Αφηρημένο

κακοήθη πλευριτική συλλογή (MPE), μπορεί να είναι χρήσιμη ως ένα μοντέλο για τη μελέτη ιεραρχική εξέλιξη του καρκίνου και /ή εντός του όγκου ετερογένεια . Για να ενισχυθεί η λογική για την ανάπτυξη του MPE-μοντέλο για τους σκοπούς αυτούς, θέσαμε ως στόχο να βρει αποδείξεις για την παρουσία καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC) σε MPE και να αποδείξει την ικανότητά του να διατηρήσει εντός του όγκου ετερογένεια στην MPE-πρωτογενείς καλλιέργειες. Οι μελέτες μας δείχνουν ότι

υποψήφιος

πνεύμονα υπογραφές CSC-έκφραση (ΡΤΕΝ, Oct4, hTERT, Bmi1, ΕΖΗ2 και SUZ12) είναι εμφανής στο κελί σφαιρίδια απομονώθηκαν από MPE και MPE-κυτταροπαθολογία ετικέτες και

υποψήφιος

-CSC (CD44, cMet, MDR-1, ALDH) υποπληθυσμών. Επιπλέον, σε πρωτογενείς καλλιέργειες που χρησιμοποιούν ΜΡΕ ως πηγή τόσο των κυττάρων όγκου και το μικροπεριβάλλον του όγκου (ΤΜΕ),

υποψήφιος

CSC διατηρούνται πάροδο του χρόνου. Αυτό μας επιτρέπει να ζούμε-sort

υποψήφιος

CSC-κλάσματα από το μίγμα MPE-όγκου βάσει των δεικτών επιφάνειας (CD44, γ-ΜΕΤ, uPAR, MDR-1) ή διαφορές σε ξενοβιοτικών μεταβολισμό (ALDH) . Έτσι, MPE-πρωτογενείς καλλιέργειες παρέχουν μια λεωφόρο για να εξαγάγετε

υποψήφιος

CSC πληθυσμών από άτομο (ισογονιδιακές) MPE-όγκους. Αυτό θα μας επιτρέψει να ελέγξετε αν αυτά τα κύτταρα μπορούν να διακριθούν σε λειτουργικές βιολογικές δοκιμασίες. Όγκου ετερογένεια στην MPE-πρωτογενείς καλλιέργειες αποδεικνύεται από μεταβλητή ανοσοσήμανση, οι διαφορές στην αποικία-μορφολογία, και οι διαφορές στα ποσοστά πολλαπλασιασμό των κυττάρων υποπληθυσμών. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα δικαιολογούν τη συνεχιζόμενη ανάπτυξη του MPE-μοντέλο για τη διερεύνηση της εντός του όγκου ετερογένεια, αλληλεπιδράσεις όγκου-TME, και την επικύρωση φαινοτυπική του

υποψήφιος

πνεύμονα CSC, εκτός από την παροχή κατεύθυνσης για την προ-κλινική ανάπτυξη της ορθολογικής θεραπευτικής

Παράθεση:. Basak SK, Veena MS, Ω S, Huang G, Srivatsan Ε, Huang Μ, et al. (2009) Το Κακοήθη υπεζωκοτική συλλογή ως μοντέλο για την Έρευνα ενδονεοπλασματική ετερογένεια στον καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 4 (6): e5884. doi: 10.1371 /journal.pone.0005884

Επιμέλεια: Mauricio Rojas, Πανεπιστήμιο Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Δεκεμβρίου, 2008? Αποδεκτές: 28 του Απρίλη του 2009? Δημοσιεύθηκε: 12 Ιουνίου, 2009

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της δήλωσης Creative Commons Public Domain που ορίζει ότι, μόλις τοποθετηθεί στο δημόσιο τομέα, το έργο αυτό μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο σκοπό

Χρηματοδότηση:. η χρηματοδότηση για τη μελέτη που προβλέπεται από τις Υποθέσεων Βετεράνων Ιατροβιολογικών Ερευνών ταμεία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία του καρκίνου θνησιμότητας στον κόσμο. Η τρέχουσα θεραπεία είναι σχετικά αναποτελεσματική, και το ποσοστό επιβίωσης 5-yr είναι περίπου 15%. Η ενδονεοπλασματική ετερογένεια πιθανώς κρύβεται αντίσταση των καρκίνων του πνεύμονα να τρέχουσες θεραπείες? ως εκ τούτου, αντιπροσωπεύοντας εντός του όγκου ετερογένεια μπορεί να είναι ένα σημαντικό κλειδί για την ανάπτυξη επιτυχημένων στρατηγικών θεραπείας για τον καρκίνο του πνεύμονα. Δυστυχώς, τα σημερινά μοντέλα του καρκίνου του πνεύμονα περιορισμένο πεδίο εφαρμογής τους να σπουδάσουν ετερογένεια των όγκων. Κακοήθη πλευριτική συλλογή (MPE) προσφέρουν μια μοναδική ευκαιρία για τον πολιτισμό μια ευρεία ποικιλία των καρκινικών κυττάρων από ένα μόνο άτομο, προκειμένου να οριοθετηθούν και να χαρακτηρίσει την περιοχή της εντός του όγκου ετερογένεια βρίσκονται σε προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα.

Το σκεπτικό για την επιλογή το μέγιστο επιτρεπόμενο σφάλμα, ένα περιφερειακό προχωρημένο στάδιο του καρκίνου του πνεύμονα που προμηνύει μια φτωχή πρόγνωση, ως μοντέλο για τη διερεύνηση εντός του όγκου ετερογένεια είναι διττός. Κατ ‘αρχάς, ένα εξελικτικό μοντέλο της καρκινογένεσης προβλέπει ότι οι προηγμένες νοσηρές καταστάσεις είναι πιο πιθανό να απεικονίσει ετερογένεια [1]. Δεύτερον, με βάση τις προσωπικές παρατηρήσεις που έγιναν κατά τη διάρκεια αρκετών ετών της μελέτης MPE [2], [3], [4], [5], ξέραμε ότι πρωτογενείς καλλιέργειες που προέρχονται από το μέγιστο επιτρεπόμενο σφάλμα που εμφανίζεται αρχικά αξιοσημείωτη ετερογένεια πολιτισμό στο δρόμο τους για την ίδρυση μορφολογικά ομοιογενή καρκίνο κυτταρικές γραμμές. Ωστόσο, δεν είχε διερευνηθεί προηγουμένως τη βιολογική ή χρονική βάση αυτές τις παρατηρήσεις σε ένα μελλοντικό τρόπο.

