Αφηρημένο

Δυσλειτουργία του Sonic hedgehog (Shh) μονοπατιού σηματοδότησης έχει συσχετιστεί με τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων (CSC) και εμπλέκεται στην έναρξη του καρκίνου του παγκρέατος. Τα παγκρεατικά ΚΕΠ είναι σπάνιες καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από την ικανότητά τους να αυτο-ανανέωση, και είναι υπεύθυνα για την υποτροπή του όγκου συνοδεύεται από αντίσταση σε τρέχουσες θεραπείες. Η θνησιμότητα από αυτές τις ανίατες, επιθετική και επεμβατική όγκους του παγκρέατος παραμένει ένας αποθαρρυντικός κλινική πρόκληση. Έτσι, ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος της Shh οδού σε καρκίνο του παγκρέατος και να εξετάσει τους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους η σουλφοραφάνη (SFN), μία δραστική ένωση σε σταυρανθή λαχανικά, αναστέλλει την ικανότητα αυτο-ανανέωσης των ανθρώπινων παγκρεατικών ΚΕΠ. Είναι ενδιαφέρον, αποδεικνύουμε εδώ ότι η Shh οδός είναι ιδιαίτερα ενεργοποιείται σε παγκρεατικά ΚΕΠ και παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση βλαστική ικανότητα με τη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων βλαστική ικανότητα. Με δεδομένη την απαίτηση για Hedgehog στον καρκίνο του παγκρέατος, ερευνήσαμε αν αποκλεισμό σκαντζόχοιρος από SFN θα μπορούσε να στοχεύσει τον πληθυσμό των βλαστικών κυττάρων στον καρκίνο του παγκρέατος. Σε μια

in vitro

μοντέλο, τα ανθρώπινα παγκρέατος ΚΕΠ προέρχεται σφαίρες ήταν σημαντικά ανέστειλε τη θεραπεία με SFN, γεγονός που υποδηλώνει την κλωνογόνο εξάντληση του ΚΕΠ. Είναι ενδιαφέρον, SFN ανέστειλε τις συνιστώσες της Shh οδού και τη δραστηριότητα μεταγραφικής Gli. Παρεμβολή της Shh-Gli σηματοδότηση μπλοκαριστεί σημαντικά SFN επαγόμενη ανασταλτικά αποτελέσματα αποδεικνύουν την απαίτηση ενός ενεργού οδού για την ανάπτυξη των παγκρεατικών ΚΕΠ. SFN ανέστειλε επίσης κατάντη στόχοι του Gli μεταγραφής καταστέλλοντας την έκφραση του πλειοδυναμίας διατήρηση παραγόντων (Nanog και Oct-4), καθώς και PDGFRα και Κυκλίνη D1. Επιπλέον, SFN επήγαγε απόπτωση μέσω αναστολής της BCL-2 και την ενεργοποίηση των κασπασών. Τα στοιχεία μας αποκαλύπτουν τον ουσιαστικό ρόλο της Shh-Gli σηματοδότηση στον έλεγχο των χαρακτηριστικών του παγκρέατος ΚΕΠ. Προτείνουμε ότι ο καρκίνος του παγκρέατος προληπτικά αποτελέσματα του SFN μπορεί να προκύψει από την αναστολή της οδού της Shh. Έτσι σουλφοραφάνη αντιπροσωπεύει δυνητικά μια φθηνή, ασφαλή και αποτελεσματική εναλλακτική λύση για την αντιμετώπιση του καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Rodova Μ, Fu J, Watkins DN, Srivastava RK, Shankar S (2012) Sonic Hedgehog Σηματοδοσίας Αναστολή παρέχει ευκαιρίες για στοχευμένη θεραπεία με σουλφοραφάνη στη ρύθμιση καρκίνο του παγκρέατος Stem Cell αυτο-ανανέωση. PLoS ONE 7 (9): e46083. doi: 10.1371 /journal.pone.0046083

Επιμέλεια: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 10, 2012? Αποδεκτές: 27 Αυγ 2012? Δημοσιεύθηκε: 28, Σεπτεμβρίου 2012

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:.. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα .

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος (PC) έχει μια από τις πιο φτωχές προγνώσεις μεταξύ όλων των καρκίνων και το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών 3% [1], [2], [3]. Δυστυχώς, στις περισσότερες περιπτώσεις καρκίνου του παγκρέατος δεν είναι χειρουργήσιμη κατά τη στιγμή της διάγνωσης. Υπάρχουν περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές διαθέσιμες για αυτήν την ασθένεια, επειδή χημειοθεραπεία και ράδιο-θεραπείες είναι σε μεγάλο βαθμό αναποτελεσματική, και μεταστατική νόσο συχνά redevelops ακόμα και μετά την επέμβαση [4]. Ως εκ τούτου, είναι επιτακτική η ανάγκη να ανακαλύψουν νέες και αποτελεσματικές χημειοπροληπτικές προσεγγίσεις για τον καρκίνο του παγκρέατος.

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα /καρκινικά κύτταρα έναρξη (ΤΠΕ στο ολιγοθέσιο σχολείο) έχουν προταθεί για να είναι η αιτία για την έναρξη του καρκίνου, την εξέλιξη και την αποτυχία χημειοθεραπείας σε διάφορες ανθρώπινες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος [5], [6], [7]. Η υπόθεση CSC υποδηλώνει ότι μόνο το διαμέρισμα αρχέγονων κυττάρων σε όγκους είναι ικανό απεριόριστης αυτοανανέωσης και ότι η εξάλειψη αυτών των κυττάρων θα σταματήσει τελικά νεοπλασματικών επέκτασης, ως καλύτερα διαφοροποιημένα κύτταρα έχουν περιορισμένη μιτογόνο ικανότητα και δεν θα συμβάλει στην μακροπρόθεσμη αύξηση του όγκου . Ως εκ τούτου, είναι επιτακτική ανάγκη να σχεδιάσει νέες στρατηγικές βασισμένες σε μια καλύτερη κατανόηση των οδών σηματοδότησης που ελέγχουν πλευρές της αυτο-ανανέωσης και επιβίωσης σε ΚΕΠ, προκειμένου για την ταυτοποίηση νέων θεραπευτικών στόχων σε αυτά τα κύτταρα. Έτσι, η ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών που στοχεύουν ειδικά του παγκρέατος ΚΕΠ μπορεί να είναι αποτελεσματική στην εξάλειψη όγκων και στη μείωση του κινδύνου της υποτροπής και της μετάστασης.

