Αφηρημένο

5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5- αζα-CDR) χρησιμοποιείται εκτενώς ως παράγοντα απομεθυλίωσης και ενεργεί σε συνεννόηση με αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης (HDACi) να επάγει απόπτωση ή αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Είτε τη δράση της 5-αζα-CdR σε αυτό συνεργιστικό αποτέλεσμα προκύπτει από απομεθυλίωση από αυτόν τον παράγοντα δεν είναι ακόμη σαφής. Σε αυτή τη μελέτη βρήκαμε ότι δεν παρατηρήθηκε αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων όταν τα κύτταρα με knockdown του DNA μεθυλοτρανσφεράση 1 (DNMT1), ή διπλό χτύπημα κάτω από DNMT1-Dnmt3a ή DNMT1-DNMT3B υποβλήθηκαν σε αγωγή με HDACi, υπονοώντας ότι η λειτουργία απομεθυλίωσης της 5- αζα-CDR μπορεί να μην εμπλέκονται σε αυτή τη συνεργική δράση. Περαιτέρω μελέτη έδειξε ότι υπήρχε σχέση αιτιότητας μεταξύ 5-αζα-CdR βλάβη που προκαλείται από DNA και την ποσότητα του [

3Η] -5-αζα-CdR ενσωματώνονται στο DNA. Ωστόσο, ενσωματώνεται [

3Η] -5-αζα-CdR μειώθηκε σταδιακά όταν τα κύτταρα επωάστηκαν σε [

3Η] -5-αζα-CdR μέσο ελεύθερο, υποδεικνύοντας ότι η 5-αζα-CdR, η οποία είναι μια ανώμαλη βάση , μπορούν να εξαιρεθούν από το σύστημα επισκευή των κυττάρων. Ήταν ενδιαφέρον ότι από HDACi αναβληθεί σημαντικά την απομάκρυνση του ενσωματωμένου [

3Η] -5-αζα-CdR από το DNA. Επιπλέον, ο αναστολέας HDAC έδειξε εκλεκτική συνέργεια με νουκλεοζίτη βλάβες στο DNA που προκαλείται από αναλογικό να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά έδειξε καμία τέτοια επίδραση με άλλες καταπονήσεις βλάβες στο DNA, όπως γ-ray και UV, ετοποσίδη ή σισπλατίνη. Αυτή η μελέτη αποδεικνύει ότι HDACi αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε συνέργεια με τα νουκλεοσιδικά ανάλογα με την καταστολή απομάκρυνση των ενσωματωθεί επιβλαβών ανάλογα νουκλεοτιδίων από το DNA

Παράθεση:. Chai G, Li L, Zhou W, Wu L, Zhao Υ, Wang D, et al. (2008) HDAC Αναστολείς νόμου με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καταστέλλοντας Απομάκρυνση των Incorporated Abases σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 3 (6): e2445. doi: 10.1371 /journal.pone.0002445

Επιμέλεια: Dong-Yan Jin, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 15 Μαρ 2008? Αποδεκτές: 12 του Μαΐου 2008? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιούν, 2008

Copyright: © 2008 Chai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίζεται από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (No.30425017, 30670417 και 30621002), και επιχορηγήσεις (2005CB522403, 2006AA02Z101, 2006CB910300 και B07001) από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

είναι γνωστό ότι η μεθυλίωση του DNA συνδέεται με την ιδιότητα του ακετυλίωση των ιστονών στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης [1] – [4]. ή τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και της γήρανσης [5]. Αυτή η σύνδεση μεταξύ της κατάστασης των ιστονών και της μεθυλίωσης του DNA ήταν καλά επιβεβαιώθηκε από Cameron

et al

ο οποίος διαπίστωσε ότι διάφορα γονίδια σιγήσει μέσω μεθυλίωσης επανενεργοποιήθηκαν όταν έλαβαν θεραπεία με απομεθυλιωτικής παράγοντα 5-αζα-CdR και αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης (HDACi) τριχοστατίνη Α (TSA) μαζί, αλλά δεν επανενεργοποιήθηκαν παρουσία 5-αζα-CdR ή TSA μόνος [6]. Αργότερα, αρκετά εργαστήρια συμπεριλαμβανομένης της δικής μας επεκτείνεται αυτά τα ευρήματα για να δημιουργήσει μια θεραπευτική στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου, στην οποία η 5-αζα-CdR δρα σε συνδυασμό με το δεψιπεπτίδιο /TSA να επάγει σημαντική αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο [7] – [10]. Από μεθυλίωσης του DNA στην περιοχή του υποκινητή συνδέεται με HDAC1 από μία πρωτεΐνη μεθυλο-δέσμευσης MeCP2 [11], είναι πιστευτό ότι ορισμένα γονίδια, αν υπερμεθυλιωμένο στην περιοχή του υποκινητή τους, είναι πιο πυκνά από τις ιστόνες και έτσι παραγόντων μεταγραφής πρόσβαση δέσμευσης DNA τους sites μόνο με μεγαλύτερη δυσκολία. Κατά συνέπεια, τα γονίδια σχετίζονται με το θάνατο των κυττάρων, οι οποίες οφείλονται σε σιγήσει υπερμεθυλίωση, θα μπορούσε να επανενεργοποιηθεί με επεξεργασία με 5-αζα-CdR? αυτό επανενεργοποίηση πρέπει να ενισχυθεί με HDACi, και την ίδια στιγμή, ο κυτταρικός θάνατος θα πρέπει να είναι πιο εύκολα παρατηρήσιμη, καθώς και.