Δεν υπάρχουν καθιερωμένους τρόπους για να τον πολιτισμό MPE με στόχο τη διατήρηση της εντός του όγκου ετερογένεια. Έτσι, έθεσε ως στόχο να αναπτύξει ένα πρωταρχικό μοντέλο πολιτισμού

de novo

. Αυτό το μοντέλο ενσωματώνει το στοιχείο της MPE-υγρού και εξάγεται στρωματικά κύτταρα σε ένα μικροπεριβάλλον του όγκου (TME) που προσομοιώνει στενά το

in situ

περιβάλλον. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η ενσωμάτωση αυτών των στοιχείων φαίνεται να διατηρήσουν ετερογένεια του όγκου. Δεδομένου ότι η ετερογένεια των όγκων μπορεί να προκύψουν λόγω μιας ιεραρχικής εξέλιξης του μετασχηματισμένου επιθηλίου [6], [7], υποθέσαμε ότι περιλαμβάνονται στη σύνθεση των κυττάρων όγκου σε MPE είναι κύτταρα τα οποία μπορούν να λειτουργήσουν ως στέλεχος του καρκίνου ή προγονικών κυττάρων. Αυτό το χειρόγραφο παρέχει απόδειξη της έννοιας που

υποψήφιος

CSC μπορεί να κλασματοποιηθεί από MPE πρωτογενείς καλλιέργειες. Αυτά τα στοιχεία δικαιολογούν την περαιτέρω ανάπτυξη του μοντέλου MPE για την εξέταση της εντός του όγκου ετερογένεια και τη μελέτη του

υποψήφιος

CSC-φαινοτύπων.

Υλικά και Μέθοδοι

MPE απομόνωσης, επεξεργασίας και τον πολιτισμό

Όλα τα άτομα υποβλήθηκαν σε γραπτή συγκατάθεση από μια διαδικασία που έχει εγκριθεί από το διοικητικό συμβούλιο θεσμική αναθεώρηση στην Υποθέσεων Βετεράνων-Μείζονος Λος Άντζελες Σύστημα Υγείας (VAGLAHS). Όλα τα άτομα ήταν βετεράνοι και ενεργούς ή πρώην καπνιστές, και MPE-δείγματα αποκτήθηκαν από μεγάλες thoracenteses όγκο. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1. Εν συντομία, μετά από φυγοκέντρηση (200 χ g, 20 λεπτά, θερμοκρασία δωματίου), οι σβώλοι κυττάρων επαναιωρηματοποιήθηκαν σε μια βαθμίδα πυκνότητας ficoll. Η MPE-υπερκείμενο διηθούνται στείρα και χρησιμοποιούνται για τη διαμόρφωση του

σ

κύριες κα ι

γ

ΠΟΛΙΤΙΣΜΟΥ

m

edium [PCM? ΫΜΕΜ-Η (HyClone, UT) + 30% ν /ν διηθείται μικροβιοκρατώς συστατικό MPE-ρευστό + Πενικιλλίνη-G /στρεπτομυκίνη 1000 U /ml και αμφοτερικίνη Β 0.25 μg /ml (Omega Scientific, CA)]. Η επιλογή του 30% ν /ν κλάσμα του συστατικού MPE-υγρού εμπειρικά εξαγόμενη. Επειδή τα βασικά διαλυτά ή /και κυτταρικά συστατικά που συμβάλλουν στη διατήρηση της ετερογένειας του όγκου σε MPE-πρωτογενείς καλλιέργειες είναι (είναι) δεν είναι γνωστό, και δεδομένου ότι υπάρχει μεταβλητότητα διάχυσης προς συλλογή στις συγκεντρώσεις των διαλυτών παραγόντων, η επιλογή των 30 % ν /ν συστατικό MPE-υγρό βασίστηκε στην παρατήρηση των πρωτογενών καλλιεργειών με οπτικό μικροσκόπιο. Εν συντομία, έχουμε παρακολουθούνται τρία διαφορετικά μέγιστα επιτρεπόμενα σφάλματα σε πρωτογενείς καλλιέργειες που περιείχαν είτε 100%, 70%, 50%, 30% και 10% συστατικό MPE-υγρού. Αξιολογήσαμε ακεραιότητα καλλιέργεια και μεταβλητότητα με μικροσκοπία, και μετρήθηκαν οι κλάσματα κυμαινόμενου νεκρά κύτταρα (με βαφή κυανούν τρυπανίου) για κάθε κατάσταση κατά τη διάρκεια αρκετών ημερών. Δεν υπήρχαν εμφανείς ποιοτικές διαφορές στην ακεραιότητα του πολιτισμού ή τη μεταβλητότητα, και δεν ποσοτικές διαφορές στην πλωτή νεκρά κύτταρα μεταξύ του 70%, 50% και 30% v /v συνθήκες MPE-υγρού. Τα 100% και 10% ν /ν MPE-συνθήκες είχαν μια αύξηση στον κυτταρικό θάνατο σε δύο από τις τρεις συλλογές. Η παρατήρηση αυτή, σε συνδυασμό με την πρακτική σκέψη ότι συστατικό MPE-υγρό ήταν

η

περιοριστικός παράγοντας για τη διάρκεια του πειραματισμού με πρωτογενείς καλλιέργειες, μας οδήγησαν να χρησιμοποιήσει το 30% v /v MPE στις υπόλοιπες περιπτώσεις.

MPE εξήχθη από την πλευρική κοιλότητα των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Η συλλογή MPE ήταν

καθιζάνουν (200 × g)

και το

σφαιρίδιο κυττάρων

διαχωρίζεται από το υγρό MPE. Το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε ελάχιστο βασικό μέσο που περιέχει MPE-υγρού και επιστρώνεται σε κλίση

Ficoll. Το κλάσμα εμπύρηνων κυττάρων, η οποία ήταν σε μεγάλο βαθμό άνευ ερυθροκυττάρων, στις περισσότερες περιπτώσεις, συλλέχθηκε από την παρεμβολή του Ficoll κλίση και μέσο αιωρήσεως, και υποβάλλονται σε επεξεργασία για χρώση (

Η &? Ε, IHC

),

μοριακές αναλύσεις

και

πρωτογενή

πολιτισμό. Οι πρωτογενείς καλλιέργειες διατηρούνται σε PCM, και αναλύονται περαιτέρω για

μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας

,

FACS ανάλυση

και

in vivo ογκογένεση

.

