Αφηρημένο

Ο εντοπισμός των ενζύμων που, εφόσον εισαχθεί σε καρκινικά κύτταρα, να οδηγήσει σε αύξηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας αποτελεί ένα σημαντικό στόχο για βιοϊατρικές εφαρμογές. Χρησιμοποιώντας μία πρωτότυπη διαδικασία με την οποία τα μεταλλαγμένα γονίδια παράγεται βάσει της χρήσης των κινητοποίηση γονιδιώματος lentivector υπό όρους, περιγράψαμε πρόσφατα, για πρώτη φορά, η ταυτοποίηση ενός ανθρώπινου δεοξυκυτιδίνης κινάση (dCK) μετάλλαξη (G12) που ευαισθητοποιεί ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών στη θεραπεία με την dCK αναλογικό γεμσιταβίνη. Εδώ, ξεκινώντας από την ίδια την παραλλαγή G12, δημιουργήσαμε μια νέα βιβλιοθήκη και εντόπισε ένα μεταλλαγμένο (M36) που προκαλεί ακόμη μεγαλύτερη ευαισθητοποίηση σε γεμσιταβίνη από G12. Όσον αφορά την G12, M36 παρουσιάζει ένα επιπλέον μετάλλαξη που βρίσκεται στην περιοχή η οποία αποτελεί τη διεπαφή του διμερούς dCK. Η απλή παρουσία αυτής της μετάλλαξης μισά τόσο του IC50 και η αναλογία των υπολειμματικών κυττάρων ανθεκτικών στην αγωγή. Επιπλέον, η χρήση των φορέων με αυτο-αδρανοποίησης LTRs οδηγεί σε αυξημένη ευαισθησία σε θεραπεία, με αποτέλεσμα συμβατή με ένα ανάγλυφο της μεταγραφικής παρεμβολής που ασκείται από τον υποκινητή U3 στην εσωτερική υποκινητή ο οποίος διευθύνει την έκφραση του M36. Είναι σημαντικό ότι, ένα αξιοσημείωτο αποτέλεσμα παρατηρείται επίσης σε θεραπείες με την αντικαρκινική ένωση κυταραβίνη (AraC), για τα οποία παρουσιάστηκε 10.000 φορές μείωση στην IC50. Με την ενεργοποίηση της ευαισθητοποίησης των διαφόρων τύπων καρκινικών κυττάρων με κακή πρόγνωση σε δύο χρησιμοποιούνται συνήθως αντικαρκινικές ενώσεις M36 είναι μια πολλά υποσχόμενη υποψήφιος για προσεγγίσεις γονίδιο αυτοκτονίας

Παράθεση:. Coulibaly ST, Rossolillo P, Χειμώνας F, Kretzschmar FK, Braye Μ , Martin DP, et al. (2015) Ισχυροί Ευαισθητοποίηση των καρκινικών κυττάρων σε αντικαρκινικά φάρμακα από ένα τετραπλό Μεταλλαγμένα του Ανθρώπου κινάση δεοξυκυτιδίνης. PLoS ONE 10 (10): e0140741. doi: 10.1371 /journal.pone.0140741

Επιμέλεια: Jean-Luc EPH Darlix, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Γαλλία

Ελήφθη: 11 του Ιούνη 2015? Αποδεκτές: 30η Σεπτεμβρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 20 Οκτωβρίου, 2015

Copyright: © 2015 Coulibaly et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:. το έργο υποστηρίχθηκε από τη χρηματοδότηση από τον καρκίνο Ligue Contre le (https://www.ligue-cancer.net), Appel d’offre Διάσκεψη de συντονισμός διαπεριφερειακή du Grand Est 2012 έως MN. Σ Coulibaly είναι αποδέκτης μιας υποτροφίας από το γαλλικό «Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche»

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η μέθοδος retrovolution και οι μεταλλάξεις που περιγράφονται στο παρόν έγγραφο καλύπτονται από διπλώματα ευρεσιτεχνίας, για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τις άδειες, παρακαλούμε επικοινωνήστε με το αντίστοιχο συγγραφέα.

Εισαγωγή

πρόκληση του θανάτου των καρκινικών κυττάρων μέσω της γονιδιακής θεραπείας είναι ένας σημαντικός στόχος για βιοϊατρικές εφαρμογές. Το κύριο εμπόδιο σε αυτό το επίτευγμα είναι η δυνατότητα παροχής ειδικά σε καρκινικά κύτταρα διαγονιδίων που οδηγούν σε κυτταρικό θάνατο: μια διαδικασία επιτυγχάνεται με την κακή απόδοση

in vivo

[1]. Μια πρόσθετη δυσκολία συνίσταται από την αποτελεσματικότητα με την οποία το διαγονίδιο επάγει το θάνατο του τροποποιημένου κυττάρου. Ο κυτταρικός θάνατος μπορεί να προκληθεί είτε ιδιοσυστατικά ή σε απόκριση σε έκθεση σε χημικές ενώσεις, όπως ένα αντικαρκινικό φάρμακο [1]. Η προσέγγιση της χρησιμοποίησης ενός γονιδίου με ένα επαγώγιμο τοξικότητα έχει το πλεονέκτημα ότι είναι του ενδιαφέροντος και στον τομέα των γονιδίων ασφαλείας που επιτρέπουν αρνητική επιλογή των μεταμοσχευμένων κυττάρων σε προσεγγίσεις γονιδιακής θεραπείας. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η παρουσία ενός γονιδίου ασφαλείας είναι απαραίτητη σε περίπτωση μιας νεοπλαστικής μεταμόρφωσης μετά εμφύτευση των κατασκευασμένων κυττάρων ή, για υιοθετούμενη ανοσοθεραπεία, στην περίπτωση της ανάπτυξης ενός μοσχεύματος έναντι απόκριση του ξενιστή [2]. Το γονίδιο αυτοκτονίας πιο συχνά χρησιμοποιούνται μέχρι σήμερα για τους σκοπούς αυτούς έχει το γονίδιο της κινάσης θυμιδίνης του ιού του απλού έρπητα (hsTK) σε συνδυασμό με θεραπεία gancyclovir [3-5]. Ωστόσο, λόγω της ιικής προέλευσης του, το hsTK παρουσιάζει το μειονέκτημα να επάγει μία ανοσολογική απόκριση σε ΤΚ-προερχόμενο επίτοπους [6], υποδηλώνοντας ότι η αντικατάστασή του από λιγότερο ανοσογόνες πρωτεΐνες θα μπορούσαν δυνητικά να αυξήσει την αποτελεσματικότητα αυτής της προσέγγισης. Για τους λόγους αυτούς, ένα ανθρώπινο ένζυμο θα αποτελούσε ιδανικό υποψήφιο.

