Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια, και η σαφής υποτύπου καρκίνωμα των ωοθηκών (OCCA) καταδεικνύει μία ιδιαίτερα φτωχή ανταπόκριση στη συνήθη θεραπεία. Βελτιώσεις στα αποτελέσματα καρκίνο των ωοθηκών, ειδικά για OCCA, θα μπορούσε να αναμένεται από μια σαφέστερη κατανόηση της μοριακής παθολογίας που θα μπορούσαν να καθοδηγήσουν τις στρατηγικές για την έγκαιρη διάγνωση και πιο αποτελεσματική θεραπεία.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

τηλέφωνα -SELEX τεχνολογία χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη νέων μοριακών ανιχνευτών για τον καρκίνο των ωοθηκών δείκτες κυτταρικής επιφάνειας. Ελήφθησαν συνολικά δεκατριών απταμερών με K

d’s να ωοθηκών καρκινικά κύτταρα στο pico- να nanomolar εύρος. Προκαταρκτική έρευνα από τους στόχους αυτών των απταμερών και τα χαρακτηριστικά τους σύνδεσης πραγματοποιήθηκε επίσης.

Συμπεράσματα /Σημασία

Έχουμε επιλέξει μια σειρά από απταμερών που συνδέονται με διαφορετικούς τύπους καρκίνου των ωοθηκών, αλλά δεν του τραχήλου της μήτρας Καρκίνος. Αν και σύνδεση με άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές παρατηρήθηκε, αυτά τα απταμερή θα μπορούσαν να οδηγήσουν στον εντοπισμό των βιοδεικτών που σχετίζονται με τον καρκίνο

Παράθεση:. Van Simaeys D, López-Colón D, Sefah Κ, Sutphen R, Χιμένες Ε, Tan W (2010) Μελέτη της Μοριακής αναγνώρισης απταμερή Επιλεγμένα μέσω καρκίνο των ωοθηκών κυττάρων-SELEX. PLoS ONE 5 (11): e13770. doi: 10.1371 /journal.pone.0013770

Συντάκτης: Cameron Neylon, Πανεπιστήμιο του Σαουθάμπτον, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 3 Μάη του 2010? Αποδεκτές: 6 Οκτώβρη, 2010? Δημοσιεύθηκε: 1 του Νοέμβρη του 2010

Copyright: © 2010 Van Simaeys et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς ευχαριστώ Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) για την υποστήριξη (R01GM079359, R01 CA133086, R01-CA106414). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις γυναίκες [1], και έχει το υψηλότερο ποσοστό θανάτου από οποιαδήποτε γυναικολογική κακοήθεια. Αυτή η νόσος χαρακτηρίζεται από μερικά πρώτα συμπτώματα, την παρουσίαση σε προχωρημένο στάδιο στην πλειονότητα των περιπτώσεων, και η κακή ποσοστά επιβίωσης [2] – [8]. Η πρόγνωση είναι ιδιαίτερα κακή για τους ασθενείς με σαφή κύτταρο αδενοκαρκινώματος ωοθηκών (OCCA), η οποία είναι συχνά ανθεκτική σε πρότυπο με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία [6] – [10].

Η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη βιοδείκτη ορό για κλινική διάγνωση και πρόγνωση είναι αντιγόνο του καρκίνου των ωοθηκών 125 (CA-125). Η τιμή CA-125 είναι αυξημένη σε περίπου 90% των περιπτώσεων προχωρημένου σταδίου του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών (στάδια 3 και 4). Ωστόσο, είναι αυξημένα μόνο σε 50-60% των γυναικών με νόσο πρώιμο στάδιο και είναι επίσης αυξημένα σε έναν αριθμό καλοήθων συνθήκες [2], [5], [7], [11] – [13].