Η

για να διαπιστωθεί πρωτογενείς καλλιέργειες, το εμπύρηνο κυτταρικό σφαιρίδιο εξάγεται από την κλίση ficoll, πλύθηκε με ϋΜΕΜ-η, και μετά από δείγματα διαχωρίστηκαν για την αποθήκευση, την αρχική μοριακή αναλύσεις και κυτταροπαθολογία, αρκετές πρωτογενείς καλλιέργειες σπάρθηκαν. Αυτά παρατηρήθηκαν άμεσα σε καθημερινή βάση, και

PCM

αντικαταστάθηκε σε κάθε 5-7 ημέρες. Κινητική ανάλυση της ανάπτυξης των πρωτογενών καλλιεργειών διεξήχθησαν σε τρεις διακριτές MPE δείγματα. Για αυτούς τους προσδιορισμούς, πρωτογενείς καλλιέργειες σπάρθηκαν σε παράλληλο σε 48 φρεατίων (Corning Incorporated, ΝΥ), σε πυκνότητα 2 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε 500 μΐ μέσου καλλιέργειας. Να μετρήσει, επιπλέοντα κύτταρα σε εναιώρημα συλλέχθηκαν πρώτα, μετά το οποίο τα προσκολλημένα πληθυσμοί πλύθηκαν ήπια με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), και αποσπάται (Τρυψίνη-ΕϋΤΑ, Sigma ΜΟ). Τα αποκολλημένα κύτταρα στη συνέχεια προστίθεται στο αρχικό κυτταρικό εναιώρημα, και το συνολικό ζωντανά κύτταρα (Trypan blue αποκλεισμό χρωστικής) με το χέρι μετρήθηκαν με Αιματοκυτταρόμετρο σε καθορισμένους χρονικά σημεία. Οι μελέτες αυτές αποτελούν τη βάση τα αποτελέσματα της αναφερόμενης ότι MPE-πρωτογενείς καλλιέργειες αυξήθηκαν σε εξαιρετικά μεταβλητή και τους βραδείς ρυθμούς ανάπτυξης.

Αντισώματα

Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημεία (IHC) ή /και κυτταρομετρία ροής (FACS ): αντι-CD 44 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, Abcam # 16728 για IHC? Mouse Anti-Human IgG2b CD44-FITC, BD Biosciences # 555478 ή PE-σημασμένο αντι-CD44 Ανθρώπου, BD Pharmingen # 555479 για FACS), αντι-uPAR (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, Santa Cruz Biotechnology # sc-13522), αντι-ALDH1A1 (Rabbit μονοκλωνικά, Abcam # 52492), αντι-CD166-FITC (μονοκλωνικό Mouse? Abcam # 33403)? πρωτοβάθμια μη σημασμένο αντι-cMet (IgG2a ποντικού, Abcam # 49210), πρωτοβάθμια μη επισημασμένη αντι-MDR-1 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, Chemicon # Mab4338), και αντι-uPAR (Santa Cruz Biotech # 13522). Δευτερογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη: Goat F (ab ‘) 2 αντι-Ποντικού IgG (H + L) ΡΕ-Cy.5.5 (Caltag εργαστήρια # M35018) και αντι-ποντικού κατσίκας F (ab’) 2 IgM (Jackson ImmunoResearch )

Κυτταρολογικό και Ανοσοεπισήμανση

συστάδες κυττάρων εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (Leica -. Leitz DMRBE) για τις καλυμμένες γυάλινες διαφάνειες, ή με οπτικό μικροσκόπιο μετά από μονιμοποίηση και χρώση. Για το τελευταίο, κύτταρα μονιμοποιούνται σε αιθανόλη (Fischer Scientific, ΡΑ) ή Ζ-fix (Anatech, ΜΙ) καθιζάνουν για να δημιουργήσει ένα κουμπί κύτταρο, το οποίο εμβαπτισμένες σε παραφίνη. Για IHC, τα τμήματα (5 μm) αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν σε ξυλόλιο και αιθανόλη. ανάκτηση αντιγόνου [10 mM κιτρικό οξύ (ρΗ 6), 70 ° C, 30 λεπτά, δύο φορές με παρεμβαλλόμενες πλύση νερό) διεξήχθη, μετά την οποία οι πλάκες ψύχθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου και διαδοχικά ξεπλύθηκε με απιονισμένο νερό και PBS. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποσβέστηκε (PBS + 2% υπεροξείδιο του υδρογόνου), και τα δείγματα διαδοχικά μπλοκαριστεί [1% αλβουμίνη βόειου ορού /PBS, θερμοκρασία δωματίου 1 ώρα, που ακολουθείται από ορό ποντικού (Santa Cruz Biotechnology) για 30 λεπτά, θερμοκρασία δωματίου] . Τομές ιστού στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS, επωάστηκαν με το δευτερογενές αντίσωμα (HRP-συζευγμένο κατσίκας αντι-ποντικού, Santa Cruz Biotechnology, 30 λεπτά, θερμοκρασία δωματίου), ξεπλύθηκαν με PBS και εκτέθηκαν σε κιτ υπόστρωμα ϋΑΒ (Vector Laboratories, Burlingame, CA ). Αρνητικοί έλεγχοι συνήθως χρησιμοποιούνται το δευτερεύον αντίσωμα μόνο εν απουσία σήμανσης με την πρωτογενή. Οι χρωματισμένες τομές παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο (Leica – Leitz DMRBE ή της Olympus IX71) και τα ληφθείσες εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Openlab. Τα θετικά χρωματισμένων κυττάρων περιοχές εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας Image Pro Plus λογισμικό. συστάδες κυττάρων με το χέρι ορίζεται χρησιμοποιώντας εικόνες φάση και το ακανόνιστο εργαλείο AOI και τις προκύπτουσες ομάδες κατά διαστήματα βασίζεται σε εμπειρικά αποφασισμένη θετικό όριο χρώση. Ποσοστό θετικώς χρωματισμένων κυττάρων εκτιμήθηκε με βάση την κλασματική περιοχή της χρώσης στη συνολική περιοχή σύμπλεγμα.