Σε αυτό το πλαίσιο, η κινάση του ανθρώπου δεοξυκυτιδίνης (dCK) έχει προσελκύσει μεγάλο ενδιαφέρον. Εκτός του ότι εμπλέκεται στο μονοπάτι διάσωσης που μετατρέπει ανακυκλωμένα δεοξυριβονουκλεοζίτες σε dNTP [7], αυτό το ένζυμο καταλύει το πρώτο περιοριστικό του ρυθμού, βήμα φωσφορυλίωση για την ενεργοποίηση των διαφόρων αναλόγων δεοξυκυτιδίνης (DCA) που χρησιμοποιούνται σε κλινικές θεραπείες διαφόρων καρκίνων. Η γεμσιταβίνη είναι ένα από αυτά τα φάρμακα. Είναι γενικά χρησιμοποιείται για τη θεραπεία πολλών καρκίνων όπως ο καρκίνος του παγκρέατος, μεταστατικό μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και του μαστού, καθώς και καρκίνων των ωοθηκών? όλα εκ των οποίων σχετίζονται με την κακή πρόγνωση [8-13]. Η dCK συμμετέχει επίσης στην ενεργοποίηση των άλλων ενώσεων, οι οποίες σχετίζονται δομικά με δεοξυκυτιδίνη και χρησιμοποιούνται ως αντικαρκινικά ή αντι-ιικά φάρμακα. Μία τέτοια φάρμακα είναι AraC (κυτοσίνη αραβινοσίδη), το οποίο χρησιμοποιείται κυρίως για τη θεραπεία της λευχαιμίας, όπως οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας (AML) [14].

Σε πολλές περιπτώσεις, η dCK καθορίζει τον βαθμό ευαισθησίας των κυττάρων στη θεραπεία με gemcitabine ή AraC. Μια συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου της έκφρασης dCK και της ευαισθησίας στη θεραπεία με DCA έχει πράγματι παρατηρηθεί σε ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπεία για λευχαιμία τριχωτών κυττάρων και χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία [15] και σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές του μαστού [16]. Ένας σύνδεσμος μεταξύ της έκφρασης του dCK, τη συσσώρευση και κατακράτηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων της πισίνας gemcitabine και ενσωμάτωση γεμσιταμπίνη στο DNA έχει επίσης αναφερθεί [17-19], καθώς και μία συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων προ της θεραπείας των ενδοκυτταρικών dCK και την ευαισθησία στην γεμσιταβίνη [ ,,,0],20]. Μια παρόμοια συσχέτιση έχει αναφερθεί για AraC [21]. Επιπλέον, η εξωγενής υπερέκφραση dCK σε κύτταρα γλοιώματος με ρετροϊικοί ή αδενοϊικοί φορείς οδηγεί σε αυξημένη ευαισθησία στην κυτταροτοξική δράση της κυτοσίνης αραβινοσίδης

in vitro

και

in vivo

[22]. Αντιστρόφως, οι ελλείψεις σε dCK μολύβδου δραστηριότητα σε αντίσταση στη θεραπεία είτε με gemcitabine [18, 23, 24] ή με AraC [25-27].

Ως εκ τούτου, η δυνατότητα πρόβλεψης γονιδιακής θεραπείας προσεγγίσεις που βασίζονται στην εισαγωγή του επιπλέον αντίγραφα του γονιδίου dCK σε καρκινικά κύτταρα φαίνεται πολλά υποσχόμενη και η δυνατότητα δημιουργίας παραλλαγών του dCK με βελτιωμένη δραστικότητα φωσφορυλίωσης DCA είναι ένας σημαντικός στόχος στον τομέα αυτό. έχουν Ορθολογική προσπάθειες να σχεδιάσουν μεταλλάκτες dCK με τέτοιες ιδιότητες έχουν γίνει στο παρελθόν, είτε με βάση τις δομικές πληροφορίες [28] ή για την επίδραση της μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις της πρωτεΐνης που έχουν παρατηρηθεί για την ενίσχυση της ενζυματικής δραστηριότητας του

in vivo

[29, 30]. Αν και αυτές οι μελέτες κατόρθωσε να λάβει dCK παραλλαγές με βελτιωμένη ικανότητα να φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν γεμσιταβίνη, η δραστηριότητα αυτή συμβαδίζει με μια πολύ πιο έντονη αύξηση της φωσφορυλίωσης του φυσικού υποστρώματος dC [28, 30]. Δεδομένου ότι ο ανταγωνισμός για το ένζυμο dCK μεταξύ φυσικό υπόστρωμα και εισερχόμενη μόρια φαρμάκου είναι ζωτικής σημασίας για την αποτελεσματικότητα της επαγωγής κυτταρικού θανάτου [31, 32], αυτή η λειτουργία προτείνει ότι τέτοιες μεταλλάξεις άπαξ εισαχθεί σε καρκινικά κύτταρα δεν θα επάγει μία ευαισθητοποίηση στη θεραπεία. Για ένα από αυτά (το τριπλό μετάλλαγμα A100V, R104M, D133A) [28], ήταν πράγματι αναφέρθηκε ότι η εισαγωγή του μέσα στα κύτταρα Messa10K, κύτταρα σαρκώματος μήτρας ανθεκτικά σε γεμσιταβίνη [33], δεν οδήγησε σε ευαισθητοποίηση σε αυτό το φάρμακο [34].