Ωστόσο, 5-αζα-CdR παίζει επίσης ένα αντι-νεοπλαστικό ρόλο που είναι μεθυλίωση ανεξάρτητη [ ,,,0],12] – [14]. 5-αζα-CDR μπορεί να ενεργεί άμεσα επί μιτοχόνδρια και επάγουν απόπτωση σε κύτταρα θηλαστικών [14]. Μια άμεση μεθυλίωση ανεξάρτητες αποδείξεις για την κυτταρικό θάνατο που επάγεται 5-αζα-CdR είναι ότι η 5-αζα-CdR ενισχύει σημαντικά την έκφραση του Apaf-1 ή ρ19

INK4d να επάγει κυτταρικό θάνατο, ωστόσο οι περιοχές προαγωγού αυτών των γονιδίων είναι εντελώς μη μεθυλιωμένες [12], [13]. 5-αζα-CdR έχει επίσης αναφερθεί ότι επάγει μια συνεργική επίδραση με την αύξηση της σισπλατίνης δεσμεύονται στο DNA, μέσω μιας αλλαγής στην τοπολογία του DNA που επιφέρει η 5-αζα-CdR χωρίς λειτουργία του ως παράγοντα απομεθυλίωσης [15]. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η 5-αζα-CdR παίζει διάφορους ρόλους σε κύτταρα τα οποία περιλαμβάνουν και τις δύο λειτουργίες και τις λειτουργίες απομεθυλίωσης μεθυλίωση-ανεξάρτητη.

Η κυτταροτοξικότητα της 5-αζα-CdR αποτελέσματα από την ικανότητά της να βλάψουν το DNA ως 5-αζα -CdR είναι ένα ανάλογο νουκλεοζίτη (νΑ) και μπορούν να ενσωματωθούν στο σκελετό του DNA [16], [17], η οποία με τη σειρά της μπορεί να προκαλέσει το σχηματισμό ενός ομοιοπολικού προϊόντος προσθήκης μεταξύ του μορίου 5-αζα-CdR και μεθυλτρανσφεράσες [16]. Έχει αποδειχθεί ότι NAs όπως 5-αζα-CDR ή κυταραβίνη (Ara-C), φωσφορυλιώνονται σε τριφωσφορική μορφή τους και στη συνέχεια ενσωματώνονται στο DNA κατά την αντιγραφή [18]. Στη συνέχεια, η ενσωματώνονται NA χρησιμεύσει ως μια εξευτελίζω που μπορεί να προκαλεί βλάβη στο DNA, οι μεταλλάξεις και εμπλοκή του διχάλα αντιγραφής του DNA [19], [20]. Αυτές οι αλλαγές στη ραχοκοκαλιά του DNA είναι επιβλαβή, και αισθητήρες βλάβη του DNA όπως DNA-PK, p53, ΑΤΜ και ATR αναγνωρίζουν αυτά τα κατεστραμμένα μνημεία και την επισκευή του ανώμαλη DNA [21], [22]. Προηγουμένως, τόσο η ομάδα μας και άλλων ερευνητών επιβεβαίωσε άμεσα ότι η 5-αζα-CdR προκαλεί βλάβη στο DNA και προκαλεί ρ53-εξαρτώμενη βιολογικές αντιδράσεις [23] – [25]. Ωστόσο, εάν οι μη φυσιολογικές αλλαγές του DNA που προκαλείται από την ενσωμάτωση του ΕΓ είναι συγκλονισμένοι, ή τα συστήματα επισκευής του DNA είναι σοβαρά αναστέλλεται, τα κύτταρα θα υφίστανται απόπτωση [26].

αναστολείς HDAC είναι νέες και αποτελεσματικές αντικαρκινικών παραγόντων [27 ], [28], τα οποία εμπλέκονται στη ρύθμιση πολλών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης της ρ53 [29], ή προς τα κάτω ρύθμιση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων [28], [30] για να ασκήσει μια αντι-νεοπλασματική δράση. Ως εκ τούτου, διερεύνηση του κατά πόσον ή όχι HDACi επηρεάζει επίσης τα ένζυμα επισκευής DNA για την ενίσχυση της NA που προκαλείται από βλάβη του DNA ονομάζεται για.

Στη μελέτη αυτή, επιβεβαιώνουμε ότι το 5-αζα-CdR ενεργεί σε συνεννόηση με HDACi να προκαλέσει μια σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε ένα μεθυλίωση ανεξάρτητο τρόπο. 5-αζα-CdR ενσωματώθηκε σε DNA σε μία δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο που σαφώς συνδέεται με την επαγωγή του DNA μονής αλυσίδας (SSB) από την 5-αζα-CDR. Οι αναστολείς HDAC κατέστειλε σημαντικά την απομάκρυνση του ενσωματωμένου 5-αζα-CdR από το DNA και έτσι παράγεται μία συνεργιστική δράση με αποτέλεσμα την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και χημική κατεργασία

Ανθρώπινο καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών Α549 και H719 χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Τόσο 5-αζα-CDR (διαλυμένο σε 50% οξικό οξύ) και Ara-C (διαλυμένο σε DMSO) (και τα δύο αγοράστηκαν από την Sigma, St Louis, ΜΟ) προστέθηκαν φρέσκο ​​εντός του μέσου κάθε 24 ώρες. TSA (Sigma) διαλύθηκε σε αιθανόλη. Δεψιπεπτιδίου (ευγενική παραχώρηση του ΝΙΗ) διαλύθηκε σε DMSO.

Προσδιορισμός κυτταρικού πολλαπλασιασμού με ΜΤΤ δοκιμασία

ίσοι αριθμοί κυττάρων (περίπου 5000 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα 24 ώρες πριν από τον πειραματισμό. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-CdR, Ara-C, γ-ακτινοβολία και HDACi μόνα τους ή σε συνδυασμό. Μετά την επεξεργασία, το διάλυμα χρωστικής ΜΤΤ (Sigma) προστέθηκε στην πλάκα 96 φρεατίων. Η διορθωμένη απορρόφηση κάθε δείγματος υπολογίστηκε σε σύγκριση με το μάρτυρα.

RT-PCR

Για να προσδιοριστεί εάν νοκ ντάουν της μεθυλοτρανσφεράσες DNA (DNMTs) είναι αποτελεσματική στο DNA απομεθυλιωτικής και επανενεργοποίηση φιμώνονται γονίδια, RT-PCR για την ανίχνευση μεταβολών στην έκφραση του p21 που σιωπήσει οφείλεται σε υπερμεθυλίωση στο

p21

υποκινητή [31]. Οι εκκινητές PCR είχαν ως εξής: p21, αριστερά εκκινητή GGA AGA CCA TGT GGA ΚΔ GT και δεξιά εκκινητή GGA ΤΤΑ GGG CTT ΚΔ CTT GG?