Αντίστροφη μεταγραφάση-ΡΟΚ (RT-PCR)

RNA εξήχθη από την πρωτογενή MPE και του πολιτισμού απομονώνει χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ και Fast Track 2.0 κιτ απομόνωσης mRNA (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). 500 ng του mRNA μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας το κιτ RT (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) ακολουθώντας τις συστάσεις του κατασκευαστή. Δύο μΐ υποπολλαπλάσιο του συνετέθη cDNA χρησιμοποιήθηκε για PCR για την ενίσχυση του ΡΤΕΝ, Oct4, Bmi1, hTERT, SUZ12 και ΕΖΗ2 γονίδια. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν έχουν ως εξής:

PTEN

Forward – 5 ‘GGACGAACTGGTGTAATGATATG 3’, αντιστροφής 5 ‘TCTACTGTTTTTGTGAAGTACAGC 3’,

Oct4

μακρόπνοη 5’CAACTCCGATGGGGC ΚΔ 3 ‘, και Αντίστροφη -5 «CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG 3 ‘

Bmi1

Forward – 5′ AATCTAAGGAGGAGGTGA 3 ‘, αντιστροφής 5’ CAAACAAGAAGAGGTGGA 3 ‘,

hTERT

Forward -5′ GGAATTCTGGAGCTGCTTGGGAACCA 3 ‘, αντιστροφής 5’ CGTCTAGAGCCGGACACTCAGCCTTCA 3 ‘,

SUZ12

Forward – 5 ‘GATAAAAACAGGCGCTTACAGCTT 3’, και Αντίστροφη 5 ‘- AGGTCCCTGAGAAAATGTTTCGA – 3’,

ΕΖΗ2

Forward 5 ‘TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC 3’, Αντίστροφη 5 ‘TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC 3’. Για

ΡΤΕΝ

ενίσχυση, οι συνθήκες ήταν ως ακολούθως: αρχική μετουσίωση στους 94 ° C για 4 λεπτά, ακολουθούμενη από 32 κύκλους στους 94 ° C for1 λεπτά, 57.5 ° C για 1 λεπτό, και 72 ° C για 3 min. Μια τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά χρησιμοποιήθηκε. Οι συνθήκες ενίσχυσης για

Oct4

ήταν μια αρχική μετουσίωση για 5 λεπτά στους 95 ° C, που ακολουθείται από 32 κύκλους στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 58 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα με τελική επέκταση στους 72 ° C για 5 λεπτά. Οι συνθήκες ενίσχυσης για

Bmi1

: αρχική μετουσίωση στους 94 ° C για 4 λεπτά που ακολουθείται από 32 κύκλους στους 94 ° C για 1 λεπτό, 53 ° C για 1 λεπτό, 72 ° C για 1 λεπτό, και μια τελική επέκταση για 7 λεπτά στους 72 ° C. Για

hTERT

οι συνθήκες ενίσχυσης ήταν: μια αρχική μετουσίωση στους 94 ° C για 4 λεπτά, ακολουθούμενη από 32 κύκλους στους 94 ° C για 50 δευτερόλεπτα, 52 ° C για 50 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 1 λεπτό, και μία τελική επέκταση στους 72 ° C για 7 λεπτά. Για SUZ12 και ΕΖΗ2 ενίσχυση: αρχική μετουσίωση στους 94 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 30 κύκλους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 72 ° C για 30 s, και ένα 7 min, τελική επέκταση στους 72 ° C. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε 8% ΤΒΕ (50 mM Tris βορικού ρΗ 8.0, 1 mM EDTA) πηκτώματα που ακολουθείται από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο. Τα πηκτώματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Kodak 1D.

κυτταρομετρία ροής και Aldefluor δοκιμασία

FACS αναλύσεις των πρωτογενών καλλιεργημένων MPE κυττάρων πραγματοποιήθηκε με ανάλυση FACS πρότυπο mutichannel χρησιμοποιώντας ένα FACSCalibur κυτταρόμετρο (Becton Dickinson, San Jose , CA) και λογισμικό ανάλυσης FCS Express (de novo λογισμικό, Οντάριο, Καναδάς). Τόσο τα μη προσκολλημένα και προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και συνενώθηκαν. Κύτταρα σε πρωτογενή καλλιέργεια αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας κατεργασία με θρυψίνη /Versine, πλύθηκαν με PBS που περιέχει 2% BSA, και απ ‘ευθείας σημασμένα με πρωτεύοντα αντισώματα φθοριοχρώμιο επισύναψη, ή μη σημασμένο πρωτεύον αντίσωμα με δευτερεύοντα αντισώματα σημασμένα με φθοριοχρώμιο (όπως υποδεικνύεται κατωτέρω). Και τα δύο πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμια συγκεντρώσεις αντισωμάτων διατηρήθηκαν σταθερά σε 1 μg /1 × 10

6 κύτταρα? κύτταρα σημάνθηκαν για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και διαδοχικά πλύθηκε τρεις φορές σε PBS που περιέχει 2% FBS, επαναιωρήθηκαν σε PBS και διατηρήθηκαν σε πάγο πριν από αναλύσεις FACS. Η Aldefluor (StemCell Technologies, Durham, NC, USA) δοκιμασία, η οποία μετρά αφυδρογονάση αλδεΰδης (ΑΙ_ϋΗ) δραστηριότητα, πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του κατασκευαστή. MPE-κύτταρα από πρωτογενή καλλιέργεια εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό δοκιμασίας που περιέχει το Aldefluor ΑΙ_ϋΗ-υπόστρωμα, Bodipy-αμινοακεταλδεΰδης (ΒΑΑΑ? 1.5 mM) και επωάστηκαν για 50 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Για την επαλήθευση ειδικότητα, ένα παράλληλο δείγμα επωάστηκε υπό ταυτόσημες συνθήκες, αλλά παρουσία του 10-πλάσια μοριακή περίσσεια του ΑΙ_ϋΗ-αναστολέα, diethylaminobenzaldehyde (ϋΕΑΒ). Αυτή η προκύπτουσα μείωση στην ένταση φθορισμού της ΑΙ_ϋΗ-θετικών κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για να αντισταθμίσει τη ροή κυτταρομετρίας αναλύσεις.