Η χρησιμοποίηση των απταμερών έχει μεγάλες δυνατότητες για την ταυτοποίηση νέων βιοδεικτών. Τα απταμερή, τα οποία είναι ανιχνευτές ικανά να δεσμεύονται ειδικά σε δείκτες κυτταρικής επιφάνειας που εκφράζονται από στοχευμένες κύτταρα όγκου [14] – [21], είναι μικρής μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια περίπου 100 nt. Επιλέγονται από μεγάλες συνδυαστικές δεξαμενές αλληλουχιών με Συστηματική εξέλιξη προσδεμάτων δι ‘εκθετικού εμπλουτισμού (SELEX) για την ικανότητά τους να συνδέονται με τους στόχους, το οποίο μπορεί να κυμαίνεται από μικρά μόρια σε πρωτεΐνες ή πολυσακχαρίτες, όπως επίσης και τα καρκινικά κύτταρα [16] – [19 ], [21] – [23]. Τα απταμερή έχουν καλά καθορισμένη τριτοταγή δομή που υπαγορεύουν την επιλεκτικότητα για τους στόχους τους.

Η εξειδίκευση στόχου και συγγένεια απταμερών είναι παρόμοιες με εκείνες των αντισωμάτων, αλλά με αρκετά πλεονεκτήματα έναντι αντισωμάτων για κλινική χρήση. Τα απταμερή μπορεί να συντεθεί χημικά σε σύντομο χρονικό διάστημα σε σχετικά χαμηλό κόστος, επιτρέποντας την καλύτερη αναπαραγωγιμότητα από παρτίδα σε παρτίδα και ευκολότερη ενσωμάτωση χημικών τροποποιήσεων. Δεδομένου ότι τα απταμερή για κύτταρα επιλέγονται, χωρίς προηγούμενη γνώση των μορίων στόχων, που επιλέγονται απταμερή μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον εντοπισμό νέων δεικτών επιφανείας επί καρκινικών κυττάρων [14], [16] – [18], [20], [24] – [27] .

Σε αυτό το έργο, επιλέχθηκε συνολικά 13 απταμερών για δύο μοντέλο κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών: το OCCA γραμμή TOV-21G [28] (10 απταμερή) και τη ωοθηκών γραμμή ορώδες αδενοκαρκίνωμα CaOV-3 [29 ] (3 απταμερή). Οι στόχοι κυτταρικής επιφανείας των απταμερών επίσης εν συντομία διερευνηθεί. Προκαταρκτική έρευνα των στόχων της απταμερών και χαρακτηριστικά δέσμευσης εκτελέστηκε επίσης

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Δύο μοντέλο κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών επιλέχθηκαν για την επιλογή των απταμερών καρκίνου των ωοθηκών:. Το OCCA κυτταρική γραμμή TOV -21G και το ορώδες αδενοκαρκίνωμα κυτταρικής σειράς ωοθήκης CaOV-3. Για να ταυτοποιηθούν απταμερή που δεσμεύονται ειδικά σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, του τραχήλου της μήτρας η καρκινική κυτταρική σειρά HeLa χρησιμοποιήθηκε για αντι-επιλογή. Η διαδικασία SELEX για TOV-21G περιγράφεται εν συντομία κατωτέρω. Μια λεπτομερής περιγραφή παρέχεται στο πειραματικό μέρος.

Για να ξεκινήσετε τη διαδικασία επιλογής, 20 pmol από αφελείς βιβλιοθήκης εμπλουτίστηκε με διαδοχική δέσμευσης μονοστιβάδες κυττάρων σε TOV-21G. Ακολουθίες που δείχνει σύνδεση προς γενικούς δείκτες επιφάνειας κυττάρου μη ειδικής απομακρύνθηκαν με επώαση του εμπλουτισμένου συνενώματος με κύτταρα HeLa (γύρους 2, 4, 5, 7, 8, 9, 12, 20, 21, 22). Το εκλουσθέν πισίνα για κάθε γύρο SELEX ενισχύθηκε μέσω PCR, μετά την οποία ανακτήθηκαν και παρακολουθήθηκαν για εμπλουτισμό προς TOV-21G με κυτταρομετρία ροής οι δεξαμενές ssDNA ενδιαφέροντος. Δεδομένου ότι οι επιλεγείσες ομάδες εμπλουτίστηκαν με αλληλουχίες που αναγνωρίζουν και δεσμεύονται στην κυτταρική σειρά στόχο, μία αύξηση στο σήμα φθορισμού παρατηρήθηκε (Σχήμα 1α). Αλλά οι προσπάθειες να παραλείψει αντιπαραγωγική επιλογή σε κύκλους 13-19 οδήγησε σε εμπλουτισμό για HeLa-αλληλουχίες πρόσδεσης. Οι αλληλουχίες πρόσδεσης σε κύτταρα HeLa απομακρύνθηκαν επιτυχώς με αντίθετη επιλογή σε επόμενους γύρους, ενώ ο εμπλουτισμός προς το κύτταρο στόχο γραμμή διατηρήθηκε (σχήμα 1β). Μετά από 22 γύρους SELEX, ένα εμπλουτισμένο πισίνα που δεσμεύεται ειδικά με το υπόδειγμα κυτταρική γραμμή OCCA, αλλά οριακά σε κύτταρα HeLa, ελήφθη (Σχήμα 2). Έτσι, η πισίνα ήταν εμπλουτισμένο με επιτυχία για αλληλουχίες σύνδεσης δεικτών επιφανείας που εκφράζονται από το μοντέλο κυτταρική σειρά OCCA, αλλά όχι από του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα.