β

-ακτίνη, αριστερά εκκινητή ΤΟΟ AGA AGA GCT ACG AGC TGC CTG και δεξιά εκκινητή ΟΤΟ CCG CCA GAC AGC ACT ΟΤΟ TTG.

Western Blot

Για την αναγνώριση μεταβολές στην έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα επεξεργασμένα με knockdown του DNMTs ή 5-αζα-CdR, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με μια ξύστρα και στη συνέχεια πλύθηκε μία φορά με ψυχρό αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό. Τα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (50 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 0.15% Igepal CA-630, και 1.5 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο). Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών (100-150 μg) ήσαν μέγεθος κλασματοποιήθηκε επί 7.5 έως 12.5% ​​SDS-PAGE. Επιπλέον, για να καθορίσει το ποσό της χρωματίνης δεσμευμένου RPA, τα κύτταρα λύθηκαν σε διάλυμα Α (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.8, 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% ΝΡ-40, 0.34 Μ σακχαρόζη, 10% γλυκερίνη, 1 mM Na

3νο

4 και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης). Για να αποκτήσετε πυρηνικά εκχυλίσματα, τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό Β (10 mM HEPES, ρΗ 7.9, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl

2, 0,34 Μ σακχαρόζη, 10% γλυκερίνη, 0,1% Triton Χ-100, κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης) . Απομονωμένα πυρήνες πλύθηκαν μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα Β και περαιτέρω λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Α όπως ανωτέρω. Για να αποκτήσετε χρωματίνη δεσμευμένες πρωτεΐνες, που απομονώνονται πυρήνες λύθηκαν σε ρυθμιστικό C (3 mM EDTA, 0.2 mM EGTA, 1 mM DTT) και περαιτέρω λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Α όπως ανωτέρω.

Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αντι-PARP ( Santa Cruz, F-2), αντι-ΚΡΑ (Santa Cruz, MA34 και MA70-2), αντι-γ-Η2ΑΧ (Upstate, 05-636), αντι-DNMT1 (Santa Cruz, Η-300), αντι-Dnmt3a (Santa Cruz, Ρ-16), αντι-DNMT3B (ένα δώρο από τον Dr. Xu, G, Σαγκάη Ινστιτούτο Βιολογικών Επιστημών) και τα αντισώματα β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz.

θεραπεία διθειώδες DNA και όξινο θειώδες αλληλούχιση

για την αξιολόγηση μεταβολές στην κατάσταση μεθυλίωσης του DNA μετά από θεραπεία με knockdown του DNMTs, DNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όξινο θειώδες νάτριο και καθαρίζεται για PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Οι εκκινητές για αλληλούχιση ο

p21

προαγωγού είχαν ως εξής: αριστερός εκκινητής, 5′-GGG AGG AGG GAA GTG ΤΤΤ ΤΤ-3 ‘και δεξιός εκκινητής, 5′-ACA ACT ACT CAC ACC TCA ACT-3’ . Τα προϊόντα PCR σε πήκτωμα εκχυλίζεται (Qiagen, Valencia, CA) και συνδέθηκε εντός ρΟΕΜ-Τ εύκολο φορέα, χρησιμοποιώντας το σύστημα κλωνοποίησης ΤΑ (Promega, Madison, WI). Τα μετασχηματισμένα βακτήρια ϋΗ5α καλλιεργήθηκαν για μία νύχτα και το πλασμίδιο DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας κιτ (Qiagen). Τουλάχιστον 10 ξεχωριστές κλώνοι επιλέχθηκαν για ανάλυση αλληλουχίας.

Comet δοκιμασία

Ο κομήτης δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, παγωμένος μικροσκοπικές πλάκες καλύφθηκαν με 0.5% φυσιολογικό τήξης αγαρόζη στους 60 ° C. Περίπου 10

5 5-αζα-CdR κατεργασμένα ή μη κατεργασμένα κύτταρα σε PBS αναμίχθηκαν με ίση ποσότητα 1% χαμηλής τήξης αγαρόζη για να σχηματίσει ένα εναιώρημα κυττάρων. Μετά την ηλεκτροφόρηση, διαφάνειες εξετάστηκαν σε 600 × μεγέθυνση και εικόνες ελήφθησαν με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (TCS, Leica, Manheim, Germany).

Ανάλυση του αποκλεισμού των ενσωματωθεί [

3Η] -5-αζα- CdR από DNA

Το ραδιοεπισημασμένο νουκλεοσιδίου δοκιμασία ανάλογο ενσωμάτωση διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως με τροποποιήσεις [32]. [

3Η] -5-αζα-CdR αγοράστηκε από Moravek Biochemicals (MT1676, 1 mCi /ml, Brea, CA). H719 και Α549 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με [

3Η] -5-αζα-CdR σε 1 μΜ για 48 ώρες με ή χωρίς δεψιπεπτιδίου σε 0,1 μΜ για τις τελικές 6 ώρες (από 42 έως 48 ώρες) και τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με κρύο PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια αντικαταστάθηκε το [

3Η] -5-αζα-CdR μέσο ελεύθερο και επωάστηκαν για 6, 12 ή 24 ώρες. Cold τριχλωροξικό οξύ (TCA, 50%) προστέθηκε στη συνέχεια στο διάλυμα και το κύτταρο TCA αδιάλυτου DNA τοποθετήθηκε σε ένα γυάλινο φίλτρο μικροϊνών (Whatman, Maidstone, England). Αυτό γυάλινο φίλτρο με TCA αδιάλυτου DNA τοποθετήθηκε σε ένα φιαλίδιο για να μετρήσει τη ραδιενέργεια με ένα Beckman LS 5000 Liquid Scintillation Counter.

Καθιέρωση κυτταρικής γραμμής με ένα σταθερό DNMT1 ανεπάρκεια κλώνος

Η pCMVneo -DNMT1 αντιπληροφοριακό πλασμίδιο παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. SB Baylin [33]. Ο φορέας διαμολύνθηκε σε κύτταρα H719 χρησιμοποιώντας το κιτ Qiagen Effectene Επιμόλυνσης (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την πρώτη επιμόλυνση, μία δεύτερη διαμόλυνση εκτελέστηκε για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας της RNAi, και στη συνέχεια 800 μg /ml του G418 προστέθηκε για την επιλογή σταθερών κυττάρων με αντιπληροφοριακό DNMT1.

