Αφηρημένο

Η εξέλιξη της μεταστατικής είναι μια πολυσταδιακή διαδικασία που περιλαμβάνει την ανάπτυξη του όγκου και την επιβίωση, την κινητικότητα και την εισβολή, και την επακόλουθη πολλαπλασιασμό σε ένα ακατάλληλο περιβάλλον. Η κινάση τυροσίνης πρωτεΐνης Src έχει εμπλακεί σε πολλά από τα βιοχημικά μονοπάτια που οδηγούν αυτές τις συμπεριφορές. Παρόλο που η ίδια Src είναι μόνο σπάνια μεταλλαγμένη σε ανθρώπινους όγκους, ανώμαλη δράση της έχει αναφερθεί σε διάφορους καρκίνους και πρότεινε να χρησιμεύσει ως ένα βαρόμετρο του μεταστατικού δυναμικού. Με αυτά τα χαρακτηριστικά κατά νου, εξετάσαμε Src κινάσης ρύθμιση κατά τη δομική, ενζυματική, και τα επίπεδα έκφρασης ως συνάρτηση της προοδευτικά διηθητικού καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές. Παραδόξως, τόσο η συνολική Src περιεχόμενο και τη δραστηριότητα της κινάσης μείωση με την αύξηση της επιθετικότητας κυτταρική σειρά, μια παρατήρηση που φαίνεται να είναι ασυνεπής με την καλά τεκμηριωμένη ρόλο της Src στα μονοπάτια σηματοδότησης που οδηγούν την ανάπτυξη και την εισβολή. Ωστόσο, εμείς παρατηρούμε μια άμεση συσχέτιση μεταξύ της Src κινάσης

συγκεκριμένη δραστηριότητα

(συνολική δραστικότητα κινάσης Src /συνολική περιεκτικότητα Src) και μεταστατικό επιθετικότητα, ενδεχομένως υποδηλώνει ότι σε εξαιρετικά επιθετική κυτταρικές σειρές, βασικά ένζυμα σηματοδότησης είναι παγκοσμίως προσληφθεί για την οδήγηση ο καρκινικός φαινότυπος. Επιπλέον, αν και η αναμενόμενη αυξημένη φωσφορυλίωση της Src σε Tyr-416 (θέση ενεργοποίησης) είναι παρούσα στις πιο επιθετικό καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές, οι απροσδόκητα υψηλά επίπεδα φωσφορυλίωσης στην ανασταλτική θέση Tyr-527 παρατηρήθηκε επίσης. Ο τελευταίος, αντί εκπρόσωπος της ανέστειλε ενζύμου, είναι περισσότερο ενδεικτική των γεμάτοι Src ανταποκρίνονται στις τοπικές φωσφορυλιωμένη εταίρων δέσμευσης

Παράθεση:. Xu W, Allbritton Ν, Lawrence DS (2012) Src κινάσης κανονισμού σε Σταδιακά διηθητικό καρκίνο. PLoS ONE 7 (11): e48867. doi: 10.1371 /journal.pone.0048867

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Αυστρία

Ελήφθη: 20 του Ιούνη 2012? Δεκτές: 1 Οκτ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 του Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγούν 5R01CA140173 για DSL. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η πρωτεϊνική κινάση Src είναι το ιδρυτικό μέλος της κινάσης Src υποοικογένεια των κινασών τυροσίνης πρωτεΐνης μη υποδεκτικές. Η καταλυτική δραστηριότητα των ενζύμων αυτών ρυθμίζεται, εν μέρει, μέσω φωσφορυλίωσης [1]. Συγκεκριμένα, η πλήρης ενεργοποίηση των Src εξαρτάται από φωσφορυλίωση σε Tyr-416. Αντίθετα, η φωσφορυλίωση Tyr-527 αναστέλλει την καταλυτική δραστικότητα, με την προώθηση μιας ενδομοριακή αλληλεπίδραση με τους τομείς SH2 του ενζύμου (και SH3). Πράγματι, το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης Tyr-527, όπως αποκαλύπτεται με ανάλυση ή ανοσοχρώση Western blot, λαμβάνεται συχνά ως μέτρο της ανενεργού ενζύμου. Για παράδειγμα, η δραστικότητα της κινάσης Src αναφέρθηκε ότι πάνω ρυθμισμένα σε ορμόνη καρκίνο του προστάτη ανθεκτικού όπως αξιολογείται με φωσφορυλιωμένη περιεχόμενο Tyr-416 [2]. Ωστόσο, η ερμηνεία αυτή είναι πολύ επικίνδυνη. Αν και η χαμηλή

