Abstract

Τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα ενεργοποιούνται γονίδιο-1 (NAG-1) που προκαλείται από μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα και έχει προαποπτωτικά και αντιογκογένεσης δραστηριότητες. Αν και τολφεναμικό οξύ (ΤΑ) διεγείρει απόπτωση σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα, η σχέση μεταξύ NAG-1 και ΤΑ δεν έχει προσδιορισθεί. Αυτή η μελέτη διερεύνησε την επαγωγή της απόπτωσης σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα επεξεργασμένα με TA και ο ρόλος της NAG-1 έκφραση σε αυτό το επαγωγή. TA μειωμένη κεφάλι και η κυτταρική βιωσιμότητα του τραχήλου σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο και απόπτωση. Η επαγόμενη απόπτωση συμπίπτει με την έκφραση του NAG-1. Η υπερέκφραση του NAG-1 ενίσχυσε την αποπτωτική δράση του ΤΑ, ενώ η καταστολή της NAG-1 έκφραση από μικρό παρεμβαλλόμενο RNA εξασθενημένος TA-επαγόμενη απόπτωση. TA ανέστειλε σημαντικά το σχηματισμό όγκου όπως αξιολογήθηκε από τα μοντέλα ξενομοσχεύματος, και αυτό το αποτέλεσμα συνόδευσαν την επαγωγή των αποπτωτικών κυττάρων και NAG-1 έκφραση σε δείγματα ιστού του όγκου. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η ΤΑ προκαλεί απόπτωση μέσω NAG-1 έκφραση σε κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, παρέχοντας ένα επιπλέον μηχανιστική εξήγηση για την αποπτωτική δραστικότητα του ΤΑ

Παράθεση:. Kang SU, Shin YS, Hwang HS, Μπεκ SJ, Lee SH, Kim CH (2012) τολφεναμικό οξύ επάγει την απόπτωση και αναστολής της ανάπτυξης σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου: Συμμετοχή του ΝΑΟ-1 έκφρασης. PLoS ONE 7 (4): e34988. doi: 10.1371 /journal.pone.0034988

Επιμέλεια: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 του Γενάρη του 2012? Αποδεκτές: 8, Μαρ 2012? Δημοσιεύθηκε: 19 Απρίλη 2012

Copyright: © 2012 Kang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την Κορέα Ίδρυμα Ερευνών και Μελετών Grant (KRF-013-2009-1-E00015) και CCRB μέσω του προγράμματος «GRRC» της Gyeonggi επαρχιακή κυβέρνηση, την Κορέα (GRRC Ajou-2011-A03). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

με πάνω από 500.000 περιπτώσεις σε όλο τον κόσμο και ένα υψηλό ποσοστό θνησιμότητας, το κεφάλι και το λαιμό ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (HNSCC) είναι η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες. Ακόμη και με βελτιωμένες θεραπείες, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης ήταν κάτω από 50% για τα τελευταία 30 χρόνια [1]. Αν και μερικοί ασθενείς επιτευχθεί μακροπρόθεσμη επιβίωση, ιδιαίτερα αυτούς που διαγνώστηκαν με πρώιμο στάδιο της νόσου, οι περισσότεροι ασθενείς με αυτόν τον τύπο καρκίνου έχουν προχωρημένη νόσο κατά το χρόνο της διάγνωσης. Οι ασθενείς αυτοί διατρέχουν κίνδυνο επανεμφάνισης της νόσου, απομακρυσμένες μεταστάσεις, ή το δεύτερο πρωτογενών όγκων, και να έχουν μια μέση επιβίωση μόνο 6-8 μήνες [2]

Το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για ασθενείς με προχωρημένο HNSCC είναι γύρω στο 30%, το οποίο είναι ουσιαστικά αμετάβλητη από το ποσοστό που καταγράφηκε πριν από δύο δεκαετίες, παρά τις διάφορες δοκιμές θεραπείας. Ως εκ τούτου, προληπτικές στρατηγικές είναι επιθυμητή, και μεγάλο μέρος της έρευνας αφιερώνεται σήμερα στις χημειοπροφύλαξη που έχει ως στόχο να αποτρέψει την εξέλιξη HNSCC σε πρώιμο στάδιο. Ωστόσο, το οποίο χημειοπροληπτικές παράγοντες είναι η ασφαλέστερη και πιο αποτελεσματική ενάντια HNSCC παραμένει ασαφής. Είναι κλινική σημασία για τη διερεύνηση της αποτελεσματικότητας των μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων (NSAIDs), όπως παράγοντες προφύλαξης.

Χημειοαποτρεπτική παράγοντες παίζουν σημαντικό ρόλο στην διακοπή της καρκινογένεσης διαδικασία και την παρεμπόδιση της επανεμφάνισης των προκαρκινικών αλλοιώσεων. Προς το παρόν, οι φαρμακευτικές αγωγές που έχουν ευρύτατα ερευνηθεί ως chemopreventive παράγοντες είναι ΜΣΑΦ. NSAIDs έχουν χρησιμοποιηθεί κλινικώς ως παράγοντες προφύλαξης για την οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση, με τον τρόπο δράσης είναι η αναστολή της κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2) [3], [4]. Ωστόσο, χημειοπροληπτικές και αντιογκογένεσης δραστηριότητες των NSAIDs έχουν επίσης παρατηρηθεί σε COX-2 κύτταρα με ανεπαρκές, υποδεικνύοντας ότι τα ΜΣΑΦ ασκούν επίσης αντικαρκινική τους δράση μέσω ενός μηχανισμού εκτός από την καταστολή της COX-2. Ένας τέτοιος μηχανισμός περιλαμβάνει την επαγωγή του NSAID ενεργοποιημένης γονίδιο-1 (NAG-1) [5].