Έχουμε αναπτύξει πρόσφατα μια πειραματική προσέγγιση (retrovolution) όταν ένα γονίδιο ενδιαφέροντος εισάγεται μέσα υπό όρους VSV-ψευδοτύπου HIV-1 που προέρχεται φορείς αντιγραφής-ελαττωματικός που χρησιμοποιούνται για να μιμούνται πολλαπλούς κύκλους μολυσματικές, στη διάρκεια της οποίας η αλληλουχία που ενδιαφέρει συσσωρεύεται μεταλλάξεις λόγω της επιρρεπής σε λάθη φύση του μηχανισμού της αντιγραφής του HIV-1 [34]. Αυτό δημιουργεί μια βιβλιοθήκη παραλλαγών του γονιδίου ενδιαφέροντος που έχουν ήδη εισαχθεί σε ένα βιολογικό φορέα κατάλληλο για την αποτελεσματική διανομή του διαγονιδίου στα ανθρώπινα κύτταρα, τα οποία μπορούν στη συνέχεια να υποβληθούν σε διαλογή άμεσα για τον επιθυμητό φαινότυπο. Χρησιμοποιώντας, ως μία αλληλουχία που μας ενδιαφέρει, το cDNA που κωδικοποιεί για την ανθρώπινη dCK, απομονώσαμε ένα μεταλλαγμένο, που ονομάζεται G12, η ​​οποία επάγει μία 300-πλάσια ευαισθητοποίηση σε γεμσιταβίνη σε κύτταρα αρχικά ανθεκτικά σε αυτό το φάρμακο (Messa 10Κ), μία επίδραση 60 φορές ισχυρότερο από εκείνη που παρατηρείται στους ελέγχους κύτταρα όπου είχε εισαχθεί ένα επιπλέον αντίγραφο του wt dCK [34]. Αυτή η μεταλλαγμένη χαρακτηρίζεται από την παρουσία τριών μεταλλάξεων, που βρίσκεται στις θέσεις της πρωτεΐνης μακριά από την ενεργή θέση και οι οποίες είναι επομένως απίθανο να έχουν προβλεφθεί σε μία λογική βάση. Μία από αυτές τις μεταλλάξεις, E171K, βρίσκεται σε μια περιοχή που εμπλέκονται στην παραγωγή της διεπαφής του διμερούς dCK. Οι άλλες δύο μεταλλάξεις (E247K και L249M) αντί βρίσκονται στο «βάση-βρόγχου ανίχνευσης» που διαμορφώνει την αναδίπλωση της πρωτεΐνης κατά τη δέσμευση του δότη φωσφορικών (ΑΤΡ ή UTP), (S1 Σχήμα) [28]. Αριθ μεταβολή του βαθμού διμερισμού ήταν ωστόσο παρατηρήθηκε

in vitro

για το μεταλλαγμένο, υποδηλώνοντας ότι ο λόγος για την αυξημένη ευαισθησία γεμσιταμπίνη ότι επάγει δεν μπορεί να αποδοθεί σε μεταβολή στο επίπεδο έκφρασης έκφραση του [34], αλλά είναι πιθανόν να οφείλεται σε μια τροποποίηση της συνολικής δομής του ενζύμου.

G12 απομονώθηκε μετά διαλογή της βιβλιοθήκης που προκύπτει από 17 διαδοχικούς κύκλους retrovolution [34]. Με αυτό τον τρόπο, οι μεταλλάξεις εισήχθησαν τυχαία στο γονίδιο χωρίς εξωτερική πίεση επιλογής που εφαρμόζεται κατά τη διάρκεια της διαδικασίας που θα ευνοούσαν την απομόνωση του επιθυμητού φαινοτύπου. Το ζήτημα της δυνατότητας απομόνωσης ενός μεταλλαγμένου με ένα ακόμη μεγαλύτερο βαθμό δραστηριότητας ευαισθητοποίησης γκεμσιταμπίνης από G12 είναι το σημείο εκκίνησης της παρούσας μελέτης.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

κύτταρα ΗΕΚ-293Τ αποκτήθηκαν από την American Type Culture Collection και αναπτύχθηκαν σε Τροποποιημένο κατά Dulbecco Eagle του Dulbecco (Gibco, Thermo Fischer Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) συμπληρωμένο με 10% FBS και 100 U /ml pennicillin-100 mg /ml στρεπτομυκίνη . κύτταρα Messa10K ευγενικά παρέχεται από LPJordheim (Λυών, Γαλλία) και αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με 10% FBS και πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη.

κύκλους Retrovolution από σωματίδια lentivector

Για την έναρξη των πειραμάτων που οδήγησαν για την παραγωγή του F27-RL (όπου RL αντιπροσωπεύει τυχαία βιβλιοθήκη), οκτώ 10-cm τρυβλία που περιέχουν 5×10

6 κύτταρα από τον πληθυσμό των κυττάρων ΗΕΚ 293Τ που χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση του κλώνου G12 (F16, αναφορά [34 ]) επιμολύνθηκαν, με χρήση του πρωτοκόλλου φωσφορικού ασβεστίου με 10 μα πλασμιδίου pCMVΔR8.91 [35] και 5 μg του pHCMV-G πλασμίδιο [36], ώστε να δημιουργηθεί το ιικό-όπως πληθυσμός F17-RL. Η ίδια διαδικασία χρησιμοποιήθηκε για την έναρξη των πειραμάτων που οδήγησαν στην παραγωγή του F11-DL, αλλά στην περίπτωση αυτή η αρχική επιμόλυνση με pCMVΔR8.91 και pHCMV-G πλασμιδίων πραγματοποιήθηκε σε μια κυτταρική γραμμή ΗΕΚ 293Τ που δημιουργούνται προηγουμένως να εκφράζουν σταθερά ο lentivector γονιδιωματικό RNA που κωδικοποιεί G12 [34]. Σε αυτή την περίπτωση η ιική-όπως πληθυσμός δημιουργείται ονομαζόταν F1-DL (όπου DL σημαίνει κατευθυνόμενη βιβλιοθήκη). Αυτά τα ιικά-σαν πληθυσμούς (F17-RL και F1-DL) στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για την μεταγωγή ανεξάρτητα φρέσκα κύτταρα ΗΕΚ 293Τ να συνεχίσει τη διαδικασία retrovolution παράλληλα, όπως περιγράφεται στην αναφορά [34]. Πραγματοποιήσαμε 11 περαιτέρω κύκλους retrovolution, που οδηγεί στην παραγωγή του F27-RL και των κυτταρικών πληθυσμών F11-DL, αντίστοιχα. Οι επιμολύνσεις κατά τη διάρκεια των κύκλων retrovolution επιτεύχθηκαν με 10 μα pCMVΔR8.91 και 5 μα pHCMV-G πλασμίδιο στις 10-cm τρυβλία 8 που περιέχει 5×10

