Αφηρημένο

Για να διευκρινιστεί η λειτουργία της MAS σχετίζονται GPCR, μέλος Δ (MRGD) σε καρκίνους, ερευνήσαμε το

in vitro

και

in vivo

ογκογόνο λειτουργία της MRGD χρησιμοποιώντας ποντικού κυτταρική σειρά ινοβλαστών ΝΙΗ3Τ3 στην οποία MRGD σταθερά εκφράζεται. Το πρότυπο έκφρασης του MRGD σε κλινικά δείγματα, αναλύθηκε επίσης. Βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του MRGD σε σχηματισμό που επάγεται εστίαση ΝΙΗ3Τ3 και το σχηματισμό πολυκύτταρων σφαιροειδών, και προωθείται όγκων σε γυμνούς ποντικούς. Με άλλα λόγια, η υπερέκφραση του MRGD σε ΝΙΗ3Τ3 προκάλεσε την απώλεια της αναστολής επαφής, ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και

in vivo

ογκογένεση. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι ο συνδετήρας του MRGD, βήτα-αλανίνη, ενισχυμένη σχηματισμός σφαιροειδή σε MRGD κύτταρα που εκφράζουν ΝΙΗ3Τ3. Από την έρευνα της κλινικής καρκινικούς ιστούς, βρήκαμε υψηλή έκφραση του MRGD σε αρκετές καρκίνων του πνεύμονα με ανοσοϊστοχημεία, καθώς και σε πραγματικό χρόνο PCR. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, MRGD θα μπορούσαν να εμπλέκονται στην καρκινογένεση και θα μπορούσε επίσης να είναι ένα μυθιστόρημα στόχο αντικαρκινικό φάρμακο

Παράθεση:. Nishimura S, M Uno, Kaneta Υ, Fukuchi Κ, Nishigohri Η, Hasegawa J, et al. (2012) MRGD, ένα MAS συνδέονται G-πρωτεΐνη υποδοχέα που συζευγνύεται, προωθεί την γένεσιν όγκων και εκφράζεται έντονα σε καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (6): e38618. doi: 10.1371 /journal.pone.0038618

Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, Κίνα

Ελήφθη: 5 του Σεπτέμβρη του 2011? Αποδεκτές: 8 Μαΐου 2012? Δημοσιεύθηκε: 8 Ιουν 2012

Copyright: © 2012 Nishimura et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από την Daiichi Sankyo Co. Ltd. Οι χρηματοδότες είχαν ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση και την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. SN, MU, YK, KF, ΠΝ, JH, ΝΚ, FN, και TA απασχολούνται από Daiichisankyo ΣΙΑ Ε.Π.Ε. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε επίσης από την Daiichi Sankyo Co. Ltd. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

τα μέλη της οικογένειας

G πρωτεΐνη υποδοχέα που συζευγνύεται (GPCR) ενεργοποιούν διάφορες φυσιολογικές σηματοδότηση και παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη καθώς και τη λειτουργία του κάθε οργάνου [1]. Επιπλέον, έχουν διαφορετικές GPCRs έχουν βρεθεί ότι υπερεκφράζεται σε πρωτογενή και μεταστατικά κύτταρα όγκου του κεφαλιού και του λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, του μαστού, του προστάτη και γαστρικών όγκων, μελάνωμα και διάχυτο από μεγάλα Β κύτταρα λεμφώματος [2]. Μερικοί GPCRs έχουν επίσης αναφερθεί ότι είναι λειτουργικά εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου [3], όπως πεπτίδιο υποδοχέα απελευθέρωσης γαστρίνης (GRPr) στον καρκίνο του προστάτη [4], CXCR4 στη μετάσταση [5] και ούτω καθεξής. MAS1, είναι η πρώτη GPCR να αναφερθεί ότι έχει οποιαδήποτε σχέση με την ανάπτυξη του καρκίνου. Έχει αναφερθεί ότι τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 που εκφράζουν εκτοπικά MAS1 προωθείται σχηματισμός εστίασης

in vitro

και διευκόλυνε την ογκογένεση σε γυμνούς ποντικούς [6], ωστόσο, ούτε σημαντική έκφραση MAS1 ούτε δραστικές μετάλλαξη MAS1 έχουν αναφερθεί σε κλινικές καρκίνους, ως εκ τούτου, η ρόλος της MAS1 στον καρκίνο είναι ακόμα ασαφής. Από την άλλη πλευρά, η υψηλή έκφραση του MAS1 παρατηρήθηκε στο κεντρικό νευρικό σύστημα, όπως ιππόκαμπο και την παρεγκεφαλίδα, και MAS1 ενίσχυσε την εξαρτώμενη από συνδετήρα εισροή ασβεστίου του υποδοχέα της Ang II (ΑΤ2Κ) όπου MAS1 σχημάτισε σύμπλοκο με AT2R. Αυτά δείχνουν ότι MAS1 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στο κεντρικό νευρικό σύστημα [7], [8].

MAS συνδέονται συζευγμένο υποδοχέα G-πρωτεΐνης, D (MRGD), που αναφέρεται επίσης ως hGPCR45 [9] ή TGR7 [10], ταυτοποιήθηκε ως νέο GPCR σε ποντικού και ανθρώπου γονιδιωμάτων [11]. Διαπιστώθηκε ότι MRGD χρησιμεύει ως υποδοχέας της β-αλανίνης [12]. Αρκετά μέλη της οικογένειας ΔΟΔΜ είχαν αναφερθεί ότι εκφράζεται σε ειδικούς υποπληθυσμούς των αισθητήριων νευρώνων, οι οποίοι ανιχνεύουν ερεθίσματα πόνου [11]. Όσο για MRGD, η έκφραση του βρέθηκε στα γάγγλια ραχιαίας ρίζας (DRG) και συν-εντοπισμένη με βανιλλοειδούς υποδοχέα-1 (VR-1), το οποίο αποτελεί βασικό υποδοχέας για τη θερμότητα και την αίσθηση του πόνου [12]. Επιπλέον, γενετική εκτομή του MRGD εκφράζουν νευρώνα μειώνει συμπεριφορική ευαισθησία σε επιβλαβή μηχανικά ερεθίσματα αλλά όχι σε θερμότητα ή κρύο ερεθίσματα σε ποντικούς [13]. Έτσι, MRGD θεωρείται ένας από τους παίκτες στην αίσθηση του πόνου και /ή μεταγωγή. Αναφέρθηκε επίσης ότι MRGD μετάγει ενδοκυτταρική σηματοδότηση της αγγειοτενσίνης (Ang) II μεταβολίτη, Ang- (1-7) [14]. Όπως περιγράφεται παραπάνω, η λειτουργία του MRGD στο κεντρικό νευρικό σύστημα έχει παρατηρηθεί από διάφορες ομάδες.