NAG-1 ταυτοποιήθηκε από ινδομεθακίνη (ένας αναστολέας COX) επαγόμενη γονιδιακή βιβλιοθήκη [5]. NAG-1 είναι ένα μέλος της αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης-β (ΤΟΡ-β) υπεροικογένεια και είναι επίσης γνωστή ως μακροφάγων ανασταλτική κυτοκίνης-1 (MIC-1), παράγοντα διαφοροποίησης αύξησης 15 (GDF15), και του προστάτη που προέρχονται παράγοντα (PDF) [6], [7], [8]. Καθαρισμένη ανασυνδυασμένη NAG-1 είναι σε θέση να αναστέλλει τη προκαλούμενη από λιποπολυσακχαρίτη παράγοντα νέκρωσης όγκου-άλφα (TNF-α) παραγωγή σε μακροφάγα, γεγονός που υποδηλώνει ότι NAG-1 δρα ως αυτοκρινής ρυθμιστικό μόριο [9].

In vitro

και

in vivo

, NAG-1 έχει αντι-ογκογόνο και προ-αποπτωτική δραστηριότητα ανεξάρτητη από COX αναστολής [5], [10]. NSAIDs και αρκετές αντιογκογένεσης ενώσεων με χημειοπροληπτική δραστηριότητες, συμπεριλαμβανομένων ρεσβερατρόλη, genistein, κατεχίνες, και ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα

γ

συνδέτες, ρυθμίζουν την έκφραση NAG-1 σε ένα προσταγλανδίνη ανεξάρτητο τρόπο [11], [12] , [13], [14], [15].

Ωστόσο, μέχρι σήμερα, η σχέση, αν υπάρχει, μεταξύ ΝΑΟ-1 και TA στο HNSCC δεν έχει διερευνηθεί. Προ-αποπτωτική δραστικότητα του NAG-1 μπορεί να παρέχει μια μοριακή βάση για να εξηγήσει χημειοαποτρεπτικό παράγοντα, TA-μεσολάβηση antitumorigenesis.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την ρύθμιση της NAG-1 έκφραση κατά την διάρκεια TA-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα HNSCC . NAG-1 μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) μεσολάβηση αναστολή της NAG-1 έκφραση εξασθενημένα TA-επαγόμενη απόπτωση. Επιπλέον, η

in vivo

αντιογκογένεσης δραστηριότητα της ΤΑ σε ποντίκια ερευνήθηκε για να αξιολογήσει τη χρήση ΤΑ ως chemopreventive παράγοντα σε HNSCC. Τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η επαγωγή της NAG-1 μπορεί να παρέχει ένα νέο μηχανισμό για την κατανόηση των κατάντη δράστες για TA-επαγόμενη απόπτωση σε HNSCC.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

Τέσσερις εγκατεστημένος γραμμές ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων της κεφαλής και του λαιμού – ΚΒ (μια στοματική καρκινική κυτταρική γραμμή), SCCQLL1 (μια στοματική καρκινική κυτταρική γραμμή), ΗΝ3 (α λαρυγγική καρκινική κυτταρική γραμμή), και FaDu (α υποφάρυγγα καρκινική κυτταρική γραμμή) – λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και της Κορέας Κυτταρική Γραμμή Τράπεζα (Σεούλ, Κορέα). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη στα 100 U /ml (GIBCO, Carlsbad, CA) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2 και 95% αέρας. TA, δικλοφενάκη, σουλινδάκη σουλφίδιο, ινδομεθακίνη, πιροξικάμη και (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) διαλύθηκαν σε αυτόκλειστο νερό ως διάλυμα αποθέματος για

in vitro

μελέτες. Για τη διερεύνηση της επίδρασης της TA στα φυσιολογικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα HaCaT (φυσιολογικά κερατινοκύτταρα) που ελήφθησαν από Κορέας γραμμή Τράπεζας Κυττάρων (Σεούλ, Κορέα).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία με βάση την μετατροπή του 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ-τετραζολίου (ΜΤΤ? Sigma Aldrich). διάλυμα ΜΤΤ προστέθηκε σε 40 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος για 4 ώρες. Μετά από τρεις πλύσεις με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS, ρΗ 7,4), το αδιάλυτο προϊόν φορμαζάνης διαλύθηκε σε 100 μλ διμεθυλοσουλφοξειδίου. Η οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε για κάθε καλλιέργεια και χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-Tek, Winooski, VT) στα 540 nm. Η OD των κυττάρων ελέγχου ελήφθησαν ως 100% βιωσιμότητα.