6 κύτταρα από τον πληθυσμό των κυττάρων ΗΕΚ 293Τ από τον προηγούμενο κύκλο retrovolution . Για τη διαδικασία μεταγωγής κατά τη διάρκεια των κύκλων του retrovolution, το υπερκείμενο lentivector περιέχει συλλέχθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, διηθείται μέσω φίλτρου 0,45 μm και συμπυκνώνεται 40 φορές σε Vivaspin 20 στήλες (MWCO 50 kDa, Sartorius Stedim Biotech, Aubagne, Γαλλία). συνθήκες Μεταγωγή διέφεραν όταν εκτελείται για να δημιουργήσει γενετική ποικιλομορφία (κύκλοι retrovolution) και όταν εκτελείται για να απομονωθούν μεμονωμένοι κλώνοι για διαλογή της βιβλιοθήκης. Για τους κύκλους retrovolution, 5×10

6 κύτταρα ΗΕΚ-293Τ μεταγωγή με 1 ml πυκνού φορείς λεντοϊών (βλέπε παραπάνω) και επιλογή πουρομυκίνης εφαρμόστηκε 24 ώρες μετά την μεταγωγή. Υπό αυτές τις συνθήκες 90-100% των μετατραπέντων κυττάρων ήταν ανθεκτικά στην πουρομυκίνη, δεικνύοντας ότι τουλάχιστον για την πλειονότητα των κυττάρων, η πολλαπλότητα των μεταγωγής ήταν υψηλότερο από ένα. Οι διαμολύνσεις για την απομόνωση μονών κλώνων ήταν, αντίθετα, πραγματοποιείται σε διάφορες αραιώσεις φορείς λεντοϊού με βάση τους τίτλους εκτιμάται από ELISA κατευθύνονται έναντι του HIV-1 ρ24 πρωτεϊνη καψιδίου (Innotest HIV Antigen mAb, Innogenetics, Gent, Βέλγιο). Α κύτταρα εκατό στη συνέχεια σπάρθηκαν ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων σε DMEM. επιλογή πουρομυκίνη εφαρμόστηκε 24 ώρες μετά από μεταγωγή με την προσθήκη πουρομυκίνη σε συγκεντρώσεις 0.6 μg /ml για κύτταρα ΗΕΚ-293Τ, 0.6 μg /ml για ΗΕΚ-293Τ-CD4

+ κύτταρα, 0,5 μg /ml για κύτταρα Messa10K. Επιλέξαμε συνθήκες όπου, κατά μέσο όρο, 5 φρεάτια ανά πλάκα είχε ως αποτέλεσμα θετική σε κυτταρική ανάπτυξη παρουσία πουρομυκίνης. Υπό αυτές τις συνθήκες, η πολλαπλότητα των μεταγωγής ήταν 5×10

-4 ανά κύτταρο εξασφαλίζοντας ότι σε κάθε φρεάτιο του κυτταρικού πληθυσμού δημιουργήθηκε με μεταγωγή με ένα μόνο φορέα λεντοϊού.

Ενίσχυση και αλληλούχιση του dCK κωδικοποιεί τμήμα του προϊικού DNA

ανθεκτικά πουρομυκίνη κλώνοι από την F27-RL και γενιές F11-DL απομονώθηκαν με οριακή αραίωση και επεκτάθηκε σε 6 φρεατίων. Κύτταρα από τα επιμέρους κλώνους στη συνέχεια ανακτήθηκαν και υποβλήθηκαν σε λύση με 250 μΐ κυτταρικού Direct PCR (Viagen Biotech, Los Angeles, CA, USA). Το διαγονίδιο dCK ενισχύθηκε από 1 μΙ του λύματος με ολιγονουκλεοτίδια επί του φορέως, EF1 (5′-gatgtcgtgtactggctccg-3 ‘) και PGK (5-gatgtggaatgtgtgcgagg-3’), που πλευρίζουν το διαγονίδιο. Αλληλουχίας του θραύσματος PCR διεξήχθη με την υπηρεσία προσδιορισμού αλληλουχίας GATC (GATC Biotech, Konstanz, Germany).

Υπολογισμός της συχνότητας των μεταλλάξεων στις βιβλιοθήκες

Για την F27-RL και F11- DL βιβλιοθήκες ο αριθμός των μεταλλάξεων που απαντώνται στην ακολουθία κωδικοποίησης dCK υπολογίστηκε ξεκινώντας από τα δεδομένα που δίνονται στον πίνακα 1 ως: (m /(783 XC)) /y, όπου m είναι ο αριθμός των μεταλλαγμένων θέσεων, 783 είναι το μέγεθος του dCK κωδικοποιητική αλληλουχία σε ζεύγη βάσεων, c είναι ο αριθμός των κλώνων αλληλουχήθηκε και το γ είναι ο αριθμός των κύκλων του retrovolution πραγματοποιηθεί. Για τη βιβλιοθήκη F11-DL η αρχική ακολουθία για τον υπολογισμό των ποσοστών μετάλλαξης ήταν η σειρά της G12.

Η

δοκιμές μεταθέσεων για την εμφάνιση των συνώνυμο και μη συνώνυμες μεταλλάξεις κατά μήκος της πρωτεΐνης dCK