Υπάρχουν πολλά μέλη της οικογένειας GPCR παρουσιάζει ομοιότητα αλληλουχίας αμινοξέων με MAS1 όπως MRGA, MRGB, MRGC, MRGD, MRGE , MRGF, MRGG, MRGH και MRGX [11]. Στην phylogenic δέντρο της οικογένειας MRG, MAS1, MRGD, MRGE, MRGF και MRGH κατηγοριοποιούνται ως που ανήκουν στον ίδιο κλάδο [11]. Αυτό έθεσε την υπόθεση ότι τα γονίδια στο phylogenic υποκατάστημα συμπεριλαμβανομένων MAS1 θα μπορούσαν να έχουν μια ομοιότητα σε λειτουργία ή μεταγωγή σήματος. Παρατηρήσαμε την ικανότητα των MAS1 για την προώθηση ογκογόνο λειτουργία σε ΝΙΗ3Τ3, και σε αυτή τη μελέτη, επιχείρησε να αποσαφηνιστεί η λειτουργία του ογκογόνο MRGD, η οποία φέρεται να εργάζονται στο κεντρικό νευρικό σύστημα όπως MAS1. Διερευνήσαμε επίσης την έκφραση του MRGD σε ανθρώπινους καρκινικούς ιστούς. Βρήκαμε ότι MRGD προάγει την απώλεια της αναστολής επαφής, ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και

in vivo

ογκογένεση και είναι επίσης εντόνως εκφρασμένο σε αρκετούς ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα, γεγονός που υποδηλώνει ότι MRGD μπορούσε να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στον καρκίνο του ανθρώπου.

Αποτελέσματα

επίδραση των MRGD στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ογκογενετικότητας in vitro

για να διευκρινιστεί η επίδραση της MRGD στην ανάπτυξη των κυττάρων, η κυτταρική σειρά ΝΙΗ3Τ3-MRGD, τα οποία κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 διαμολύνθηκαν σταθερά με ρετροϊικό φορέα έκφρασης MRGD ιδρύθηκε και αναλύθηκαν τα προφίλ ανάπτυξης που σχετίζονται με της. Η έκφραση του γονιδίου του MRGD στην κυτταρική σειρά ΝΙΗ3Τ3-MRGD επιβεβαιώθηκε με RT-PCR και αλληλούχιση (Σχήμα S1). Χρησιμοποιώντας τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-MRGD, η δοκιμασία σχηματισμού εστίασης (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) εκτελέστηκε, όπου σημαντικό σχηματισμό εστιών παρατηρήθηκε στην κυτταρική καλλιέργεια ΝΙΗ3Τ3-MRGD, ενώ κανένα τέτοιο εστιών παρατηρήθηκε σε ΝΙΗ3Τ3-Mock (Σχήμα 1Α). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η γονιδιακή έκφραση MRGD ακυρώνει αναστολή επαφής των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3, ένα από τα χαρακτηριστικά των κανονικών ινοβλαστών. Για τον προσδιορισμό άλλα χαρακτηριστικά ανάπτυξης που σχετίζονται με MRGD, ο προσδιορισμός της ανάπτυξης σφαιροειδές (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) εκτελέστηκε, όπου τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-MRGD και ΝΙΗ3Τ3-Mock κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 96-φρεατίων μη προσκολλημένα U πυθμένα πλάκα, αντίστοιχα. Πρώτον, έχουμε παρατηρήσει ότι παρατηρήθηκαν μεγαλύτερα σφαιρίδια για ΝΙΗ3Τ3-MRGD από ό, τι για ΝΙΗ3Τ3-Mock την 5η ημέρα μετά την επίστρωση. Το σφαιροειδές ΝΙΗ3Τ3-Mock συρρικνωθεί κατά την καλλιέργεια, ενώ εκείνη της ΝΙΗ3Τ3-MRGD προφανώς αυξήθηκε μέρα με τη μέρα, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β. Προσδιορίσαμε αυτό το χαρακτήρα της ανάπτυξης που σχετίζονται με τη μέτρηση της αλλαγής στις διαμέτρους των σφαιροειδών και επίσης με μέτρηση διαφορά στην ΑΤΡ δραστηριότητα των σφαιροειδών (Σχήμα 1 C και D). Σημαντικά μεγαλύτερες διαμέτρους σφαιροειδείς παρατηρήθηκαν για ΝΙΗ3Τ3-MRGD από εκείνους για ΝΙΗ3Τ3-Mock από 2 έως 8 ημέρες μετά την επίστρωση (Σχήμα 1 C, ρ & lt? 0.005, Mann-Whitney U test, 2 ουρές). Επίσης, πολύ περισσότερο περιεχόμενο ΑΤΡ παρατηρήθηκε για ΝΙΗ3Τ3-MRGD σύγκριση με εκείνη των ΝΙΗ3Τ3-Mock στις 6 ημέρες μετά την επίστρωση (Εικόνα 1 D, ρ & lt? 0.005, Mann-Whitney U test, 2 ουρές). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν από [

3Η] -θυμιδίνης μέτρησης δοκιμασία ενσωμάτωσης (Εικόνα S2, S1 αρχείου). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι MRGD προάγει σημαντικά την ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη της κανονικής ινοβλαστών, με άλλα λόγια, MRGD κατέχουν ογκογόνο ικανότητα.