Αποτελέσματα

MPE-χαρακτηριστικά, επεξεργασία και κύρια καλλιέργεια

Για να αναπτύξει ένα μοντέλο για τη μελέτη του καρκίνου του πνεύμονα ενδοφαινοτύπους σε πρωτογενή καλλιέργεια, εμείς κλασματοποιήθηκε το κύτταρο και υγρό διαμερίσματα MPE (Σχήμα 1). Τα κλινικά χαρακτηριστικά των συλλογών που χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία αυτού του συνόλου δεδομένων ήταν τυπικά του MPE (Πίνακες 1 και 2, βλέπε παρακάτω). Επτά από εννέα συλλογές ήταν κακοήθεις βάσει κυτταροπαθολογικά διάγνωση (Πίνακας 1). Σε δύο MPE, η τελική ερμηνεία κυτταροπαθολογία από 100 ml δείγματος δείγμα ήταν «εξαιρετικά ύποπτες, αλλά ασαφή»? Οι περιπτώσεις αυτές συμπεριλήφθηκαν λόγω αύξησης του όγκου ήταν εμφανής σε πρωτογενείς καλλιέργειες (συμπεριλαμβανομένων

in vivo

σε μία περίπτωση, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Προηγούμενες μελέτες είχαν μακρά έδειξαν ότι επιμετάλλωση απόδοση και παραγωγή των πρωτογενών καλλιεργειών από κλινικά δείγματα καρκίνου του πνεύμονα είναι κακή, και εξαρτάται τόσο από τις συνθήκες καλλιέργειας και παράγοντες του ξενιστή που σχετίζονται με [8], [9], [10], [11]. Ωστόσο, οι μελέτες αυτές δεν συμπληρώνουν τις πρωτογενείς καλλιέργειες καρκινικών με συστατικά από τα

in situ

μικροπεριβάλλον του όγκου (TME), πιθανώς επειδή η κύρια ή μοναδική στόχος ήταν να δημιουργηθεί αθάνατες κυτταρικές σειρές όγκων. Στην πραγματικότητα, προκειμένου να αντλήσουν «καθαρό όγκο» κυτταρικές σειρές σε καθορισμένες συνθήκες, όλες οι προηγούμενες προσεγγίσεις έλαβε μέτρα για την ελαχιστοποίηση της «μόλυνσης» των καλλιεργειών με TME-στοιχεία. Κατά συνέπεια, αν υπήρχε υποπληθυσμών κυττάρων διακριτές όγκου σε επιμέρους όγκους που εξαρτιόταν από στοιχεία ΤΜΕ για επιβίωση, στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας οποιοδήποτε τεχνητό ΤΜΕ μπορεί να παρέχει ένα πλεονέκτημα ανάπτυξης σε συγκεκριμένες υποομάδες των κυττάρων του όγκου σε ένα σύστημα συνεχούς καλλιέργειας. Έτσι, είναι πιθανό ότι τα μοντέλα των καρκινικών κυττάρων είχαν «επιλέγονται για» η TME πολιτισμού που χρησιμοποιήθηκαν για τις κυτταρικές σειρές όγκων.

Η

Εμείς αιτιολογημένη ότι το πλήρες συμπλήρωμα των καρκινικών κυττάρων ενδοφαινότυποι θα πρέπει να μελετηθεί καλύτερα σε πρωτογενείς καλλιέργειες που ενσωματώνονται αυτόλογη ΤΜΕ. Έτσι, σε μία προσπάθεια να διατηρηθεί εντός του όγκου ετερογένεια

ex vivo

, τόσο ο όγκος-συνοδεύουν εμπύρηνο κυτταρικό πληθυσμό και το ρευστό συστατικό του MPE χρησιμοποιήθηκαν για να εμπλουτίσουν την αρχική καλλιέργεια-ΤΜΕ. Για να ξεπεραστεί το παρελθόν αναγνωρίζεται αναποτελεσματικότητα για την ίδρυση καλλιέργειες πρωτογενούς όγκου, και με βάση τις εμπειρικές παρατηρήσεις που περιγράφονται στις μεθόδους, επιλέξαμε την «βέλτιστη» κατάσταση ως 30% MPE-υγρό συστατικό αναμειγνύεται v /v στο μέσο βάσης που περιέχει αντιβιοτικά (μέσο πρωτογενή καλλιέργεια ή PCM). Στις

pcm

, τόσο πρωτογενή καλλιέργεια και σειριακά περάσματα διατηρήθηκαν με μεγαλύτερη ποικιλότητα σε μορφολογία, και οι καλλιέργειες φάνηκε να είναι πιο ισχυρή (σε σύγκριση με παράλληλη αύξηση σε ορό εμβρύου μόσχου, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, η χρησιμοποίηση ενός 30% ν /ν-κλάσμα του MPE-ρευστού μας επέτρεψε να διατηρήσει αυτό το περιοριστικό αντιδραστήριο για μεγαλύτερες διάρκειες πειραματισμού με πρωτογενείς καλλιέργειες. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μεθοδολογία, ιδρύσαμε πρωτογενείς καλλιέργειες MPE-όγκων από όλες τις επτά απόπειρες.

Αναλύσεις

Τα προκαταρκτικά έδειξε ότι το υπερκείμενο το εμπλουτισμένο με φλεγμονώδεις κυτοκίνες, με συγκεντρώσεις ιντερλευκίνης (IL) 1, IL-6, CXC χημειοκινών προσδέματος 10 (IP10), CC χημειοκίνη συνδετήρα 2 (MCP1), και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) που εκτιμάται ότι είναι & gt? 10 ng /ml. Αυτά και άλλοι παράγοντες, που πιθανόν προήλθε από όγκο, στρώματος και /ή κυκλοφορούντων κυττάρων σε MPE (Πίνακας 2), συνέβαλαν σε ένα σύνθετο μείγμα από κυτοκίνες, χημειοκίνες και αυξητικούς παράγοντες στο συστατικό MPE-υγρού. Σε σχέση με τα κυτταρικά MPE-εξαρτήματα, εμπύρηνο μετρήσεις κυττάρων κυμάνθηκε από 1,3 × 10

8 έως 2,5 × 10

9 κύτταρα ανά λίτρο συλλογή. Η κυρίαρχη κυκλοφορούσα τύπος κυττάρου στο ΤΜΕ ήταν λεμφοκύτταρα (μέση ± STDEV: 60 ± 26% επί του συνόλου των 681 ± 560 WBC /μl), με σημαντική (& gt? 1%) κλάσματα του ΡΜΝ, μακροφάγα, μονοκύτταρα και μεσοθηλιακών κυττάρων (Πίνακας 2) σχεδόν σε όλες τις συλλογές. Έτσι, από την άποψη των κυκλοφορούντων σύνθεση των κυττάρων τους και τη βιοχημεία (που ήταν όλα τα εκκρίματα) [12], οι συλλογές μελετήσαμε ήταν χαρακτηριστικές της MPE.