Μια δοκιμή μετάθεση έγινε με προσομοίωση της εμφάνισης μεταλλάξεων στα δύο μισά της αλληλουχίας που κωδικοποιεί πρωτεΐνη (δηλαδή και στις δύο πλευρές του κωδικονίου 130) με βάση την παρατηρούμενη συχνότητα εμφάνισης τυχαίων μεταλλάξεων και των προτιμησιακών μεταλλάξεων σε αλληλουχίες συναινέσεως APOBEC3F (29.1 και 70,9%, αντίστοιχα, βλέπε πίνακα 1). Η σχετική συχνότητα εμφάνισης συνώνυμοι και μη συνώνυμες μεταλλάξεις που ελήφθη πειραματικά συγκρίθηκε με εκείνη των 10.000 προσομοιώνεται συνόλων δεδομένων. Το ποσοστό των προσομοιωμένων συνόλων δεδομένων με μη συνώνυμες /συνώνυμες (dN /dS) αναλογίες μεταλλάξεως μικρότερη ή ίση με εκείνες του πραγματικού συνόλου δεδομένων ελήφθησαν στη συνέχεια ως η πιθανότητα ότι υπήρξε σημαντική τάση στην περιοχή θεωρούνται για την εμφάνιση περισσότερων συνώνυμες μεταλλάξεις από ό, τι αναμενόταν με βάση στοχαστική. Αντίστροφα, η αναλογία των προσομοιωμένων συνόλων δεδομένων με dN αναλογίες /dS ανώτερες ή ίσες με εκείνες του πραγματικού συνόλου δεδομένων στη συνέχεια παρελήφθη ως η πιθανότητα ότι υπήρξε σημαντική τάση στην περιοχή θεωρούνται για την εμφάνιση περισσότερων μη συνώνυμες μεταλλάξεις ό, τι αναμενόταν με βάση στοχαστικά.

Δοκιμές ευαισθησίας σε αντικαρκινικά φάρμακα

κύτταρα που φέρουν ολοκληρωμένο βραδέος ιού γονιδιώματα φορέα (G12, M36, μονά ή διπλά μεταλλάγματα) σπάρθηκαν σε 5 000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 96 -Καλά πλάκα και αναπτύχθηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Για κάθε πληθυσμό πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν. Δώδεκα ώρες μετά την σπορά, αυξανόμενες συγκεντρώσεις της γεμσιταβίνης (0-400 ηΜ), ή AraC (0-10 mM) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και αφέθηκαν σε καλλιέργεια για περαιτέρω 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ (Δοκιμασία CellTiter 96 μη-ραδιενεργά κυτταρικού πολλαπλασιασμού, Promega, Fitchburg, WI, USA) και ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων σε κάθε φρεάτιο αξιολογήθηκε με μέτρηση της OD στα 570 nm. Για κάθε πληθυσμό, το κλάσμα των ζωντανών κυττάρων υπολογίστηκε ως OD570 συγκέντρωση Χ Gem /συγκέντρωση OD570 0 Gem, για να εκτιμηθεί η ευαισθησία του πληθυσμού στο προφάρμακο.

Δοκιμές ευαισθησίας σε αντι-ιικά φάρμακα

οι φορείς λεντοϊών παράχθηκαν με επιμόλυνση, χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο φωσφορικού ασβεστίου, των κυττάρων ΗΕΚ-293Τ με 10 μg ρΟΜν ΔR8.91 πλασμιδίου [35], 5 μα pHCMV-G πλασμίδιο [36], και 10 μg γονιδιωματικού πλασμιδίου SDY-dCK (που περιγράφεται στο Rossolillo κ.ά. [34].), στην έκδοση SIN του (βλέπε αποτελέσματα) που κωδικοποιούν είτε για την αλληλουχία άγριου τύπου της ανθρώπινης dCK ή παραλλαγής M36. Αρκετές μεταγωγές, χρησιμοποιώντας διαφορετικές ποσότητες φορέα λεντοϊού, πραγματοποιήθηκαν σε 1×10 κύτταρα

6 ΗΕΚ-293Τ-CD4 + [37] και σε μεταγωγή κύτταρα επιλέχθηκαν με την παρουσία 0,6 μg /ml πουρομυκίνης, προστίθενται 24 ώρες μετά την μεταγωγή. Μόνο συνθήκες μεταγωγή δίνοντας 50 έως 200 μεμονωμένα πουρομυκίνη-ανθεκτικοί κλώνοι (κάθε κλώνο που προέρχεται από ένα κύτταρο σε μεταγωγή από έναν μόνο φορέα λεντοϊού) διατηρήθηκαν και όλοι οι κλώνοι συνενώθηκαν και επεκτάθηκαν για να ληφθεί ένα πολύκλωνο πληθυσμό ΗΕΚ-293Τ-κυττάρων CD4 + είτε εκφράζει ένα επιπλέον αντίγραφο του wt ενζύμου dCK ή ενός αντιγράφου του M36 (ΗΕΚ 293Τ /CD4

+ – SINvec-wtdCK ή ΗΕΚ 293Τ /CD4

+ – SINvec-M36, αντίστοιχα). Φορείς για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της μεταγωγής με την παρουσία αντι-ιικών φαρμάκων δημιουργήθηκαν με επιμόλυνση πλακών δώδεκα 10-cm που περιέχει κύτταρα 293Τ 5×10

6 ΗΕΚ με 10 μg ρΤΟΡΟ πλασμίδιο στο οποίο η αλληλουχία που κωδικοποιεί για το περίβλημα του HIV-1 ADA [38] είχε εισαχθεί [39], και 10 μg pNL4.3-βην

-Luc +, που κωδικοποιεί την λουσιφεράση πυγολαμπίδας, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [40]. Τα προκύπτοντα lentivectors συμπυκνώθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Μεταγωγή του 2.5×10

5 ΗΕΚ 293Τ /CD4

+ – κύτταρα SINvec-wtdCK και ΗΕΚ 293Τ /CD4

+ – κύτταρα SINvec-M36 πραγματοποιήθηκαν παράλληλα με τη χρήση 1 ml κάθε συμπυκνωμένου φορέα λεντοϊού. Πέντε ώρες μετά την μεταγωγή κύτταρα σπάρθηκαν σε 5×10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε μία πλάκα 6 φρεατίων σε παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων των ενώσεων κατά ιών ddC ή 3TC. Η αποτελεσματικότητα της μεταγωγής στη συνέχεια παρακολουθήθηκε 48 ώρες μετά την μεταγωγή μέσω της έκφρασης του γονιδίου της λουσιφεράσης. Για το σκοπό αυτό, το μέσο απομακρύνθηκε, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε PBS, λύθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η δραστικότητα της λουσιφεράσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Promega, Fitchburg, WI, USA) με ένα φωτόμετρο Glomax (Promega, Fitchburg, WI, USA), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [40].