A. Εκπρόσωπος φωτογραφίες του σχηματισμού εστίαση σε καλλιέργειες μονοστιβάδας κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 που εκφράζουν σταθερά Mock (ΝΙΗ3Τ3-Mock κύτταρα, αριστερά) ή MRGD (κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-MRGD, δεξιά). Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες μετά από στερέωση με παραφορμαλδεΰδη 4%. Β Εκπρόσωπος εικόνες της ΝΙΗ3Τ3-MRGD ή ΝΙΗ3Τ3-Mock σφαιροειδές τις Ημέρες 1 και 7. καμπύλες αύξησης Γ σφαιροειδές. Τα μεγέθη σφαιροειδές ΝΙΗ3Τ3-MRGD (κλειστή) ή ΝΙΗ3Τ3-Mock (ανοικτή) εις Ημέρες 2, 3, 5 και 7, παρουσιάζονται με διαμέτρους τους (μέση τιμή ± SD). * Υποδηλώνει ρ & lt? 0.005 (Mann-Whitney U test, 2 ουρές). Δ κυτταρικό πολλαπλασιασμό των σφαιροειδές καλλιέργειες ΝΙΗ3Τ3-MRGD ή ΝΙΗ3Τ3-Mock. Η φωταύγεια του περιεχομένου ολικού κυττάρου ΑΤΡ (μέσο ± SD) μετρήθηκε στις 6 ημέρες μετά την επίστρωση. * Υποδηλώνει p & lt?. 0.005 (Mann-Whitney U test, 2 ουρές)

Η

Επίδραση των MRGD στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ογκογενετικότητας in vivo

Η

Στη συνέχεια, για να αξιολογούν

in vivo

ογκογόνο δράση, μπορούμε υποδορίως ΝΙΗ3Τ3-MRGD ή ΝΙΗ3Τ3-παρωδία σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς. Η αξιοσημείωτη αύξηση του μεταμοσχευμένου ιστού παρατηρήθηκε με τους ποντικούς υποδορίως εμφυτευμένων με κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-MRGD αλλά όχι με ΝΙΗ3Τ3-κύτταρα Mock (Πίνακας 1). Οι μέσες όγκοι του όγκου του ΝΙΗ3Τ3-MRGD-κύτταρα ποντικών εμφυτευμένες υπερέβη 2.000 mm

3 σε 21 ημέρες μετά τον εμβολιασμό. Αντιθέτως, δεν αξιοσημείωτη ανάπτυξη παρατηρήθηκε σε ΝΙΗ3Τ3-Mock-κύτταρα-μοσχευμένου ποντίκια μέχρι 21 ημέρες μετά τον εμβολιασμό. Μια συστάδα των κυττάρων βρέθηκε σε ΝΙΗ3Τ3-Mock-κύτταρα-εμβολιασμένα ποντίκια 24 ημέρες μετά τον εμβολιασμό, όμως, ήταν ακόμη πολύ μικρό και μέσο όγκο της ήταν μικρότερο από 400 mm

3. Όπως ΝΙΗ3Τ3-MRGD αποτέλεσε τη μεγάλη συστάδα

in vivo

, πραγματοποιήσαμε HE χρώση για να επιβεβαιώσει ότι η συστάδα ΝΙΗ3Τ3-MRGD κατείχε όγκου-όπως παθολογικά χαρακτηριστικά. HE χρώση των μεταμοσχευμένων τομές ιστών από ΝΙΗ3Τ3-MRGD-κύτταρα-μοσχευμένου ποντικοί έδειξαν ινοσάρκωμα-όπως μορφολογία (Σχήμα S3). Στο σύνολό τους, το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι η έκφραση MRGD προκαλεί όχι μόνο

in vitro

αλλά και

in vivo

ογκογενετικότητας.

Η

Η επαγωγή της κυτταρικής ανάπτυξης με διέγερση με συνδέτη

για να αξιολογηθεί η επίδραση της βήτα-αλανίνης, ένας από τους συνδετήρες MRGD [12], για σφαιροειδές ανάπτυξη προωθείται από MRGD, βήτα-αλανίνη σε διάφορες συγκεντρώσεις προσετέθησαν στην καλλιέργεια σφαιροειδές των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3-MRGD ή ΝΙΗ3Τ3-RASV12 κύτταρα. ΝΙΗ3Τ3-Mock κύτταρα δεν αναπτύσσονται καλά σε σφαιροειδές καλλιέργεια και όχι σταθερή ανάπτυξη προκλήθηκε ακόμη και με την παρουσία του βήτα-αλανίνης (τα δεδομένα δεν φαίνονται), και ως εκ τούτου, η ομάδα ΝΙΗ3Τ3-Mock κυττάρων δεν ορίστηκε στην παρούσα μελέτη. Σε αυτό το πείραμα, σημαντική προαγωγή της ανάπτυξης των κυττάρων από β-αλανίνης με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο παρατηρήθηκε για ΝΙΗ3Τ3-MRGD όπως μετράται με δραστικότητα ΑΤΡ (ρ & lt? 0,05, Mann-Whitney U test, 2-ουρές), ενώ καμία επίδραση της βήτα-αλανίνη παρατηρήθηκε για ανάπτυξη σφαιροειδή ΝΙΗ3Τ3-RASV12 ακόμη και με 2.000 μg /ml β-αλανίνης (Σχήμα 2). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη των κυττάρων που εκφράζουν MRGD μπορεί να ενισχυθεί με διέγερση με συνδέτη του.

κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 επιμολυσμένα με MRGD ή RASV12 καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 που περιέχει 0.1% BSA και διάφορες συγκεντρώσεις β-αλανίνης για 7 ημέρες. Τα δεδομένα ελήφθησαν από τρεις καλλιέργειες ανεξάρτητων κυττάρων (μέσα ± SD). * Υποδηλώνει ρ & lt?. 0.05 (Mann-Whitney U test, 2 ουρές), σε σύγκριση με ΝΙΗ3Τ3-MRGD χωρίς βήτα-αλανίνη, και με ΝΙΗ3Τ3-RASV12