Α) Ο εμπλουτισμός με κύτταρα TOV-21G Β) Η οριακή δέσμευσης του αντίστοιχου πισίνες σε κύτταρα HeLa. Με τον τρόπο επιλογής πάγκο, αλληλουχίες δέσμευσης για HeLa αφαιρέθηκαν.

Η

Ο αρνητικός έλεγχος σε αυτές τις δοκιμασίες πρόσδεσης ήταν ΡΕ /Cy5-επισημασμένο τυχαία βιβλιοθήκη. C) Τα κύτταρα επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις ΡΕ-Cy5-επισημασμένο απταμερές εις διπλούν. Η ένταση του φθορισμού που προέρχονται από τη σύνδεση σε κάθε συγκέντρωση υποβάθρου αφαιρέθηκε από την μέση ένταση φθορισμού της αντίστοιχης απταμερούς

Η

Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας επιλογής, τρεις πισίνες επιλέχθηκαν και υποβλήθηκαν για ανάλυση αλληλουχίας:. Η τελική πισίνα (στρογγυλή 22), η προηγούμενη πισίνα (στρογγυλή 21) και μια πισίνα που δείχνει ελάχιστη εμπλουτισμού (στρογγυλή 13). αλληλουχίας πισίνα ήταν χρησιμοποιείται για να βοηθήσει στον εντοπισμό των υποψηφίων απταμερούς με την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων των ακολουθιών. Αυτός ο αριθμός των ακολουθιών (εδώ τουλάχιστον 2000 ανά ομάδα) είναι αρκετά μεγάλη ώστε να επιτρέπουν την ταυτοποίηση των απταμερών που έχουν μόνο ένα μικρό αναπαράσταση στην πισίνα (δηλαδή λιγότερο από 1%). Όπως μπορεί να φανεί στον Πίνακα 1, που επιλέγεται απταμερή ήταν πράγματι υπάρχει τόσο νωρίς όσο παρατηρήθηκε μια ελάχιστη εμπλουτισμού. ποσοστό μέγεθος AptTOV1 μειώθηκε καθώς η SELEX συνεχίστηκε, η οποία είναι αξιοσημείωτη, δεδομένης της υψηλής συγγένειας της παρούσας απταμερούς. Αυτή η συμπεριφορά έχει επίσης παρατηρηθεί σε άλλες επιλογές [30]. Άλλες απταμερή δείχνουν μια σταθερή αύξηση του ποσοστού μεγέθους όπως ο εμπλουτισμός αυξημένη. Τα αποτελέσματα από AptTOV6 συμπεριλαμβάνονται για να καταδείξουν ότι ακόμη και σχετικά μικρές οικογένειες μπορεί να οδηγήσει σε απταμερή.