RNA παρεμβολής με Dnmt3a , DNMT3B

Η RNAi στοχευμένες αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων έχουν ως εξής: CAT CCA CTG TGA ATG ΑΤΑ ΑΤΤ (Dnmt3a) και GAT CAA GCT ΚΕΔ GAC TCT C (DNMT3B) (αγοράστηκε από τη Σαγκάη GeneChem Company). Τα ολιγονουκλεοτίδια για Dnmt3a και DNMT3B siRNA επιμολύνθηκαν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 επί 48 ώρες.

Αποτελέσματα

5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης συνεργάζεται με HDACi να επάγουν την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με μια μεθυλίωση ανεξάρτητο μηχανισμό

έχει αναφερθεί ότι η 5-αζα-CdR δρα μαζί με αναστολείς HDAC για να επάγει συνεργικά κυτταρικού θανάτου ή αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού [7] – [10]. Για να διερευνηθεί κατά πόσο ο ρόλος της 5-αζα-CdR που εμπλέκονται σε αυτή την συνεργική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων όταν συνδυάζεται με HDACi είναι επιγενετική, δύο διπλά γκρεμίζω (DKD) κλώνους (DKD της DNMT1 /Dnmt3a και DKD της DNMT1 /DNMT3B) ιδρύθηκαν. Για να αποφευχθεί η πρόκληση μιας διαφορά στην αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης όταν τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με δύο φορείς ή δύο RNAi ολιγονουκλεοτίδια, ένα DNMT1 ανεπάρκεια σταθερός κλώνος δημιουργήθηκε πρώτα με επιμόλυνση ενός φορέα με αντιπληροφοριακό DNMT1 cDNA σε κύτταρα H719 και επιλεγμένα με G418. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, DNMT1 πρωτεΐνη είναι καλά γκρέμισε σε αυτή τη σταθερή κυτταρική γραμμή H719. Στη συνέχεια, DKD του DNMT1 /Dnmt3a, ή DNMT1 /DNMT3B πραγματοποιήθηκε με επιμόλυνση Dnmt3a ή DNMT3B RNA ολιγονουκλεοτιδίων στην DNMT1 knockdown σταθερά κύτταρα. Σχήμα 1Β-Γ δείχνει σαφώς ότι Dnmt3a και τα επίπεδα πρωτεΐνης DNMT3B μειώθηκαν σημαντικά από αυτές τις θεραπείες RNAi. Για να αξιολογηθεί κατά πόσον αυτές οι DKDs της DNMTs ήταν αποτελεσματική για απομεθυλίωσης DNA, την κατάσταση μεθυλίωσης του

p21

WAF1 /Cip1

υποστηρικτής επιλέχθηκε για τη δοκιμή με όξινο θειώδες αλληλούχιση, επειδή η

p21

WAF1 /Cip1

υποκινητής είναι ιδιαίτερα μεθυλιώνεται H719 κύτταρα [31]. Σύκο. 1D αντιπροσωπεύει ένα σχηματικό διάγραμμα που δείχνει την περιοχή προαγωγέα του

ρ21

WAF1 /Cip1

και το θραύσμα που ορίζεται για διθειώδες αλληλούχιση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1E, η

p21

WAF1 /Cip1

προαγωγό σε κύτταρα H719 ήταν άκρως μεθυλιώνονται (51,25% του CGs στο

p21

WAF1 /Cip1

υποκινητή μεθυλιώνονται σε 10 επιλεγμένους κλώνους ). Ωστόσο, μεθυλιωμένα ΟΟδ μειώθηκαν στους 23,75%, 21,5% και 12,5% όταν DNMT1, DNMT1 /Dnmt3a και DNMT1 /DNMT3B υποβλήθηκαν σε διπλασιασμό γκρεμίζω με 10 επιλεγμένους κλώνους (Σχ. 1Ε), υποδεικνύοντας ότι η knockdown του DNMT1 και DNMT3B μαζί ήταν η πιο αποτελεσματική για DNA απομεθυλίωση. Αυτή η μείωση στην μεθυλίωση του

ρ21

WAF1 /Cip1

υποκινητή είχε σαφώς συνδέεται με την έκφραση του ρ21 όπως μετράται με RT-PCR (Σχ. 1 F).

(Α) Αντιπροσωπευτική Western κηλίδα δείχνει ότι το επίπεδο της πρωτεΐνης στα κύτταρα DNMT1 H719 μειώθηκε σημαντικά κατά την DNMT1 ανεπάρκεια σταθερός κλώνος σε σύγκριση με τον έλεγχο μη-ειδικό ολιγονουκλεοτίδιο θεραπεία. (Β) και (C) Αντιπροσωπευτική κηλίδες Western δείχνουν επίσης ότι το επίπεδο της πρωτεΐνης Dnmt3a ή DNMT3B ήταν σημαντικά μειωμένη μετά την επεξεργασία RNAi σε DKD των κυττάρων /Dnmt3a DNMT1 ή DKD κυττάρων DNMT1 /DNMT3B, αντίστοιχα. β-ακτίνης παρουσιάζεται ως έλεγχος φόρτωσης στο κάτω πάνελ. (Δ) Ένα σχηματικό διάγραμμα που δείχνει το

p21

WAF1 /Cip1

υποκινητή, με τη μαύρη περιοχή που υποδεικνύει το θραύσμα που υπέστη όξινο θειώδες αλληλουχίας (-233-2 σε σχέση με την θέση έναρξης της μεταγραφής). (Ε) με όξινο θειώδες αλληλουχίας, 10 κλώνοι επιλέχθηκαν τυχαία και η κατάσταση μεθυλίωσης του

ρ21

WAF1 /Cip1

προαγωγού προσδιορίστηκε σε μη επεξεργασμένα κύτταρα H719 ή στα κύτταρα H719 σε επεξεργασία με knockdown του DNMT1, DKD της DNMT1 /Dnmt3a ή DKD της DNMT1 /DNMT3B. (F) RNA εξήχθη από H719 κύτταρα επεξεργασμένα με DKD του DNMT1 /DNMT3B, και RT-PCR για την ανίχνευση της έκφρασης του mRNA p21. β-ακτίνης παρουσιάζεται ως έλεγχος φόρτωσης για την ανάλυση RT-PCR.