Προς τα πάνω ρύθμιση sonic hedgehog οδού έχουν αποδειχθεί σε ΚΕΠ, τα οποία εξέλιξης επίδραση του όγκου συμπεριλαμβανομένης της μετανάστευσης , εισβολή και μετάσταση. Ακατάλληλη δραστικότητα του μονοπατιού σηματοδότησης Hh έχει επίσης συνδεθεί με τους τύπους όγκων που προκύπτουν σποραδικά ή σε άτομα με γενετική προδιάθεση [8], [9]. Η οδός Shh είναι ένα πρώιμο και όψιμο μεσολαβητής της ογκογένεσης σε επιθηλιακούς καρκίνους. Η ενεργοποίηση της Shh σηματοδότηση φαίνεται να προηγείται μεταμόρφωση του παγκρεατικού ιστού του στελέχους κυττάρων σε παγκρεατικά τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα, με παράγοντα μεταγραφής Gli λειτουργεί ως μεσολαβητής της περιβαλλοντικά σήματα και στην εξέλιξη της παγκρεατικής ΚΕΠ σε μεταστατικά κύτταρα όγκου. σηματοδότηση Shh έχει ξεκινήσει με τη δέσμευση της εκκρίνονται πεπτιδίου Shh με την διαμεμβρανική πρωτεΐνη 12- διάρκεια ΡαίοΗβά (Ptch), με αποτέλεσμα την απώλεια της δραστηριότητας Ptch και την επακόλουθη φωσφορυλίωση και μετα-μεταγραφική σταθεροποίηση της 7ης ζωής διαμεμβρανική πρωτεΐνη λειαίνονται (ΠΕΑ), ένα μέλος της σερπαντίνας υποδοχείς [10], [11]. Ως αποτέλεσμα, η έκφραση των γονιδίων στόχων Hh αρχικοποιείται μέσω μετα-μεταφραστική ενεργοποίηση της οικογένειας Gli παραγόντων μεταγραφής δακτύλου ψευδαργύρου [12]. Η οικογένεια Gli είναι ένα από τα γονιδίου στόχου επάγεται με συνέπεια κάθε φορά που η οδός Shh είναι ενεργοποιημένο, καθιστώντας αυτό το μεταγράφημα ένα αξιόπιστο δείκτη τόσο φυσιολογικών και παθολογικών δραστηριότητα σηματοδότηση Shh. Η ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης Shh εμπλέκεται στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των παγκρεατικών ΚΕΠ. Έτσι, με τη στόχευση οδούς σηματοδότησης που ενεργοποιούνται ανωμάλως και των σημαντικών για τη διατήρηση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών αγωγών για τον καρκίνο του παγκρέατος, με την κατάργηση του παγκρέατος ΚΕΠ του καρκίνου [13], [14].

Επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του παγκρέατος σχετίζονται με τον καπνό, η παχυσαρκία και η υψηλή κατανάλωση λίπους, ψάρι, χοιρινό ή βοδινό, και ότι μειώθηκαν οι κίνδυνοι που συνδέονται με την κατανάλωση σταυρανθή λαχανικά. Μια σημαντική ομάδα παραγόντων που έχουν αυτή την ιδιότητα είναι οι ενώσεις organosulfur όπως ισοθειοκυανικά (ΔΕΕ), πλούσια σε σταυρανθή λαχανικά, για τα οποία η κατανάλωση έχει επιδημιολογικά δείξει μια σύνδεση αντίστροφο με καρκίνο του παγκρέατος. έχουν ΔΕΕ έχει αποδειχθεί ότι εμφανίζουν αρκετά δυνητικά χημειοπροστατευτικής δραστηριότητες σε κυτταρικά και ζωικά μοντέλα [15], [16], [17], [18]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η στοματική χορήγηση της σουλφοραφάνης ανέστειλε την ανάπτυξη των PC-3 κύτταρα ορθοτοπικά εμφυτεύονται στον προστάτη γυμνών ποντικών με επαγωγή απόπτωσης και αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου, μετάσταση και την αγγειογένεση [19]. Έχουμε επίσης καταδείξει πρόσφατα ότι SFN μόνο και σε συνδυασμό με κερκετίνη αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος βλαστικών κυττάρων που προέρχονται από καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές

in vitro

μέσω της ρύθμισης των πρωτεϊνών FOXO [20]. Έτσι, SFN υπόσχεται πολλά για την ανάπτυξη ως chemopreventive /θεραπευτικό παράγοντα. Παρά αυτές τις εύρημα, δεν υπάρχουν μελέτες που αποδεικνύουν τη ρύθμιση του παγκρέατος ΚΕΠ από SFN, και αν SFN μπορούν να αναστείλουν Σσσς οδού.

Έτσι, ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει το ρόλο του Sonic οδού σκαντζόχοιρος σε παγκρεατικά του καρκίνου και για την εξέταση των μοριακών μηχανισμών με τους οποίους η σουλφοραφάνη (SFN), μία δραστική ένωση σε σταυρανθή λαχανικά, αναστέλλει την ικανότητα αυτο-ανανέωσης των παγκρεατικών ΚΕΠ. Η υπογραμμισμένη μοριακός μηχανισμός που εμφανίζουν αυτό το φαινόμενο ήταν μέσω της αναστολής του Sonic μονοπατιού σηματοδότησης hedgehog στο επίπεδο του Gli μεταγραφής, πολλαπλασιασμού, τα βλαστικά χαρακτηριστικά των κυττάρων και η επαγωγή της απόπτωσης. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι SFN μπορεί να είναι ένας ευεργετικός παράγοντας για την πρόληψη και θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος. Οι εν λόγω πληροφορίες θα επιτρέψουν όχι μόνο ορθολογικό σχεδιασμό των στρατηγικών SFN-βάση για την πρόληψη ή /και θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος, αλλά θα μπορούσε επίσης να διευκολύνει την ανάπτυξη των πρωτοκόλλων μηχανισμού με γνώμονα τη βέλτιστη κλινικά αποτελέσματα.

Αποτελέσματα

Έκφραση των Sonic hedgehog γονιδίων οδό σηματοδότησης σε παγκρεατικά ΚΕΠ

το hedgehog (Hh) οδού σηματοδότησης είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των ιστών και των οργάνων [8]. Ωστόσο, ανώμαλη ενεργοποίηση του Ηχητικού ακανθόχοιρου (Shh) μονοπατιού σηματοδότησης παίζει σημαντικούς ρόλους στην ογκογένεση και την εξέλιξη πολλών όγκων [8], [9]. Για να αξιολογηθεί η πιθανότητα ότι η σηματοδότηση Hh είναι ενεργή σε ανθρώπινα παγκρεατικά ΚΕΠ συγκρίναμε την έκφραση mRNA των διαφόρων συνιστωσών της οδού Shh σε ανθρώπινα παγκρεατικά CSC (PanCSC) στην ανθρώπινη παγκρεατική κανονική πόρου επιθηλιακά κύτταρα (HPNE) και ανθρώπινη φυσιολογική παγκρεατικά βλαστοκύτταρα ( HNPSC), σε μια

in vitro

μοντέλο κυτταρικής καλλιέργειας και ως ποσοτικά με qRT-PCR. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1.Α-C, παρατηρήσαμε μια ισχυρή έκφραση των βασικών συστατικών του μονοπατιού Shh-Gli σε παγκρεατικά CSC, σε σύγκριση με την κανονική αντίθετα μέρη τους. Η έκφραση της πρωτεΐνης από αυτά τα συστατικά επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με κηλίδωση Western όπως φαίνεται στο Σχ. 1.Δ. Είναι ενδιαφέρον, αποδεικνύουμε εδώ ότι Sonic hedgehog οδού είναι ιδιαίτερα ενεργοποιείται σε παγκρεατικά ΚΕΠ υποδηλώνοντας ότι η υπερδραστήρια σηματοδότηση Shh-Gli μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων βλαστική ικανότητα σε παγκρεατικά ΚΕΠ και παίζουν ένα ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την εξέλιξη των παγκρεατικών ΚΕΠ.

(Α-C), σχετική έκφραση διαφόρων συνιστωσών της Shh οδού ποσοτικοποιήθηκε σε ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα (PanCSC), ανθρώπινα παγκρεατικά φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων (HNPSC) και ανθρώπινη παγκρεατική κανονική πόρου επιθηλιακά κύτταρα (HPNE). Η έκφραση των γονιδίων Shh ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας ποσοτικό προσδιορισμό σε πραγματικό χρόνο ανάστροφης μεταγραφάσης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (q-RT-PCR), και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση GAPDH. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και υπολογίστηκαν με βάση ΔΔ

C

t μέθοδο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. %, Και $ = σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0.05. (D), Ανοσοκηλίδωση των Gli1 /2, Smo και β-ακτίνη της ανθρώπινης καρκίνου του παγκρέατος βλαστικά κύτταρα (PanCSC), ανθρώπινα παγκρεατικά φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων (HNPSC) και ανθρώπινη παγκρεατική κανονική πόρου επιθηλιακά κύτταρα (HPNE).

Η

η σουλφοραφάνη αναστέλλει σκαντζόχοιρος σηματοδοτικό μονοπάτι σε παγκρεατικά ΚΕΠ

in vitro

η

για το λόγο αυτό ζήτησε να εξετάσει τα αποτελέσματα της SFN στην έκφραση του υποδοχέα της Shh (Smothened) και τελεστές (Gli1 και Gli2) από qRT-PCR σε ανθρώπινο παγκρεατικό ΚΕΠ. Όπως φαίνεται στο (Σχ. 2.Α-C), SFN ανέστειλε την έκφραση του ΠΕΑ, Gli1 και Gli2. Δεδομένου ότι έχουμε δείξει προηγουμένως την ενεργοποίηση Shh μονοπατιού σε μια ομάδα ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών παγκρεατικού [21], επιδιώξαμε επίσης να εξεταστούν οι επιδράσεις της SFN για την έκφραση του υποδοχέα Shh (Smothened) και τελεστές (Gli1 και Gli2) με qRT-PCR σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ASPC και PANC-1. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, SFN ανέστειλε την έκφραση του ΠΕΑ, Gli1 και Gli2 σε αυτές τις κυτταρικές σειρές, καθώς, γεγονός που υποδηλώνει ότι SFN μπορούν να αναστείλουν την ενεργοποίηση της Shh σηματοδότησης σε καρκίνο του παγκρέατος.

(Α-Γ), η αναστολή των συστατικών του Sonic σκαντζόχοιρος μονοπάτι. Παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σουλφοραφάνη (0-20 μΜ) για 24 ώρες. Η έκφραση του Gli1, Gli2 και Smo μετρήθηκε με qRT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση GAPDH. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και υπολογίστηκαν με βάση ΔΔ

C

t μέθοδο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. *, @, Και $ = σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0,05? (D), Ανοσοκηλίδωση των Gli1 /2, Smo και β-ακτίνη της ανθρώπινης καρκίνου του παγκρέατος βλαστικά κύτταρα (PanCSC) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σουλφοραφάνη (0-20 μΜ).

Η

(Α-Β), η αναστολή των συστατικών της ηχητικής οδού hedgehog. ASPC1 και PANC1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σουλφοραφάνη (0-20 μΜ) για 24 ώρες. Η έκφραση του Gli1, Gli2 και Smo μετρήθηκε με qRT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση GAPDH. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και υπολογίστηκαν με βάση ΔΔ

C

t μέθοδο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. $, @, Και & amp? = Σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0.05.

Η

Περαιτέρω, δεδομένου ότι η παρουσία των πυρηνικών Gli έκφρασης είναι ενδεικτική της ενεργού σηματοδότησης Hh, εξετάσαμε τις επιδράσεις της SFN για την πυρηνική μετατόπιση παραγόντων μεταγραφής Gli χρησιμοποιώντας ανοσοκυτταροχημεία (ICC). Παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με SFN (0-20 μΜ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με αντι-Gli και αντίσωμα Gli2 (πράσινο φθορισμό) και DAPI (κόκκινος φθορισμός). συγχωνεύονται εικόνες εμφανίζονται, τα οποία δείχνουν χρώση κίτρινο-πορτοκαλί του Gli 1 και Gli2 βρίσκεται στο οφείλονται για τη συγχώνευση του πράσινου και κόκκινου φθορισμού πυρήνα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, SFN ανέστειλε την πυρηνική μετατόπιση του Gli1 και Gli2, όπως μετράται με ICC. Αυτά τα δεδομένα επομένως υποδεικνύουν ότι SFN αναστέλλει Sonic hedgehog οδού στο επίπεδο της ενεργοποίησης Gli.

(α), η πυρηνική μετατόπιση του Gli1 και Gli2, μετρήθηκε με ανοσοκυτταροχημεία. Παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σουλφοραφάνη (0-20 μΜ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με αντι-Gli και αντίσωμα Gli2 (πράσινο φθορισμό) και DAPI (κόκκινος φθορισμός). Συγχωνευθείσας εικόνες φαίνονται, που δείχνουν κίτρινο-πορτοκαλί χρώση Gli 1 και Gli2 βρίσκεται στον πυρήνα λόγω της συν-εντοπισμό του πράσινου και κόκκινου φθορισμού. (Β), η αναστολή του Gli μεταγραφής. Παγκρέατος ΚΕΠ μετήχθησαν με ιικά σωματίδια Gli-απόκρισης GFP /λουσιφεράσης πυγολαμπίδας (pGreen Fire1-Gli με EF1, Σύστημα Biosciences). Μετά την μεταγωγή, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε και ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σουλφοραφάνη (0-20 μΜ) για 24 ώρες. δραστηριότητα ανταποκριτή Gli-απόκρισης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία λουσιφεράσης (Promega Corporation). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. @,%, Και * = σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0.05.

Η

Η διακοπή της Shh σηματοδότησης με σουλφοραφάνη αναστέλλει τη δράση δημοσιογράφος Gli στο παγκρέατος ΚΕΠ

Από παράγοντα Gli μεταγραφής διαμεσολαβεί τις επιδράσεις της Shh που παίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση βλαστική ικανότητα και την ογκογένεση, εμείς επόμενη μέτρησε τη δραστηριότητα μεταγραφικής Gli (Εικ. 4Β). Παγκρέατος ΚΕΠ μετήχθησαν με ιικά σωματίδια Gli-απόκρισης GFP /λουσιφεράσης πυγολαμπίδας (pGreen Fire1-Gli με EF1, Σύστημα Biosciences). SFN ανέστειλε Gli μεταγραφική δραστικότητα σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι μπορεί να ρυθμίσει SFN παγκρεατική καρκινογένεσης η οποία μεσολαβείται μέσω της αναστολής της Shh σηματοδότησης.

Αναστολή της Gli ενισχύει τις επιδράσεις της σουλφοραφάνης στο σχηματισμό σφαιροειδές σε παγκρεατικά ΚΕΠ

Επιπλέον, για να προσδιοριστεί η επίδραση της SFN στην αναστολή του σήματος Shh στα παγκρεατικά πολλαπλασιασμό CSC και αυτο ανανέωση, πραγματοποιήσαμε δοκιμασία σχηματισμού σφαίρας. Παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με SFN (0-20 μΜ) για 1 εβδομάδα και αξιολογούνται για την εγγενή ικανότητά του να σχηματίζει πρωτογενή σφαίρες σε καλλιέργεια. Στο τέλος μιας εβδομάδας, το συνολικό αριθμό των σφαιρών μετρήθηκαν και ικανότητα να σχηματίζουν δευτερογενείς σφαίρες αξιολογήθηκε περαιτέρω για μια άλλη εβδομάδα. Ανθρώπινη παγκρεατική ΚΕΠ προέρχονται σφαίρες αναστέλλεται σημαντικά σε θεραπεία με SFN, γεγονός που υποδηλώνει την κλωνογόνο εξάντληση του ΚΕΠ (Εικ. 5Α).

(Α), Ανασταλτικά αποτελέσματα των SFN για σφαιροειδούς βιωσιμότητα της CSC. Παγκρέατος ΚΕΠ σπάρθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SFN (0 και 20 μΜ). Μετά από 7 και 14 ημέρες, πρωτογενή και δευτερογενή σφαιροειδή διαχωρίστηκαν και βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν με trypan blue δοκιμασίας. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. @, Και $ = σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0.05. (Β), του παγκρέατος ΚΕΠ υπέστησαν μεταγωγή είτε με περιπλεγμένο shRNA ή Gli1 και Gli2 shRNA εκφράζουν φορείς λεντοϊών (pLKO.1) και κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και ανάλυση κηλίδας Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντι-Gli1 ή Gli2 αντίσωμα. (C), CSC /κωδικοποιημένα και CSC /Gli shRNA σπάρθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SFN (0-20 μΜ). Μετά από 7 ημέρες, σφαιροειδή συνελέγησαν και εναιωρήματα κυττάρων παρασκευάστηκαν και βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν με trypan blue δοκιμασίας. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. @,%, Και * = σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0.05. (D), Gli shRNA ενισχύει τις ανασταλτικές επιδράσεις της SFN σε σφαιροειδές βιωσιμότητα της CSC. CSC /κωδικοποιημένα και CSC /Gli shRNA σπάρθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SFN (0 και 20 μΜ). Μετά από 7 ημέρες, σφαιροειδή μικροφωτογραφηθεί.

Η

Με δεδομένη την απαίτηση για σκαντζόχοιρος σηματοδοσίας στον καρκίνο του παγκρέατος, ερευνήσαμε αν Hedgehog αποκλεισμός από σουλφοραφάνη θα μπορούσε να στοχεύσει τον πληθυσμό των βλαστικών κυττάρων στον καρκίνο του παγκρέατος. Για να κατανοήσουμε τον ρόλο της Shh σηματοδότηση στο SFN επαγόμενη αναστολή της παγκρεατικής πολλαπλασιασμού CSC, επιδιώξαμε να αναστέλλουν την σηματοδότηση Shh σε παγκρεατικά ΚΕΠ με να χτυπήσει κάτω τον παράγοντα μεταγραφής Gli χρησιμοποιώντας λεντοϊού μεσολαβούμενη μεταγωγή του Gli shRNA αναστολής τόσο Gli1 και 2 έκφραση. Η έκφραση του Gli σε παγκρεατικά CSC κατεστάλη σχεδόν κατά 100% με τη χρήση των Τα siRNAs που στοχεύουν Gli1 και Gli2 όπως ποσοτικοποιείται με κηλίδωση Western (Εικ. 5Β). Όπως φαίνεται στο (Σχ. 5C-D), το ποσοστό της σφαίρας ικανότητα σχηματισμού των παγκρεατικών ΚΕΠ ήταν σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα Gli knock-κάτω σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. Περαιτέρω, η παρεμβολή του Shh- Gli σηματοδότησης μέσω λεντοϊού – μεσολάβηση φίμωση σημαντικά μπλοκαριστεί SFN επάγεται ανασταλτικά αποτελέσματα αποδεικνύουν την απαίτηση ενός ενεργού οδού για την ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος βλαστοκυττάρων

SFN αναστέλλει την έκφραση των παραγόντων μεταγραφής πλειοδυναμίας διατήρηση.

Έχουμε αποδείξει πρόσφατα ότι εκφράζουν τα βλαστικά κύτταρα του παγκρέατος της CSC δείκτες CD133, CD44, CD24, ESA, εκφράζουν υψηλά επίπεδα πλειοδυναμίας διατήρηση παραγόντων, και γονίδια αντίστασης στα φάρμακα MDR1 και ABCG2 σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα του παγκρέατος και του παγκρέατος καρκινικών κυττάρων [22]. Ως εκ τούτου, χαρακτηρίζεται από τις ΚΕΠ απομονώθηκε από ανθρώπινο παγκρεατικό όγκων με cytometery ροής που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη. Όπως φαίνεται στο (Σχ. 6A-D), του παγκρέατος ΚΕΠ εκφράζουν βλαστικών κυττάρων δείκτες CD44, ESA, CD133, και CD24. Είναι ενδιαφέρον, του παγκρέατος CD44

+ ESA

+ CD133

+ CD24

+ ΚΕΠ εξέφρασε επίσης CK19 (καρκίνος του παγκρέατος συγκεκριμένες επιθηλιακά δείκτη) και γονίδια αντίστασης στα φάρμακα ABCG2 (Σχ. 6Ε-F).

(Α-Δ), έκφραση δεικτών παγκρεατικών αρχέγονων κυττάρων. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του παγκρέατος ΚΕΠ εκφράζοντας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση δεικτών των βλαστικών κυττάρων CD44-PE, ESA-PerCP, CD133-APC, CD24-FITC και κατάλληλους ελέγχους. (Ε-Ρ), Έκφραση των παγκρεατικών επιθηλιακών δεικτών και γονιδίων αντοχής φαρμάκου. ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του παγκρέατος CD44

+ ESA

+ CD133

+ CD24

+ ΚΕΠ εξέφρασε επίσης CK19-ΡΕ και ABCG2-ΡΕ, αντίστοιχα.

Η

Nanog είναι απαραίτητη για την πλειοδυναμία, μαζί με άλλους παράγοντες, όπως ES υπογραφή, όπως Oct4 είναι επίσης κρίσιμη για την παγκρεατική ΚΕΠ και άλλων καρκίνων [23], [24]. Γίνονται αποδεκτές γονιδίων στόχων Hh, όπως καλά. Πράγματι, τα επίπεδα του Oct4 μπορεί να επάγει επιθηλιακή δυσπλασία σε ποντίκια, και έχει εμπλακεί σε διάφορους ανθρώπινους όγκους, όπως ρυθμίζεται επίσης από HH-Gli σηματοδότηση. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να εξετάσει τις επιπτώσεις της SFN στην έκφραση αυτών των παραγόντων

in vitro

. Όπως φαίνεται στο (Σχ. 7Α-Β), SFN ανέστειλε την έκφραση του mRNA του Nanog, και Oct-4 σε παγκρεατικά ΚΕΠ. Περαιτέρω, όπως επιβεβαιώνεται από κηλίδωση Western στο (Σχ. 7C), SFN ανέστειλε την πρωτεΐνη έκφραση Nanog, και Oct-4 σε παγκρεατικά ΚΕΠ. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η Shh σηματοδότηση μπορεί να προάγει τον πολλαπλασιασμό των παγκρεατικών ΚΕΠ μέσω της ενισχυμένης αυτο-ανανέωση των κυττάρων.

(Α-Β), Επιδράσεις της SFN στην έκφραση των γονιδίων στόχων Hh των παγκρεατικών ΚΕΠ. Πραγματικού χρόνου PCR (Q-RT-PCR) διεξήχθη για να εξεταστεί η έκφραση του Nanog και Oct4 και τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με GAPDH. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και υπολογίστηκαν με βάση ΔΔ

C

t μέθοδο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. @ Και% = σημαντικά διαφορετική από έλεγχο, P & lt? 0.05. (Γ), του παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με SFN (0-20 μΜ), και κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και ανάλυση κηλίδας Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντι Nanog, Oct4 ή αντίσωμα β-ακτίνης. (D-E), Επιδράσεις της SFN στην έκφραση των γονιδίων στόχων Hh εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων των παγκρεατικών ΚΕΠ. Πραγματικού χρόνου PCR (Q-RT-PCR) διεξήχθη για να εξεταστεί η έκφραση της PDGFRα και Κυκλίνη D1, που εμπλέκονται στη διατήρηση του πολλαπλασιασμού αναλύθηκε και κανονικοποιημένο με GAPDH. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και υπολογίστηκαν με βάση ΔΔ

C

t μέθοδο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. @,%, Και $ = σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0.05. (F), του παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με SFN (0-20 μΜ), και κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και Immunobloted για αντι PDGFRα, Κυκλίνη D1 ή αντίσωμα β-ακτίνης.

Η

Hedgehog blockadge σηματοδότηση από σουλφοραφάνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επάγει την απόπτωση σε παγκρεατικά ΚΕΠ

Εξετάσαμε επόμενο τις επιδράσεις της SFN για την έκφραση του mRNA των γονιδίων κατάντη του Gli μεταγραφής που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Όπως φαίνεται στο (Σχ. 7D-Ε), SFN ανέστειλε κατάντη στόχοι του Gli μεταγραφής κυκλίνης D1 και PDGFRα σε παγκρεατικά ΚΕΠ τα οποία είναι γνωστά γονίδια στόχους Hh εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό. Περαιτέρω, η αναστολή της πρωτεΐνης έκφρασης αυτών των στόχων από SFN σε παγκρεατικά ΚΕΠ επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western σε (Σχ. 7F). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι μπορεί να ρυθμίσει SFN παγκρεατική καρκινογένεση με αναστολή Shh μονοπάτι και κατάντη των στόχων της.

Επιπλέον, έχουμε καταδείξει ότι SFN επαγόμενη απόπτωση σε παγκρεατικά ΚΕΠ μέσω της αναστολής της έκφρασης Bcl-2 και μέσω της ενεργοποίησης της κασπάσης 3 /7 (Σχ. 8Α-Β). Η αναστολή της πρωτεΐνης έκφρασης του BCL2 και προς τα πάνω ρύθμιση διασπασμένης κασπάσης-3, επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western, όπως φαίνεται στο (Σχ. 8C). Περαιτέρω, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με χρώση ΡΙ των SFN-κατεργασμένων κυττάρων σε (Σχ. 8D), απεικονίζει ότι οι αυξανόμενες δόσεις της SFN ενισχυμένη απόπτωση σε παγκρεατικά CSCs με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι SFN μπορούν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και διεγείρει απόπτωση σε παγκρεατικά ΚΕΠ με στόχευση Shh μονοπάτι και τα γονίδια-στόχους της.

(Α), Επιδράσεις της SFN για bcl-2expression. Q-RT-PCR πραγματοποιήθηκε για να εξετάσει την έκφραση του Bcl-2. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και υπολογίστηκαν με βάση ΔΔ

C

t μέθοδο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. @,% Και $ = σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0.05. (Β), Επιδράσεις της SFN για κασπάσης-3/7 Δράση. Παγκρέατος ΚΕΠ που έλαβαν θεραπεία με SFN (0-20 μΜ) για 24 ώρες, και της κασπάσης-3/7 Δράση μετρήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. @,%, Και $ = σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0.05. (Γ), του παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με SFN (0-20 μΜ), και κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και Immunobloted για αντι- Bcl-2, διασπασμένη κασπάση 3 ή αντίσωμα β-ακτίνης. (D), Επιδράσεις της SFN στην απόπτωση. Παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με SFN (0-20 μΜ) για 48 ώρες, και η απόπτωση μετρήθηκε με χρώση ΡΙ χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής.