Η

Οι αλληλουχίες ευθυγραμμίστηκαν σε οικογένειες ανάλογα με την ομολογία αλληλουχίας. Ο αριθμός των ομολόγων έγινε σύγκριση μεταξύ των διαφόρων αλληλουχία πισίνες για να επικυρώσει τον εμπλουτισμό τους μέσω της διαδικασίας επιλογής, χρησιμοποιώντας βασικές πληροφορική βιο. Δέκα αλληλουχίες που δείχνει την καλύτερη ομολογία σε ολόκληρη πισίνες επελέγησαν ως υποψήφιοι απταμερούς, συντίθενται και δοκιμάζονται ως προς τη δέσμευση του μοντέλου κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών. Όλοι οι υποψήφιοι έδειξαν πρόσδεση σε TOV-21G, με δεσμευτικές συγγένειες στην pico- να νανο-μοριακή σειρά (Πίνακας 2). Αυτό καταδεικνύει το δυναμικό της αλληλούχισης επόμενης γενιάς σε SELEX για να γίνει ένα ισχυρό και αναπαραγώγιμη μέθοδος για την ανάπτυξη των απταμερών.

Η

Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, απταμερή aptTOV1 (K

d = 0,25 ± 0,08 nM) και aptTOV2 (0,90 ± 0,25 nM) δεσμεύει πολύ στενά με τα κύτταρα TOV-21G. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, και τα δύο απταμερή μπορούν να διακρίνουν TOV-21G από κύτταρα HeLa.

Η δέσμευση των επιλεγμένων απταμερών δοκιμάστηκε με διαφορετικές κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος, όπως επίσης και άλλων τύπων καρκίνου κυτταρικών γραμμών, όπως φαίνεται στο Πίνακας 2. Πέντε των απταμερών επιλέγονται έναντι TOV-21G έδειξε δέσμευση σε κύτταρα CEM (οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία), ενώ κανένας από τους απταμερών δεσμεύονται σε κύτταρα Ramos (λέμφωμα Burkitt) ή HL-60 (οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία). Όλα τα ελήφθη απταμερών δεσμεύονται με ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα (HCT-116) και γλοιοβλαστώματος (Α172). Τα απταμερή που λαμβάνονται από TOV-21G δεν συνδέονται προς DLD-1 (τύπος C ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα Dukes ‘), ενώ οι απταμερή που προέρχονται από CaOV-3 συνεδέετο με αυτήν την κυτταρική γραμμή. Αυτή η συμπεριφορά είναι παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε σε προηγούμενες εργασίες που πραγματοποιούνται στο εργαστήριο μας.

Δεδομένου ότι και οι δύο επιλογές διεξήχθησαν στους 4 ° C, τα επιλεγμένα απταμερή δοκιμάστηκαν σε φυσιολογικές συνθήκες. Τα απταμερή επωάστηκαν με την κυτταρική σειρά στόχο στους 37 ° C και 4 ° C και δέσμευση μετρήθηκε τους. Όλα τα απταμερή έδειξε παρόμοια δέσμευσης σε 4 ° C και 37 ° C (π.χ., aptTOV1 στο σχήμα 2α), γεγονός που υποδηλώνει ότι έχουν δυνατότητες για in vivo μελέτες.

Για να διερευνηθεί η φύση του μορίου στόχου του κάθε απταμερούς, σύνδεση του κάθε απταμερούς ελέγχθηκε μετά την επεξεργασία των κυττάρων-στόχων με τα πρωτεάσες τρυψίνη ή πρωτεϊνάση K. Όπως μπορεί να φανεί στο σχήμα 3α, aptTOV1 δείχνει σαφή απώλεια σύνδεσης προς TOV-21G μετά τη θεραπεία πρωτεάσης. Η ίδια συμπεριφορά παρατηρήθηκε επίσης με όλες τις άλλες απταμερή aptTOV. Είναι ενδιαφέρον ότι, για τη δεύτερη κυτταρική γραμμή μοντέλο, CaOV-3, DOV3 και DOV4 διατηρούνται δέσμευσης τους μετά τη θεραπεία πρωτεάσης (σχήμα 3β), υποδηλώνοντας ότι αυτά τα απταμερή μπορεί να μην συνδέεται με πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας της μεμβράνης, αλλά μάλλον σε άλλο τύπο δείκτη κυτταρικής επιφάνειας (δηλαδή, υδατάνθρακα ή λιπιδίου). Ούτε DOV3 ούτε DOV4 συνδέεται προς τα κύτταρα λευχαιμίας δοκιμάστηκαν (Πίνακας 3).