Η

Ένα αναπάντεχο εύρημα ήταν ότι δεν είχαμε παρατηρήσει τη διαφορά στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων όταν H719 κύτταρα με DKDs ή TKDs (νοκ ντάουν της DNMT1 /3Α /3Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς δεψιπεπτιδίου και αναλύθηκε με ΜΤΤ (Εικ. 2Α). Σε αντίθεση, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά και στις δύο Α549 και H719 κύτταρα τα οποία υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-αζα-CdR και HDACi δεψιπεπτιδίου /TSA, αν και μόνο 5-αζα-CdR και δεψιπεπτιδίου /TSA μόνο είχε μικρή επίδραση στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε οι δόσεις που χρησιμοποιούνται (Σχ. 2Β-C). Ωστόσο, 5-αζα-CdR επαγόμενη αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού ήταν κυτταρική γραμμή εξαρτώμενη. Για παράδειγμα, η 5-αζα-CdR έδειξε μια προφανή επίδραση στην παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού Α549 κυττάρων (Σχ. 2C), αλλά δεν είχε καμία επίδραση σε H719 κύτταρα (Σχ. 2Β). Αυτές οι διαφορές στην 5-αζα-CdR επαγόμενη επίδραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μεταξύ Α549 και H719 κύτταρα προέκυψαν από την κατάσταση της ρ53 των κατεργασμένων κυττάρων [24]. Κύτταρα Α549 έχουν ένα άγριου-τύπου ρ53, ενώ ρ53 κύτταρο H719 είναι μεταλλαγμένο [31]. Επιπλέον, αν και η προκαΐνη έχει αναφερθεί ότι είναι ένας παράγοντας απομεθυλίωσης [34], συνεργική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων δεν παρατηρήθηκε όταν τα κύτταρα H719 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με προκαΐνη (0.5 mM για 72 ώρες) και δεψιπεπτιδίου (0,1 μΜ για 6 ώρες σε 66- 72 ώρες) ή TSA (1 μΜ για 6 ώρες σε 66-72 ώρες) (Σχ. 2D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο ρόλος της 5-αζα-CdR σε συνεργική δράση της με HDACi στην επαγωγή αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων δεν μπορεί να προκύψει από τη λειτουργία απομεθυλίωσης της.

(Α) H719 κύτταρα με ανεπαρκή DNMT1, DKD του DNMT1 /Dnmt3a, DKD του DNMT1 /DNMT3B, ή TKD (τριπλή knockdown) του DNMT1 /Dnmt3a /DNMT3B υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς δεψιπεπτιδίου σε 0,1 μΜ για 6 ώρες, και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ελέγχθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ. (Β) και (Γ) 5-αζα-CDR (1 μΜ για 72 ώρες) συνεργάζεται με δεψιπεπτίδιο αναστολέα HDAC (0,1 μΜ για τις τελικές 6 ώρες) ή TSA (1 μΜ για τους τελικούς 6 ώρες) για να προκληθεί συνεργικά αναστολή της κυτταρικής πολλαπλασιασμός σε H719 (Β) ή κύτταρα Α549 (C). (D) H719 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με προκαΐνη (0,5 mM) για 72 ώρες, και δεψιπεπτιδίου (0,1 μΜ για τις τελικές 6 ώρες) ή TSA (1 μΜ για τους τελικούς 6 ώρες) στη συνέχεια προστέθηκαν στα επεξεργασμένα κύτταρα. Όλα τα δεδομένα είναι τα αποτελέσματα δύο χωριστών πειραμάτων.

Η

5-αζα-CdR επάγει κυτταροτοξικότητα με ενσωμάτωση στο DNA ως ένα ανάλογο νουκλεοζίτη

Είναι γνωστό ότι η 5-αζα-CdR φωσφορυλιώνεται προς τριφωσφορική μορφή της στα κύτταρα και στη συνέχεια ενσωματώθηκαν στο DNA κατά την αντιγραφή [18]. Προκειμένου να διερευνηθεί ο βαθμός 5-αζα-CdR ενσωμάτωση σε κύτταρα, [

3Η] -5-αζα-CdR προστέθηκε σε Α549 ή H719 κυττάρων για 24 ώρες και το DNA στη συνέχεια εκχυλίσθηκε με κατακρήμνιση TCA. μετρήθηκε η ραδιενέργεια ανά μg DNA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α-Β, ενσωμάτωση της [

3Η] -5-αζα-CDR σε DNA ήταν εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση και στις δύο κυτταρικές σειρές. Ενσωματωθεί ραδιενέργειας ανά μg DNA σε 0,1 μΜ και 1 μΜ [

3Η] -5-αζα-CdR αυξημένη ~2- και περίπου 12 φορές αντίστοιχα κύτταρα H719, και ~10- και -110 φορές αντίστοιχα Α549 κύτταρα σε σύγκριση με την ραδιενέργεια του 0.01 μΜ [

3Η] -5-αζα-CdR σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές.

(Α) H719 ή (Β) κύτταρα Α549 επωάστηκαν με [

3Η ] -5-αζα-CdR για 24 ώρες σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και κατόπιν πλύθηκε με ψυχρό PBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε φρέσκο ​​μέσο για άλλες 24 ώρες, και το DNA μετά καταβυθίστηκε με ψυχρό TCA. Η ραδιενέργεια μετρήθηκε και σχετικής ραδιενέργειας ανά μg μετρήθηκε. Ίδια ποσότητα DNA φορτώθηκε και τρέχει σε 1% πηκτώματος αγαρόζης σε 100 V για 5 λεπτά ως έλεγχος φόρτωσης, η οποία απεικονίζεται στο άνω πάνελ του Σχ. 3Α και το σχ. 3Β, αντιστοίχως. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι από δύο ξεχωριστά πειράματα βλάβη (μέση τιμή ± SD) DNA που επάγεται από την 5-αζα-CdR σε H719 κυττάρων προσδιορίστηκε με τον κομήτη προσδιορισμό. (Γ) μη επεξεργασμένου ελέγχου, (D) 5-αζα-CdR σε 0,1 μΜ για 72 ώρες και (Ε) 5-αζα-CdR σε 1 μΜ για 72 ώρες.