Terminal δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης μεσολάβηση dUTP-βιοτίνη nick τέλος επισήμανση (τούνελ) δοκιμασία

DNA κατάτμηση αναλύθηκε με το

in situ

κιτ ανίχνευσης θανάτου κυττάρου (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).

Κυτταρομετρία ροής ανίχνευση της απόπτωσης

Η απόπτωση ανιχνεύθηκε με τη χρήση της Annexin V-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) ανίχνευσης απόπτωσης σετ (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ). Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας 6 φρεατίων και επωάστηκαν με 0, 10, 20, και 40 μΜ TA για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, και χρωματίστηκαν με Αννεξίνη V-FITC και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Πρώιμη και καθυστερημένη απόπτωση προσδιορίστηκαν ποσοτικά σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απόπτωση ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα FACS Canto (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ), με τις ρυθμίσεις διέγερσης και εκπομπής των 488 και 530 nm, αντίστοιχα.

μεμβράνη Μιτοχονδριακή δυναμικό (ΜΜΡ) δοκιμασία

ΜΜΡ ανέπαφων κυττάρων μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής με το λιπόφιλο κατιονικό ανιχνευτή 5,5 V, 6,6 V-τετραχλωρο-1,1 V 3,3 V-τετρα ιωδιούχο ethylbenzimidazolcarbocyanine (JC-1? Molecular Probes, Eugene, OR). Το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε για λίγο από τα προσκολλημένα κύτταρα ΚΒ και τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS. μονοστοιβάδες των κυττάρων επωάστηκαν με DMEM και 5 μg /ml JC-1 στους 33 ° C για 20 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και επεξεργασία με θρυψίνη. Οι σβώλοι κυττάρων μετά επαναιωρήθηκαν σε 500 μΙ PBS. Η αλλαγή στην MMP μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής (BD Biosciences) και μικροσκοπία φθορισμού σε 72 ώρες μετά την ακτινοβόληση.

Transfectiom του NAG 1-cDNA και παρεμβολή RNA (RNAi)

Όλα τα πειράματα επιμόλυνσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [5]. Μετά από επώαση για 24 ώρες, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και υποβλήθηκε σε επεξεργασία είτε με ΤΑ ή όχημα για 24 ώρες. NAG-1 cDNA περιγράφηκε προηγουμένως [5]. siRNA για τον έλεγχο και NAG-1 (νόημα και αντινόημα CUCAGUUGUCCUGCCCUGUdTdT ACAGGGCAGGACAACUGAGdTdT) αγοράστηκαν από την Invitrogen.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS και εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Sigma-Aldrich) συμπληρωμένο με PhosSTOP και πλήρης μίνι EDTA-free (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland). Οι πρωτεΐνες από κύτταρα ΚΒ ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες Immobilon-P (Millipore, Bedford, ΜΑ). Ανίχνευση ειδικών πρωτεϊνών διεξήχθη με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια Western blotting κιτ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

μελέτη σε ζώα

ΚΒ κύτταρα (1 χ 10

6) εκ νέου εναιώρηση σε PBS υποδορίως χορηγείται στο πλευρό του κάθε BALB /c ηυ /ηυ ποντικό κάτω δεξιά. Μετά από 1 εβδομάδα, όταν οι όγκοι έφθασαν περίπου 100 mm σε διάμετρο, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες (η = 10 ανά ομάδα) και ξεκίνησε θεραπεία. Η αγωγή ξεκίνησε την ημέρα μετά την εμφύτευση των κυττάρων είτε με ενδοπεριτοναϊκή ένεση TA (25 mg /kg) ημερησίως (ομάδες θεραπείας) ή φυσιολογικού ορού μόνο (ομάδα ελέγχου). Οι όγκοι μετρήθηκαν με συρόμενη δαγκάνα μία φορά κάθε 2 ημέρες και (3 mm

) υπολογίστηκαν οι όγκοι σύμφωνα με τον τύπο V = Α χ B

2 × 0,52, όπου το Α είναι η μεγαλύτερη επιφανειακή διάμετρος και το Β είναι η μικρότερη επιφανειακή διάμετρος [16]. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι όγκοι συλλέχθηκαν και ζυγίστηκαν 17 ημέρες μετά την εμφύτευση. Το ήμισυ του ιστού ήταν συμπληρωματικό καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και χρησιμοποιήθηκαν για την εκχύλιση των πρωτεϊνών. Το άλλο μισό είχε καθοριστεί για μία νύχτα σε ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη και υποβάλλονται σε επεξεργασία με μεθόδους ρουτίνας. Western κηλίδωση του NAG-1 εκτελέστηκε σε δείγματα όγκου και φυσιολογικών δειγμάτων μαλακών ιστών. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας σε πειράματα με ζώα της Ajou Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου.