Α) αριθ δέσμευση παρατηρήθηκε για aptTOV1 να θρυψίνη κύτταρα TOV-21G. Β) Η σύνδεση του DOV 3 και 4 για να CaOV-3 κύτταρα δεν επηρεάστηκε από τη θεραπεία πρωτεάσης. Όλα τα άλλα απταμερή έδειξε την ίδια συμπεριφορά όπως παρουσιάζεται στο α).

Η

Εν κατακλείδι, έχουμε επιλέξει μια σειρά από απταμερών με υψηλή συγγένεια για ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων OCCA (TOV-21G) και ορώδες αδενοκαρκίνωμα (CaOV-3). Με αντίθετη επιλογή έναντι των κυττάρων HeLa, επιλέχθηκαν απταμερή που μπορεί να διακρίνει τον καρκίνο των ωοθηκών από καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Ειδικότερα, AptTOV 1 έδειξε πολύ υψηλή συγγένεια προς TOV-21G, με Κ

δ 250 ρΜ.

Λόγω του περιορισμένου αριθμού των βιοδεικτών για καρκίνο των ωοθηκών είναι διαθέσιμα σήμερα, τα απταμερή λαμβάνονται από αυτές τις επιλογές έχουν δυναμικό βελτίωσης διάγνωση και τη θεραπεία αυτής της θανάσιμης ασθένειας. Επειδή οι απταμερών δεσμεύουν επίσης καλοήθεις κύστεις (Πίνακας 3), τα απταμερή δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον εντοπισμό του καρκίνου των ωοθηκών

per se

. Ωστόσο, δεδομένου ότι οι apamers aptTOV δεν δεσμεύονται με έναν καρκίνο παρόμοιων αιτιολογία (Caov3) και επίσης να μην HeLa, εξακολουθούν να έχουν τη δυνατότητα να παρέχουν περισσότερες πληροφορίες σχετικά με την παθολογία του καρκίνου των ωοθηκών. Έχει παρατηρηθεί ότι υπάρχουν σημαντικές διαφορές στην πρωτεώματος ορώδους και σαφή καρκίνου των ωοθηκών κυττάρου [31]. Οι στόχοι για αυτά τα απταμερή είναι πιο πιθανό κάτω ρυθμιζόμενη ή σιγήσει σε αυτά τα δύο μοντέλα κυττάρων. Επιπλέον, τα απταμερή AptTOV δείχνουν δέσμευση σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου από διαφορετικές μη σχετίζονται καρκίνους (Πίνακας 3), και μερικά απταμερή AptTOV δεσμεύουν και CEM κύτταρα. Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι οι απταμερών που λαμβάνονται από αυτή SELEX μπορεί να χρησιμοποιηθεί για δημιουργία προφίλ της έκφρασης των πρωτεϊνών μεμβράνης διαφορετικών καρκίνων. Ο εντοπισμός των στόχων των επιλεγμένων απταμερών αναμένεται να ρίξει φως σχετικά με τους υποκείμενους μηχανισμούς που εμπλέκονται.

Η ανακάλυψη των δύο απταμερών που ήταν ευαίσθητα στην πρωτεάση πέψη είναι ενδιαφέρουσα. Επιπλέον, τους πρόσδεση σε όλες τις δοκιμασμένες κύτταρα αδενοκαρκινώματος, αλλά όχι σε οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές λευχαιμίας, προτείνει τη δυνατότητα να διαφωτίσει περαιτέρω τις υποκείμενες μοριακές διαφορές μεταξύ αυτών των τύπων καρκίνου. Περαιτέρω έρευνα είναι αναγκαία για να προσδιορίσει τους στόχους αυτών των απταμερών και να αξιολογούν τις επιδόσεις τους σε κλινικά δείγματα.

Υλικά και Μέθοδοι

Όργανα και αντιδραστήρια

Όλα τα ολιγονουκλεοτίδια συντέθηκαν με τυπικές φωσφοραμιδίτη χημεία χρησιμοποιώντας συσκευή σύνθεσης DNA 3400 (Applied Biosystems) και καθαρίστηκαν με ανάστροφης φάσης HPLC (Varian Prostar). Όλα τα μείγματα PCR περιείχε 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCl (ρΗ 8.3), 2.0 mM MgCl

2, dNTPs (το καθένα σε 2.5 mM), 0.5 μΜ του κάθε εκκινητή, και Hot Taq DNA εκκίνηση πολυμεράσης (5Units /μL ). PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα Biorad Thermocycler και όλα τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Takara. Παρακολούθηση του εμπλουτισμού πισίνα, χαρακτηρισμός των επιλεγμένων απταμερών, και την ταυτοποίηση των δοκιμασιών πρωτεΐνης-στόχου διεξήχθησαν με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιώντας FACScan κυτταρόμετρο (BD Immunocytometry Systems). Θρυψίνη και πρωτεϊνάση Κ αγοράστηκαν από την Fisher Biotech. Η απεικόνιση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με ένα της Olympus FV500-IX81 ομοεστιακό μικροσκόπιο (Olympus America Inc., Melville, ΝΥ). Οι αλληλουχίες DNA καθορίστηκαν με το Εργαστήριο Genome Sequencing Υπηρεσιών στο Πανεπιστήμιο της Φλόριντα με τη χρήση 454 αλληλουχίας (Roche).

Κυτταρική καλλιέργεια και ρυθμιστικά

Ο CaOV-3, HeLa, Hs832 κυτταρικές γραμμές (C) Τ και TOV-21G όπου ελήφθησαν από την American Type Cell Culture (ATCC). Το κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών TOV-21G CaOV-3 και όταν διατηρούνται σε καλλιέργεια με MCBD 105: Medium 199 (1:01)? η κυτταρική γραμμή HeLa καλλιεργήθηκε σε RPMI-1640? και ο Hs832 κυτταρική γραμμή (C) T καλλιεργήθηκε σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM). Όλα τα μέσα όπου συμπληρωμένο με 10% FBS και 100 UI /ml πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης. Άλλες κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται για δοκιμασίες επιλεκτικότητας συμπεριλαμβάνονται CEM (λευχαιμία Τ κυττάρων), Ramos (λέμφωμα Burkitt), HCT-116, DLD-1, ΗΤ-29 (ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα), NCI_H23 (μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα) και Α172 (γλοιοβλαστώματος ), όλα εκ των οποίων καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τις προδιαγραφές ATCC. Όλες οι κυτταρικές σειρές όπου επωάζονται στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα.

Κατά τη διάρκεια της επιλογής, τα κύτταρα πλύθηκαν πριν και μετά την επώαση με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (WB), το οποίο περιέχει 4,5 g /L γλυκόζη και 5 mM MgCl

2 σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό ϋυΐββοοο με χλωριούχο ασβέστιο και χλωριούχο μαγνήσιο (Sigma). ρυθμιστικό σύνδεσης (ΒΒ) που χρησιμοποιούνται για την επιλογή παρασκευάστηκε με προσθήκη tRNA ζυμομυκήτων (0,1 mg /mL) (Sigma) και BSA (1 mg /mL) (Fisher) εις το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης για τη μείωση δέσμευση υποβάθρου.

SELEX βιβλιοθήκη και αστάρια

Η HPLC-καθαρίζεται βιβλιοθήκη περιείχε ένα τμήμα τυχαία ακολουθία 40 νουκλεοτιδίων (nt) περιστοιχίζεται από θέσεις υβριδισμού εκκινητή 20-nt:

(5′-ATC CAG ΑΟΤ GAC GCA GCA (Ν)

40 ΤΟΟ ACA CGG ΤΟΟ CTT AGT-3 ‘) και (5’-ACT ACC AAC GAG CGA CCA CT (Ν)

40 AGA Γ.Ο.Σ. CAG GAG AGG CAG GT-3′). Τα εμπρός εκκινητές σημάνθηκαν με 5′-FITC και τα αντίστροφα εναύσματα σημάνθηκαν με 5′-βιοτίνη.

In Vitro κύτταρο-SELEX

Σε αυτή τη μελέτη, TOV-21G χρησιμοποιήθηκε ως ο στοχεύουν κυτταρική γραμμή και HeLa χρησιμοποιήθηκε για αντι-επιλογή. Για τον πρώτο γύρο, τα κύτταρα επωάστηκαν με 20 pmol παρθένα βιβλιοθήκη ssDNA διαλύθηκε σε ΒΒ. Για γύρους αργότερα, 50 pmol εμπλουτισμένου πισίνα χρησιμοποιήθηκαν για την επώαση, επίσης, διαλυμένο σε ΒΒ. Πριν από την επώαση, η πισίνα ssDNA μετουσιώθηκε με θέρμανση στους 95 ° C για 5 λεπτά και ψύχθηκε ταχέως επί πάγου για 5 λεπτά, επιτρέποντας σε κάθε αλληλουχία για να σχηματίσει την πιο σταθερή δευτερογενή δομή.

Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές ( 2 λεπτά) με WB και επωάζονται με το DNA πισίνα σε πάγο σε ένα τροχιακό ανακινητή για 30 λεπτά. Σε επόμενους γύρους επιλογής, τα κύτταρα πλύθηκαν με αυξημένη αυστηρότητα για την απομάκρυνση ασθενώς δεσμευτικός αλληλουχίες (μεγαλύτερο αριθμό πλύσεων και αυξημένο χρόνο πλύση, μέχρι 5 λεπτά). Τα δεσμευμένα αλληλουχίες εκλούστηκαν σε 500 μL ΒΒ με θέρμανση στους 95 ° C για 15 λεπτά, ψύχθηκε σε πάγο για 5 λεπτά και φυγοκεντρήθηκε στις 14.000 rpm για 2 λεπτά.

Το υπερκείμενο που περιέχει τις αλληλουχίες του DNA επωάστηκε στη συνέχεια με μία αρνητική κυτταρική γραμμή για να εκτελέσει μια αφαίρεση του γενικού αλληλουχιών, όπως περιγράφεται παραπάνω. Οι υπόλοιπες αλληλουχίες ενισχύθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας το FITC- και επισημασμένο με βιοτίνη εκκινητές. Πολλαπλασιασμοί διεξήχθηκαν στους 95 ° C για 30 s, 60 ° C για 30 s, και 72 ° C για 30 s, που ακολουθείται από τελική επέκταση επί 3 λεπτά στους 72 ° C. Το επιλεγμένο αίσθηση ssDNA διαχωρίστηκε από το βιοτινυλιωμένο αντινόημα ssDNA με σφαιρίδια sepharose επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη (Amersham Bioscience). Το ssDNA εκλούσθηκε από τα σφαιρίδια sepharose με τήξη σε ένα διάλυμα 0,2Μ NaOH.

Ο εμπλουτισμός των ειδικών αλληλουχιών αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής, όπως εξηγείται παρακάτω. Όταν το επίπεδο εμπλουτισμού φτάσει σε ένα οροπέδιο, πισίνες ενδιαφέροντος υποβλήθηκαν για αλληλούχιση. Η επιλογή απταμερές για το Caov3 κυτταρική γραμμή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο, ωστόσο ένα βήμα θρυψινοποίηση 1 λεπτό ήταν χρησιμοποιηθούν για να αναστείλουν τα κύτταρα πριν από την προσθήκη στις πισίνες. Συμπληρωματικά στοιχεία S1 και S2 περιέχουν τα clustal δεδομένων των ευθυγραμμίσεις της κάθε επιλογής (τελική πισίνα)

μελέτες Affinity:. Ροή κυτοφθορομετρική ανάλυσης για τον προσδιορισμό της συγγένειας δέσμευσης

Για να προσδιορίσετε τις συγγένειες δέσμευσης οι απταμερή, τα κύτταρα-στόχοι (5 × 10

5) επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις του 5′-βιοτίνη επισημασμένο απταμερή σε πάγο για 20 λεπτά σε 100 μL του ΒΒ. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με 500 μι ΒΒ, και αιωρήθηκε σε 100 μι ΒΒ που περιέχει στρεπταβιδίνη-ΡΕ-Cy5.5. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με 500 μι WB, και εναιωρήθηκαν σε 200 μL του ΒΒ για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, χρησιμοποιώντας ένα 5′-βιοτίνη επισημασμένο τυχαία ακολουθία ως αρνητικός έλεγχος. Όλα τα πειράματα για δοκιμασίες σύνδεσης επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 2 φορές. Η ειδική ένταση πρόσδεσης υπολογίστηκε με αφαίρεση της μέσης έντασης φθορισμού της πρόσδεσης από το μέση ένταση φθορισμού των απταμερών φόντο. Η σταθερά διάστασης ισορροπίας (Κ

δ) του φθορίζοντος συνδέτη ελήφθη δια προσαρμογής ενός οικοπέδου της συγκεκριμένης έντασης πρόσδεσης έναντι (Y) η συγκέντρωση απταμερούς (Χ) με την εξίσωση Y = B

MAXX /(Κ

δ + Χ) χρησιμοποιώντας SigmaPlot. (Jandel, San Rafael, CA). Συμπληρωματικό S3 δεδομένων περιέχει τα δεδομένα ροής για όλα τα πειράματα που παρουσιάζονται σε αυτό το άρθρο.

εκλεκτικότητα και ειδικότητα

Για να προσδιοριστεί η κυτταρική εξειδίκευση των επιλεγμένων απταμερών, κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων των HeLa, Κ562, Η23, Η69 , Α172, HL-60. ΗΤ-29, Ramos και CEM χρησιμοποιήθηκαν σε δοκιμασίες πρόσδεσης με κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφεται παραπάνω.

Επίδραση της θερμοκρασίας στην απταμερούς δεσμευτικός

Η διαδικασία επιλογής απταμερές και όλα τα δοκιμασίες πρόσδεσης διεξήχθησαν σε πάγος. Έχει παρατηρηθεί ότι ορισμένα από τα απταμερών επιλεγμένων σε χαμηλότερες θερμοκρασίες δεν μπορεί να δεσμεύεται καλά στους 37 ° C [26], που οδηγεί σε κακή απόδοση υπό φυσιολογικές συνθήκες. Προκειμένου να εξακριβωθεί η σταθερότητα δέσμευσης, απταμερή επωάστηκαν με τον στόχο στους 37 ° C, και η ένταση του φθορισμού προσδιορίσθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα απταμερή επωάστηκαν σε πάγο χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος.

πέψη πρωτεάσης δοκιμασία

Τα κύτταρα-στόχοι (5 × 10

5) αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας μη-ενζυματική λύση διαστάσεως κυττάρων. Μετά την επαναιώρηση, τα κύτταρα πλύθηκαν με 3 ml PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με 1 κ.εκ. 0.05% θρυψίνη /0,53 mM EDTA σε HBSS ή 0,1 mg /ml πρωτεϊνάση Κ σε PBS στους 37 ° C για 1, 5, 15, 30 και 60 λεπτά. Καθαρό FBS προστέθηκε για την απόσβεση των πρωτεϊνασών. Μετά από πλύση με 2 ml ΒΒ, τα επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασίες σύνδεσης όπως περιγράφεται παραπάνω.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Data S1.

allignment του τελικού πισίνα TOV

doi:. 10.1371 /journal.pone.0013770.s001

(1,13 MB TXT)

δεδομένων S2.

allignment του τελικού πισίνα Caov3

doi:. 10.1371 /journal.pone.0013770.s002

(0,20 MB TXT)

δεδομένων S3.

Αυτό το αρχείο περιέχει τα δεδομένα της ροής από τα στοιχεία που παρουσιάζονται σε αυτό το άρθρο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0013770.s003

(3,69 MB ZIP)

δεδομένων S4.

Υπόμνημα με το ποσό της πλεονεκτήματα. Το ποσοστό αυτό ήταν κατευθυντήρια γραμμή μας για να καθορίσει το ποσό της συν για τον πίνακα 3.

doi: 10.1371 /journal.pone.0013770.s004

(0,04 MB PDF)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ. Parag Parekh και Tahir Bayrac για τις πολλές χρήσιμες επιστημονικές συζητήσεις που συνέβαλαν σε αυτή την εργασία, κος Γιώργος Ansoaunoor για τεχνική βοήθεια. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω τον Δρ Kathryn Williams για την κριτική εξέταση της του χειρογράφου. Ευχαριστούμε τον πυρήνα της αλληλουχίας του DNA, ICBR, στο Πανεπιστήμιο της Φλόριντα.