Η

Έκφραση MRGD σε ανθρώπινους καρκίνους

Θα προσδιορίζεται η έκφραση MRGD σε διάφορες κλινικές μορφές καρκίνου. Πρώτον, για να διευκρινίσει το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης MRGD σε δείγματα καρκίνου του πνεύμονα, πραγματοποιήσαμε IHC χρησιμοποιώντας ένα ζεύγος τμημάτων όγκου και κανονικό ιστό του 33 ζεύγη δειγμάτων ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Για IHC, το αντι-αντίσωμα κουνελιού MRGD ανυψώθηκε και την εξειδίκευση αντιγόνου του αντισώματος επιβεβαιώθηκε όπως δείχνεται στο Υλικά και Μέθοδοι? σήματα χρώση του αντισώματος αντι-MRGD στην εξωτερική μεμβράνη ανιχνεύθηκαν σε σταθεροποιημένο με φορμαλίνη ΗΕΚ293 /ανβ3 κύτταρα επιμολυσμένα με MRGD, αν και όχι σε ψευδο-μορφομετατραπέντα ΗΕΚ293 /ανβ3 κύτταρα (Σχήμα 3Α και Β). Με αυτό το αντίσωμα, 22 από τις 33 κλινικές περιπτώσεις καρκίνου του πνεύμονα έδειξε MRGD θετικά σήματα (22/33): αδενοκαρκινώματα (9/10), ελάχιστα διαφοροποιημένο καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (7/10) και καλά διαφοροποιημένα καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (6 /10) (Πίνακας 2). Έχουμε παρατηρήσει ιδιαίτερα ισχυρά σήματα σε ορισμένα δείγματα, συμπεριλαμβανομένων αδενοκαρκινώματα (8/9) (Σχήμα 3C και S4), κακώς-διαφοροποιημένα καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (3/7) και καλά διαφοροποιημένο καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (2/10). Από την άλλη πλευρά, κανένα σήμα ανιχνεύθηκε χρώση για μικροκυτταρικό καρκίνωμα (ημερομηνία δεν παρουσιάζεται).

δείγματα μπλοκ κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα του αντισώματος σε ανοσοχρώση. Τα ΗΕΚ293 /ανβ3 κύτταρα επιμολυσμένα με φορέα έκφρασης MRGD (Α) ή Mock φορέα (Β) απεικονίζεται. Γ Ο εκπρόσωπος χρώση του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, η οποία είναι θετική για MRGD.

Η

Αναλύσαμε επίσης την έκφραση του γονιδίου MRGD σε κλινικές καρκίνους με ποσοτική RT-PCR. Χρησιμοποιήθηκαν Εκατόν είκοσι επτά σύνολα δειγμάτων RNA τόσο με τον καρκίνο και μη καρκινικές τμήματα του πνεύμονα, του οισοφάγου, του μαστού, των νεφρών, του στομάχου, της μήτρας και του παχέος εντέρου καρκινικούς ιστούς. Στα δείγματα της μήτρας ή του ιστού του κόλου, η έκφραση MRGD στο τμήμα καρκίνος δεν υπερέβη ποτέ 3 φορές την ποσότητα στην κανονική μερίδα. Όσο για τους καρκίνους του πνεύμονα, ο μέσος όρος της έκφρασης MRGD στο τμήμα καρκίνο υπερέβαινε το ποσό ίσο με 3 φορές όσο αυτό στον πνεύμονα κανονική μερίδα, και για 12 από 33 δείγματα ζεύγους πνευμόνων, η έκφραση MRGD στο τμήμα καρκίνο υπέρβαση 3 φορές το ύψος του ζευγαρωμένα κανονικό τμήμα (Σχήμα 4). Σε όλα τα 7 είδη του καρκίνου προσδιορίζεται εδώ, τα δείγματα ζεύγος πνευμόνων έδειξαν την υψηλότερη συχνότητα (36%) για υψηλότερη έκφραση MRGD στο τμήμα του καρκίνου σε σύγκριση με εκείνη του κανονικού τμήματος με τα κριτήρια που υπερβαίνουν τα 3 φορές την ποσότητα (Σχήμα 4). Κάποια άλλα δείγματα καρκίνου, όπως το στήθος (3 από 16), οισοφάγοι (2 από 12), των νεφρών (1 στα 10) και τα στομάχια (1 από 25), έδειξε επίσης 3 φορές υψηλότερη έκφραση στο τμήμα καρκίνο σε σύγκριση με εκείνη στην κανονική μερίδα. Δεν είδαμε μια στατιστική διαφορά στη συνολική σύγκριση του σήματος mRNA μεταξύ φυσιολογικού και του καρκίνου τμήματα σε κάθε τύπο καρκίνου με μονόδρομη ANOVA. Πιο ακριβή κατηγοριοποίηση των ασθενών πρέπει να είναι απαραίτητο για την επίτευξη στατιστικής σημαντικότητας. Ωστόσο, τα στοιχεία δείχνουν σαφώς ότι πάνω από 3 φορές υψηλότερη σήματα έκφρασης φαίνονται στον όγκο και όχι την κανονική μερίδα σε μερικούς ασθενείς με καρκίνο. Υψηλότερη έκφραση του τμήματος του καρκίνου στον καρκίνο του πνεύμονα ήταν επίσης πολύ συνεπής με τα αποτελέσματα της IHC. Αυτά δείχνουν ότι τα δεδομένα είναι πολύ σημαντικές για να υποδείξει την επόμενη κατεύθυνση της έρευνας επί της έκφρασης MRGD στον καρκίνο.

Εκατόν είκοσι επτά σύνολα δειγμάτων RNA του καρκίνου και μη καρκίνου του τμήματα από τους ίδιους ασθενείς με πνευμονική ( n = 33), του οισοφάγου (n = 12), του μαστού (n = 16), νεφρό (η = 10), στομάχι (n = 25), της μήτρας (n = 12) ή στο κόλον (n = 19) του καρκίνου. Αναλογίες της ποσότητας του mRNA σε MRGD τμήμα όγκου ανά ότι στην κανονική μερίδα της κάθε περίπτωσης παραστάθηκαν γραφικά. Η γραμμή δείχνει τη μέση τιμή του δείκτη σε κάθε τύπο καρκίνου.