Η

Συζήτηση

Ο καρκίνος του παγκρέατος γίνεται κλινικά εμφανής στο τέλος του στάδια και αντιστέκεται σε όλες τις μορφές της συμβατικής χημειοθεραπείας και ακτινοθεραπείας [1], [2]. Έχουμε αποδείξει προσφάτως ότι ΚΕΠ μοιράζονται μοριακά χαρακτηριστικά με φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα (SCs) και παίζουν κρίσιμους ρόλους στην αντίσταση στο φάρμακο και τη μετάσταση του καρκίνου. Παγκρέατος ΚΕΠ δείχνουν, επίσης, προς τα πάνω ρύθμιση μορίων σημαντικά στην αναπτυξιακή μονοπάτια σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων Sonic hedgehog (Shh) μονοπάτι. Ανεξέλεγκτη ενεργοποίηση της οδού Shh έχει εμπλακεί στην πρόοδο και τη συντήρηση των παγκρεατικών αδενοκαρκινώματα [25], [26]. ενεργοποίηση Pathway μέσω Smo έτσι μπορεί να συμβεί είτε με διέγερση της πρωτεΐνης Hh ή μέσω απώλεια δραστικότητας Ptch, όπως φαίνεται στην σποραδικούς καρκίνους ή εκείνες που προκύπτουν στο σύνδρομο οικογενούς καρκίνου του προδιάθεση, BCNS (σύνδρομο βασικών κυττάρων σπίλου, που συνδέονται με την ετερόζυγη μετάλλαξη του ανθρώπινου Ptch γονίδιο). Η ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης Shh εμπλέκεται στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των παγκρεατικών ΚΕΠ [27]. Ετσι, παράγοντες που αναστέλλουν την Shh μονοπάτι έχουν τη δυνατότητα να αποτρέψει την εξέλιξη της νόσου και μεταστατική εξάπλωση [28]. Καθώς και τα φάρμακα που στοχεύουν επιλεκτικά ΚΕΠ προσφέρουν μεγαλύτερη υπόσχεση για την πρόληψη και θεραπεία του καρκίνου. Το έργο βασίζεται στην παραδοχή ότι SFN, μια φυσική ένωση από τα σταυρανθή λαχανικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πρόληψη ή /και θεραπεία ανθρώπινων καρκίνου του παγκρέατος. Έτσι, ο κύριος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει το ρόλο του Sonic οδού σκαντζόχοιρος στον καρκίνο του παγκρέατος και να εξετάσει τους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους η σουλφοραφάνη αναστέλλει την παγκρεατική χαρακτηριστικά CSC, και να αξιολογήσει chemopreventive /θεραπευτικό δυναμικό της κατά του καρκίνου του παγκρέατος με τη στόχευση ΚΕΠ.

SFN είναι ένα φυσικό ισοθειοκυανικού με ελπιδοφόρα χημειοπροληπτική δραστηριότητα [29]. Επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι οι άνθρωποι που καταναλώνουν σταυρανθή λαχανικά έχουν μειωμένη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του παγκρέατος και άλλων καρκίνων. Δοκιμή με ζώα έχουν δείξει ότι η διατροφή SFN μείωσε τη συχνότητα, το μέγεθος και τον αριθμό των όγκων διαφόρων προελεύσεων. Ήταν καλά και απορροφάται γρήγορα και εμφανίζεται απόλυτη βιοδιαθεσιμότητα 82% [30]. Είναι ένα ένζυμο επαγωγέας φάσης 2 [31], και αναστέλλει βενζο [α] πυρένιο σχηματισμός-DNA και προϊόντα προσθήκης 1,6-dinitropyrene-DNA. Δρα ως αντιοξειδωτικό, αντιπολλαπλασιαστική, αντικαρκινική και αντι-αγγειογόνο παράγοντα, και ως εκ τούτου ένα νέο υποψήφιο για χημειοπροφύλαξη [19], [32], [33], [34]. Ορισμένα πρόσφατες μελέτες σχετικά με τον καρκίνο του παγκρέατος βλαστικά κύτταρα που προέρχονται από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές έχουν αναφερθεί, όταν έχουν δείξει ότι η SFN μπορούν να αναστείλουν την ανάπτυξή τους μέσω της αναστολής της NFKB [35]. Αυτές οι μελέτες υποδεικνύουν έντονα ότι SFN μπορούν να ρυθμίσουν την έκφραση των γονιδίων που είναι γνωστό ότι παίζουν ρόλους στη διαδικασία της καρκινογένεσης και, ως εκ τούτου, μπορεί να είναι ένας πιθανός παράγοντας για τη χημειοπρόληψη κατά του καρκίνου του παγκρέατος. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που δείχνει ότι η σουλφοραφάνη μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη του πρωτογενούς παγκρεατικού ΚΕΠ που προέρχονται από ανθρώπινους όγκους

in vitro

μέσω της αναστολής της Sonic οδού σκαντζόχοιρος και ως εκ τούτου θεωρείται ως πολύ μυθιστόρημα.

στην παρούσα μελέτη έχουμε καταδείξει για πρώτη φορά, ότι ο καρκίνος προληπτικό παράγοντα SFN αναστέλλει την έκφραση των συστατικών της οδού Shh σε ανθρώπινο παγκρεατικό ΚΕΠ. SFN ανέστειλε την έκφραση του μορίου του υποδοχέα Smo, καθώς και τελεστές Gli 1 και 2, υποδεικνύοντας την κλινική σημασία της Shh οδού σε παγκρεατικά εξέλιξης του καρκίνου. Η επιβολή ενεργοποίηση της Shh ή η αναστολή της Gli1 συν Gli2 έκφρασης με shRNA μπλοκάρει τις ανασταλτικές επιδράσεις της SFN, γεγονός που υποδηλώνει τις επιδράσεις της SFN διαμεσολαβούνται μέσω της αναστολής της Shh οδού. SFN αναστέλλει την ικανότητα αυτο-ανανέωσης του ανθρώπινου παγκρέατος ΚΕΠ αναστέλλοντας pluripotency διατηρώντας παράγοντες και Σσσς μονοπάτι. Συγκεκριμένα, SFN αναστέλλει την ικανότητα αυτο-ανανέωσης των παγκρεατικών ΚΕΠ αναστέλλοντας την έκφραση των παραγόντων πλειοδυναμίας διατήρηση μεταγραφής (Nanog και Oct-4), τα συστατικά του Shh οδού, και επάγει την απόπτωση μέσω αναστολής της Bcl-2, κυκλίνη D2, και την ενεργοποίηση της κασπάσης -3 και 7. Λαμβανόμενα μαζί παρούσες μελέτες μας υποδηλώνουν έντονα ότι SFN είναι ένας ισχυρός αναστολέας βιολογική της ανθρώπινης παγκρεατικής καρκινογένεσης, μειώνοντας την πολλαπλασιαστική τους και επεμβατικές δραστηριότητες. Αυτές οι μελέτες αυξάνει την προοπτική ότι η σουλφοραφάνη μπορεί να είναι ένας ευεργετικός παράγοντας για την πρόληψη ή /και θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος με ΚΕΠ στόχευσης.