Απόδειξη της εντός του όγκου ετερογένεια στην εξάγεται δείγματα MPE-όγκου

Το σχήμα 2Α παρουσιάζει αντιπροσωπευτικά H & amp? Ε βάφονται κυτταροπαθολογία μετά διαβάθμιση πυκνότητας Ficoll. Όπως φαίνεται, το μέγιστο επιτρεπόμενο σφάλμα όγκου μεταβλητά περιέχεται μέσα ακαθόριστα συσσωματώματα κυττάρων διαφόρων συνθέσεων, είτε ως καλά οργανωμένη σφαιροειδή. Προσεκτικότερη εξέταση πρότεινε ότι οι δύο αυτές καρκινικών κυττάρων ομίλων είχαν οργανωθεί σε διακριτές μικροεπικράτειες. Εμείς με βάση αυτή την καχυποψία σχετικά με την παρατήρηση ότι όταν επισημανθεί δείγματα για

υποψήφιος

CSC-δείκτες, διαπιστώθηκε συχνά χρώση κατά διακριτές εστίες στα συσσωματώματα (Εικόνα 2Β). Για παράδειγμα, βάφονται MPE δείγματα παθολογία για την κλασματική έκφραση του CD44. CD44, ο υποδοχέας κυτταρικής επιφάνειας για το υαλουρονικό [13], είχε χρησιμοποιηθεί ως επισήμανση επιφάνεια για να επιλέξετε CSC. CD44 είχε προηγουμένως χρησιμοποιηθεί μόνο του [14] και σε συνδυασμό με άλλους δείκτες επιφανείας κυττάρου να λύσουμε CSC από διάφορες επιθηλιακές κακοήθειες, και στα δύο συστήματα ανθρώπου και ποντικού μοντέλο [15], [16], [17], [18], [19] , [20], [21]. Όλα τα MPE δείγματα εμφανίζεται ένα CD44 + κλάσμα, που κυμαίνονταν από περίπου 8% έως 47% των εμπύρηνων κυττάρων με ανοσοϊστοχημεία (IHC) (Σχήμα 2Β, Σχήματα S1a και S1c). Εκτός από την CD44, κυτταρικά κλάσματα εμφανίζονται επίσης και άλλα

υποψήφιος

CSC-δείκτες, cMet [22], [23] και MDR-1 [24], [25] (Σχήμα 2Β). Προηγουμένως, άλλοι ερευνητές είχαν επίσης αξιοποιηθεί διαφορές στο μεταβολισμό των ξενοβιοτικών κυττάρων να διαχωρίζει CSC από το μίγμα του όγκου. Μία τέτοια τεχνική χρησιμοποιείται η δοκιμασία Aldefluor ™ (StemCell Technologies), που διαχωρίζονται

υποψήφιος

CSC βάσει της δραστηριότητας ALDH1A1 [26], [27], [28]. Όπως και CD44, βρήκαμε ότι τα κύτταρα που φέρουν ετικέτα για ΑΙ_ϋΗ1 παρατηρήθηκαν σε συγκεντρωτική τσέπες στο πλαίσιο MPE-όγκους (Σχήμα 2Β, εικόνα S1b). Έντονη μεταβλητότητα της χρώσης ήταν εμφανής ακόμη και σε ένα επιμέρους δείγμα. Έτσι, θα μπορούσε κανείς να βρει διακριτά θύλακες αδύναμο, μέσης και ισχυρή χρώση ΑΙ_ϋΗ1 (Σχήμα 2Β). Απ ‘όλα, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η ατομική MPE δείγματα είχαν ποικίλες ανοσολογικές και μεταβολικές φαινοτύπων. Επιπλέον, εάν η

υποψήφιος

CD44 και ALDH σήματα ήταν έγκυρα υποκατάστατων δεικτών για την CSC, τότε CSC φάνηκε να διαμένουν σε διακριτά προστατεύεται μικροεπικράτειες (κόγχες) στις συστάδες MPE-όγκου. Τέλος, αν και η χρονική έκφραση και λειτουργική συσχέτιση αυτών των CSC-ετικέτες δεν έχει ακόμη καθοριστεί, τα δεδομένα πρότειναν ότι τα κύτταρα που εκφράζουν

υποψήφιος

δείκτες CSC θα μπορούσαν δυνητικά να διαχωριστεί από το μίγμα MPE-όγκου.

(Α) Εκπρόσωπος των κυττάρων συστάδες και σφαιροειδή στο MPE-κυτταροπαθολογία. Εκπρόσωπος H & amp? Ε δειγμάτων όγκων που προέρχονται από MPE δείχνει συμπλέγματα και οργανωμένο σφαιροειδή ποικίλης μορφολογίας και στρωματικών κυττάρων συνθέσεις /(20 × ή 100 ×). (Β) IHC για τις υποψήφιες δείκτη CSC έκφρασης. δείγματα όγκων που προέρχονται από MPE ήταν ανοσοεπισημάνθηκαν για

υποψήφιος

δείκτες CSC, συμπεριλαμβανομένων των CD44 (40 × και 400 ×), cMet (100 × και 400 ×), MDR-1 (100 × και 400 ×), και ΑΙ_ϋΗ -1 (40 × και 200 ​​×).