in vitro

καταλυτική δράση του ρΤγΓ-527 Src είναι αδιαμφισβήτητη, η αντίστοιχη δραστηριότητα του ιδίου ενζύμου σε ένα βιολογικό περιβάλλον είναι λιγότερο βέβαιο. Κατά την αλληλεπίδραση των τομέων SH2 ή SH3 του ενζύμου Src με άλλες πρωτεΐνες, η ανασταλτική υπόλειμμα ρΤγΓ-527 απελευθερώνεται, ο οποίος παράγει πλήρως ενεργή ρΤγΓ-527 Src [3] – [5]. Πράγματι, η διαδικασία αυτή ανακεφαλαιώνεται από βραχέα πεπτίδια ρΤγΓ περιέχοντα που, κατά την σύνδεση με τον τομέα SH2 Src, να ανατρέψουν την ενδομοριακή αλληλεπίδραση ανασταλτική ρΤγΓ-527 και έτσι να ενεργοποιούν δραστικότητα κινάσης [6] – [8]. Κατά συνέπεια, ρΤγΓ-527 κατάσταση δεν είναι απαραίτητα ενδεικτική μιας ανέστειλε ενζύμου

per se

, αλλά μάλλον ενός ενζύμου που είναι δυνητικά προετοιμαστεί και είναι έτοιμη να «ενεργοποιηθεί» από την αλληλεπίδραση με ένα κατάλληλο εξάρτημα πρωτεΐνη. Εν ολίγοις, τα υψηλά επίπεδα ρΤγΓ-527 Src θα μπορούσε να αποτελέσει ανέστειλαν το ένζυμο, ενεργοποιημένο ένζυμο, ή κάποια παραλλαγή στο ενδιάμεσο. Η αβεβαιότητα αυτή αναδεικνύει την ανάγκη να δοκιμάσετε Src κινάσης

απευθείας μέσω της ικανότητάς του να φωσφορυλιώνει ένα υπόστρωμα στόχο. Εκτός από την φωσφορυλίωση, η κινάση Src ρυθμίζεται στο επίπεδο της πρωτεΐνης μέσω ουβικιτινίωση και επομένως αποικοδόμηση από το πρωτεάσωμα μεσολάβηση οδού [9]. Κατά συνέπεια, με τον ίδιο τρόπο που το καθεστώς φωσφορυλίωσης είναι ένα αμφισβητήσιμη προάγγελος της δραστικότητας κινάσης, τα επίπεδα mRNA δεν είναι απαραίτητα ενδεικτικά περιεχόμενο κινάσης Src ή δραστηριότητα.