Η

Συζήτηση

Έχουμε αποδείξει ότι η έκφραση MRGD προκαλεί απώλεια της αναστολής επαφής, αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη σφαιροειδές

στο vitro

και επίσης ογκογένεση

in vivo

, τα οποία δεν παρατηρούνται σε γονικών φυσιολογικά κύτταρα ινοβλαστών (Σχήμα 1, Πίνακας 1). Αυτά με τη λειτουργική φαινοτύπους που παρατηρείται για MRGD είναι αρκετά παρόμοια με εκείνα που αναφέρθηκαν για ένα αντιπροσωπευτικό ογκογονίδιο, RASV12 [15]. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι η έκφραση RASV12 προάγει την ακύρωση της αναστολής επαφής των φυσιολογικών κυττάρων ινοβλαστών και επάγει επίσης σφαιροειδές ανάπτυξη ή την ανάπτυξη των κυττάρων αγκυροβόλιο-ανεξάρτητο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, δείξαμε ότι τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-MRGD προέκυψε σημαντική ανάπτυξη του ινοσαρκώματος κύτταρα που μοιάζουν με

in vivo

(Σχήμα S3), και μορφολογικά φαινοτύπους τους ήταν αρκετά παρόμοια με τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-RASV12 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν σθεναρά ότι MRGD μετατρέπει ογκογόνο σηματοδότηση και προωθεί την ανάπτυξη των κυττάρων αγκύρωση-ανεξάρτητο δει με RASV12. Έχει αναφερθεί ότι τα κύτταρα iPS έγινε από το ποντίκι εμβρυϊκών ινοβλαστών (MEF) επαναπρογραμματιστεί με την εισαγωγή πολλών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων ογκογονίδια [16]. Σε αυτή τη μελέτη, εστιάσαμε στην ογκογόνο λειτουργία της MRGD, ωστόσο, θα μπορούσε να είναι επίσης ενδιαφέρον να διευκρινιστεί κατά πόσον ή όχι MRGD είναι σε θέση να προωθήσει βλαστική ικανότητα. Η έκφραση του βλαστική ικανότητα σημειωτές όπως οκτ-3/4, το Nanog και ούτω καθεξής [16] – [19] σε ΝΙΗ3Τ3-MRGD και άλλα MRGD-θετικών κυττάρων, όπως επίσης και την έκφραση του ίδιου του MRGD σε βλαστικά κύτταρα και επαναπρογραμματιστούν MEFs, είναι ενδιαφέρον να γνωρίζουν τη σημασία της MRGD σε αυτό το θέμα και θα πρέπει να διευκρινιστεί στο μέλλον.

Μια σειρά από εκθέσεις δείχνουν ότι όχι μόνο ογκογονίδιο όπως RASV12 αλλά και πρωτο-ογκογονίδια, όπως ErbB2 και FYN δώσει παρόμοια ογκογονικά φαινότυπο σε κύτταρα ινοβλαστών [20], [21]. Επιπλέον, η έκφραση αυτών των ογκογονιδίων και /ή πρωτο-ογκογονίδια είναι συχνά αυξημένη σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους και αν η κυτταρική ανάπτυξη τους και αντι-αποπτωτικά σήματα προωθούν όχι μόνο την ανάπτυξη των καρκινικών αλλά και την εξέλιξη της νόσου σε ασθενείς με καρκίνο [2], [22] – [25]. Στην έκθεση αυτή βρήκαμε ότι MRGD mRNA εκφράζεται σε κλινικά δείγματα ανθρώπινου καρκίνου από μερικούς ασθενείς με πνεύμονα, του μαστού, του οισοφάγου, των νεφρών ή του καρκίνου του στομάχου. Επιπλέον, βρήκαμε ότι ορισμένα από αυτά τα δείγματα καρκίνου του εκφράζει MRGD mRNA έδειξαν σχετικά υψηλότερη έκφραση πρωτεΐνης MRGD σε σύγκριση με τα τμήματα μη καρκινικών από τους ίδιους τους ασθενείς, αν και καμία συνολική στατιστική σημαντικότητα παρατηρήθηκε σε κάθε τύπο του όγκου (Σχήμα 4). Για καρκίνων του πνεύμονα, μας RT-PCR αναλύσεις έδειξαν έκφραση υψηλού και συχνή MRGD mRNA, και οι αναλύσεις IHC μας αποκάλυψαν ότι το υψηλότερο επίπεδο, το οποίο ανιχνεύεται για έκφραση πρωτεΐνης MRGD, παρατηρήθηκε συχνά σε ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα (Πίνακας 2), ιδιαίτερα στον πνεύμονα αδενοκαρκινώματα (Σχήμα 3). Αν και οι περαιτέρω αναλύσεις των λειτουργιών MRGD σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και ιστούς που απαιτούνται, το προφίλ έκφρασης του MRGD σε κλινικές καρκίνους αποκαλύπτεται σε αυτή τη μελέτη υποδηλώνει σαφώς την πιθανή συμβολή της ογκογόνου λειτουργία του ίδιου και /ή ένα σχετικό σηματοδοτικό μονοπάτι MRGD σε μερικούς συμπαγείς όγκους όπως οι καρκίνοι του πνεύμονα. GPCRs θα μπορούσαν να είναι καλοί στόχοι αναστολέων μικρών μορίων καθώς και αντισώματα, και ως εκ τούτου MRGD, ένας GPCR, θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως νέο στόχο για θεραπεία του καρκίνου. Πνεύμονα αδενοκαρκινώματα μπορεί να είναι ένα ιδιαίτερα ενδιαφέρον τύπος καρκίνου για πιθανή αντικαρκινική θεραπεία στοχεύει MRGD.

Οι μηχανισμοί με τους οποίους MRGD προάγει ογκογόνο σήματα παραμένουν άγνωστα. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση MRGD προάγει ογκογόνο φαινοτύπων σε φυσιολογικά κύτταρα τόσο

in vitro

και

in vivo

(Εικόνα 1, Πίνακας 1), και επίσης ότι ο συνδετήρας, βήτα-αλανίνη, ενεργοποιεί την ανάπτυξη MRGD εξαρτώμενη κυτταρική

in vitro

(Σχήμα 2). Έχει αναφερθεί ότι τα φυσιολογικά επίπεδα του β-αλανίνης ήταν περίπου 3.8 μΜ σε υγιές ανθρώπινο πλάσμα [26]. Επίσης αναφέρονται, ήταν ότι οι συγκεντρώσεις βήτα-αλανίνης στο νεύρο που σχετίζονται ιστός φαίνεται να είναι περίπου 50 μΜ σε ισχιακό νεύρο αρουραίου και 60 μΜ σε εγκέφαλο γάτα [27], [28]. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η βήτα-αλανίνη προάγει την ανάπτυξη σφαιροειδές από 2 μΜ έως 2.000 μΜ σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, και 50% την προώθηση της ανάπτυξης παρατηρήθηκε σε 20 μΜ (Σχήμα 2). Ως εκ τούτου, βήτα-αλανίνη σε υγιείς ανθρώπινο πλάσμα είναι αρκετά υψηλή ώστε να προωθήσει την ανάπτυξη σφαιροειδές μέσω MRGD. Μια έκθεση έχει μέχρι σήμερα, έδειξε ότι η υψηλή βήτα-αλανίνης συγκέντρωση συνδέεται με τον καρκίνο? με λεπτομέρεια, μαστικούς όγκους αρουραίου ή ποντικού περιέχουν υψηλά επίπεδα β-αλανίνης που έχουν ποτέ βρεθεί σε κανονικό ιστό μαστού από αρουραίο ή ποντικό [29]. Ως εκ τούτου, βήτα-αλανίνη συγκέντρωση στο πλάσμα ή όγκους των ασθενών με καρκίνο θα μπορούσε να είναι υψηλότερη από εκείνη της φυσιολογικά άτομα. Θα μπορούσε να είναι δυνατό ότι η βήτα-αλανίνη ενεργοποιεί την ανάπτυξη του όγκου και σήματα επιβίωσης σε ασθενείς με καρκίνο μέσω MRGD σε κάποιο βαθμό. Επιπλέον, σε καρκινικούς ιστούς, υψηλή έκφραση MRGD μπορεί να προκαλέσει συστατική μεταγωγή ογκογόνα σήματα, ή μπορεί να προκαλέσει υψηλότερη ανταπόκριση συνδέτη σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς που οδηγεί στην προώθηση της ανάπτυξης του καρκίνου. Από την άλλη πλευρά, καμία έκθεση αποκάλυψε ότι βήτα-αλανίνη προάγει την ανάπτυξη του καρκίνου, και ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι μπορεί να υπάρχει ένας άλλος συνδέτης MRGD συμβάλλουν στην ανάπτυξη του καρκίνου μέσω MRGD. Αυτά θα πρέπει να διευκρινιστεί στο μέλλον

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε.? 1) ογκογόνο δραστικότητα της MRGD

in vivo

και

in vitro

, 2) έκφραση MRGD σε κλινικές καρκινικούς ιστούς, 3) την προώθηση του σφαιροειδούς ανάπτυξης με βήτα-αλανίνη, το συνδετήρα MRGD, και 4 ) ινοσάρκωμα-όπως μορφολογία των μεταμοσχευμένων ιστών ποντικών υποδορίως εμφυτευμένων κυττάρων MRGD εκφράζουν. Αυτά δείχνουν ότι MRGD είναι ένας ισχυρός στόχος στη θεραπεία του καρκίνου και ότι μικρού μορίου ανταγωνιστές, αντισώματα ή RNAi για MRGD θα προσφέρει πολλά υποσχόμενη αντικαρκινική θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους συμμετεχόντων, όταν πήραμε όλες τις κλινικές τους ιστούς, και όλα τα πειράματα των κλινικών ιστών διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας στην έρευνα Daiichi Sankyo. Όλες οι εργασίες ζώο έχει διεξαχθεί σύμφωνα με τη σχετική εθνική κατευθυντήρια γραμμή το 2005, όταν μελετήθηκαν τα έργα των ζώων.

Αυτά τα πρωτόκολλα πείραμα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ερευνών ζώων ηθικής Sankyo, στην Sankyo Co., Ltd., η οποία ήταν η προηγηθείσα της Daiichi Sankyo Co., Ltd.

Υλικά και καλλιέργεια κυττάρων

FBS αγοράστηκε από Hyclone (Νότια Logan, UT). DMEM, RPMI1640, Opti-ΜΕΜ, Geneticin και Lipofectamine 2000 αγοράστηκαν από την Life Technologies (Carlsbad, CA). Ρετροϊός κυτταρική γραμμή συσκευασίας, 293-10A1, ιδρύθηκε το εργαστήριο μας από την κυτταρική σειρά 293 (ATCC, CRL-1573) με την επιμόλυνση με PCL 10Α1 (Imgenex, Sorrento Valley, CA). Η 293-10A1 κυτταρική γραμμή διατηρήθηκε με μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, 3 μg /ml του blasticidin (Wako, Osaka, Japan) κάτω από συνθήκες 5% CO

2 στους 37 ° C. ΝΙΗ3Τ3 κυτταρική γραμμή ελήφθη από την ATCC (CRL-1658) και προσαρμόστηκε για μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. Εξαδιμεθρίνη βρωμιούχο αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (Tokyo, Japan). ΗΕΚ293 /ανβ3 κυτταρική γραμμή δημιουργήθηκε από κύτταρα 293 (ATCC, CRL-1573) με σταθερή επιμόλυνση με ιντεγρίνης αν και φορείς έκφρασης β3, και καλλιεργήθηκε σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο 10% FBS.

Δημιουργία ΝΙΗ3Τ3-MRGD κύτταρα

cDNA που κωδικοποιεί πλήρους μήκους ανθρώπινη MRGD, RASV12 ή GFP κλωνοποιήθηκε σε έναν φορέα pLNCX (Clontech Laboratories, Mountain View, CA). Για τη μόλυνση, τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 σπάρθηκαν σε ένα πιάτο 10 cm και καλλιεργήθηκαν για 1-3 ημέρες. Τα κύτταρα 293-10A1 απλώθηκαν σε 10 cm κολλαγόνο Ι-επικαλυμμένες πιάτο (AGC Techno Glass, Chiba, Japan) και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα. pLNCX-MRGD, pLNCX-RASV12 ή pLNCX-Mock επιμολύνθηκε στα κύτταρα 293-10A1 με Lipofectamine 2000. Το υπερκείμενο των διαμολυσμένων 293-10A1 κύτταρα συλλέχθηκαν, τότε φρέσκο ​​μέσο προστέθηκαν για τον επόμενο κύκλο. Το συλλεγόμενο υπερκείμενο διηθήθηκε με μία μεμβράνη 0,45 μm PVDF (Millipore, Billerica, ΜΑ) και το ίσο όγκο μέσου RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και 16 μg /ml εξαδιμεθρίνη βρωμιούχο προστέθηκαν. Αυτή η ιογενής διάλυμα προστέθηκε σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 για μόλυνση. Η σειρά των διαδικασιών αυτών μόλυνση επαναλήφθηκαν τρεις φορές κάθε 12 ώρες. Μετά από 12 ώρες από την τελευταία μόλυνση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με 500 μg /ml Geneticin του για μία εβδομάδα για να συσσωρεύονται τα κύτταρα που εκφράζουν το γονίδιο στόχος.

σχηματισμός Focus δοκιμασία

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε μία πλάκα 6 φρεατίων καλλιέργειας κυττάρων (Corning Ιαπωνία, Tokyo, Japan) και καλλιεργήθηκαν για μία εβδομάδα. Τα καλλιεργημένα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (Wako, Osaka, Japan) επί 30 λεπτά στους 4 ° C και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες (Sigma-Aldrich Japan, Tokyo, Japan).

ανάπτυξη σφαιροειδές δοκιμασία

κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-MRGD αιωρήθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FBS ή 0.1% BSA και απλώθηκε σε 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε 100 μΙ σε 96 φρεατίων σφαιροειδές πλάκα (Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan) . Στην περίπτωση όπου προστέθηκε βήτα-αλανίνη, τα κύτταρα απλώθηκαν σε 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε 80 μΐ και στη συνέχεια 20 μΙ β-αλανίνης προστέθηκε την ίδια ημέρα. Σφαιροειδές ανάπτυξη μετρήθηκε με οποιαδήποτε από τις ακόλουθες μεθόδους. 1) Μέτρηση σφαιροειδές διαμέτρου: σφαιροειδές διαμέτρου μετρήθηκε με οφθαλμικό μικρόμετρο. Κάθε διάμετρος υπολογίσθηκε από την μεγέθυνση ενός αντικειμενικού φακού και ένα προσοφθάλμιο. 2) Μέτρηση σφαιροειδές του ΑΤΡ ποσότητα: Κυττάρων Ο τίτλος-Glo φθορισμού κυττάρων Δοκιμασία Βιωσιμότητας (Promega KK, Τόκιο, Ιαπωνία) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, σφαιροειδές με 100 μΐ αντιδραστηρίου ήταν καλά με πιπέτα και μεταφέρονται σε ένα λευκό επίπεδη πλάκα πυθμένα (Corning Ιαπωνία, Tokyo, Japan). Το 1 δευτερόλεπτο φωταύγεια της πλάκας μετρήθηκε με Mithras LB940 (Berthold Technologies, Wildbad, Germany).

Ανάλυση in vivo ογκογονικότητας MRGD επιμολυσμένα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3

αθυμικά γυμνά ποντίκια (BALB /cAJcl-ηυ /ηυ ποντίκια, CLEA Japan, ηλικίας 5 εβδομάδων, θηλυκό) εμβολιάστηκαν υποδόρια με 3 × 10

6 κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-MRGD (n = 3) ή ΝΙΗ3Τ3-Mock κύτταρα (n = 3), ως αρνητικό έλεγχος. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε 3 φορές την εβδομάδα. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν σύμφωνα με τις ακόλουθες εξισώσεις: Σύμφωνα με τη σχετική εθνική κατευθυντήρια γραμμή, όλα τα ποντίκια ήταν να τους γίνει ευθανασία εάν σημάδι της τοξικότητας όπως μειωμένη δραστηριότητα, μειωμένη όρεξη, μειωμένη κατανάλωση, γλύφει, φυλάει τα άκρα, αυξημένη επιθετικότητα, φώνηση, αποστροφή προς con-ιδιαιτερότητες, αφυδάτωση, λείπει ανατομία, μη φυσιολογική στάση του σώματος, σπασμένο εξάρτημα και πρόπτωση, διάρροια, προοδευτική δερματίτιδα, κυρτή στάση του σώματος, λήθαργος ή επίμονος κατάκλιση, βήχας, δυσκολία στην αναπνοή, ρινική καταρροή, ίκτερο και /ή αναιμία, νευρολογικά συμπτώματα, αιμορραγία από κάθε στόμιο, αυτο-επαγόμενης τραύμα, δυσκολία με βάδιση, η υπερβολική ή παρατεταμένη υπερθερμία ή υποθερμία, ή απώλεια βάρους που υπερβαίνουν το 10% του συνολικού σωματικού βάρους των ποντικών αρνητικού ελέγχου, παρατηρήθηκε. Καμία ένδειξη τοξικότητας παρατηρήθηκε στα ποντίκια κατά τη διάρκεια αυτού του πειράματος.

Παρασκευή αντι-ανθρώπινης MRGD πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού

Το μίγμα των 2 είδη πεπτιδίων, GTVESALNYSRGSTVH (16 mer) και ELEGGETPTVGTNEMGA ( 17 mer), χρησιμοποιήθηκε ως ένα αντιγόνο. Οροί ελήφθησαν από κουνέλια ανοσοποιημένα με το αντιγόνο που παρασκευάζεται με ατελές ανοσοενισχυτικό του Freund (DIFCO, Detroit, ΜΙ) εκτός από την πρώτη ανοσοποίηση, η οποία περιείχε πλήρες ανοσοενισχυτικό Freund (DIFCO, Detroit, ΜΙ). Τέλος, πολύκλωνα αντισώματα IgG καθαρίστηκαν από τα οροί από μία στήλη συνάφειας με τα πεπτίδια αντιγόνου.

ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Η ειδικότητα των αντι-MRGD αντισώματα επικυρώθηκαν με κηλίδωση ΗΕΚ293 ανβ3 κύτταρα /επιμολυσμένα με MRGD εκφράζουν ή κενό φορέα. Αυτά τα προϊόντα επιμόλυνσης μονιμοποιήθηκαν με 20% φορμαλίνη ουδέτερου ρυθμιστικού διαλύματος (Wako, Osaka, Japan) και παραφίνη ενσωματωμένα για να κάνει μπλοκ των κυττάρων. Τα μπλοκ των κυττάρων κόπηκαν σε λεπτές τομές από μικροτόμο και που σε ένα APS-επικαλυμμένο γυάλινο πλακίδιο. Οι τομές ξηραίνονται, de-parafinized και προεπεξεργασία μέσω συστήματος φραγής Βιοτίνη (Dako Ιαπωνία, Tokyo, Japan). Οι τομές στη συνέχεια αποκλείστηκαν με μπλοκ πρωτεΐνη χωρίς ορό (Dako Ιαπωνία, Tokyo, Japan) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-ανθρώπινης MRGD (1/200) εντός αραιωτικού αντισώματος (Dako Ιαπωνία, Tokyo, Japan). Τα τμήματα αντισώματος-αγωγή υποβλήθηκαν σε αγωγή με βιοτινυλιωμένη IgG αντι-κουνελιού, στη συνέχεια κατεργάζεται με ABC-ΑΡ της Vectastain ABC kit IgG αλκαλική φωσφατάση κονίκλου (CliniScience, Montrouge, Γαλλία). AP κόκκινο της Kit αλκαλική φωσφατάση υποστρώματος που χρησιμοποιήθηκε ως χρωστική υπόστρωμα. τομές καρκινικού ιστού παρασκευάστηκαν από εμπεδωμένα με παραφίνη μπλοκ και ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο ABC.

Μέτρηση της έκφρασης του γονιδίου σε κλινικές MRGD ιστό

Ολικό RNA του όγκου ή μη-όγκου ιστούς από κλινικά το ίδιο δότη αγοράστηκαν από BioChain (Hayward, CA). Αυτά τα δείγματα ζεύγος RNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΑΤΡ-εξαρτώμενη DNase (Toyobo, Osaka, Japan) με 10 μονάδες αναστολέα ΚΝάσης (Toyobo, Osaka, Japan) επί 15 λεπτά επί πάγου. Η DNase αφαιρέθηκε από το συνολικό σύστημα miniprep RNA (VIOGENE, Taipei County, Ταϊβάν). Για να ληφθεί cDNA, ένα μίγμα εκμαγείου συνολικού RNA (2 ng), τυχαία εναύσματα (9 mer, 50 pmol), ReverTra Ace (10 μονάδες, Toyobo, Osaka, Japan) και ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης (50 mM Tris-HCl ρΗ 7,5, 75 mM ΚΟΙ, 6 mM MgCl

2, 1 mM DTT, 1 mM ρυθμιστικό dNTP) επωάστηκε στους 25 ° C για 15 λεπτά, 42 ° C για 30 λεπτά, και στη συνέχεια 95 ° C για 3 λεπτά. αντίδρασης σε πραγματικό χρόνο-PCR πραγματοποιήθηκε με TaqMaq One-Step RT-PCR Master Mix (Life Technologies Ιαπωνία, Tokyo, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, χρησιμοποιώντας την ακόλουθη καθετήρα και εναύσματα.

MRGD

-2 (αλληλουχία ανιχνευτή TaqMan): TGTGTGCCACCATGCCTGGCTAATT

MRGD

-F2 (Forward αστάρι σειρά): GCTCACTACAACCTCAATGTGCC

MRGD

-R2 (Reverse αστάρι ακολουθία): GCCACATAGCAAGATCTCATCTCTAC

δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με TaqMan αντιδραστήριο ελέγχου β-ακτίνης (Life Technologies Ιαπωνία, Tokyo, Japan). Αυτές οι εκφράσεις γονιδίων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Mx3000P QPCR System (Agilent Technology, Santa Clara, CA).

Στατιστικές Αναλύσεις

Όλα τα

vitro

πειράματα αναλύθηκαν με Mann-Whitney U -ΜΕΛΕΤΕΣ, εκτός ποσοτική ανάλυση RT-PCR σε κλινικά δείγματα, τα οποία αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA. Αναφερθεί σ τιμές είναι δύο ουρές και θεωρούνται στατιστικά σημαντικές σε ρ & lt?. 0.05

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης

του ενισχυμένου με PCR ενθέματα cDNA. επιβεβαιώθηκαν οι αλληλουχίες νουκλεϊκών οξέων των προϊόντων της PCR για ένθετα φορέα. Διαδρομή 1 και 3: RT-PCR-ενισχύθηκε GFP από ολικό RNA από ΝΙΗ3Τ3-GFP? λωρίδα 2: Ενισχυμένα GFP από το πλασμίδιο GFP (θετικός έλεγχος)? λωρίδα 4 και 6: RT-PCR-ενισχύθηκε MRGD από ολικό RNA των ΝΙΗ-3Τ3-MRGD? λωρίδα 5:. ενισχυμένου MRGD από MRGD πλασμίδιο (θετικός μάρτυρας)

doi: 10.1371 /journal.pone.0038618.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

κυτταρικό πολλαπλασιασμό των NIN3T3-MRGD σφαιροειδές μετράται από [

3Η] -θυμιδίνης. [

3Η] -θυμιδίνης στα σφαιροειδή μετρήθηκε στις 6 ημέρες μετά την επίστρωση. * Υποδηλώνει p & lt? 0.005 (Mann-Whitney U test, 2 ουρές)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0038618.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

HE χρώση των ΝΙΗ3Τ3-MRGD μεταμοσχευμένου ιστού σε γυμνό ποντίκι. Οι μάζες ΝΙΗ3Τ3-MRGD στις 7 ημέρες μετά τον εμβολιασμό σε ποντίκια χωρίς θύμο αδένα (Α, Χ 40, Β, Χ 800) έδειξε ένα αντιπροσωπευτικό τύπο κυτταρικό ιστό του όγκου της ατράκτου κυττάρων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0038618.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

HE και IHC χρώσεις δειγμάτων αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα με αντι-MRGD αντισώματος. HE χρώση (A, C, E) και IHC χρώση (Β, D, F) διεξήχθησαν. Αυτά είναι τα παραδείγματα από τρεις ανεξάρτητες ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Ο ασθενής 1, Α, Β? Ο ασθενής 2, C, D? Ασθενής 3, Ε, ΣΤ

doi: 10.1371 /journal.pone.0038618.s004

(ΔΕΘ)

αρχείου S1.

Υλικό και Μέθοδοι του σχήματος S2.

doi: 10.1371 /journal.pone.0038618.s005

(DOC)

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τα μέλη της R &? Δ Τμήμα της Daiichi Sankyo? Ν Maeda και Ν Abe για την κατασκευή μπλοκ των κυττάρων, Μ Yamada για χρώση HE και IHC δείγματα, Σ Endo για στατιστική ανάλυση, και ο Δρ Μ Ono, ο Δρ Π Rodley και ο Δρ Γ Abe για την παροχή συμβουλών σε η συγγραφή της παρούσας έκθεσης.