κηλίδος Western αναλύσεις

Messa10K κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν είτε M36, τόσο στο πλαίσιο ενός βραδέος ιού DNA φορέα με ένα λειτουργικό LTR ή με αδρανοποιημένο LTR λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα 1Χ RIPA (25mM Tris-HCl, 1% IGEPAL, 0,1% SDS, 0,5% δεοξυχολικό νάτριο, 150mM NaCl, αναστολέας πρωτεάσης) και 30, 60, και 120 μα συνολικής πρωτεΐνης (αξιολογήθηκε με δοκιμασία Bradford) για κάθε τύπο κυττάρου φορτώθηκαν σε 12% δις-τρικίνης γέλης (Invitrogen, Carlsbad, NM, USA). Μετά την μεταφορά σε μεμβράνη PVDF, οι πρωτεΐνες dCK αναλύθηκαν με western blot με 1: 4000 αραίωση ενός πολυκλωνικού αντισώματος αντι-dCK (κουνέλι, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) και 1: 3000 αραίωση ενός αντι HRP κουνελιού συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (BioRad, Hercules, CA, USA) με την πρόσδεση ανιχνεύεται με χημειοφωταύγεια (Pierce ECL Western Blotting υπόστρωμα, Thermo Scientific).

Παραγωγή και καθαρισμός των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών dCK

Τα wT-dCK αλληλουχιών και M36 κλωνοποιήθηκαν στο πλασμίδιο pET14b και εκφράζεται σε

E

.

coli

κύτταρα BL21 DE3 ρΙ_γδΕ. Η πρωτεϊνική έκφραση προκλήθηκε με προσθήκη 0,1 mM IPTG και τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 4 ώρες ανάπτυξης στους 37 ° C. -Tagged His πρωτεΐνες εκλούστηκαν με 250 mM ιμιδαζόλιο από His-Trap Στήλες TM FF (GE Healthcare Life Science, Little Chalfont, UK), η ετικέτα ιστιδίνης απομακρύνεται με τη χρήση του S-Tag θρομβίνη Purification Kit (Novagen, Madison, WI, USA ), και dCK και M36 καθαρίστηκαν περαιτέρω με διήθηση πήγματος σε στήλες S-200 Sephacryl (GE Healthcare Life Science, Little Chalfont, UK).

δοκιμές φωσφορυλίωση

in vitro

η

Η αποτελεσματικότητα της φωσφορυλίωσης του φυσικού υποστρώματος δεοξυκυτιδίνης και της γεμσιταβίνης προφαρμάκων και AraC μετρήθηκαν για καθαρισμένο wt-dCK και M36 σε μία δοκιμασία που βασίζεται σε NADH όπως περιγράφηκε προηγουμένως [41]. Όλα τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA) με την εξαίρεση γεμσιταβίνη (Lilly, Indianapolis, ΙΝ, USA). Τα ένζυμα προσδιορίστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου σε συγκέντρωση 0,9 μΜ για το DC, και 0.3 μΜ τόσο για gemcitabine και AraC. dC χρησιμοποιήθηκε σε συγκεντρώσεις μεταξύ 5 και 50 μΜ, η γεμσιταβίνη σε συγκεντρώσεις μεταξύ 20 μΜ και 1 mM και AraC σε συγκεντρώσεις μεταξύ 10 μΜ και 0.5 mM. ΑΤΡ χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 4 mM.

Στατιστικές αναλύσεις

Για να αξιολογηθεί κατά πόσον οι μέσες ποσότητες κυτταρικού θανάτου που συμβαίνουν στους πληθυσμούς Messa10K περιέχουν διαφορετικές παραλλαγές dCK ήταν σημαντικά διαφορετική από την τιμή που εμφανίζεται από Messa10K wT-dCK, δύο δείγμα t-test για τις διάφορες συγκεντρώσεις της γεμσιταβίνης.

Αποτελέσματα

Συνεισφορά των επιμέρους μεταλλάξεων των G12 στο ευαισθητοποίησης σε γεμσιταβίνης

Χρησιμοποιώντας μια νέα μέθοδο κατευθυνόμενης εξέλιξης ανθρώπινου γονιδίου που έχουμε αναπτύξει στο εργαστήριο μας, περιγράψαμε προηγουμένως την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό ενός μεταλλαγμένου dCK, που ονομάζεται G12, που επάγει ευαισθητοποίηση των καρκινικών κυττάρων σε θεραπεία με την αντικαρκινική ένωση γεμσιταβίνη [34]. G12 χαρακτηρίζεται από τρεις μεταλλάξεις σε σχέση με το ένζυμο dCK άγριου τύπου. Ωστόσο, έχει παραμείνει απροσδιόριστο αν η δραστηριότητα ευαισθητοποίηση που παρατηρείται σε G12 εξαρτάται από την παρουσία και των τριών μεταλλάξεων και, αν ναι, ποια είναι η σχετική συμβολή κάθε μίας από αυτές τις μεταλλάξεις προς το φαινότυπο G12 είναι. Για να αντιμετωπιστούν αυτά τα ζητήματα, κατασκευάσαμε έξι μεταλλάξεις, τρεις περιέχουν είτε το E171K, το E247K, ή μάλλον η μετάλλαξη L249M, και τα τρία περιέχει δύο μεταλλάξεις καθένα, καλύπτοντας όλους τους πιθανούς συνδυασμούς των διπλών μεταλλακτών (E171K /E247K, E171K /L249M, και E247K /L249M). Οι μεταλλάξεις εισάγονται στην προηγουμένως περιγραφείσα pSDY πλασμίδιο [34], και χρησιμοποιήθηκε για επιμόλυνση με πλασμίδια τρανσσυμπληρωματικότητας όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι, προκειμένου να παραχθούν φορείς λεντοϊών. Όσον αφορά τα πλασμίδια pSDY που περιγράψαμε προηγουμένως [34], τα πλασμίδια χρησιμοποιήσαμε (pSDY-SIN) περιείχε ένα μερικώς διαγραφεί και ως εκ τούτου μη λειτουργική εκδοχή της 3 ‘αλληλουχία U3 (Σχήμα 1Α). Οι προκύπτουσες φορείς λεντοϊών θα δημιουργήσει, μετά την αντίστροφη μεταγραφή, μη λειτουργικές ακολουθίες LTR και ως εκ τούτου ονομάζεται αυτο-αδρανοποίηση (SIN) φορείς (SDY-SIN στην περίπτωσή μας). Αυτά lentivectors επιλέχθηκαν για αυτή τη δοκιμή για την καταλληλότητα τους για βιοϊατρικές εφαρμογές. Ως μάρτυρες, η G12 και οι κβ ακολουθίες dCK ήταν επίσης εισαχθεί στο πλασμίδιο pSDY-SIN. Για κάθε παραλλαγή του dCK, οι lentivectors χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία ενός πολυκλωνικού πληθυσμού κυττάρων Μέσα 10K. Αυτά τα πολύκλωνα πληθυσμούς (SINvec-G12 πληθυσμού για G12, SINvec-wt dCK για κ.β. dCK, SINvec-E171K για τις μεταλλάξεις E171K, και ούτω καθεξής) δημιουργήθηκαν με μεταγωγή 10