Src έντονα εμπλέκεται στις οδούς που ελέγχουν πολλές της χαρακτηριστικής κελί συμπεριφορές υπεύθυνος για την εισβολή και την εξέλιξη του όγκου. Για παράδειγμα, Src μεσολαβεί δυναμική προσκόλληση και του κυτταροσκελετού και επομένως ελέγχει κυττάρου μετανάστευση [10], [11]. Διηθητική μετανάστευση αυξάνεται με μια Src εξαρτώμενη επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση [12] και την ενεργοποίηση των πρωτεασών αποδόμησης μήτρας [13] – [16]. φωσφορυλίωση Src της κασπάσης 8 είναι αντιαποπτωτικών [17], ενώ μεσολαβεί η Src ενεργοποίηση STAT προάγει την κυτταρική ανάπτυξη και επιβίωση [9]. Εν ολίγοις, Src εμπλέκεται σε μια πληθώρα διόδων που έχουν επάνω ρυθμισμένη σε πολλές από τις πιο επιθετικές και επεμβατικές μορφές καρκίνου. Ωστόσο, δεδομένου ότι η Src είναι μόνο σπάνια μεταλλαγμένη σε ανθρώπινους όγκους, παρεκκλίνουσα συμπεριφορά Src είναι συνήθως μια συνέπεια της μη φυσιολογικής ρύθμισης του. Εξετάσαμε ρύθμιση κινάσης Src στις δομικές, καταλυτικά, και τα επίπεδα έκφρασης σε ένα πλατφόρμα του καρκίνου του προστάτη κυτταρικών γραμμών που ποικίλουν σε συμπεριφορά από μη επεμβατική υψηλής επεμβατική και από εξαρτώμενων από ανδρογόνα για ανεξάρτητου από ανδρογόνο. Απροσδόκητα, βρήκαμε ότι τα επίπεδα καταλυτική δραστηριότητα Src και πρωτεΐνη μείωσε σημαντικά στις πιο επιθετικές κυτταρικές γραμμές. Αντίθετα, αυτές οι επιθετικές κυτταρικές γραμμές εμφανίζουν υψηλή ειδική δραστικότητα Src και αυξημένα επίπεδα της φωσφορυλίωσης κατά Tyr-527 (η λεγόμενη ανασταλτική θέση) σε σχέση με λιγότερο επιθετικές τους ομολόγους τους. Αυτά τα αποτελέσματα συζητούνται στο πλαίσιο του μηχανισμού της δράσεως της Src σε ιδιαίτερα πολλαπλασιαστικές περιβάλλοντα.

Αποτελέσματα

Σχεδιασμός και σύνθεση της Src κινάσης αισθητήρα

Με βάση, εν μέρει, σε μια αλληλουχία υπόστρωμα Src προσδιορίζονται από ένα προσανατολισμένο βιβλιοθήκη πεπτιδίων [18], κατασκευάσαμε το επισημασμένο με φθοροφόρο αλληλουχία: 5-FAM-Orn (Ac) -Glu-Glu-Glu-Ile-Tyr-Gly-Glu-Phe-Orn ( Ac) -αμίδιο (1), όπου Tyr είναι η περιοχή της φωσφορυλίωσης. Επιπλέον, ορνιθίνη (Orn) υπολείμματα τοποθετήθηκαν σε κάθε άκρο της αλληλουχίας πεπτιδίου, σε περίπτωση που το πεπτίδιο αποδείχθηκε εμφανίζουν φτωχή επιλεκτικότητα για Src έναντι άλλων κινασών πρωτεϊνών. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η τροποποίηση της πλευρικής αλυσίδας του δραστικού τοποκατευθυνόμενης πεπτίδια με αφύσικη υποκαταστάτες μπορεί να βελτιώσει σημαντικά την επιλεκτικότητα για την πρωτεΐνη-στόχο κινάσης (

vide infra

) [19] – [25]. Τόσο το μη φωσφορυλιωμένο και οι φωσφορυλιωμένες μορφές [5-FAM-Orn (Ac) -Glu-Glu-Glu-Ile-ρΤγΓ-Gly-Glu-Phe-Orn (Ac) -αμίδιο (2)] του πεπτιδίου παρασκευάστηκαν μέσω σύνθεσης πεπτιδίων στερεάς φάσης. 5-FAM (5-καρβοξυφλουορεσκεΐνη) επιλέχθηκε ως το φθοροφόρο για το υπόστρωμα και ανίχνευση προϊόντος με LIF.