Στατιστικές αναλύσεις

Σε περίπτωση που τα δεδομένα προήλθαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα, οι παράμετροι εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Η σύγκριση των μέσων των διαφόρων ομάδων έγινε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης. Η δοκιμή Student-Newman-Keuls χρησιμοποιήθηκε για ζεύγη συγκρίσεις βρέθηκε να είναι σημαντικά από επαναλαμβανόμενες μετρήσεις της ANOVA αποτελεσμάτων. Η στατιστική σημαντικότητα συναχθεί σε

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Πρόκληση ΝΑΟ-1 και την απόπτωση σε HNSCC κύτταρα από διάφορες ΜΣΑΦ

Για να διερευνήσουν οι επιδράσεις των ΜΣΑΦ στην ανάπτυξη των κυττάρων HNSCC, οι τέσσερις επιλεγμένες κυτταρικές σειρές HNSCC επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις (0, 5, 10, 30, 50, 70, 100, 150, και 200 ​​μΜ) του ΤΒ για 16 ώρες και κύτταρο βιωσιμότητα μετρήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, διάφορα NSAIDs μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 1Α) και TA μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα των HNSCC κυτταρικές σειρές (Σχ. 1Β). Ιδιαίτερα, TA ήταν η πιο ισχυρός επαγωγέας τόσο απόπτωση και NAG-1 έκφρασης (Σχ. 1 και 2), και επιλέχθηκε για περαιτέρω έρευνα. Στη συνέχεια, για να διερευνηθούν οι τοξικές επιδράσεις του ΤΑ στα φυσιολογικά κύτταρα, πραγματοποιήσαμε ποσοτικό προσδιορισμό του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε κύτταρα HaCaT (φυσιολογικά κερατινοκύτταρα). κύτταρα HaCaT υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΤΒ για 16 ώρες στις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις (0, 5, 10, 30, 50, 70, 100, 150, 200 μΜ). Η σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων HaCaT εξετάστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ (Εικ. 1 C). TA ήταν ελάχιστα κυτταροτοξική επί HaCaT μέχρι 100 μΜ, αλλά TA ήταν σημαντική κυτταροτοξική για τα κύτταρα στις υψηλές συγκεντρώσεις.

Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας πολλαπλασιασμού. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας ιστών 96 φρεατίων στα 1000 κύτταρα /φρεάτιο σε τελικό όγκο 100 μΐ μέσου και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 2 ημέρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή μια φορά με διάφορες δόσεις ΤΒ για 24 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± S.D. από πέντε ανεξάρτητα πειράματα. *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. (Α) Ο καρκίνος κεφαλής και τραχήλου κυτταρική σειρά KB υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΜΣΑΦ. (Β) Η κυτταροτοξικότητα της TA σε διάφορα κύτταρα HNSCC. (C) Η κυτταροτοξικότητα του TA επί κανονικών κερατινοκυττάρων (HaCaT)

Η

(Α) NAG-1 έκφραση που προκαλείται από μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα με την ακόλουθη σειρά:. TA, ινδομεθακίνη, σουλινδάκη σουλφίδιο, δικλοφενάκη, πιροξικάμη και . Η έκφραση του NAG-1 μετρήθηκε με ανάλυση Western blot και ομαλοποιήθηκε ως προς το επίπεδο της α-τουμπουλίνης έκφρασης. (Β) Επαγωγή NAG-1 έκφρασης σε διάφορες κυτταρικές γραμμές καρκίνου κεφαλής και λαιμού από την ΤΑ. (Γ και Δ) TA δόση και αυξάνει το χρόνο-εξαρτώμενο επίπεδα πρωτεΐνης NAG-1 σε κύτταρα ΚΒ. ΚΒ κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 10, 30, και 40 μΜ TA για 24 ώρες. Η έκφραση του NAG-1 μετρήθηκε με ανάλυση Western blot και α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η ίδια μεμβράνη απογυμνώθηκε και επανα-διερευνήθηκαν με διασπασμένης ΡΑΚΡ και διασπασμένη κασπάση-3 αντίσωμα.

