA Tech, Aurora, CO, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Αποτελέσματα

Full Length EMMPRIN Εξυπηρετεί ως Γενικός δείκτης της ΕΕΥ εκκρίνεται σε Βιολογικά υγρά, καθώς και από καλλιεργημένα κύτταρα

Η παρουσία εξωκυτταρικής μορφής EMMPRIN (ες) για πρώτη φορά αξιολογήθηκε σε διάφορους τύπους βιολογικών υγρών συμπεριλαμβανομένων των ανθρωπίνων ορούς, πλάσμα, και υγρό ασκίτη να καθοριστεί αν EMMPRIN μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως γενικός δείκτης για την παρουσία της ΕΕΥ, όπως έχει πρόσφατα προταθεί [16]. Τα δείγματα διηθήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο 0,22 μm για να απομακρυνθούν οποιαδήποτε κύτταρα ή κυτταρικά θραύσματα και ανοσοκατακρημνίσθηκαν (iPed) χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα EMMPRIN. Μετά την απογλυκοζυλίωση, η μορφή πλήρους μήκους της πρωτεΐνης (28 kDa) ανιχνεύθηκε σε ανθρώπινους ορούς και πλάσμα τόσο από υγιείς δότες και ασθενείς με καρκίνο καθώς και στο υγρό ασκίτη συλλέγεται από ασθενείς με καρκίνο χωρίς καμία παρατηρήσιμη επίπεδα τυχόν διασπασμένου μορφές εντός των εν λόγω βιολογικών υγρά (βλέπε Εικ. S1 Α και το Σχ. S1B για ανθρώπινους ορούς και υγρό ασκίτη, αντίστοιχα). Ανάλυση μάζης φασματομετρίας προϊόντων πέψης θρυπτικού χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί χωρίς αμφιβολία ότι EMMPRIN είναι στο δείγμα ορού iPed, Σχ. S1c. Αρκετά πεπτίδια χαρτογράφηση στον εξωτερικό τομέα της EMMPRIN ανιχνεύθηκαν και χρησιμοποιείται για να επιβεβαιώσει την παρουσία εξωκυτταρικών EMMPRIN εντός των δειγμάτων ορού, Σχ. S1c. Η παρουσία ενός πλήρους μήκους διαμεμβρανική πρωτεΐνη όπως EMMPRIN προσδιορίζονται εδώ είναι σύμφωνη με μια γενική έκκριση διαμεμβρανικών πρωτεϊνών μέσω ΗΟ σε όλα τα βιολογικά υγρά, αλλά αυτό περαιτέρω παρουσιάζεται στο ό, τι ακολουθεί.

Προκειμένου να εξασφαλίζεται ένα συνεκτικό και αξιόπιστη πηγή των ΕΕΥ για τις επόμενες αναλύσεις για να εξετάσουν άμεσα διεγερτική τους ρόλους τους, ΕΕΥ καθαρίστηκαν από διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές θηλαστικών. EMMPRIN ανιχνεύθηκε για να προσδιοριστεί αν αυτή η διαμεμβρανική πρωτεΐνη θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως γενικός δείκτης των ΗΟ για όλες αυτές τις κυτταρικές γραμμές ανάλογη με ΗΟ καθαρίζεται από βιολογικά υγρά όπως παραπάνω. Δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού, MCF-7 και MDA-MB-231, χρησιμοποιήθηκαν και ΗΟ καθαρίστηκαν από αυτές τις κυτταρικές σειρές που υποδηλώνεται ως EV

MCF-7 και EV

MDA, αντίστοιχα. Επιπλέον, τόσο η κυτταρική γραμμή μονοκυτταρικής λευχαιμίας, U937, και ένα παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική γραμμή, L3.6pL, χρησιμοποιήθηκαν με ΗΟ που προέρχονται από αυτές τις κυτταρικές σειρές που υποδηλώνεται ως EV

937 και EV

L3.6pL, αντίστοιχα. Τα υπερκείμενα από κύτταρα που καλλιεργήθηκαν στα κατάλληλα μέσα συμπληρωμένα με αντιβιοτικά και 3% EV δωρεάν FBS συλλέχθηκαν κάθε 48 ώρες.