Ο διαχωρισμός του μη φωσφορυλιωμένο υπόστρωμα και η φωσφορυλιωμένη προϊόν με CE-LIF φαίνεται στο Σχ. 1Α. Ένα μίγμα 1:01 των πεπτιδίων φορτώθηκε στον τριχοειδή σωλήνα. Κάτω από τις συνθήκες διαχωρισμού που περιγράφονται στο Υλικά και Μέθοδοι, υπόστρωμα πεπτιδίου 1 αναδύεται στα 240 sec, ενώ η φωσφορυλιωμένη προϊόν 2 φαίνεται στα 290 sec. Η ανάπτυξη της τελευταίας παρακολουθήθηκε ως συνάρτηση του χρόνου, με επώαση του υποστρώματος (1) με ενεργή κινάση Src. Η κορυφή 290 sec επιβεβαιώθηκε ότι είναι το φωσφορυλιωμένο προϊόν δια συγκρίσεως με συνθετικό φωσφο-πεπτίδιο 2. Η κινητική της φωσφορυλίωσης ελήφθη με αξιολόγηση δειγμάτων που συλλέγονται χρονικό σημείο μέσω CE-LIF και την ποσοτικοποίηση της έκτασης της φωσφορυλίωσης μέσω ενσωμάτωσης των διαφόρων κορυφών. Το πεπτίδιο 1 φωσφορυλίωσης είναι ουσιαστικά πλήρης μέσα σε 3 λεπτά κάτω από τις συνθήκες δοκιμασίας που χρησιμοποιούνται καθαρού ενζύμου Src (Εικ. 1Β). Αντίθετα, τα επόμενα πειράματα σε κυτταρικά λύματα (

βλέπε κατωτέρω

) να προχωρήσει σε ένα πιο χαλαρό ρυθμό. Στην τελευταία περίπτωση, η αρχική κινητική ποσοστό ( Μια πιθανή εξήγηση είναι η γνωστή ευαισθησία των ενεργοποιημένων Src, σε σχέση με μη ενεργοποιημένο ομόλογό του, να διαμεσολαβείται από την ουβικουϊτίνη αποικοδόμησης [54], [55]. Κατά συνέπεια, οι κυτταρικές σειρές που βρίσκονται κάτω από έντονη πίεση ενεργοποιηθεί Src μπορεί, κατά ειρωνεία της τύχης, εμφανίζουν χαμηλότερη περιεκτικότητα σε Src από τους λιγότερο επιθετικά κύτταρα. Επιπλέον, δύο πρόσφατες μελέτες προτείνουν ένα μηχανισμό εξαρτώμενης micro RNA (MIR) με την οποία ρυθμίζονται τα επίπεδα Src. Bhatnagar

et al

έχουν δείξει ότι η πιο επεμβατική η κυτταρική σειρά προστάτη όσο υψηλότερο είναι το επίπεδο miR-205 [48]. miR-205 είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση της Src [56]. Η παρατήρησή μας ότι τα επίπεδα Src είναι χαμηλότερες σε επιθετικό κυττάρων του προστάτη γραμμές είναι σύμφωνη τόσο με ουβικιτίνης και μηχανισμούς miRNA. Επιπλέον, η υψηλότερη ειδική δραστικότητα στις πιο επιθετικές κυτταρικές σειρές δείχνουν ότι, σε αυτά τα κύτταρα, αν και υπάρχει λιγότερη Src παρόν, μεγαλύτερο κλάσμα αυτό έγκειται στο ενεργό μορφή.