Η

Για να διερευνηθεί η σχέση μεταξύ του NSAID επαγόμενη απόπτωση και NAG-1 έκφραση, τα κύτταρα HNSCC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες οι συγκεντρώσεις των επιπέδων NSAID και πρωτεΐνη του NAG-1 μετρήθηκαν με ανάλυση αποτύπωσης Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, διάφορα NSAIDs επαγόμενη την έκφραση του NAG-1 πρωτεΐνης σε κύτταρα ΚΒ (Εικ. 2Α) και TA επαγόμενη έκφραση του NAG-1 σε διάφορα κύτταρα HNSCC (Εικ. 2Β). TA επαγόμενη επίσης έκφραση της πρωτεΐνης NAG-1 σε δόση και χρονο-εξαρτώμενη τρόπους (Σχ. 2C και 2D). Όταν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 40 μΜ του ΤΑ για διάφορους χρόνους, επαγωγή πρωτεϊνών NAG-1 παρατηρήθηκε μετά από 3 ώρες σε κύτταρα ΚΒ (Σχ. 2D). Η ίδια μεμβράνη απογυμνώθηκε και την εκ νέου ανιχνεύτηκαν για διασπασμένο πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) και διασπασμένη κασπάση 3, τα οποία επίσης επάγεται από ΤΑ (Σχ. 2C και 2D). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι TA-επαγόμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο και διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων σε κυτταρικές σειρές HNSCC πιθανώς διαμεσολαβείται από την έκφραση της προ-αποπτωτική πρωτεΐνη NAG-1. Για να καθοριστεί εάν το TA-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο με απόπτωση ήταν, εκτελέσαμε ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων (FACS) με Annexin-V /χρώση ΡΙ και δοκιμασία TUNEL. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, αννεξίνης V-FITC-θετικά κύτταρα αυξήθηκαν επίσης με κατεργασία TA σε κύτταρα ΚΒ (Εικ. 3Α) και TUNEL-θετικών κυττάρων από την ΤΑ αυξήθηκαν με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (0, 10, 20, και 40 μΜ) σε KB κύτταρα (Σχ. 3Β). ΜΜΡ μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης της μιτοχονδριακής άνοιγμα πόρου, η οποία είναι ένας δείκτης της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας. Ποσοτική ανάλυση του κόκκινου και του πράσινου σήματα φθορισμού από ενδοκυτταρικό χρωστική JC-1 αντικατοπτρίζει το βαθμό μιτοχονδριακές βλάβες. Επομένως, εξετάσαμε την επίδραση της TA επί ΜΜΡ στα κύτταρα ΚΒ να καθορίσει αν η απώλεια της ΜΜΡ θα μπορούσαν να διαδραματίσουν ένα ρόλο στην TA-επαγόμενη απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3C, ένα υψηλό ΜΜΡ διατηρήθηκε σε κύτταρα ελέγχου, όπως υποδεικνύεται από το κυρίως ερυθρός φθορισμός της χρωστικής JC-1. Ωστόσο, η θεραπεία TA αύξησε τον πράσινο φθορισμό κύτταρο υποδεικνύοντας μία απώλεια του ΜΜΡ και μιτοχονδριακή βλάβη (Σχ. 3C).

(Α) Για την ανίχνευση με κυτταρομετρία ροής των αποπτωτικών κυττάρων, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας 6 φρεατίων και επωάστηκαν με 0, 10, 20, 30 και 40 μΜ TA για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια χρωματίζονται με αννεξίνη V-FITC και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Πρώιμη και την όψιμη απόπτωση ποσοτικά. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές που λαμβάνονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα και ράβδοι παριστάνουν τυπικές αποκλίσεις. (Β) Τα αποτελέσματα της ανάλυσης TUNEL. Απόπτωση σε ΚΒ κυττάρων προσδιορίστηκε με την μέθοδο TUNEL χρησιμοποιώντας μια in situ κιτ ανίχνευσης κυττάρων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του ΤΑ για 24 ώρες. χρώση TUNEL ήταν αυξημένη σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Αριστερά, 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ)? μέση, TUNEL? δεξιά, συγχώνευση. Η γραμμή κλίμακας δείχνει 50 μm. (Γ) Η επίδραση του ΤΑ στην μιτοχονδριακή αποπτωτικό μονοπάτι. Μετά την εφαρμογή 10, 20, 30, και 40 μΜ ΤΒ για 24 ώρες, ο φθορισμός JC-1 μετατοπίστηκε από το κόκκινο-πορτοκαλί σε πράσινο, υποδηλώνοντας αποπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (ΜΜΡ). Η αλλαγή ΜΜΡ ήταν αντικειμενικά μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

Η υπερέκφραση και καταστολή της NAG-1 προωθεί και εξασθενεί TA-επαγόμενη απόπτωση, αντίστοιχα

στη συνέχεια, προσπαθήσαμε να διευκρινιστεί η σημασία της NAG-1 ανοδική ρύθμιση σε TA-επαγόμενη απόπτωση. Ανθρώπινη NAG-1 cDNA διαμολύνθηκε σε κύτταρα ΚΒ. NAG-1 υπερέκφραση προκάλεσε αυξημένη κασπάσης-3 διάσπαση και διασπασμένη PARP, και τη θεραπεία του KB /NAG-1 με 40 μΜ TA ενισχύεται περαιτέρω τόσο διασπασμένης κασπάσης-3 και διασπασμένη PARP, σε σύγκριση με TA-κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 4Α). Παράλληλα με την αύξηση της κασπάσης-3, τα κύτταρα ΚΒ /NAG-1 σημαντικά αυξημένη τυπικά μορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης, συμπεριλαμβανομένης χρώσης αννεξίνης V-θετικά και TUNEL θετικών κυττάρων, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Αυτή η επίδραση αυξήθηκε περαιτέρω με κατεργασία ΤΑ (Σχ. 4Β και 4C). Στη συνέχεια εξετάστηκε αν η καταστολή της NAG-1 έκφραση μπορεί να διαμορφώσει TA-επαγόμενη απόπτωση. ΚΒ κύτταρα επιμολυσμένα με είτε NAG-1 siRNA ή ελέγχου siRNA υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς 30 μΜ TA για 24 ώρες. Η ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως έδειξε ότι μορφομετατροπή του siRNA κατά NAG-1 κατέστειλε την έκφραση του NAG-1, διασπασμένη PARP και διασπασμένη κασπάση 3 παρουσία του ΤΑ, σε σύγκριση με τον έλεγχο επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 5Α). Υπό αυτές τις συνθήκες, TA-μεσολάβηση αννεξίνης V-θετικά και TUNEL-θετικά κύτταρα ήταν σημαντικά εξασθενημένη σε κύτταρα επιμολυσμένα με NAG-1 siRNA (Σχ. 5Β και 5C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι NAG-1 παίζει ένα ρόλο στην απόπτωση και ότι η αναστολή της NAG-1 σε κύτταρα ΚΒ επηρεάζουν TA-επαγόμενη απόπτωση. Επιπλέον, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι TA-επαγόμενη NAG-1 πάνω ρύθμιση μπορεί να είναι ένας από τους υποκείμενους μηχανισμούς που συμβάλλουν στην TA-επαγόμενη απόπτωση.