6 ΗΕΚ 293Τ κύτταρα με διαφορετικές ποσότητες φορέα λεντοϊού σε προκειμένου να ληφθεί, μετά από επιλογή πουρομυκίνης, 50 έως 200 μεμονωμένων κλώνων. Με αυτό τον τρόπο, κάθε κλώνος είναι σχεδόν βέβαιο ότι προέρχεται από ένα κύτταρο που περιέχει ένα μοναδικό ενσωματωμένο αντίγραφο του προϊικού DNA. Οι κλώνοι στη συνέχεια ομαδοποιήθηκαν διασφαλίζοντας ότι το προκύπτον πληθυσμός αποτελείτο από κύτταρα που φέρουν το ίδιο διαγονίδιο, αλλά με το γονίδιο ολοκληρωμένο σε διαφορετικές θέσεις στο γονιδίωμα, έτσι κατά μέσο όρο πάνω πιθανές επιπτώσεις που θα μπορούσε να οφείλεται στην θέση ενσωμάτωσης. Το γεγονός ότι τα κύτταρα περιείχε ένα μόνο αντίγραφο του διαγονιδίου επέτρεψε τον αποκλεισμό, κατά τη σύγκριση των πληθυσμών το ένα με το άλλο, των πιθανών ανεπιθύμητων δόσης λόγω του αριθμού των διαγονιδίων ολοκληρωμένων. Ευαισθητοποίηση σε θεραπεία γεμσιταβίνης στη συνέχεια αξιολογήθηκε με δοκιμές ΜΤΤ. Για το σκοπό αυτό, οι διάφορες πολύκλωνα πληθυσμοί Μέσα 10Κ είχαν μded σε πλάκες 96-φρεατίων, που εκτίθενται σε διάφορες συγκεντρώσεις της γεμσιταβίνης, και η επιβίωση των κυττάρων μετρήθηκε για κάθε κατάσταση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34].

Πίνακας Α Δομή του γονιδιωματικού RNA που παράγεται με μεταγραφή μετά από επιμόλυνση των κυττάρων με πλασμίδια pSDY-SIN. R, επαναλαμβανόμενη αλληλουχία από HIV-1 γονιδιώματος? U5, 5 ‘μοναδική ακολουθία του HIV-1 LTR? Cis-δράσης, αλληλουχίες που απαιτούνται για συσκευασία και ανάστροφη μεταγραφή του RNA γονιδιώματος? EF1 άλφα, ανθρώπινος παράγοντας επιμήκυνσης 1-α προαγωγός? hPGK, ανθρώπινο προαγωγέα φωσφογλυκερικής κινάσης? Puro, πουρομυκίνη γονίδιο Ν-ακετυλο-τρανσφεράσης? ΔU3, διαγράφονται μερικώς έκδοση του 3 ‘μοναδική ακολουθία του HIV-1 LTR. Πάνελ Β και C. Το ποσοστό των ζωντανών κυττάρων στον συνολικό αριθμό των κυττάρων ως συνάρτηση της συγκέντρωσης σε γεμσιταβίνη δίνεται ως αναλογία σε σχέση με τα ζωντανά κύτταρα παρατηρείται εν απουσία του φαρμάκου. Λευκό σύμβολα αντιπροσωπεύουν πληθυσμούς αναφοράς και στις δύο ομάδες και. γκρι σύμβολα αντιπροσωπεύουν μονά και διπλά μεταλλάγματα (όπως περιγράφεται στο κυρίως κείμενο). Από μονά και διπλά μεταλλάγματα ελέγχθηκαν παράλληλα στο ίδιο πείραμα. Τα δεδομένα είναι ο μέσος όρος 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι ράβδοι σφάλματος δεν εμφανίζονται για λόγους σαφήνειας.

Η

Τα τρία μονά μεταλλάγματα (γκρι σύμβολα Σχήμα 1Β) έδωσε καμπύλες απόκρισης στο ίδιο εύρος με την αναφορά κ.β. πληθυσμού dCK (λευκά τετράγωνα). Τα ίδια αποτελέσματα ελήφθησαν για τους διπλούς μεταλλάκτες E171K /E247K, και E247K /L249M (γκρι τρίγωνα και κύκλους στο σχήμα 1 C, αντιστοίχως). Και οι τρεις από τα μονά μεταλλάγματα και δύο από τα τρία διπλά μεταλλάγματα που δοκιμάστηκαν δεν ήταν σε θέση να επάγουν gemcitabine ευαισθητοποίηση πιο αποτελεσματικά από ό, τι ήταν επιτεύξιμη με ένα επιπλέον αντίγραφο του γονιδίου ννί dCK. Η τρίτη διπλή μετάλλαξη, E171K /L249M (γκρι τετράγωνα στο σχήμα 1C), έδωσε ένα αποτέλεσμα παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε για κ.β. κύτταρα Μέσα 10K (λευκό τρίγωνα στο σχήμα), γεγονός που υποδηλώνει ότι μια αδρανοποίηση της δραστικότητας dCK τητα για αυτό το μεταλλαγμένο, αφήνοντας το κύτταρα στερούνται δραστηριότητα dCK (όπως συμβαίνει με την αρχική γραμμή Μέσα 10K). Τελικά, δεδομένου ότι κανένα από τα μονά και διπλά μεταλλάγματα επέδειξαν καμπύλη απόκρισης παρόμοια προς εκείνη του G12 (λευκοί κύκλοι στην Εικ), την ταυτόχρονη παρουσία των τριών μεταλλάξεων προφανώς απαιτείται για την επίτευξη του φαινοτύπου ευαισθητοποίηση που παρατηρείται με G12.