Η

Υπήρξε μια σχέση μεταξύ ενσωματώθηκε 5-αζα-CdR και βλάβη του DNA όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία κομήτη. Το Σχήμα 3C-Ε δείχνει ότι η 5-αζα-CdR επέδειξε μία χωρητικότητα εξαρτώμενη από τη δόση για βλάβες του DNA σε κύτταρα Α549, το οποίο αποδεικνύεται από την παρουσία ενός ουρά DNA. Ευρύτερη περιοχή της ουράς του DNA και μεγαλύτερο μήκος της ουράς του DNA αντιπροσωπεύουν μεγαλύτερη βλάβη του DNA. Ο Πίνακας 1 δείχνει μια στατιστική ανάλυση του κομήτη δοκιμασία συγκρίνοντας 5-αζα-CdR επεξεργασμένων δειγμάτων σε ένα μάρτυρα. Αυτά τα δεδομένα είναι παράλληλη με την ενσωματωθούν ποσό των 5-αζα-CdR, και υπονοεί ότι το 5-αζα-CdR παίζει ρόλο στην κυτταροτοξικότητα με ενσωμάτωση στο DNA.

Η

Όπως απόπτωση μπορεί επίσης να δώσει ένα θετικό αποτέλεσμα στην κομήτη δοκιμασία [35], συλλέξαμε 5-αζα-CdR κατεργασμένα κύτταρα και εκτελείται ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για να προσδιοριστεί αν 5-αζα-CdR προκαλούμενη βλάβη του DNA προκαλεί αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Τα κύτταρα με περιεχόμενο DNA μικρότερη από εκείνη του G

0 /G

1 (περιοχή του Μ1 στο σχήμα 4) θεωρούνται ότι είναι αποπτωτικά κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, 5-αζα-CdR δεν προκάλεσε απόπτωση σε κύτταρα Α549 σε 0.1 μΜ (Εικ. 4Β) ή 1 μΜ για 72 ώρες (Εικ. 4C). Επιπλέον, τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-CdR σε 1 μΜ για 48 ώρες ή 72 πρωτεΐνη hrsand εκχυλίζεται για κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-PARP (διάσπαση της PARP είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης). Σύκο. 4D δείχνει ότι η 5-αζα-CdR δεν διεγείρουν τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε περιορισμένες δόσεις. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η 5-αζα-CdR μόνη σε περιορισμένες δόσεις δεν είναι σε θέση να διεγείρει απόπτωση και έτσι το αποτέλεσμα είναι θετικό σε κομήτη αποτελέσματα της ανάλυσης, κυρίως από 5-αζα-CdR βλάβη που προκαλείται από το DNA.

(Α-Γ ) Για να προσδιοριστεί αν η 5-αζα-CdR προκαλούμενη βλάβη του DNA επάγει αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μέσω αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, διεξήχθη μια ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα Α549 (Α) ή κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-αζα-CdR στα 0.1 μΜ (Β) ή σε 1 μΜ για 72 ώρες (C), και τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν για χρώση με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). περιεκτικότητα σε DNA με μικρότερο από το G

0 /G

1 θεωρήθηκε ως αποπτωτικά DNA (περιοχή της Μ1). (D) Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-CdR σε 1 μΜ για 48 ή 72 ώρες και η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε για κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-ΡΑΚΡ για την ανίχνευση διάσπασης της ΡΑΚΡ σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 5-αζα-CDR. Μια αποπτωτικών θετικός μάρτυρας παρουσιάστηκε στο λωρίδα της ακροδεξιάς, στην οποία υπάρχουν δύο ζώνες αναφέροντας την PARP (116 KD) και PARP cleavaged (85 KD).

Η

Σε γενικές γραμμές, παράγοντες βλάβης του DNA επάγουν DNA μονής αλυσίδας (SSB) ή διπλά σπασίματα (ΟΕΔ). Για να προσδιορίσετε το είδος της βλάβης του DNA που προκαλείται από 5-αζα-CdR, πραγματοποιήθηκε κηλίδωση Western με τη χρήση αντι-ΚΡΑ (πρωτεΐνη αντιγραφής Α) ή γ-H2AX. Οι περισσότεροι παράγοντες βλάβης του DNA επάγουν κυτταρικές αποκρίσεις μέσω της ενεργοποίησης του ATR (ΑΤΜ και Rad3 σχετίζονται) [36] – [40], και η ενεργοποίηση του ATR εξαρτάται από ένα ενδιάμεσο μόριο σε μεγάλο βαθμό RPA [41], [42]. Χρωματίνης εκχυλίστηκε από 5-αζα-CdR επεξεργασμένο H719 κύτταρα και χρωματίνη δεσμευμένο περιεχόμενο RPA προσδιορίστηκε. Σύκο. 5Α δείχνει ότι χρωματίνη δεσμευμένη RPA αυξήθηκε σε απόκριση στην αυξημένη 5-αζα-CdR, υποδεικνύοντας ότι η 5-αζα-CdR προκαλούμενη βλάβη του DNA μπορεί να είναι μονής αλυσίδας (SSB). Από την άλλη πλευρά, γ-Η2ΑΧ θεωρείται ότι είναι το σήμα κατατεθέν του DNA δίκλωνα σπασίματα (DSB) [43], και ως εκ τούτου κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε με την χρησιμοποίηση μυρμήγκι-γ-Η2ΑΧ να αποκλείσει το ενδεχόμενο της 5-αζα-CdR που προκαλείται DSB. Σύκο. 5Β δείχνει ότι η 5-αζα-CdR στο 1 μ δεν προκάλεσε DSB. Ωστόσο, 5-αζα-CdR σε υψηλότερη συγκέντρωση (& gt? 5 μΜ) προκάλεσε δοσοεξαρτώμενη DSB (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η 5-αζα-CdR επαγόμενη DNA SSB ή DSB εξαρτάται δοσολογίας. Σε αυτή τη μελέτη, 5-αζα-CdR ήταν σχεδόν πάντα χρησιμοποιείται σε χαμηλότερες δόσεις (1 μΜ) και έτσι η 5-αζα-CdR προκαλούμενη βλάβη του DNA είναι SSB.