ΚΒ /NAG-1 και κύτταρα ΚΒ /φορέα έλαβαν αγωγή με 30 μΜ TA για 24 ώρες, και η απόπτωση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία TUNEL και με FACS με αννεξίνη V-FITC /ΡΙ. (Α) Western Blot. Ίσες ποσότητες των προϊόντων λύσης κυττάρου (30 μγρ) αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής δωδεκυλ θειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE), μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και διερευνήθηκαν με αντι-NAG-1, PARP, διασπασμένη κασπάση 3, ή α-τουμπουλίνης αντίσωμα. (Β και Γ) Απόπτωση σε κύτταρα ΚΒ προσδιορίστηκε με την μέθοδο TUNEL και FACS με AnnexinV-FITC /PI, όπως περιγράφεται στο Σχ. 3. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές που λήφθηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα και μπάρες αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. Η ράβδος κλίμακα δηλώνει 50 μm.

Η

ΚΒ κύτταρα επιμολυσμένα με είτε την υποδεικνυόμενη NAG-1 siRNA ή αρνητικό siRNA ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 30 μΜ TA για 24 ώρες. Η απόπτωση αναλύθηκε με τη δοκιμασία TUNEL και με FACS με AnnexinV-FITC /ΡΙ. (Α) Western Blot. Ίσες ποσότητες των προϊόντων λύσης κυττάρου (30 μγρ) αναλύθηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, και ανιχνεύθηκαν με αντι-NAG-1, PARP, διασπασμένη κασπάση 3, orαα-τουμπουλίνης. (Β και Γ) Απόπτωση σε κύτταρα ΚΒ προσδιορίστηκε με την μέθοδο TUNEL και FACS με AnnexinV-FITC /PI, όπως περιγράφεται στο Σχ. 3. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές που λήφθηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα και μπάρες αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. Η γραμμή κλίμακας δείχνει 50 μm.

Η

Επίδραση της ΤΑ για ογκογονικότητα και την απόπτωση σε BALB /c ποντίκια nu /nu

Για να προσδιορίσετε αν τα πιο πάνω αποτελέσματα ήταν εμφανή

in vivo

, χρησιμοποιήσαμε το /c ποντίκια ηυ /ηυ BALB και τους διαιρούνται τυχαία εξ ίσου σε ομάδα ελέγχου και θεραπείας (/kg τΑ 25 mg) ομάδα μετά το σχηματισμό όγκων (περίπου 100 mm σε διάμετρο). Όλοι οι ποντικοί επιβίωσαν σε όλη την πειραματική περίοδο. Χορήγηση ΤΑ επηρέασε σημαντικά το σχηματισμό όγκων και της ανάπτυξης (

σ

& lt? 0,05? Τα Σχ. 6Α και 6Β). Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων στο σωματικό βάρος. χρώσης TUNEL αποκάλυψε ότι TA αύξησε σημαντικά τον αριθμό των TUNEL θετικών κυττάρων (Εικ. 6C). Για να διερευνηθεί το επίπεδο της NAG-1 στους όγκους, κηλίδωση Western του NAG-1 έκφραση σε δείγματα όγκων του BALB /c ηυ /ηυ ποντικούς διεξήχθη. Ισχυρή επαγωγή του

in vivo

NAG-1 έκφραση σε πρωτεΐνες που εκχυλίστηκαν από όγκους σε TA-αγωγή ποντικούς ήταν εμφανής, σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου. (Εικ. 6D) Τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ΤΑ αυξάνει την έκφραση του NAG-1 σε όγκους και ότι η επαγόμενη NAG-1 καταστέλλει το μέγεθος των όγκων.

(Α) BALB /c ηυ /ηυ ποντικοί ήταν τυχαία διαιρείται σε δύο ίσες ομάδες (έλεγχος και 25 mg /kg) μετά από έγχυση κυττάρων ΚΒ. Μετά το σχηματισμό όγκων (περίπου 100 mm σε διάμετρο), η θεραπεία ξεκίνησε με ενδοπεριτοναϊκή ένεση είτε TA (25 mg /kg) ημερησίως (ομάδες αγωγής) ή έναν ίσο όγκο φυσιολογικού ορού μόνο (ομάδα ελέγχου). Τα ζώα θανατώθηκαν και οι όγκοι συλλέχθηκαν και ζυγίστηκαν 17 ημέρες μετά την εμφύτευση. (Β) Διάγραμμα του όγκου και του βάρους των όγκων. (Γ) ΤϋΝΕΕ χρώση σε ομάδες ελέγχου και θεραπείας. Η γραμμή κλίμακας δείχνει 50 μm. (D) NAG-1 έκφραση σε εμφυτεύονται KB όγκους. Η επαγωγή NAG-1 από την ΤΑ συγκρίνεται με κάθε έλεγχο.