κατάσταση φωσφορυλίωσης Src έχει υποτεθεί να συσχετίζονται με δραστηριότητα όπου λαμβάνεται ρΤγΓ-416 ως ενεργό και ρΤγΓ-527 ως ανενεργές μορφές του ενζύμου. Με αυτό κατά νου, μετρήσαμε τα επίπεδα της ρΤγΓ-416 με ανάλυση κηλίδας Western και χαράσσεται ρΤγΓ-416 src /συνολικό Src (κλασματικό ρΤγΓ-416) σε σχέση με κυτταρική σειρά επιθετικότητα. Όπως είναι προφανές από το Σχ. 5Α και 6D, άκρως επιθετική κυτταρικές σειρές εμφανίζουν υψηλότερη αναλογία ρΤγΓ-416 με το σύνολο των Src από nonaggressive ομολόγους τους. Αυτό είναι σύμφωνο με μια πρόσφατη έκθεση από τον Evans και οι συνεργάτες του αποδεικνύουν ότι ο αναστολέας saracatinib Src είναι πιο αποτελεσματικό κατά των κυττάρων του προστάτη γραμμές που έχουν την υψηλότερη αναλογία του ενεργού προς το σύνολο των Src [57]. Στην τελευταία μελέτη, «ενεργός Src» ελήφθη να είναι ρΤγΓ-416 Src. Αυτοί οι ερευνητές ανέφεραν επίσης ότι τα κύτταρα με τους χαμηλότερους δείκτες (ρΤγΓ-416 Src /συνολικός Src) εκφράζουν την πλέον Src.

Ένα υψηλό ρΤγΓ-527 /συνολικό δείκτη Src θα πρέπει να είναι, σύμφωνα με το συμβατικό μοντέλο, ενδεικτικό της μια συνολική χαμηλότερη κλάσμα του δραστικού ενζύμου. Ωστόσο, έχουμε διαπιστώσει ότι η αναλογία αυτή είναι υψηλότερη στις επιθετικές γραμμές, καθώς και (Εικ. 5Β και Σχ. S5). Μια πιθανή εξήγηση για αυτό το μη αναμενόμενο αποτέλεσμα είναι η γνωστή ικανότητα του ενζύμου ρΤγΓ-527 Src να ενεργοποιείται από φωσφορυλιωμένη πεπτίδια και πρωτεΐνες. Με λίγα λόγια, αν και ρΤγΓ-527 Src είναι ανενεργή σε απομονωμένη, καθαρισμένη μορφή του, το αντίθετο μπορεί να ισχύει όταν το δυναμικό φωσφορυλιωμένα εταίρους δέσμευσης είναι παρόντες. Συνεπώς, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι τα επίπεδα ρΤγΓ-527 Src δεν είναι ένα χρήσιμο βαρόμετρο των ανενεργών Src και, μάλλον, μπορεί στην πραγματικότητα να είναι μια πιο κατάλληλη μάντης δραστηριότητας Src. Παρεμπιπτόντως, σημειώνουμε ότι οι κηλίδες Western που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη για να ανιχνεύσει κατάσταση φωσφορυλίωσης Src χρησιμοποιείται μεγάλους πληθυσμούς κυττάρων. Ωστόσο, οι πρόσφατες εξελίξεις, οδηγείται από την τεχνολογία CE, ενεργοποιήστε την κατάσταση φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών που πρέπει να επιλυθούν και να ανιχνευθούν από μόλις 25 κύτταρα [58]. Πράγματι, CE ως μικροκλίμακα Western σύστημα αποτύπωση έχει λάβει σημαντική προσοχή [59]. Κατά συνέπεια, μπορεί τελικά να είναι εφικτό να δοκιμάσετε ταυτόχρονα τα επίπεδα του συγκεκριμένου ενζύμου φωσφο-ισόμορφα καθώς και ενζυμική δραστηριότητα μέσα σε λίγα κύτταρα χρησιμοποιώντας την τεχνολογία CE.