Δημιουργία βιβλιοθηκών με χρήση «τυχαία» έναντι «σε σκηνοθεσία» εξέλιξη

Η μετάλλαξη G12 είχε απομονωθεί, ξεκινώντας από το βάρος ακολουθία dCK, από μια βιβλιοθήκη της dCK παραλλαγών που λαμβάνεται μετά από 17 γενιές retrovolution (που ονομάζεται F16 , η πρώτη γενιά που αποτελείται από το γονικό διανύσματα Ρ [34]). Εδώ ερευνήσαμε αν εκτελεί retrovolution ξεκινώντας από την ακολουθία G12 αντί για το βάρος ακολουθία dCK, θα δώσει μεταλλάξεις με περαιτέρω βελτίωση της φαινότυπο. Για το σκοπό αυτό, η κυτταρική γραμμή ΗΕΚ 293Τ που εκφράζουν σταθερά G12 που δημιουργήσαμε προηγουμένως [34], χρησιμοποιήθηκε για να ξεκινήσει 11 κύκλους retrovolution, με επιμόλυνση με τα πλασμίδια τρανσσυμπληρωματικότητας pCMVΔR 8.91 και pHCMV-G [35, 36] όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι και σκιαγραφείται στην Εικ 2. Αυτό οδήγησε στην παραγωγή του πληθυσμού της βιβλιοθήκης κυττάρων ΗΕΚ 293Τ που ονομάζουμε F11-DL (για F11 κατευθυνόμενη βιβλιοθήκη). Παράλληλα, για να αξιολογηθεί η δυνατότητα απομόνωσης μεταλλάξεων με βελτιωμένη φαινότυπο σε σχέση με G12 απλά συνεχίζοντας τη διαδικασία retrovolution που οδήγησε στην απομόνωση του G12, εκτελέσαμε επίσης περαιτέρω 11 κύκλους retrovolution επί του συνόλου του πληθυσμού F16 από την οποία G12 απομονώθηκε [34], ώστε να επιτευχθεί η δημιουργία F27 (λέμε F27-RL, για F27 τυχαία βιβλιοθήκη).

Η γενική δομή των γονιδιωματικών RNA που χρησιμοποιείται για retrovolution δίνεται στην κορυφή, για το αριστερό για τον πληθυσμό F16 και στα δεξιά για τον πληθυσμό που περιέχει μόνο την παραλλαγή G12. Η διαδικασία έχει περιγραφεί προηγουμένως [34] και συνίσταται στην επαναλαμβανόμενη μεταγωγή των κυττάρων ΗΕΚ 293Τ με φορείς λεντοϊού που ακολουθείται από την επιλογή, με πουρομυκίνη, των κυτταρικών πληθυσμών που έχουν ενσωματώσει σταθερά το προϊικό DNA που έχει παραχθεί με αντίστροφη μεταγραφή. Η επιμόλυνση αυτού του πληθυσμού με τα πλασμίδια τρανσσυμπληρωματικότητας pHCMV-G και pCMVΔ8.91 (βλέπε κυρίως κείμενο) επιτρέπει την παραγωγή της επόμενης γενιάς φορέα που χρησιμοποιείται στη συνέχεια για τη μεταγωγή φρέσκα κύτταρα ΗΕΚ 293Τ κατά τη διάρκεια επαναλαμβανόμενων κύκλων επιλογής, η επιμόλυνση και μεταγωγή. Για λόγους διαλογής, τα κύτταρα-στόχοι μετάγονται με λιγότερο από ένα σωματίδιο lentivector ανά κύτταρο, και ξεχωριστοί κλώνοι απομονώθηκαν με την παρουσία πουρομυκίνης. Η διαλογή για ευαισθησία σε διάφορες ενώσεις πραγματοποιείται όπως περιγράφεται στο κείμενο.

Η

Για να απομονωθούν ξεχωριστοί κλώνοι από κάθε βιβλιοθήκη, για τον τελευταίο κύκλο του retrovolution η F10-DL και F26-RL ομοιάζουν με ιό πληθυσμοί χρησιμοποιήθηκαν για την μεταγωγή ανεξάρτητα φρέσκα κύτταρα ΗΕΚ 293Τ σε πολλαπλότητα σωματιδίων φορέα ανά κύτταρο, που ήταν σημαντικά χαμηλότερο από 1. τα μετατραπέντα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων, και επιλογή με πουρομυκίνη εφαρμόστηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι, σε τέτοιες ένας τρόπος που κάθε κλώνος περιείχε ένα μόνο αντίγραφο του διαγονιδίου. Μεμονωμένα κλώνοι επεκτάθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση αλληλούχισης. Για τη λειτουργική διαλογή των βιβλιοθηκών, οι κλώνοι ΗΕΚ 293Τ απομονώνεται με τη μέθοδο αυτή επιμολύνθηκαν με τα πλασμίδια τρανσσυμπληρωματικότητας, και τα προκύπτοντα πληθυσμοί που ομοιάζουν με ιό χρησιμοποιήθηκαν για την μεταγωγή κυττάρων Μέσα 10Κ για να δημιουργήσει πολυκλωνικά πληθυσμούς, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα προκύπτοντα πληθυσμοί χρησιμοποιήθηκαν για τη δοκιμή για την ευαισθησία σε αντικαρκινικές και αντιικές ενώσεις.

αλληλουχίας του βιβλιοθηκών

Για να αξιολογηθεί η πολυπλοκότητα της βιβλιοθήκης και χαρακτηρίζουν την φύση των μεταλλάξεων που παράγονται κατά τη διάρκεια της 11 κύκλοι retrovolution που διεξήχθησαν στο DL και στις βιβλιοθήκες RL, 41 ΗΕΚ 293Τ κλώνων από την F27-RL και 43 από το F11-DL αλληλουχήθηκαν στη dCK κωδικοποιητική περιοχή, μετά από ενίσχυση PCR από προϊικό DNA. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.