Η

Συζήτηση

NSAIDs αναστέλλουν την COX-εξαρτώμενη σύνθεση των προσταγλανδινών που διαμεσολαβούν τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις σε πολλαπλούς ιστούς [3], [ ,,,0],4], [5]. NSAIDs επάγουν επίσης αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, την απόπτωση, και αντιαγγειογένεση? ενεργοποίηση των οδών που εμπλέκονται σε αυτές τις επιδράσεις είναι κρίσιμη για τις αναφερόμενες αντικαρκινική δραστηριότητα των ΜΣΑΦ και των σχετικών αναστολέων της COX-2, όπως το celecoxib [17], [18], [19], [20], [21]. Εκτεταμένες επιδημιολογικές μελέτες του ρόλου των NSAIDs στην πρόληψη και θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου έχει παράσχει αποδείξεις ότι η χρήση των NSAIDs, όπως η ασπιρίνη και κάποια αναστολέων COX-2, συνδέεται με μια μείωση στη συχνότητα εμφάνισης ή /και της θνησιμότητας του καρκίνου του παχέος εντέρου [22], [23], [24].

Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι NSAIDs έχουν άλλους στόχους εκτός από την COX-2. Αυτός et al [25]. ανέφερε ότι το δέλτα υποδοχέα ενεργοποίησης πολλαπλασιασμό υπεροξεισωμάτων (ΡΡΑΡδ) είναι επίσης ένα αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC) -regulated στόχος των ΜΣΑΦ. Επιπλέον, τα ΜΣΑΦ μεταβολίτες μπορεί να καταστείλει το σήμα επιβίωσης πυρηνικού παράγοντα-κΒ (NF-κΒ) μέσω I κΒ κινάσης α (IκKα) αναστολή [26]. Αυτά δείχνουν ότι NSAIDs αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου μέσω της COX-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από μονοπάτια.

ΤΑ είναι ένας ισχυρός, καλά ανεκτή NSAID με χαμηλό γαστρικό παρενέργεια και υψηλό θεραπευτικό δείκτη, σε σύγκριση με άλλα ΜΣΑΦ [27] . Διαθέτει αντιπυρετικές και αναλγητικές δραστηριότητες όπως αποδεικνύεται σε αρκετά ζωικά μοντέλα και έχει δείξει υποσχόμενα αποτελέσματα στην μακροπρόθεσμη θεραπεία της οστεοαρθρίτιδας, της ρευματοειδούς αρθρίτιδας, και της ημικρανίας [27]. TA επηρεάζει επίσης την απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, καθώς και μετάσταση και η ογκογένεση σε παγκρεατικά καρκινικά μοντέλα [28] [29], [30].

Εξειδίκευση πρωτεΐνη 1 (SP1) αποικοδόμηση με TA αναστέλλει διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές συμπεριλαμβανομένων παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [28], [29]. Έτσι, Sp1 μπορεί να είναι μια άλλη πιθανή μοριακό στόχο για TA-επαγόμενη απόπτωση. TA μειώθηκε επίσης αρκετές Sp-εξαρτώμενη γονίδια και πρωτεΐνες όπως αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), VEGFR1, survivin, κυκλίνη D1, και bcl-2, και αυτές οι αποκρίσεις συμβάλλουν στην αντικαρκινική δράση τους [31]. Πρόσφατα, Kim et al. έδειξαν ότι οι πρωτεΐνες COX-1 και COX-2 δεν άλλαξαν από την ΤΑ και ότι TA επαγόμενη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης εμφανιστεί σε μια COX-ανεξάρτητο τρόπο σε κύτταρα ΚΒ HNSCC [32].

Παρά αυτές τις προόδους στη γνώση, η μοριακός μηχανισμός της ΤΑ στις antitumorigenesis στο HNSCC δεν είναι σαφής. Είναι πιθανό ότι πολλαπλοί μηχανισμοί είναι λειτουργικοί. Οι επιδράσεις του ΤΑ στην ανάπτυξη των ΚΒ ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και τον μηχανισμό στηρίζονται αυτές επιδράσεις επί του παρόντος διερευνάται.