Από τις προηγούμενες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον καθαρισμό εκκρινόμενη ΕΕΥ, επιλέξαμε να χρησιμοποιήσει χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους [27] . Συγκεκριμένα, Superose 6 μέγεθος χρωματογραφία αποκλεισμού χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή για τα μεγάλα κλάσματα μοριακού βάρους, το Σχ. 1Α (κόκκινο πλαίσιο). EMMPRIN ανιχνεύθηκε στο κλάσμα EV συλλέγονται από όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν εδώ, το Σχ. 1Β, υποδεικνύοντας ότι η έκκριση EMMPRIN είναι μια διαδικασία ευρέως συμβαίνουν.

Α) αποκλεισμού μεγέθους χρωματογραφία προφίλ έκλουσης του καθαρισμού ρυθμισμένων μέσων για την απομόνωση ΕΕΥ. Το κόκκινο κουτί αντιστοιχεί στην κορυφή έκλουσης για το καθαρισμένο ΕΕΥ. Β) EMMPRIN εκκρίνεται μέσω ΗΟ σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν όπως φαίνεται από την κηλίδα Western ανιχνεύτηκαν για EMMPRIN στα κλάσματα κυστιδίων καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους. Γ) νανοσωματιδίων ανάλυση Παρακολούθηση ανιχνεύει ΕΕΥ στο καθαρισμένο δείγμα και επικυρώνει τη μέθοδο αποκλεισμού μεγέθους μας για να καθαρίσει ΕΕΥ από ρυθμισμένα μέσα. Δ) Ηλεκτρονική μικροσκοπία χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει τις εκκρινόμενες ΕΕΥ. Τα δεδομένα που παρατίθενται είναι για EV

MDA.

Η

Έτσι, οι μελέτες μας δείχνουν εδώ ότι η εξωκυττάρια, σε όλο το μήκος EMMPRIN έκκριση μέσω ΕΕΥ είναι μια ευρέως εμφανιζόμενο φαινόμενο και όχι μιας συγκεκριμένης διαδικασίας τύπο κυττάρων και EMMPRIN μπορεί να είναι χρησιμοποιείται ως γενικός δείκτης για την παρουσία της ΕΕΥ.

Επιβεβαίωση και επικύρωση των καθαρισμένα ΕΕΥ χρήση νανοσωματιδίων Tracking Analysis, Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας και Φασματομετρίας μάζας

Εμείς χρησιμοποιούνται διάφορες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται συνήθως για την ανίχνευση EV και οπτικοποίηση να επικυρώσει περαιτέρω μέθοδος μας καθαρισμού EV πέρα ​​επιβεβαίωσε την παρουσία μας EMMPRIN ως γενικός δείκτης EV (Εικ. 1Α, Β). Συγκεκριμένα, νανοσωματιδίων ανάλυση εντοπισμού (ΝΤΑ) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της κατανομής μεγέθους των ΗΟ σε δείγματα. Με βάση την κατανομή μεγέθους των ΗΟ ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας ΝΤΑ (Εικ. 1C), μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη εκκρίνουν μια ετερογενή πληθυσμό ΗΟ κυμαίνονται σε μέγεθος από 20-300 nm. Η περιοχή μεγέθους δείχνει ότι αυτά τα μικρότερα κυστίδια να περιλαμβάνουν τα ΗΟ, γνωστή ως εξωσώματα (10-100 nm), και τα μεγαλύτερα ΗΟ γνωστή ως μικροκυστίδια (100-1000 nm). Σημειώστε ότι περαιτέρω σακχαρόζη κλασματοποίηση κλίσης και επακόλουθη ανάλυση Western blot προσδιορίζονται EMMPRIN στους δύο πληθυσμούς EV (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι EMMPRIN είναι ένας γενικός δείκτης για τους δύο τύπους των ΗΟ. Ηλεκτρονική μικροσκοπία (ΕΜ) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση των ΕΕΥ που εκκρίνεται από διάφορες κυτταρικές σειρές, όπως φαίνεται για καθαρισμένο EV