Υπάρχουν υπήρξε και συνεχίζει να είναι ένα τιτάνιο προσπάθεια για τον εντοπισμό CaP δεικτών που συσχετίζονται με κληρονομικότητα, καθώς απέκτησε σωματικές μεταλλάξεις. Για παράδειγμα, περισσότερα από 40 θέσεις επιδεκτικότητα έχουν ανατεθεί σε περίπου 25% του κληρονομικές κινδύνου. [60] Επιπλέον, τόσο περιοχή κωδικοποίησης και αναλύσεις ολόκληρο το γονιδίωμα έχουν διεξαχθεί για τον εντοπισμό γενετικών ανωμαλιών που συσχετίζονται με σωματικώς αποκτήθηκαν καπάκι. Για παράδειγμα, μια πρόσφατη μελέτη ολόκληρο το γονιδίωμα διεξήχθη χρησιμοποιώντας δείγματα όγκων από ασθενείς με επιθετική καπάκι. Αυτοί οι ερευνητές εντοπίστηκαν σχεδόν 4.000 μεταλλάξεις σωματικών βάσης και 90 χρωμοσωματικών αναδιατάξεων ανά όγκο, καθώς και συσχετισμούς μεταξύ μια σειρά από αναδιάταξη σημεία διακοπής και διάφορες επιγενετικές σημάτων. [61] Οι συγγραφείς σημειώνουν ότι ένα «φάσμα των μηχανισμών άμεσης γένεση και την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη» [61] και ως εκ τούτου καμία μεμονωμένη αλλαγή στην ενζυματική δραστηριότητα είναι υπόλογη για την έναρξη, την εξέλιξη, και /ή επιθετικότητα της νόσου. Για παράδειγμα, οι πολύπλοκες γονιδιωματικές μεταθέσεις διαδεδομένη σε CaP πιστεύεται ότι προσκρούσουν στην διαγραφή και την ενίσχυση μιας σειράς γονιδίων που κωδικοποιούν γνωστά καταστολείς όγκων και ογκογονίδια, αντίστοιχα. Παρ ‘όλα αυτά, τα δεδομένα μας δεν δείχνουν ότι Src ειδική δραστικότητα μπορεί να χρησιμεύσει ως βαρόμετρο του CaP επιθετικότητας. Αυτό είναι πιθανό μια συνέπεια του γεγονότος ότι η ίδια η Src είναι ένα βασικό συμμετέχων σε οδούς που μεσολαβούν την κυτταρική ανάπτυξη και κινητικότητα, η οποία με τη σειρά της μπορεί να αντανακλά τις μαζικές και πολύπλοκες γονιδιωματική δομικές αλλαγές διαδεδομένη στην ΚΓΠ. Επιπλέον, αν και έχουμε διαπιστώσει ότι ρΤγΓ-416 src /συνολικό Src είναι ένας αξιόπιστος δείκτης της συγκεκριμένης δραστηριότητας Src, τα αποτελέσματα με ρΤγΓ-527 είναι, με την πρώτη ματιά, απρόσμενη. Η φωσφορυλιωμένη Tyr-527 θεωρείται γενικά ότι είναι αντανακλαστική του αδρανούς ενζύμου. Ωστόσο, έχουμε διαπιστώσει ότι η αναλογία των ρΤγΓ-527 /συνολικό Src είναι μια φτωχή δείκτης

στο

ενεργό Src σε κυτταρικές σειρές καπάκι. Αντιθέτως, ο τελευταίος λόγος φαίνεται να είναι μια πολύ καλύτερη ικανότητα πρόβλεψης των δραστικών Src. Από μηχανιστική άποψη, αυτό μπορεί να αντανακλά την παρουσία των φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών που μπορούν να συνδεθούν με (μέσω του τομέα SH2 Src) και με τον τρόπο αυτό ενεργοποιούν ταχέως το ένζυμο αναστέλλεται. Κατά συνέπεια, το καθεστώς της δραστηριότητας της ρΤγΓ-527 Src θα πρέπει να θεωρηθεί ως «έτοιμη για δράση» και όχι στατικά ανενεργό.

Εν ολίγοις, έχουμε αναπτύξει ένα σύστημα ανίχνευσης ευαίσθητο και επιλεκτική δράση κινάσης Src. Χρησιμοποιώντας μια σειρά από nonaggressive, επιθετική, και ανδρογόνο-ανεξάρτητες κυτταρικές σειρές του προστάτη, έχουμε διαπιστώσει ότι η συνολική δραστηριότητα της Src μειώνεται ως συνάρτηση της αύξησης του προστάτη επιθετικότητας κυτταρική σειρά. Fmoc-Orn(Aloc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Tyr(PO(OBzl)OH)-Gly-Glu(OtBu)-Phe-Orn(Aloc)-amide-Resin