(Α-Β) H719 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-CDR (0.1-1 μΜ) για 48 ώρες, και κυτταρικά εκχυλίσματα συμπεριλαμβανομένης της χρωματίνης κλάσμα (Α, Chr) και διαλυτό κλάσμα (Β, Sol) απομονώθηκαν για κηλίδωση Western για την ανίχνευση μεταβολών σε RPA70 και RPA32. Η ένταση της ζώνης του μη επεξεργασμένο δείγμα ορίστηκε ως 1. Η αριθμητική τιμή του κάθε δείγματος αντιπροσωπεύει το ποσοστό της έντασης ζώνης σε σχέση με εκείνη των μη επεξεργασμένων δειγμάτων. (C) κύτταρα H719 υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή με 5-αζα-CdR σε 1 μΜ για 24, 48 ή 72 ώρες, και η πρωτεΐνη στη συνέχεια εκχυλίστηκε για κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-γ-Η2ΑΧ. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με δοξορουβικίνη σε 1 μΜ για 24 ώρες ως θετικός έλεγχος (άκρη δεξιά λωρίδα).

Η

Δεψιπεπτίδιο αναστέλλει ειδικά την απομάκρυνση του ενσωματώνεται 5-αζα-CdR και ενισχύει νουκλεοζίτη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα αναλογικό

Επειδή βλάβης του DNA που προκαλείται από χαμηλή δόση της 5-αζα-CdR είναι αναστρέψιμη, είναι ιδιαίτερα σημαντικό να κατανοήσουμε πώς αναστολέα HDAC ενισχύει 5-αζα-CdR επαγόμενη τοξικότητα. Επιπλέον, όπως διαδοχική επεξεργασία του 5-αζα-CdR και αναστολέα HDAC είναι πιο αποτελεσματική στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου [44], οδηγηθήκαμε να εξεταστεί αν HDACi αυξάνει την πρόσληψη 5-αζα-CDR σε DNA ή μειώνει την απομάκρυνση των ενσωματωθεί 5- αζα-CdR από το DNA, ενισχύοντας έτσι την 5-αζα-CdR επαγόμενη κυτταροτοξικότητα. Πρώτον, δεψιπεπτιδίου (0.1 μΜ) και [

3Η] -5-αζα-CDR (1 μΜ) προστέθηκαν μαζί σε κύτταρα Α549 για αρχική 6 ώρες, και τα κύτταρα στη συνέχεια συνεχώς καλλιεργήθηκαν σε μέσο με [

3Η] -5-αζα-CdR μόνος για άλλες 42 ώρες. Η ραδιενέργεια μετρήθηκε σε 0-24 ώρες μετά τα κύτταρα επωάστηκαν σε ραδιενέργεια μέσο ελεύθερο. Συγκρίνοντας τα δείγματα που έλαβαν θεραπεία με [

3Η] -5-αζα-CdR μόνο για να δείγματα που κατεργάζονται με [

3Η] -5-αζα-CdR συν δεψιπεπτιδίου, καμία διαφορά στη ραδιενέργεια παρατηρήθηκε, υποδεικνύοντας ότι δεψιπεπτίδιο δεν προάγει ενσωμάτωση [

3Η] -5-αζα-CDR σε DNA (Σχ. 6Α). Για να ελεγχθεί αν δεψιπεπτιδίου επηρεάζει την απομάκρυνση των ενσωματωθεί 5-αζα-CdR, μια ανάλυση αποσύνθεση του ενσωματώνεται [

3Η] -5-αζα-CdR διεξήχθη σε κύτταρα Α549. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με [

3Η] -5-αζα-CdR σε 1 μΜ για 48 ώρες, με και χωρίς δεψιπεπτιδίου σε 0,1 μΜ για τις τελικές 6 ώρες της θεραπείας, και τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και αντικαταστάθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο ( χωρίς πειραματική αντιδραστήρια) για 6, 12 και 24 ώρες. Εικόνα 6Α δείχνει ότι ενσωματώθηκε [

3Η] -5-αζα-CdR μειώθηκε σταδιακά κατά τη διάρκεια της επώασης σε [

3Η] -5-αζα-CdR ελεύθερο μέσο. Η ραδιενέργεια ανά μg DNA σε 6, 12 και 24 ώρες σε κύτταρα κατεργασμένα με [

3Η] -5-αζα-CdR μόνο, για παράδειγμα, μειώθηκε στα 78,44 ± 7,08%, 57,5 ​​± 3,88% και 36,05 ± 1,79%, αντίστοιχα , σε σύγκριση με την ραδιενέργεια στην αρχή της επώασης. Αυτό αντανακλά την αφαίρεση του [

3Η] -5-αζα-CdR από το DNA. Εντούτοις, η προσθήκη δεψιπεπτίδιο αναβληθεί σημαντικά την αφαίρεση του [

3Η] -5-αζα-CdR από το DNA, και η ραδιενέργεια ανά μg DNA σε 6, 12 και 24 ώρες ήταν 80,3 ± 13,21%, 78,71 ± 12,72% και 82,5 ± 20.47%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με την ραδιενέργεια στην αρχή της επώασης. Αυτού που επάγεται δεψιπεπτίδιο μείωση στην απομάκρυνση της [

3Η] -5-αζα-CdR ήταν επίσης εξαρτάται από τη συγκέντρωση δεψιπεπτίδιο. Για παράδειγμα, η ραδιενέργεια των κυττάρων σε επεξεργασία με [

3Η] -5-αζα-CdR και δεψιπεπτιδίου στα 0,05 μΜ, 0,1 μΜ και 0,2 μΜ έδειξαν 1.8-, 2.7- και 3,25 φορές σε αυξήσεις αντίστοιχα έναντι εκείνης των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με [