MDA (Εικ. 1D). Τα δεδομένα EM έδειξαν επίσης ετερογένεια στο μέγεθος των κυστιδίων, όπως προσδιορίστηκε με ΝΤΑ. Ανάλυση μάζης φασματομετρίας απέδωσε επίσης ταυτοποίηση αρκετών άλλων δεικτών EV όπως CD63, CD81 και αννεξίνης V, όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, με τον τρόπο αυτό την επικύρωση περαιτέρω τη μέθοδο καθαρισμού που χρησιμοποιείται εδώ. Έτσι, δίνεται η κατανομή του μεγέθους ανιχνεύεται με ΝΤΑ και EM και την ταυτοποίηση των συγκεκριμένων πρωτεϊνών EV, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η μέθοδος καθαρισμού μας αποδίδει ένα μίγμα εξωσωμάτων και μικροκυστιδίων.

Η

ΕΕΥ εσωτερικοποιείται ταχύτατα στα κύτταρα Παραλήπτη

ρύθμιση EV της λειτουργίας δέκτη κυττάρων έχει προταθεί να είναι τουλάχιστον εν μέρει εξαρτάται από την αρχική πρόσληψη και τη μεταφορά του φορτίου τους (βλέπε ανασκόπηση από Lopez-Verrilli [28]). Σε συμφωνία με μια τέτοια προτεινόμενο μηχανισμό, βρήκαμε ότι τα καθαρισμένα ΕΕΥ εσωτερικεύεται μέσα σε λίγα λεπτά από τα κύτταρα μονοκυτταρικής λευχαιμίας ΤΗΡ-1 (Εικ. 2) και μονοκύτταρα λευχαιμίας U937 (Εικ. S4) επιβεβαιώνοντας έτσι την βιολογική δραστικότητα του καθαρισμένου ΕΕΥ μας. Συγκεκριμένα, οπτικοποιούνται την εσωτερίκευση του Texas Red βάφονται ΗΟ ως διακριτές puncti σε κύτταρα χρωματίζονται με ένα αντίσωμα EMMPRIN-FITC που επέτρεψε για οπτικοποίηση της κυτταρικής μεμβράνης (Σχ. 2, δεξιά). Ετσι, σε αυτά τα πειράματα χρησιμοποιήσαμε το γεγονός ότι EMMPRIN αρχικά υψηλά εκφράζεται στην επιφάνεια κυττάρου δέκτη ως δείκτης για την κυτταρική μεμβράνη. Ενιαία εικόνες από μέσα από τον όγκο των κυττάρων Z-στοίβες συλλέχθηκαν για να επιβεβαιώσει ότι οι ΕΕΥ πράγματι εσωτερικεύονται και όχι απλώς εντοπίζεται στην επιφάνεια των κυττάρων. Εμείς ποσοτικά, επίσης, το ποσοστό των κυττάρων που εσωτερικεύσει τα EVs μετρώντας τη συχνότητα των EV θετικών κυττάρων. Δεδομένα κατά μέσο όρο από τρεις ανεξάρτητες μετρήσεις δείχνουν ότι κυστίδιο εσωτερίκευση συμβαίνει στο 76% των κυττάρων. Έτσι, φλύκταινα εσωτερικοποίηση δεν είναι ένα σπάνιο περιστατικό, αλλά μια συχνή εκδήλωση. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν επίσης εντοπισμός του Texas Red βάφονται ΕΕΥ επί της κυτταρικής μεμβράνης, γεγονός που δείχνει ότι τα ΗΟ είναι πιθανό ενσωματώνεται ή συγγενούς με την κυτταρική μεμβράνη καθώς και να εσωτερικεύεται.