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι NSAIDs επάγουν NAG-1 έκφραση και την απόπτωση σε κύτταρα HNSCC, και ότι TA είναι ο πιο ισχυρός NSAID από εκείνους που δοκιμάστηκαν. Παρά το γεγονός ότι έχει παρατηρηθεί η επαγωγή απόπτωσης από NSAIDs σε διάφορα καρκινικά κύτταρα [10], [11], [33], [34], [35], η συγκεκριμένη NSAID που προκαλεί μέγιστη επαγωγή της NAG-1 έκφραση εξαρτάται από τον τύπο του καρκινικού κυττάρου. Για παράδειγμα, θειώδες σουλινδάκ είναι το πιο ισχυρό NAG-1 επαγωγέα σε καρκίνο του παχέος εντέρου και η ινδομεθακίνη είναι ο πιο ισχυρός σε καρκίνο ρινός και των παραρρινίων [5], [10], [36] Αυτές οι διαφορές πιθανώς σχετίζεται με την πολύπλοκη ρύθμιση του NAG-1 έκφραση , η οποία περιλαμβάνει τόσο μεταγραφικά και μεταγραφικούς μηχανισμούς. Επιπλέον, η έκφραση του φαίνεται να περιλαμβάνει cis- και trans-δρώντα στοιχεία προαγωγού, διάφοροι παράγοντες μεταγραφής, και αρκετές αντιογκογένεσης ουσίες [37]. NAG-1 είναι επίσης ένας προς τα κάτω στόχος του ποικιλόμορφη ρ53, ERG-1 και /-3 GSK καταστολής όγκων οδούς ΑΚΤ [12], [13], [14], [38], [39], [40], [ ,,,0],41]. Έτσι, ο μηχανισμός ρύθμισης NAG-1 εξαρτάται από τον τύπο των κυττάρων και τον τρόπο της επαγωγής. Περαιτέρω μελέτες για την επαγωγή της NAG-1 από TA στα κύτταρα HNSCC είναι απαραίτητα.

Τα παρόντα δεδομένα καταδεικνύουν ότι ΝΑΟ-1 είναι ένας από τους βασικούς ρυθμιστές για TA-επαγόμενη απόπτωση. TA ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων ΚΒ (Εικ. 1). Μια υψηλότερη συγκέντρωση TA (100 μΜ) οδήγησε σε θάνατο περισσότερο από το 70% των κυττάρων, με τα κύτταρα να αποσπαστούν και στρογγυλοποιείται-up μέσα σε 24 ώρες μετά τη θεραπεία.

Επιπλέον, TA επαγόμενη απόπτωση όπως αποδεικνύεται από την αυξημένη υπο -G1 πληθυσμού, νουκλεοσωμικών κατακερματισμού (τα δεδομένα δεν φαίνονται), και διασπασμένης ΡΑΚΡ (Εικ. 2), γεγονός που υποδηλώνει ότι η απόπτωση συμβάλλει στις ανασταλτικές επιδράσεις του τΑ στην βιωσιμότητα των κυττάρων ΚΒ. Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με προηγούμενες αναφορές ότι TA επάγει διάσπαση PARP σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα [30] και παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [28].

μιτοχονδριακές δηλωτικά βλάβη ως αρχική υπερπόλωση, που ακολουθείται από μια απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης και δυναμικό η απελευθέρωση των πρωτεϊνών από χώρο των μιτοχονδρίων, όπως το κυτόχρωμα c. Άμεση και έμμεση διατάραξη των μιτοχονδρίων μπορούν να ενεργοποιήσουν το αποπτωτικό μονοπάτι. TA επάγεται σημαντικά την απώλεια της ΜΜΡ (Εικ. 3), γεγονός που υποδηλώνει ότι μιτοχονδριακές βλάβες εμπλέκεται σε TA-επαγόμενη απόπτωση.

NAG-1 επάγεται από ΤΑ σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 2), και η υπερέκφραση του NAG-1 ενίσχυσε την αποπτωτικό αποτέλεσμα TA (Εικ. 4). Επιπλέον, siRNA μεσολάβηση knockdown του NAG-1 εξασθενημένος TA-προκαλούμενη απόπτωση (Σχ. 5), υποδηλώνοντας ότι NAG-1 έκφραση συνδέεται στενά με την απόπτωση.

Ο

in vivo

αντικαρκινική δραστηριότητα ΤΑ διερευνήθηκε σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς που φέρουν κύτταρα ΚΒ ως ξενομοσχεύματα. Σε δόση 25 mg /kg /ημέρα, TA ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου και του βάρους και αυξημένη TUNEL θετική χρώση κυττάρων (απόπτωση) σε τομές όγκων από αγωγή έναντι των ζώων ελέγχου. Αυτό συνοδεύτηκε από αυξημένη χρώση NAG-1 σε όγκους από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή (Εικ. 6). Κλινικές μελέτες με ΤΒ για χρόνια θεραπεία της ρευματοειδούς αρθρίτιδας έχει χρησιμοποιηθεί δόσεις TA τόσο υψηλές όσο 10 mg /kg /ημέρα, η οποία είναι μόνο 2,5 φορές χαμηλότερη από τη δόση που απαιτείται για την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου HNSCC σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι το ΤΑ είναι ένας ιδιαίτερα αποτελεσματικός αντικαρκινικός παράγοντας τόσο

in vitro

και

in vivo

μοντέλα HNSCC, και συμπληρώνει τα προηγούμενα αποτελέσματα [29], [31], [32]. Ο μηχανισμός δράσης του TA ως αναστολέας της ανάπτυξης του όγκου οφείλεται, εν μέρει, στην επαγωγή της NAG-1 και NAG-1-σχετιζόμενα γονίδια.

Η σύνδεση μεταξύ NAG-1 επαγωγή και TA αποκαλύπτεται σε αυτή τη μελέτη παρέχει ένα νέο μοριακό μηχανισμό που μπορεί να συμβάλει στην αντι-ογκογόνο δραστηριότητες της τΑ στο HNSCC.