3Η] -5-αζα-CdR μόνο (Σχ. 6Β). Επιπλέον, η 5-αζα-CdR βλάβη που προκαλείται DNA επίσης σταδιακά ανακτάται όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 5-αζα-CdR μέσο ελεύθερο. Το μήκος και η περιοχή της ουράς DNA που επάγεται από την 5-αζα-CdR ήταν μικρότερη και μικρότερα όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 5-αζα-CdR μέσο ελεύθερο για 12 ώρες σε σύγκριση με τα κύτταρα χωρίς επώαση χωρίς φάρμακο (σχ. 6C-Ε ). Αυτή η διαδικασία της ανάκτησης από 5-αζα-CdR βλάβη που προκαλείται DNA κατεστάλη σημαντικά με δεψιπεπτίδιο, έτσι ώστε το μήκος και την περιοχή των ουρών του κομήτη δοκιμασία ήταν μεγαλύτερη και μεγαλύτερα όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-CDR και δεψιπεπτίδιο μαζί ( Σχ. 6F-Η). Η δεψιπεπτίδιο επαγόμενη καταστολή της ανάκτησης από 5-αζα-CdR προκαλούμενη βλάβη του DNA συνοψίζεται στον πίνακα 2. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο αναστολέας HDAC μπορεί να καταστείλει την ανάκτηση από 5-αζα-CdR βλάβη που προκαλείται από DNA και συνεργικά επάγουν αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

(Α) H719 κύτταρα επωάστηκαν με [

3Η] -5-αζα-CdR για 48 ώρες, με την παρουσία ή την απουσία δεψιπεπτιδίου σε 0,1 μΜ για τις πρώτες 6 ώρες (δεψιπεπτιδίου + [

3Η] -5-αζα-CDR) ή τελευταία 6 ώρες ([

3Η] -5-αζα-CdR + δεψιπεπτιδίου) και στη συνέχεια πλύθηκε με ψυχρό PBS. Τα κύτταρα αντικαταστάθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο για περαιτέρω επώαση για διάφορα χρονικά διαστήματα και το DNA στη συνέχεια εκχυλίσθηκε με ψυχρό TCA. Σχετική ραδιενέργεια του κάθε δείγματος σε διαφορετικά χρονικά σημεία σε σχέση με την ραδιενέργεια των κυττάρων κατά την έναρξη της επώασης. (Β) H719 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με [

3Η] -5-αζα-CdR για 48 ώρες, και δεψιπεπτίδιο στα 0,05, 0,1 και 0,2 μΜ προστέθηκε στη συνέχεια στα κύτταρα για τα τελευταία 6 ώρες. Σε 24 ώρες μετά την επώαση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκε η ραδιενέργεια. Ίδια ποσότητα DNA φορτώθηκε και τρέχει σε 1% πηκτώματος αγαρόζης σε 100 V για 5 λεπτά ως έλεγχος φόρτωσης, η οποία απεικονίζεται στο άνω πάνελ του Σχ. 6Α και το Σχ. 6Β, αντίστοιχα. (Ο-Ε) Comet προσδιορισμός δείχνει ότι η 5-αζα-CdR βλάβη που προκαλείται από DNA που ανακτήθηκε όταν τα κατεργασμένα κύτταρα επωάστηκαν σε 5-αζα-CdR μέσο ελεύθερο για 12 ώρες. (Γ) μη επεξεργασμένου ελέγχου, (D) 5-αζα-CdR σε 1 μΜ για 24 ώρες χωρίς επώαση, και (Ε) 5-αζα-CdR σε 1 μΜ για 24 ώρες, ακολουθούμενη από πλύση για περαιτέρω επώαση σε ένα χωρίς φάρμακο μέσο για 12 ώρες. (F-Η) Ανάκτηση της βλάβης του DNA που προκαλείται από 5-αζα-CdR ανεστάλη με αγωγή δεψιπεπτιδίου (0,1 μΜ για τις τελικές 6 ώρες). (F) Δεψιπεπτίδιο κατεργασμένων κυττάρων (0,1 μΜ) για 6 ώρες, (G) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-CDR (1 μΜ για 24 ώρες) και δεψιπεπτιδίου (0,1 μΜ για τα τελευταία 6 ώρες) χωρίς επώαση, ή (Η) Τα κύτταρα αντιμετωπίζονται ως ανωτέρω και περαιτέρω επωάζονται σε ένα μέσο χωρίς φάρμακο για 12 ώρες.

η

αναστολέας HDAC ενήργησε επιλεκτικά με ανάλογο νουκλεοτιδίου να προκαλέσει αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

για να προσδιορίσετε αν HDACi ενισχύει επιλεκτικά NA-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα, H719 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Ara-C, ένα άλλο ανάλογο κυτιδίνης, και δεψιπεπτίδιο ή TSA προστέθηκε στη συνέχεια στα κύτταρα να παρατηρηθούν αλλαγές στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό προσδιορίστηκε με ΜΤΤ. Ήταν ενδιαφέρον το γεγονός ότι και οι δύο δεψιπεπτιδίου και TSA σημαντικά ενισχυμένη Ara-C που προκαλείται από την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχ. 7Α-Β). Ωστόσο, αυτή η συνεργική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων δεν παρατηρήθηκε στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με δεψιπεπτίδιο και άλλες βλάβες του DNA επαγωγείς όπως γ-ray (Σχ. 7C), UV (Σχ. 7D), σισπλατίνη (Εικ. 7Ε) ή ετοποσίδη (Σχ . 7F). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι HDACi δρα εκλεκτικά σε συνεννόηση με NAs να επάγει αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

(Α) H719 κύτταρα ή (Β) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με Ara-C σε 0.1 μΜ για 72 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία HDACi (δεψιπεπτίδιο 0,1 μΜ ή TSA 2 μΜ για τις τελικές 6 ώρες). Τα κύτταρα στη συνέχεια πλένονται και περαιτέρω επωάστηκαν για 24 ώρες για την δοκιμασία ΜΤΤ. (C) Επίδραση της αλληλεπίδρασης του HDACi και ακτινοβολία σε 2 Gy προσδιορίσθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ. κύτταρα H719 ακτινοβολήθηκαν στα 2 Gy, ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με δεψιπεπτιδίου σε 0.1 μΜ, ή TSA στα 2 μΜ για 6 ώρες μόνα τους ή σε συνδυασμό. (Δ) H719 κύτταρα, επίσης, αντιμετωπίζονται με UV στα 128 J /m

2, με ή χωρίς θεραπεία δεψιπεπτίδιο.