Η

MPE-όγκοι εκφράζουν CSC-δείκτες που εμπλέκονται σε προγράμματα επέκτασης προγονικών κυττάρων ή πλειοδυναμία

σε γενικές γραμμές, οι όγκοι προκύπτουν λόγω της μη φυσιολογικής σύλληψης κατά τη διάρκεια της ιστο-διαφοροποίηση [29], [30]. Μια από τις πρώτες εκδηλώσεις της διαφοροποίησης-σύλληψη είναι ότι υπάρχει μια επέκταση της πισίνας προγονικών κυττάρων. Έτσι, μοριακές υπογραφές των προγονικών κυττάρων μπορεί να χρησιμεύσει ως

υποψήφιος

CSC-βιοδεικτών. Από την άποψη αυτή, μελέτες σε ζώα είχαν εμπλακεί ΡΤΕΝ για την κατάλληλη συντήρηση και διαφοροποίηση του πληθυσμού περιφερικών προγονικών κυττάρων του πνεύμονα [31]. ΡΤΕΝ σίγηση υποκινητής αποδεικνύεται στον καρκίνο του ανθρώπινου πνεύμονα [32], που εμπλέκουν αυτή την οδό για την ανάπτυξη ή /και την πρόοδο της. Η τελομεράση (hTERT) ενεργοποίηση συμβάλλει στην παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα [33], και hTERT συνήθως ενεργοποιείται στον καρκίνο του πνεύμονα. Μαζί με ρ16 (ΙΝΚ4 &), hTERT φαίνεται να απαιτείται για την κυτταρική αθανασία που χαρακτηρίζει τις δύο βλαστικών κυττάρων και κυττάρων του όγκου [34], και η έκφρασή του μπορεί να υποδεικνύει μία δυναμική αλλαγή στο κλάσμα του αθανατοποιημένων φαινότυπο [35], [36]. Κοινόχρηστο δείκτες μεταξύ

υποψήφιος

CSC και τα βλαστικά κύτταρα περιλαμβάνουν επίσης μονοπάτια που διαμεσολαβούν κυττάρων αυτο-ανανέωση και pluripotency. Oct4 είναι ένα εμβρυονικό δείκτη που σχετίζεται με pluripotency, και χρησιμοποιείται συνήθως για την επισήμανση του CSC-φαινότυπο [21], [37]. Ομοίως, η ρύθμιση της πολυδύναμων κατάσταση επιγενετικώς ελέγχεται από διαρθρωτικές αλλαγές στη χρωματίνη [38], [39], [40]. Μεταγραφικό έλεγχο κατά τη διάρκεια της πολυδύναμων κατάσταση εφαρμόζεται από την ομάδα Polycomb (PCG) των πρωτεϊνών που εργάζονται για να τροποποιήσει τη δομή της χρωματίνης. SUZ12, ΕΖΗ2 και Bmi1 είναι συστατικά των συμπλοκών PCG, και επειδή η έκφρασή τους σε ανάπτυξη είναι χαρακτηριστική των βλαστικών ιστών κυττάρων, έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί για την επισήμανση του υποψηφίου

CSC-φαινότυπο [6], [7] , [41]. Για να δοκιμαστεί εάν αυτά τα μοριακά σήματα του

υποψήφιος

CSC θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε MPE-όγκους, RNA εκχυλίστηκε από τα εμπύρηνα κλάσματα κυττάρων και RT-PCR για αυτούς τους δείκτες εκτελέστηκε. Βρήκαμε ότι αυτά

υποψήφιος

CSC-βιοδεικτών εκφράστηκαν σε διαφορετικές MPE-όγκους (Σχήμα 3). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο πνεύμονας CSC-φαινότυπο διατηρήθηκε στην MPE παρά το φλεγμονώδες περιβάλλον του MPE-TME, σε αντίθεση με ορισμένες συμβατικές αξιώματα σχετικά με τη θέση περιβάλλον CSC. Ίσως, αυτό έγινε επειδή η CSC προστατεύτηκαν (όπως περιγράφεται) από το διαλυτό TME στους ομίλους του όγκου που αποδεικνύεται στην MPE. Το πιο σημαντικό, αυτά τα αποτελέσματα που επίσης το στάδιο για τη δυναμική παρακολούθηση αυτών των μοριακών σημάτων, όπως οι πειραματικές αλλαγές στις συνθήκες καλλιέργειας εισήχθη στις προσπάθειες για τον εμπλουτισμό της CSC-φαινότυπο.

προφίλ έκφρασης του ΡΤΕΝ, Oct4, hTERT, BMI1 , SUZ12, και ΕΖΗ2 μελετήθηκαν με αντίστροφη μεταγραφάση-ΡΟΚ. RNA εξάγεται από το εμπύρηνο κυτταρικό ίζημα του MPE μεταγράφηκε αντίστροφα και το cDNA χρησιμοποιήθηκε στην PCR-ενίσχυσης των αντίστοιχων γονιδίων. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε 10% γέλες ΤΒΕ, που ακολουθείται από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο, και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Kodak 1D. PTEN, hTERT, SUZ12, ΕΖΗ2 ήταν ομοιόμορφα εκφράζονται σε όλα τα MPE, ενώ BMI1 και η έκφραση Oct4 δεν ανιχνεύθηκε σε επιμέρους δείγματα. Β τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Απόδειξη της εντός του όγκου ετερογένεια στην MPE-πρωτογενείς καλλιέργειες

MPE-πρωτογενείς καλλιέργειες ιδρύθηκαν το PCM. Σε αυτές τις συνθήκες, οι πρωτογενείς καλλιέργειες εμφανίζονται διαφορετικές μορφολογίες (Εικόνα 4Α), και μεταβλητά αργούς ρυθμούς ανάπτυξης. Οι πρωτογενείς καλλιέργειες τυπικά πήρε αρκετές εβδομάδες για να «ωριμάσουν» (όπως ορίζονται με ανάπτυξη σε δοχείο καλλιέργειας προσεγγίζει 70-80% συρροή). Κατά τη διάρκεια αυτού του διαστήματος, οι συστάδες και σφαιροειδής δομές που παρατηρήθηκαν στην αρχική MPE-κυτταροπαθολογία δεν ήταν καλά συντηρημένο. Παρ ‘όλα αυτά, οι πρωτογενείς καλλιέργειες επέδειξαν φαινοτυπική ετερογένεια που δεν είχαν προηγουμένως εξεταστεί. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξής τους, πρωτογενείς καλλιέργειες πάντα αποτελούνται από αποικίες με ποικίλες μορφολογίες (κυμαινόμενο αδρανών υλικών που αποκλείουν trypan μπλε, αποικίες γίγαντας των κυττάρων, ινοβλαστοειδή και λιθόστρωτους clusters), παρά το γεγονός ότι στην ίδια φιάλη με ένα φαινομενικά πανομοιότυπο ΤΜΕ (Εικόνα 4Α). Αυτές οι αποικίες φάνηκε να επεκταθεί σε διάφορα ποσοστά, γεγονός που υποδηλώνει ότι είχαν διαφορετικούς δείκτες πολλαπλασιασμού, παρά το γεγονός ότι σε μια «κοινή» περιβάλλον. Εμείς αιτιολογημένη ότι αν CSC, όπως προγονικά κύτταρα ιστού, είχαν μειωμένο κύκλο εργασιών, τότε οι διαφορές στον πολλαπλασιασμό θα μας επιτρέψει να διαχωρίζει τα κλάσματα εμπλουτισμένα για CSC. Για να ελέγξετε αν μια τέτοια στρατηγική ήταν εφικτή με MPE- πρωτογενείς καλλιέργειες, έχουμε αναπτύξει μια στρατηγική διαλογής ζωντανών κυττάρων που χρησιμοποιούνται καρβοξυφλουοροσκεΐνη ηλεκτριμιδύλ εστέρα (CFSE) σε ένα σύστημα δοκιμή σήμανσης για την κλασματοποίηση κύτταρα βασίζονται σε διαφορετικούς δείκτες αναπαραγωγής. CFSE είναι ένα διαπερατή μεμβράνη αντιδραστήριο που διασπάται από ενδοκυτταρικές εστεράσες για να δώσει ένα φθορίζον αμίνη αντιδραστική μεταβολίτης που παραμένει στο κυτταρόπλασμα για εβδομάδες. Κάθε χρόνο τα κύτταρα υποβάλλονται σε διαίρεση, το ποσό της CFSE που υπάρχει σε κάθε κύτταρο κόρη είναι κατά το ήμισυ. Τα κύτταρα που δεν αναπαράγει διατηρούν την ετικέτα. Έτσι,

αν

CSC αργά αναπαράγει,

τότε

η ετικέτα συγκράτηση του πληθυσμού θα πρέπει να εμπλουτιστεί για CSC. Παρά το γεγονός ότι πρέπει να προσδιοριστούν καλύτερα οι κυτταρικές καταγωγές που περιλαμβάνουν την ετικέτα διατηρώντας υποσύνολο, αυτές οι μελέτες πιλότος, proof-of-concept πρότεινε ότι κλασματοποίηση MPE-όγκου με βάση τις διαφορές στους δείκτες πολλαπλασιασμού ήταν εφικτή (βλέπε την ετικέτα συγκράτησης των κυττάρων του πληθυσμού-M1 ότι αναδύεται πάροδο του χρόνου στο

PCM?

Εικόνα 4Β). Συνοπτικά, οι διαφορές στη μορφολογία, τον πολλαπλασιασμό, δείκτη επιφάνειας και μεταβολικές ιδιότητες αντανακλούν ενδεχομένως διακριτές ενδοφαινοτύπους των καρκινικών κυττάρων σε MPE. Παρά το γεγονός ότι τα λειτουργικά συσχετισμοί που συνδέονται με καθένα από αυτά τα χαρακτηριστικά έχουν ακόμη να διερευνηθούν περαιτέρω, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το MPE-πρωτογενείς καλλιέργειες, η έρευνα της εντός του όγκου ετερογένεια είναι εφικτή.

(Α) Μορφολογική ετερογένεια σε πρωτογενή καλλιέργεια. Τρία διαφορετικά MPE (Δείγμα Α, Δείγμα Β και Δείγμα C) καλλιεργήθηκαν σε PCM αξιολογήθηκαν για μορφολογία αποικίας. Κάθε στήλη (Α, Β, και C) αντιπροσωπεύει ένα συγκεκριμένο δείγμα. Αντιπροσωπευτικά φωτομικρογραφίες ετερογένειας αποικίας με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης τις ημέρες 3, 15 και 20 της πρωτογενούς καλλιέργειας (σειρές 1, 2 και 3, αντίστοιχα) που παρουσιάζονται. Οι μικροφωτογραφίες στις σειρές 1, 2 και 3 είναι σε μεγεθύνσεις από 40 × 100 × 400 και Χ, αντίστοιχα. (Β) MPE-υποπληθυσμών σε πρωτογενή καλλιέργεια μπορεί να κλασματοποιηθεί με βάση τις διαφορές στον πολλαπλασιασμό: Αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα ροή της Ημέρας 1 έναντι ημέρα 9 του CFSE επισημασμένου πρωτογενή καλλιέργεια. Με επέκταση, υποπληθυσμοί που είναι πολλαπλασιαστική χάνουν την ετικέτα CFSE, και εκείνα τα οποία είναι αδρανή διατηρούν την ετικέτα. Σε αυτό το παράδειγμα,

την ημέρα 1, 96,14%

των μετρήσεων βρίσκονται στην περιοχή περιφραγμένη με Μ1? στο

ημέρα 9, 8,36%

των μετρήσεων βρίσκονται στην περιοχή περιφραγμένη από M1.

Η

Λογικά κλασματοποίηση MPE-πρωτογενείς καλλιέργειες για να ταξινομήσετε τη θεωρούμενη CSC-υποπληθυσμό

με μοριακή υπογραφές που υποδηλώνει ότι η CSC είναι παρόντες στην MPE, είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν θα μπορούσαμε να συλλάβει τη em> υποψήφιος

CSC από MPE-όγκους

υποψήφιος

CSC-δείκτες. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε κάθε περίπτωση δοκιμαστεί μέχρι σήμερα, η επιφάνεια ανοσοφαινότυπος των κυττάρων σε πρωτογενή καλλιέργεια υποδεικνύεται γενικά ένα φαινόμενο επέκταση στην CD44 + κλάσμα (Εικόνα 5). Ενώ τα κύτταρα ήταν σχεδόν ομοιόμορφα θετικές για έκφραση CD44, τα κλάσματα ήταν πιο μεταβλητά θετική για cMet, CD166 [42], και uPAR [43] έκφρασης (Σχήμα 5). Επιπλέον, χρησιμοποιώντας ένα φθορίζον δοκιμασία που αναφέρθηκε να λύσουμε υποθετικές CSC από καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνο του μαστού, και πολλαπλό μυέλωμα [26], [27], [28], βάσει της διαφορικής δραστικότητας ΑΙ_ϋΗ, ένα μικρό κλάσμα του MPE-προερχόμενο πρωτοπαθείς όγκους που εμφανίζονται στην ΑΙ_ϋΗ

hi /CD44

+ φαινότυπο (Σχήμα 6). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι

υποψήφιος

CSC-κλάσματα μπορούν να διαχωρίζονται από πρωτογενείς καλλιέργειες MPE-όγκου.