Από ΚΕΠ /προγονικά κύτταρα παίζουν μείζονα ρόλο στην έναρξη του καρκίνου, την εξέλιξη, υποτροπής και της αντίστασης στα φάρμακα , αναστολή της ανάπτυξης CSC και αυτο-ανανέωση τους ικανότητα κατά σουλφοραφάνη θα μπορούσε να είναι σημαντική για τη διαχείριση του καρκίνου του παγκρέατος και έχει πρόσφατα αναθεωρηθεί διάφορα έγγραφα ως στρατηγική chemopreventive διαιτητικών παραγόντων για τη στόχευση του καρκίνου βλαστικών κυττάρων [36], [37]. Διευκρίνιση του μηχανισμού (ων) για αντιπολλαπλασιαστική δραστηριότητα των SFN είναι κρίσιμη στην συνολική εκτίμηση για πιθανή κλινική χρησιμότητα του. Οι εν λόγω πληροφορίες θα επιτρέψουν όχι μόνο ορθολογικό σχεδιασμό των σουλφοραφάνη, οι στρατηγικές που βασίζονται για την πρόληψη ή /και θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος, αλλά θα μπορούσε επίσης να διευκολύνει την ανάπτυξη των πρωτοκόλλων μηχανισμού με γνώμονα τη βέλτιστη κλινικά αποτελέσματα.

Συμπεράσματα

Έχουμε αποδείξει εδώ για πρώτη φορά, ότι SFN ανέστειλε ικανότητα αυτο-ανανέωσης των παγκρεατικών ΚΕΠ απομονώθηκε από ανθρώπινο πρωτογενείς όγκους και αναστέλλει την παγκρεατική χαρακτηριστικά CSC. Οι ανασταλτικές επιδράσεις της SFN διαμεσολαβείται μέσω της αναστολής της Shh οδού. SFN ανέστειλε την έκφραση των παραγόντων μεταγραφής (Nanog και Oct-4), τα οποία απαιτούνται για τη διατήρηση των βλαστικών κυττάρων pluripotency. SFN εξαλείφει ισχυρά τα παγκρεατικά χαρακτηριστικά ΚΕΠ επηρεάζοντας κλωνογονίας, σφαιροειδή σχηματισμό μαζί με σηματοδότηση που εμπλέκονται στην αντίσταση απόπτωση και τον πολλαπλασιασμό. Έτσι, η ρύθμιση της Shh μονοπατιού σηματοδότησης σε ΚΕΠ με σουλφοραφάνη μη τοξικό παράγοντα, θα μπορούσε να θεωρηθεί ως μια νέα στρατηγική για τη θεραπεία ή /και πρόληψη του καρκίνου του παγκρέατος. Από συμβαίνει παρεκκλίνουσα σηματοδότηση Shh στα παγκρεατικά ογκογένεση, θεραπευτικά μέσα που στοχεύουν Σσσς οδός μπορεί να βελτιώσει τα αποτελέσματα των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος με τη στόχευση ΚΕΠ, αλλά και να διευκολύνει την ανάπτυξη των πρωτοκόλλων μηχανισμού με γνώμονα τη βέλτιστη κλινικά αποτελέσματα.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Αντισώματα έναντι GAPDH και Gli αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, ΜΑ). SFN αγοράστηκαν από LKT Laboratories, Inc. (St. Paul, MN). Ενισχυμένη χημειοφωταύγειας (ECL) Western αντιδραστήρια ανίχνευσης στυπώματος ήταν από την Amersham Life Sciences Inc. (Arlington Heights, IL). Όλα τα άλλα χημικά αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ).

Κυτταρική καλλιέργεια

Η ανθρώπινη φυσιολογική παγκρεατικά βλαστοκύτταρα (HPSC) και ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου του βλαστικά κύτταρα (CD133

+ /CD44

+ /CD24

+ /ESA

+) ελήφθησαν από Celprogen Inc. (San Pedro, CA). Αυτοί απομονώθηκαν από πρωτογενείς όγκους και έχουν περιγραφεί προηγουμένως [38]. Αυτά τα ΚΕΠ αποτελούνται από ένα μαζικό πληθυσμό καρκίνο βλαστικών κυττάρων του παγκρέατος, και ως εκ τούτου δεν μπορεί να θεωρηθεί ως μια κυτταρική γραμμή. Οι CSCs καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 1% Ν2 Συμπλήρωμα (Invitrogen), 2% Β27 συμπλήρωμα (Invitrogen), 20 ng /ml ανάπτυξη ανθρωπίνων αιμοπεταλίων παράγοντα (Sigma-Aldrich), 100 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Invitrogen) και 1 % αντιβιοτικό-αντιμυκητικό (Invitrogen) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2. Ανθρώπινων παγκρεατικών φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του πόρου (HPNE) ελήφθησαν από

Lonza, Clontetics και διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με κιτ αυξητικού παράγοντα σφαίρα.

αναλύσεις των όγκων σφαιροειδές δοκιμασία

σφαιροειδές διαμόρφωσης διεξήχθησαν όπως περιγράφεται αλλού [22], [39].