εικόνες μικροσκοπία φθορισμού των ΤΗΡ-1 κύτταρα επεξεργασμένα με Texas κόκκινο χρωματισμένο ΕΕΥ. Αριστερό πλαίσιο – ΤΗΡ-1 κυττάρων βάφονται με EMMPRIN FITC και DAPI. Το κόκκινο σήμα είναι το σήμα αυτόματης φθορισμού του κυττάρου. Μεσαίο πάνελ – ΤΗΡ-1 κυττάρων που έλαβαν μόνο το Texas Red λεκέ. Το σήμα που παρατηρείται είναι η ίδια όπως και στην αριστερή εικόνα και αντιστοιχεί στο Τέξας κόκκινο φόντο και το σήμα κυτταρικής αυτόματη φθορισμού. Δικαίωμα πάνελ – THP-1 κύτταρα επεξεργασμένα με Texas Red βάφονται ΕΕΥ και οπτικοποιούνται μετά από μια περίοδο επώασης 5 λεπτών με τα πόδια. Η κυτταρική μεμβράνη χρωματίζεται με EMMPRIN-FITC αντίσωμα, οι ΕΕΥ φαίνεται στο κόκκινο και το DAPI χρώση πυρήνα εμφανίζεται με μπλε χρώμα. Το μπαρ αναφοράς είναι 10 μm.

Η

ΕΕΥ διεγείρει την έκκριση της Αρκετοί καρκίνο που σχετίζεται Παράγοντες

δοκιμασίες αρχική δραστηριότητα.

Θα προβληθεί αρχικά αρκετές παραλήπτη κυτταρικές σειρές για να καθορίσουν η οποία, αν υπάρχουν, καλλιεργημένα κύτταρα ανταποκρίνονται σε καθαρισμένο μας EV

MCF και EV

MDA. Συγκεκριμένα, ΜΜΡ-9 και IL-6 έκκρισης (Εικ. S2 και το Σχ. S3, αντίστοιχα) παρακολουθήθηκε κατά τη διέγερση με EV

MCF-7 και EV

MDA χρησιμοποιώντας ένζυμο συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA), αφού και οι δύο αυτών των πρωτεϊνών είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω σε πολλαπλές καρκίνους μαζί με το δείκτη EMMPRIN των ΗΟ [29], [30]. Σε γενικές γραμμές, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι υπάρχει προτιμησιακή εκλεκτικότητα στον τύπο κυττάρου προκαλεί μία απόκριση κατά EV διέγερση. Για παράδειγμα, τα μονοπύρηνα υ937 ήταν ανταποκρίνονται περισσότερο στην έκκριση τόσο της IL-6 και ΜΜΡ-9 κατά τη διέγερση με ΗΟ σε σύγκριση με τα επιθηλιακά κύτταρα. Κάναμε παρατηρούμε μια αύξηση στην έκκριση IL-6 τόσο HFF και κυττάρων ΜΒΑ-ΜΒ-231 κατά τη διέγερση με EV

MDA, ωστόσο, ούτε η έκκριση της IL-6 ή ΜΜΡ-9 διεγέρθηκε με EV

MCF- 7. Έτσι, δεδομένου ότι τα κύτταρα U937 προκάλεσε την πιο αξιοσημείωτη ανταπόκριση μετά από διέγερση με τους δύο τύπους της ΕΕΥ που χρησιμοποιούνται σε αυτές τις αρχικές δοκιμασίες ELISA, επικεντρωθήκαμε σε μονοκύτταρα, ΤΗΡ-1 και 937, στις επόμενες δοκιμασίες δραστηριότητας.

καθαρισμένα ΕΕΥ τόνωση η έκκριση της EMMPRIN υποδηλώνουν μια θετική βρόχος ανάδρασης.

από προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι EMMPRIN έχει εμπλακεί σε μια θετική ανάδραση σε ορισμένες κυτταρικές σειρές [31], έχουμε δίπλα ήθελε να εκτιμηθεί η επίδραση των ΕΕΥ για EMMPRIN έκφραση κυτταρικής επιφάνειας και έκκριση σε μονοκύτταρα. κύτταρα ΤΗΡ-1 διεγέρθηκαν με 10 μg ολικής πρωτεΐνης για κάθε τύπο κυστιδίων, δηλαδή EV

MCF-7 και EV

MDA, και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ.