Αφηρημένο

Ο όγκος που προέρχεται από μονοκλωνικό αντίσωμα IgM PAT-SM6 σκοτώνει συγκεκριμένα κακοήθη κύτταρα από ένα αποπτωτικό μηχανισμό που συνδέονται με την υπερβολική πρόσληψη των λιπιδίων του πλάσματος. Ο μηχανισμός υποτίθεται να συμβεί μέσω της προσάρτησης πολλαπλών σημείων του PAT-SM6 στην ξεδιπλωμένη πρωτεΐνη ρυθμιστή απόκρισης GRP78, που βρίσκεται στην επιφάνεια των κυττάρων του όγκου, σε συνδυασμό με την ταυτόχρονη σύνδεση του πλάσματος λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας (LDL). Εμείς παρασκευάστηκε και χαρακτηρίστηκε LDL και οξειδωμένης LDL με χρήση ταχύτητας καθίζησης και ανάλυση μικρής γωνίας σκέδαση ακτινών Χ (SAXS). Ενζυματικής ανοσοαπορρόφησης (ELISA) τεχνικές που επισημαίνονται φαινόμενες σταθερές διαστάσεως περίπου 20 ηΜ για την πρόσδεση του LDL ή οξειδωμένης LDL να Pat-SM6. πειράματα ELISA έδειξαν διασταυρούμενη ανταγωνισμό με την αναστολή της δέσμευσης σε ακινητοποιημένη GRP78 PAT-SM6 LDL, ενώ, κατά την αντίστροφη πείραμα, GRP78 ανέστειλε σύνδεση προς ακινητοποιημένο LDL PAT-SM6. Σε αντίθεση με τα αποτελέσματα των πειραμάτων ELISA, τα πειράματα ταχύτητας καθίζησης που αναφέρεται σχετικά ασθενής αλληλεπίδραση μεταξύ LDL και PAT-SM6, προτείνοντας immunoabsorbance στην πλάκα μικροτιτλοδότησης οδηγείται από έναν μηχανισμό πρόσδεσης απληστία που βασίζεται. Η σημασία της απληστία και η προσκόλληση multipoint αντιγόνων PAT-SM6 ερευνήθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας σφαιρίδια πολυστυρενίου επικαλυμμένα με αντιγόνο. Απορρόφηση GRP78 ή LDL σε μικροσφαιρίδια πολυστυρολίου οδήγησε σε αύξηση στην αναστολή της δέσμευσης PAT-SM6 σε πλάκες μικροτιτλοδότησης επικαλυμμένες με GRP78 ή LDL, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η βιολογική δράση του PAT-SM6 σε απόπτωση των καρκινικών κυττάρων εξαρτάται από τη φύση του πολυσθενούς PAT-SM6 και την ικανότητα να αλληλεπιδρούν ταυτόχρονα με την LDL και πολλαπλά μόρια GRP78 συγκεντρωμένα στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων.

Παράθεση: Rosenes Ζ, Mok YF, Yang S, Griffin GMD, Mulhern TD, Hatters DM, et al. (2013) ταυτόχρονη σύνδεση του Αντικαρκινικού IgM μονοκλωνικό αντίσωμα PAT-SM6 έως χαμηλή πυκνότητας λιποπρωτεΐνες και GRP78. PLoS ONE 8 (4): e61239. doi: 10.1371 /journal.pone.0061239

Επιμέλεια: Gunnar F. Kaufmann, Το Ερευνητικό Ινστιτούτο Scripps και το Sorrento Therapeutics, Inc., Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Γενάρη 2013? Αποδεκτές: 6, Μαρτίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 19 Απρ., 2013

Copyright: © 2013 Rosenes et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση ARC σύνδεση (LP100100392) και από Patrys Ltd, μια εταιρεία που διεξάγει επί του παρόντος κλινικές δοκιμές PAT-SM6 ως δυνητική αντικαρκινική θεραπεία. FH είναι ο διευθύνων σύμβουλος της Patrys, GmbH. Το αντίσωμα PAT-SM6 είναι ιδιοκτησία της Patrys Limited και η εταιρεία συμφωνεί να κάνουν για να κάνουν ελεύθερα διαθέσιμο οποιοδήποτε υλικό και πληροφορίες που περιγράφονται στη δημοσίευση τους, που μπορεί ευλόγως να ζητηθεί για τους σκοπούς της ακαδημαϊκής, μη εμπορική έρευνα. Λόγω της ιδιωτικής φύσης των κομμάτων αντίσωμα θα χρειαστεί να συνάψει συμφωνία μεταφοράς υλικού. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Το έργο υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση ARC σύνδεση (LP100100392) και από Patrys Ltd, μια εταιρεία που διεξάγει επί του παρόντος κλινικές δοκιμές PAT-SM6 ως δυνητική αντικαρκινική θεραπεία. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. FH είναι ο διευθύνων σύμβουλος της Patrys, GmbH. Το αντίσωμα PAT-SM6 είναι ιδιοκτησία της Patrys Limited και η εταιρεία συμφωνεί να κάνουν για να κάνουν ελεύθερα διαθέσιμο οποιοδήποτε υλικό και πληροφορίες που περιγράφονται στη δημοσίευση τους, που μπορεί ευλόγως να ζητηθεί για τους σκοπούς της ακαδημαϊκής, μη εμπορική έρευνα. Λόγω της ιδιωτικής φύσης των κομμάτων αντίσωμα θα χρειαστεί να συνάψει συμφωνία μεταφοράς υλικού.

Εισαγωγή

Το ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα IgM, PAT-SM6, που προέρχονται από ιστούς ανθρώπινου όγκου [1] , είναι ένας πιθανός αντικαρκινικός παράγοντας ικανό να επάγει απόπτωση των κυττάρων του όγκου σε προ-κλινικά μοντέλα ανθρώπινου καρκίνου [2]. Ενώ ο ακριβής μηχανισμός της PAT-SM6 θάνατος που επάγεται κυττάρων δεν είναι γνωστή, η μέθοδος αυτή συνοδεύεται από ενδοκυτταρική συσσώρευση λιπιδίων που οδηγεί στην υπόθεση ότι PAT-SM6 διευκολύνει την πρόσληψη των λιπιδίων του πλάσματος. Συνεπής με αυτή την πρόταση είναι η παρατήρηση ότι και οι δύο λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (LDL) και της οξειδωμένης LDL αλληλεπιδρούν με PAT-SM6 και να ενισχύσει PAT-SM6 επαγόμενη απόπτωση [2]. PAT-SM6 συνδέεται επίσης με τον ξεδιπλωμένη πρωτεΐνη ρυθμιστή απόκρισης GRP78, το οποίο υπερεκφράζεται εξωτερικά στην κυτταρική επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων [3]. GRP78, επίσης γνωστό ως (πρωτεΐνη πρόσδεσης βαρείας αλυσίδας ανοσοσφαιρίνης) ΒίΡ, είναι ένα μέλος της πρωτεΐνης θερμικού σοκ 70 (HSP70) οικογένεια που αποτρέπει την επαγόμενη από στρες απόπτωση. Enzyme-linked immunosorbent δοκιμασίες (ELISA), χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις επικάλυψης GRP78, έχουν δημιουργήσει προηγουμένως αλληλεπίδραση υψηλής συνάφειας μεταξύ PAT-SM6 και GRP78 διαμεσολαβείται από την πρόσδεση πολλαπλών σημείων του PAT-SM6 να GRP78 συγκεντρωμένα στην επιφάνεια του δίσκου μικροτίτλου [4]. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η απληστία των αλληλεπιδράσεων των PAT-SM6 με την LDL και την οξειδωμένη LDL και την ανταγωνιστική φύση της δέσμευσης της LDL και GRP78 να PAT-SM6. Ο ρόλος των πολλαπλό σθένος στις αλληλεπιδράσεις του PAT-SM6 με αντιγόνα στόχους διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας σφαιρίδια πολυστυρενίου επικαλυμμένα με αντιγόνο. Τα αποτελέσματα αποδεικνύουν τη σημασία της ομαδοποίησης αντιγόνου στη διαμόρφωση των υψηλών ζωηρότητες που χαρακτηρίζουν τις αλληλεπιδράσεις αντιγόνου PAT-SM6. Η ικανότητα των PAT-SM6 να δεσμεύει τόσο GRP78 και LDL είναι συνεπής με την πρόταση ότι PAT-SM6 θανατώνει κύτταρα παρέχοντας περίσσεια λιπιδίου, με τη μορφή της LDL σε όγκους με σύνδεση ταυτόχρονα σε GRP78 παρόντα στην επιφάνεια των κυττάρων του όγκου [2].

Πειραματικές Διαδικασίες

Υλικά |

Το ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα PAT-SM6 εκφράστηκαν και καθαρίστηκαν από σταθερές καλλιέργειες εναιωρήματος μιας ανθρώπινης κυτταρικής σειράς σε μέσα άνευ ορού [5], [6]. ισοτυπικού ελέγχου IgM λήφθηκε από Jackson ImmunoResearch Labs, inc, West Grove, ΡΑ. PAT-SM6 σημάνθηκε με φλουορεσκεΐνης χρησιμοποιώντας ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (Sigma-Aldrich) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ώριμη ανθρώπινη GRP78 που περιέχει ένα Ο-τερματικό 6 × His-tag εκφράστηκε και καθαρίστηκε από το

E. coli

όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4].

Ηθική Δήλωση

Φρέσκα δείγματα ανθρώπινου αίματος ελήφθησαν από Νοσοκομείο Σεντ Βίνσεντ χρησιμοποιώντας πρωτόκολλα εγκεκριμένα από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Αγίου Βικεντίου Νοσοκομείο Μελβούρνης Ανθρωπίνων Έρευνας . Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση από τους συμμετέχοντες λήφθηκε για το αρχικό ανθρώπινο έργο που παρήγαγαν τα δείγματα αίματος για την απομόνωση της LDL. Η LDL απομονώθηκε με πυκνότητα κλασμάτωση παρασκευαστική υπερφυγοκέντρηση χρησιμοποιώντας KBr [7]. Η οξειδωμένη LDL παρασκευάστηκε με την προσθήκη 20 μΜ CuSO

4 σε 200 μ§ /κ.εκ LDL και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 16 ώρες [8]. Οξείδωση παρακολουθήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 234 nm και με θειοφλαβίνης Τ φθορισμού (ThT). ThT προστέθηκε σε LDL σε μία τελική συγκέντρωση 8 μΜ και ο φθορισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα

f

max

platereader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) εξοπλισμένο με φίλτρα 444/485 nm διέγερση /εκπομπή. Οξείδωση σταμάτησε με την προσθήκη ΕϋΤΑ προς τελική συγκέντρωση 1 mM. LDL και οξειδωμένης LDL διυλίσθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα άλατος με φωσφορικό (PBS? 20 mM φωσφορικό νάτριο, 150 mM NaCl, ρΗ 7,4) που περιέχει 1 mM EDTA και 0.1% NaN

3 και αποθηκεύεται στους 4 ° C. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης των LDL προσδιορίσθηκε από την απορρόφηση στα 280 nm διορθωμένο για σκέδαση φωτός [9] και χρησιμοποιώντας ένα συντελεστή απόσβεσης των 844 cm

2 /g εκτιμάται από την σύνθεση αμινοξέων της απολιποπρωτεΐνης Β η μοριακή συγκέντρωση της LDL ήταν υπολογίζονται θεωρώντας μια τιμή 2,2 × 10

6 για το μέσο μοριακό βάρος της ανθρώπινης LDL [10].

μικρής γωνίας ακτίνων Χ (SAXS)

Synchrotron SAXS με ενσωματωμένο χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (SEC-SAXS) της LDL και οξειδωμένης LDL πραγματοποιήθηκε στο beamline Αυστραλίας Synchrotron SAXS /WAXS. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε SEC επί στήλης με μέγεθος πόρων 500 Α (WTC-050N5, Wyatt Technology, Santa Barbara, CA), δίνοντας μια αποτελεσματική πρωτεΐνη MW εύρος διαχωρισμού των 15.000 έως 5.000.000 Da. Η στήλη εξισορροπήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει PBS σε ρυθμό ροής 0,4 κ.εκ. /λεπτό. Οι ενέσεις ήταν 20 μL με συγκέντρωση πρωτεΐνης 3 mg /ml. Το μέγεθος δέσμης στο δείγμα ήταν 250 μm οριζόντια × 150 μm κάθετη (FWHM). εικόνες ανιχνευτή Pilatus 1Μ αναλύθηκαν ως μέσοι όροι των δέκα διαδοχικών 2 s ανοιγμάτων και μετατρέπεται σε ατομική

I

(

q

) προφίλ SAXS χρησιμοποιώντας το λογισμικό Scatterbrain (Australian Synchrotron).

I

(

q

) είναι η σκεδαζόμενη ένταση ακτίνων Χ ως συνάρτηση του μεγέθους του φορέα μεταφοράς ορμής

q

= (4πsinθ) /λ, όπου ο γωνίας σκέδασης είναι 2θ και το μήκος κύματος ακτίνων Χ είναι λ (1,12713 Α). Τα δεδομένα συλλέχθηκαν στους 298 Κ χρησιμοποιώντας ένα μήκος κάμερα των 3,3 m, το οποίο επέτρεψε εντάσεις που πρέπει να συγκεντρωθούν σε ένα

q-

φάσμα 0,00429 έως 0,24575 Α

-1. προφίλ SAXS αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το ΑΤΣΑΣ (έκδοση 2.4) σουίτα προγραμμάτων [11].

Καθίζηση Velocity Ανάλυση

πειράματα ταχύτητα καθίζησης χρησιμοποιώντας οπτική απορρόφηση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα αναλυτικό υπερφυγόκεντρο XL-I (Beckman Coulter, Fullerton, CA) εξοπλισμένο με μια 60-Ti στροφείο στους 20 ° C. Τα δείγματα πρωτεΐνης προστέθηκαν σε ΕΡΟΝ γεμάτο κεντρικά διπλού κλάδου με PBS στο διαμέρισμα αναφοράς. Radial δεδομένων απορρόφησης αποκτήθηκαν σε μία ταχύτητα ρότορα των 28.000 rpm, χρησιμοποιώντας ένα μήκος κύματος 280 nm, και με ακτινικές βήματα των 0,003 cm σε τρόπο συνεχούς σάρωσης. Πειράματα ταχύτητα καθίζησης διεξήχθησαν επίσης χρησιμοποιώντας ένα XL-A αναλυτική υπερφυγόκεντρο εξοπλισμένο με ένα σύστημα ανίχνευσης φθορισμού (FDS? Αβίβ Biomedical) για την παρακολούθηση της καθίζησης των επισημασμένων με φλουορεσκεΐνη PAT-SM6 και KBPA-101. Τα όρια καθιζάνον προσαρμόστηκαν σε ένα μοντέλο υποθέτοντας μια κατανομή των συντελεστών καθίζησης για μη αλληλεπιδρώντων ειδών, C (S), χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα SEDFIT [12]. Τα δεδομένα προσαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας το μέγιστο νομιμοποίησης εντροπίας, ένα P-τιμή του 0,95 και τριβής αναλογία 1.9 [4]. συντελεστές καθίζησης διορθώθηκαν για τις επιδράσεις της LDL για την πυκνότητα του διαλύματος και το ιξώδες, υποθέτοντας τιμές των 0.967 mL /g και 3.4 mL /g για τη μερική ειδικό όγκο και εγγενές ιξώδες της LDL, αντίστοιχα [10].

Ένζυμο Συνδέεται ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA)

αντιγόνα επιστρώθηκαν σε δίσκους μικροτιτλοδότησης των 96 φρεατίων (Nunc Maxisorp) με επώαση όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν 3 φορές σε PBS, 3 φορές σε PBS + 0.1% Tween 20, 3 φορές σε PBS και αποκλείστηκαν με 5% (w /v) BSA σε PBS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια πλένεται και πάλι ως ανωτέρω. Όλα τα παρασκευάσματα αντισώματος έγιναν σε 5% (w /v) BSA σε PBS. Για τις έμμεσες πειράματα ELISA, τα αντισώματα εφαρμόστηκαν απευθείας στην πλάκα και επωάστηκαν για 1 ώρα. Για ανταγωνιστική ELISAs, τα αντισώματα επωάστηκαν σε διάλυμα με διάφορες ποσότητες αντιγόνου πριν από την εφαρμογή στο πλακίδιο μικροτιτλοδότησης. Μετά από πλύσιμο και πάλι όπως παραπάνω, peroxidise-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο IgM δευτερεύον αντίσωμα (Dako) εφαρμόστηκε στην πλάκα και επωάστηκαν για 1 ώρα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από μία τελική πλύση, η δέσμευση του αντισώματος καθορίστηκε χρησιμοποιώντας 100 μL ανά φρεάτιο 3,3 ‘, διάλυμα υποστρώματος 5,5’-τετραμεθυλοβενζιδίνη (Sigma) και μετρώντας την αλλαγή χρώματος στα 655 nm. Η χρονική πορεία για την ανάπτυξη χρώματος ήταν ουσιαστικά γραμμική στην περιοχή οπτική πυκνότητα 0-3. Οι μετρήσεις ελήφθησαν 15 λεπτά μετά την προσθήκη του υποστρώματος. Σε πειράματα ελέγχου, που περιλαμβάνουν απευθείας επίστρωση των πλακών με PAT-SM6, στο εύρος συγκέντρωσης /mL, παρατηρήθηκε 0-2,5 μg συστηματική αύξηση του σήματος ELISA με αυξημένη συγκέντρωση επίστρωσης, πράγμα που συνεπάγεται μια άμεση συσχέτιση μεταξύ του σήματος ELISA και η ποσότητα του αντισώματος που συνδέεται με την πλάκα. δεδομένα ELISA για την τιτλοδότηση του πρωτογενούς αντισώματος που συνδέεται προς ακινητοποιημένο LDL αναλύθηκε υποθέτοντας μια απλή ισόθερμο δέσμευσης Langmuir που περιγράφεται από τη σχέση Υ = K

α /(1-K

α) όπου το Υ είναι το μέγεθος του σήματος ELISA και Κ

a είναι η φαινόμενη σταθερά δέσμευσης, υποθέτοντας μια ενιαία κατηγορία των θέσεων δέσμευσης.

αντιγόνου-επίχρισμα πολυστερίνη μικροσφαιρίδια

οι αναρτήσεις του 1 μm μικροσφαιρίδια διαμέτρου από πολυστυρένιο (Polysciences, Inc) σε συγκέντρωση 2,5% (w /v) πλύθηκαν με επαναλαμβανόμενη σύμπηξη (χ 3) σε μία μικροφυγόκεντρο και επαναιώρηση σε PBS, PBS-0.1% Tween 20, και στη συνέχεια μια τελική φορά με PBS. Τα πλυμένα μικροσφαιρία στη συνέχεια σφαιροποιήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 2 mg /ml αντιγόνου (LDL ή GRP78) ή 5% (w /v) BSA (διάλυμα αποκλεισμού) σε μια τελική συγκέντρωση μικροσφαίρας του 2,5% (w /v). Σωλήνες του μίγματος μικροσφαιρίων /αντιγόνου επωάστηκαν για μια νύχτα σε μια περιστρεφόμενη πλατφόρμα σε 4 ° C. Για να προσδιοριστεί ο βαθμός δέσμευσης αντιγόνου, τα μικροσφαιρίδια σφαιροποιήθηκαν, και η απορρόφηση στο υπερκείμενο μετρήθηκε στα 280 nm και συγκρίνεται με την απορρόφηση του αρχικού διαλύματος αντιγόνου. Τα επικαλυμμένα μικροσφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν όπως παραπάνω και στη συνέχεια δεσμεύτηκαν χρησιμοποιώντας 5% BSA και αποθηκεύτηκαν σε 4 ° C μέχρι να είναι έτοιμο για χρήση.

Αποτελέσματα

Η οξείδωση της LDL

Ο Cu

2+ επαγόμενη οξείδωση της LDL παρακολουθήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης φωτός στα 234 nm (Σχήμα 1Α). Η αύξηση της απορρόφησης στα 234 nm προσεγγίζει ένα μέγιστο μετά από 24 ώρες και μπορεί να αποδοθεί στο σχηματισμό συζυγιακών διενίων [13]. οξείδωση της LDL παρακολουθήθηκε επίσης με συνεχή ThT δοκιμασία [8]. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ThT φθορισμού LDL επωάζεται με 20 mM θειικό χαλκό

4 αυξήσεις κατά την ίδια χρονική περίοδο φτάνοντας σε ένα οροπέδιο μετά από 16 ώρες χωρίς αντίστοιχες αλλαγές που παρατηρούνται για επωάσεις έλεγχο της LDL ή ThT μόνο. Περαιτέρω χαρακτηρισμός της οξειδωμένης LDL πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση ταχύτητας καθίζησης. διανομές συντελεστής καθίζησης (Σχήμα 1C) έδειξε μία μοναδική συμμετρική κορυφή για την LDL με μια τροπική συντελεστή καθίζησης των περίπου 4,5 S, ενώ η διανομή λαμβάνεται για την οξειδωμένη LDL ήταν διπλής μορφής με την κύρια κορυφή καθιζάνουν με τροπική συντελεστή καθίζησης περίπου 8 S. Αυτή η αύξηση στην ταχύτητα καθίζησης οφείλεται σε μεταβολή στην πυκνότητα των σωματιδίων οφείλεται σε σημαντική απώλεια των λιπιδίων μετά από οξείδωση [8].

(Α) μεταβολή στην απορρόφηση στα 234 nm ως συνάρτηση του χρόνου επώασης. (Β) Χρονική πορεία για τη μεταβολή ThT φθορισμού της LDL (συνεχής γραμμή), της LDL επωάστηκε με 20 mM θειικό χαλκό

4 (διακεκομμένη γραμμή) ή PBS μόνο (διακεκομμένη γραμμή). (Γ) Καθίζηση διανομή συντελεστή που προκύπτει από την ανάλυση της ταχύτητας καθίζησης των LDL (διακεκομμένη γραμμή) και της οξειδωμένης LDL (συνεχής γραμμή).

Η

μικρής γωνίας Σκέδαση ακτίνων Χ (SAXS) Ανάλυση της LDL και οξειδώνεται LDL

ανάλυση SAXS έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς για το χαρακτηρισμό της LDL και Cu

2 + κατεργασμένα οξειδωμένη LDL [14], [15], [16]. Αυτή η τεχνική παρέχει πληροφορίες σχετικά με το συνολικό μέγεθος και σχήμα των σωματιδίων λιποπρωτεϊνης από παραμέτρους όπως η ακτίνα περιστροφής (

R

ζ) και η μέγιστη διάσταση (

D

max), καθώς και πληροφορίες σχετικά με την εσωτερική δομή των σωματιδίων από τη λειτουργία ζεύγους διανομής απόσταση

P

(

r

). Εδώ, LDL και οξειδωμένη LDL υποβλήθηκαν σε synchrotron χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους SAXS (SEC-SAXS) [4]. Η μέθοδος αυτή βελτιώνει την ποιότητα των δεδομένων SAXS με την παράδοση το μέγεθος κλασματοποιήθηκε το δείγμα απευθείας την ακτίνα, και έτσι το διαχωρισμό της σκέδασης από το σωματίδιο του ενδιαφέροντος από ότι τυχόν αδρανή υλικά, αλλά παρέχει επίσης ένα σχεδόν τέλειο ταίρι ρυθμιστικό για την αφαίρεση της μείωσης δεδομένων διαδικασία.

Η έκλουση της LDL και οξειδωμένης LDL από τη στήλη παρακολουθήθηκε με απορρόφηση στα 280 nm και η ένταση SAXS στο μηδέν γωνίας (

I

(0)) σαν μία συνάρτηση του όγκου. Τα προφίλ SAXS των ειδών κορυφής που φαίνεται στο Σχήμα 2Α. Για κάθε είδος,

R

g υπολογίστηκε από την κλίση των αντίστοιχων οικοπέδων Guinier τους (ln [

I

(

q

)] έναντι

q

2) (Εικόνα 2Β). Για LDL η πλοκή Guinier ήταν γραμμική πάνω από ένα

q

.

R

g εύρος 0,8 έως 2,4, δίνοντας ένα

R

g αξίας 134 ± 1 Å. Η

R

g του είδους αιχμής LDL μετράται εδώ είναι σε καλή συμφωνία με τη δημοσιευμένη μέση τιμή των 139 Α από την περιοχή 121-160 Α παρατηρήθηκε για 17 σκευάσματα LDL από 12 δότες [16]. Για οξειδωμένη LDL η πλοκή Guinier ήταν γραμμική πάνω από ένα

q

.

R

g φάσμα 0,8-1,6 δίνοντας μια

R

g αξίας 112 ± 3 Α. Προηγούμενες μελέτες με ακτίνες Χ και σκέδασης νετρονίων της οξείδωσης της LDL χρησιμοποιηθούν στατικά δείγματα, η οποία έδειξε εξαρτώμενη από τον χρόνο και [Cu

2 +] – εξαρτώμενη αυξήσεις στη φαινομενική

R

g, μέχρι ~160 Α, λόγω του σχηματισμού συσσωματωμάτων [16], [17]. Η SEC-SAXS προέρχεται

R

g αξία αναφερθεί εδώ είναι η πρώτη μέτρηση για τις απομονωμένες οξειδωμένη LDL σωματίδια απουσία αδρανών υλικών. Για το προφίλ κάθε SAXS το

P

(

r

) λειτουργία εκτιμήθηκε με έμμεση μετασχηματισμού Fourier (Σχήμα 2C). Η ανάλυση

P

(

r

) έδειξε ότι η LDL και οξειδωμένης LDL είχαν παρόμοια

D

max τιμές των -250 Α, η οποία είναι συνεπής με τις προηγούμενες μετρήσεις [ ,,,0],16]. Η ανάλυση

R

g αξία για την LDL από το

P

(

r

) ήταν 131 ± 2 Α και οξειδωμένη LDL ήταν 109 ± 3 Α, η οποία είναι σε καλή συμφωνία με τις τιμές από τη Guinier αναλύσεις. Cu

2 + μεσολάβηση οξείδωση προκαλεί χαρακτηριστικές αλλαγές στην εσωτερική οργάνωση του σωματιδίου LDL, με έχει αποδοθεί σε απώλεια διέταξε εστέρα χοληστερόλης και τη δομή triacyglycerol [16].

P

(

r

) ανάλυση είναι διαγνωστική αυτής της αλλαγής, όπως η καμπύλη

P

(

r

) της LDL παρουσιάζει ισχυρή αρνητική κορυφή στα

r

= 135 Α, η οποία έχει χαθεί εντελώς κατά την οξείδωση (Σχήμα 2C). Έχει προταθεί ότι αυτή η αρνητική κορυφή οφείλεται στην αρνητική αντίθεση των παραγγελθέντων αλυσίδες υδρογονάνθρακα στην εξωτερική μονοστιβάδα της LDL, τα οποία έχουν χαμηλότερη πυκνότητα ηλεκτρονίων από τον περιβάλλοντα διαλύτη. Η οξείδωση πιστεύεται ότι έχει ως αποτέλεσμα την προσθήκη οξυγόνου στο ακόρεστο ακυλο αλυσίδες, καθιστώντας τα πιο πυκνά ηλεκτρόνια από το νερό και σαν αποτέλεσμα θετικής αντίθεσης [16], [17].

A. Τα δεδομένα SAXS δείχνονται ως μέση ένταση

I

(

q

) ± 1 τυπική απόκλιση, ως συνάρτηση της μεταφοράς ορμής

q

για LDL (συμπαγείς κύκλοι) και οξειδώνεται LDL (ανοικτοί κύκλοι). (Β) Guinier οικόπεδα των δεδομένων SAXS σε χαμηλές

q

για LDL (συμπαγείς κύκλοι) και η οξειδωμένη LDL (ανοιχτοί κύκλοι). Η κατώτερη και ανώτερη

q

.

R

g όρια για την Guinier αναλύσεις υποδεικνύονται. Λειτουργία (Γ) Ζεύγος διανομή απόσταση

P

(

r

) ως συνάρτηση της ακτινικής απόστασης

r

για LDL (μαύροι κύκλοι) και της οξειδωμένης LDL (ανοιχτοί κύκλοι).

Η

Enzyme-ανοσοαπορρόφησης Αναλύσεις του PAT-SM6 Αλληλεπιδράσεις με LDL και οξειδωμένη LDL

διεξήχθησαν πειράματα ELISA χρησιμοποιώντας ένα εύρος συγκεντρώσεων και πλάκες PAT-SM6 επικαλυμμένα με διαφορετικές συγκεντρώσεις είτε LDL ή οξειδωμένη LDL (Σχήμα 3). Τα αποτελέσματα δείχνουν μια συστηματική αύξηση του σήματος ELISA ως συνάρτηση της συγκέντρωσης PAT-SM6 με πιο εκτεταμένη δέσμευση που παρατηρείται σε υψηλότερες συγκεντρώσεις επίστρωσης αντιγόνου. Τα δεδομένα προσαρμόστηκαν σε μία απλή ισόθερμου δέσμευσης Langmuir για να ληφθούν οι φαινομενικές σταθερές σύνδεσης (Κ

α) ως συνάρτηση της συγκέντρωσης επικάλυψης LDL (Σχήμα 3C). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αλληλεπίδραση του PAT-SM6 με LDL ή οξειδωμένη LDL είναι παρόμοια και σχετικά ανεξάρτητη από τις συγκεντρώσεις επίστρωσης με φαινόμενη Κ

A τιμές περίπου 50 μΜ

-1, που αντιστοιχούν σε σταθερές διάστασης 20 ηΜ. Αυτές οι τιμές δείχνουν ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ PAT-SM6 και LDL είναι ασθενέστερη από την αλληλεπίδραση μεταξύ PAT-SM6 και GRP78, όπου μελέτες ELISA έδωσε φαινόμενες σταθερές διαστάσεως περίπου 4 ηΜ [4].

Οι ανιχνεύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ( Α) LDL ή (Β) της οξειδωμένης LDL σε συγκεντρώσεις επικάλυψης 0 μg /mL (ανοικτοί κύκλοι), 1 μg /mL (κλειστά τρίγωνα), 2 μg /mL (ανοικτά διαμάντια), 3 μg /mL (κλειστά τετράγωνα), 4 μg /mL (ανοίξτε ανεστραμμένα τρίγωνα), και 5 μg /mL (κλειστοί κύκλοι). (Γ) Τα δεδομένα προσαρμόστηκαν σε μια απλή ισόθερμου δεσμευτικό για να ληφθεί φαινομενική σταθερές σύνδεσης (Κ

α) ως προς τη δέσμευση PAT-SM6 ως συνάρτηση της συγκέντρωσης επικάλυψης της LDL (ανοικτοί κύκλοι) ή οξειδωμένη LDL (κλειστοί κύκλοι). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν τα διαστήματα εμπιστοσύνης 95% από την τοποθέτηση των δεδομένων ELISA σε μια καμπύλη δέσμευσης Langmuir.

Η

Η ταυτόχρονη σύνδεση της LDL και GRP78 να PAT-SM6

Η ικανότητα της PAT-SM6 να αλληλεπιδρούν ταυτόχρονα με GRP78 και LDL εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ανταγωνισμός πειράματα ELISA. Τα αποτελέσματα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας χαμηλές συγκεντρώσεις επιμετάλλωση του GRP78 ή LDL την πλέον αποτελεσματική αναστολή της PAT-SM6 δέσμευσης με την προσθήκη διαλυτού αντιγόνου. Αποτελέσματα με τη χρήση διαλυτών LDL ως ένας ανταγωνιστής ανέφερε ότι η σημαντική αναστολή της PAT-SM6 σύνδεση παρατηρήθηκε για πλάκες επικαλυμμένες είτε με GRP78 ή LDL. Αντίθετα, τα αποτελέσματα χρησιμοποιώντας GRP78 ως ανταγωνιστή αποκάλυψε σημαντική αναστολή της PAT-SM6 δέσμευση σε ακινητοποιημένο GRP78 ή LDL, επιβεβαιώνοντας την ικανότητα των GRP78 και LDL να ανταγωνίζονται μεταξύ τους για την σύνδεση με PAT-SM6. Μία περαιτέρω παρατήρηση από το Σχήμα 4 είναι ότι οι υψηλότερες συγκεντρώσεις της LDL που απαιτούνται για το ήμισυ της μέγιστης αναστολής, σε σύγκριση με GRP78, συνεπής με την υψηλότερη συγγένεια του GRP78 για PAT-SM6 αποκάλυψε από την άμεση πειράματα ELISA (Σχήμα 3 και [4]).

τα φρέατα επικαλύφθηκαν με 7,5 mg /mL GRP78 (κύκλοι), 7,5 mg /mL LDL (τρίγωνα) ή αφέθηκαν μη επικαλυμμένα (τετράγωνα). PAT-SM6 (5 mg /mL) επωάστηκε με διάφορες συγκεντρώσεις του ανταγωνιστή πριν από την εφαρμογή στο πλακίδιο μικροτιτλοδότησης.

Η

Καθίζηση Velocity Ανάλυση PAT-SM6 και LDL

Τα αποτελέσματα στο σχήμα 3 έδειξε ότι η φαινόμενη Κ

a τιμές για την αλληλεπίδραση του PAT-SM6 με ακινητοποιημένα LDL ή οξειδωμένης LDL ήταν ανεξάρτητη από την συγκέντρωση επίστρωσης αντιγόνου. Τα ευρήματα αυτά έρχονται σε αντίθεση με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με GRP78 [4], όπου η ισχυρή εξάρτηση της PAT-SM6 δεσμευτική για τη συγκέντρωση επικάλυψης των GRP78 λήφθηκε ως αποδεικτικό στοιχείο για την ομαδοποίηση αντιγόνο ως κύριος καθοριστικός παράγοντας της αντοχής των αλληλεπιδράσεων δεσμευτική PAT-SM6. Τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν για την LDL πρότεινε ότι η LDL μπορούν να ομαδοποιούνται στην πλάκα μικροτιτλοδότησης, ακόμη και σε χαμηλές συγκεντρώσεις επιμετάλλωση, ή ότι PAT-SM6 μπορεί να δεσμεύονται άμεσα με μεμονωμένα σωματίδια LDL. Για να εξεταστεί η τελευταία αυτή δυνατότητα, τα πειράματα ταχύτητας καθίζησης διεξήχθησαν για το χαρακτηρισμό της αλληλεπίδρασης μεταξύ διαλυτό LDL και PAT-SM6. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 5Α δείχνουν κατανομές συντελεστή καθίζησης για ένα μείγμα από LDL και PAT-SM6. Δύο μεγάλες κορυφές που παρατηρούνται με τροπική συντελεστές καθίζησης κοντά στις τιμές που παρατηρούνται για την LDL μόνο και PAT-δΜ6 μόνο. Η ανάλυση του μέσου συντελεστή καθίζησης του ταχύτερα κορυφής, διορθώνοντας για τη μικρή επίδραση της LDL επί πυκνότητα του διαλύματος και το ιξώδες, δεν αποκάλυψαν καμία σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τον μέσο συντελεστή καθίζησης για μόνος PAT-SM6. Η απουσία οποιασδήποτε ανιχνεύσιμη αλλαγή στο ρυθμό της καθίζησης του PAT-SM6 παρουσία της LDL δείχνει πολύ μικρή αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των ειδών υπό αυτές τις συνθήκες και έρχεται σε αντίθεση με τις ισχυρές αλληλεπιδράσεις που παρατηρήθηκαν στα πειράματα ELISA (σχήματα 3 και 4). Μία πιθανότητα που εξετάστηκε ήταν ότι η χρήση 50 mg /mL BSA ως ένας παράγοντας μπλοκαρίσματος στα πειράματα ELISA μπορεί να δράσει ως μακρομοριακό παράγοντα συνωστισμός και αυξάνουν τη συνδετική συγγένεια [18]. Για να δοκιμαστεί αυτή η πιθανότητα καθίζησης πειράματα ταχύτητα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας σημασμένο με φθορισμό PAT-SM6 και το σύστημα ανίχνευσης φθορισμού στο αναλυτική υπερφυγόκεντρο. Αυτό επέτρεψε ο ρυθμός καθίζησης του επισημασμένου PAT-SM6 να παρακολουθείται υπό την παρουσία και απουσία υψηλών συγκεντρώσεων BSA. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 5 δείχνουν ότι η LDL έχει πολύ μικρή επίδραση επί του ρυθμού καθίζησης των επισημανθεί δια φθορισμού PAT-SM6 είτε σε παρουσία ή απουσία 50 mg /mL BSA. Τα αποτελέσματα της ταχύτητας καθίζησης στο Σχήμα 5 αποκλείουν ένα αλληλεπίδραση υψηλής συγγένειας μεταξύ διαλυτό LDL και μεμονωμένες θέσεις σε PAT-SM6 και υποστηρίζουν την πρόταση ότι η σύνδεση του PAT-SM6 σε LDL ακινητοποιείται επί πλακών μικροτίτλου οδηγείται από μια απληστία που βασίζεται μηχανισμός πρόσδεσης του αλλιώς ασθενείς αλληλεπιδράσεις (τουλάχιστον υψηλό εύρος μΜ).

(Α) Καθίζηση διανομές συντελεστή ο οποίος λαμβάνεται με τη χρήση οπτικών απορρόφηση στα 280 nm για PAT-SM6 (0,3 μΜ, μαύρο), LDL (1,8 μΜ, κόκκινο) και ένα μίγμα του PAT-SM6 και LDL (0,3 μΜ και 1,8 μΜ, αντίστοιχα (πράσινο). (κατανομές Β) συντελεστή καθίζησης που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας οπτική φθορισμού για FITC-επισημασμένο PAT-SM6 (40 ηΜ) με την παρουσία (συνεχής γραμμή) και απουσία (διακεκομμένη γραμμή) της LDL (1,8 μΜ). (κατανομές C) Καθίζηση συντελεστή ο οποίος λαμβάνεται με την παρουσία BSA (50 mg /mL) χρησιμοποιώντας οπτική φθορισμού για FITC-επισημασμένο PAT-SM6 (40 ηΜ) με την παρουσία (συνεχής γραμμή) και απουσία (διακεκομμένη γραμμή) της LDL (1,8 μΜ).

η

Οι αλληλεπιδράσεις των PAT-SM6 με πολυστερίνη Μικροσφαιρίδια

Τα στοιχεία που το PAT-SM6 αλληλεπιδρά με multi-σημείο σύνδεσης αντιγόνου με επικάλυψη να συγκεντρωμένα αντιγόνα πρότεινε ότι η απορρόφηση του GRP78 ή LDL σε μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου μπορεί να αυξήσει την ικανότητα αυτών των αντιγόνων να αναστέλλουν τις αλληλεπιδράσεις δέσμευσης PAT-SM6. μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου επικαλυμμένα με αντιγόνο παρασκευάστηκαν με επώαση των μικροσφαιριδίων πολυστυρενίου με αντιγόνα και την παρακολούθηση της έκτασης της δέσμευσης χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία φυγόκεντρο σύμπηξη. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 6 δείχνουν ότι η GRP78 και της LDL δεσμεύονται ταχέως στα σφαιρίδια πολυστυρενίου. Τα αποτελέσματα δείχνουν επίσης την έκταση της δέσμευσης των αυξήσεων GRP78 ως συνάρτηση της συγκέντρωσης GRP78 και ότι η BSA δεσμεύεται στα σφαιρίδια σε μια κορέσιμο τρόπο (Εικόνα 6).

(Α) ποσότητα πρωτεΐνης δεσμεύεται ανά γραμμάριο μικροσφαιρίων ως συνάρτηση της GRP78 (κλειστοί κύκλοι) ή συγκέντρωση BSA (ανοικτοί κύκλοι). (Β) χρονική πορεία της GRP78 (συμπαγείς κύκλοι) και LDL (ανοιχτά τρίγωνα) δέσμευση σε μικροσφαιρίδια πολυστυρολίου.

Η

πειράματα ELISA για να ελεγχθεί αν GRP78 ή LDL επικαλυμμένα μικροσφαιρίδια αναστέλλουν τη σύνδεση του PAT-δΜ6 να αντιγόνου επικαλυμμένες πλάκες μικροτίτλου πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση υψηλών συγκεντρώσεων του αντιγόνου επικάλυψης για να μεγιστοποιηθεί η έκταση της ομαδοποίησης στην πλάκα. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 7 δείχνουν ότι GRP78 επικαλυμμένα μικροσφαιρίδια αναστέλλουν PAT-SM6 δέσμευση σε πλακίδια μικροτιτλοδοτήσεως επικαλυμμένα με είτε GRP78 ενώ, στην ίδια περιοχή συγκέντρωσης και τις συνθήκες, τα διαλυτά GRP78 ή BSA επικαλυμμένα μικροσφαιρίδια ελέγχου δεν ανέστειλε. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ισχυρή δέσμευση της PAT-SM6 με χάντρες GRP78 επικαλυμμένα με πολυδύναμο εξάρτημα που απομονώνει PAT-SM6 και εμποδίζει τη σύνδεση του PAT-SM6 να GRP78 ηβιιίτανϊάϊη. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας πλάκες μικροτίτλου LDL-επικαλυμμένα, αν και σε αυτή την περίπτωση και τα δύο σφαιρίδια GRP78 επικαλυμμένα και διαλυτή GRP78 ανέστειλαν PAT-SM6 δέσμευσης στις πλάκες. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με την μεγαλύτερη φαινομενική απληστία του PAT-SM6 για GRP78 σύγκριση με LDL. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 8 δείχνουν ότι η LDL επικαλυμμένα μικροσφαιρίδια αναστέλλουν PAT-SM6 δέσμευση σε πλακίδια μικροτιτλοδοτήσεως επικαλυμμένα με LDL, ενώ σύμφωνα με την ίδια σειρά και τις συνθήκες διαλυτό LDL ή BSA επικαλυμμένα μικροσφαιρίδια ελέγχου δεν ανέστειλε συγκέντρωση. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 8 δείχνουν επίσης τις LDL-επικαλυμμένα μικροσφαιρίδια δεν ανέστειλε την πρόσδεση του PAT-SM6 να GRP78 επικαλυμμένες πλάκες, σύμφωνα με μια υψηλότερη απληστία του PAT-SM6 για σύμπλεγμα GRP78 σε σύγκριση με συγκεντρωμένα LDL.

PAT -SM6 (5 mg /mL) επωάστηκε με GRP78 επικαλυμμένα μικροσφαιρίδια (κύκλοι), διαλυτό GRP78 (τρίγωνα) ή BSA επικαλυμμένα μικροσφαιρίδια (τετράγωνα) πριν από την προσθήκη στις πλάκες μικροτίτλων.

η

PAT- SM6 (5 mg /mL) επωάστηκε με LDL-επικαλυμμένες μικροσφαίρες (κύκλοι), διαλυτό LDL (τρίγωνα) ή BSA επικαλυμμένα μικροσφαιρίδια (τετράγωνα) πριν από την προσθήκη στις πλάκες μικροτίτλων.

η

Συζήτηση

φυσικά αντισώματα IgM αποτελούν μέρος της έμφυτης ανοσολογικής απόκρισης όπου εμπλέκονται στην αναγνώριση των ξένων σωματιδίων συμπεριλαμβανομένων οξειδωμένα και χημικώς τροποποιημένες πρωτεΐνες και μετασχηματισμένα κύτταρα [19]. Αυτή η κατηγορία αντισώματος συνήθως παρουσιάζουν χαμηλή ειδικότητα αντιγόνου με την ικανότητα να δεσμεύουν περισσότερους από έναν τύπο αντιγόνου [20]. Αυτή η ικανότητα να δεσμεύουν περισσότερους από έναν τύπο αντιγόνου είναι εμφανής στην περίπτωση του PAT-SM6 όπου δεδομένα ELISA δείχνουν ισχυρές αλληλεπιδράσεις με δομικά άσχετες με μεμβράνη που συνδέεται GRP78 κυττάρου σε κύτταρα όγκου [3] και τόσο με εγγενή και οξειδωμένη χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες πλάσματος [2]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η αλληλεπίδραση του PAT-SM6 με GRP78 προκαλείται μέσω ενός μηχανισμού που βασίζεται απληστία με βάση την πολλαπλό σθένος του αντισώματος. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη υποδεικνύουν μία παρόμοια μηχανισμός απληστία που βασίζεται λειτουργεί για τη σύνδεση του PAT-SM6 με LDL. Αρκετές παρατηρήσεις υποστηρίζουν αυτό το συμπέρασμα. Η αλληλεπίδραση του PAT-SM6 με LDL αναλύθηκαν με ταχύτητα καθίζησης δεν αποκάλυψε καμία σημαντική αλλαγή στο ρυθμό της καθίζησης του PAT-SM6 παρουσία LDL. Αντίθετα, ισχυρές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ακινητοποιημένων GRP78 και PAT-SM6 παρατηρήθηκαν σε πειράματα ELISA. Αυτές οι μελέτες προτείνουν σχετικά αδύναμη αλληλεπιδράσεις (μικρομοριακής φάσμα συγκέντρωσης) όταν PAT-SM6 και LDL είναι ελεύθερα σε διάλυμα, αλλά πολύ ισχυρότερη αλληλεπίδραση με LDL συγκεντρωμένα στην πλάκα μικροτιτλοδότησης. Υποστήριξη για τον ρόλο της ομαδοποίησης παρέχεται επίσης από τα αποτελέσματα από πειράματα που χρησιμοποιούν μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου επικαλυμμένα με αντιγόνο, τα οποία έδειξαν αυξημένη αναστολή της πρόσδεσης του PAT-SM6 σε πλάκες μικροτίτλου επικαλυμμένων με αντιγόνο, σε σύγκριση με ισοδύναμες συγκεντρώσεις διαλυτών μορφών του αντιγόνου. Μια σημαντική διαφορά με PAT-SM6 αλληλεπιδράσεις με LDL σε σύγκριση με τις αλληλεπιδράσεις με GRP78 είναι ότι η φαινομενική απληστία για PAT-SM6 αλληλεπιδράσεις με LDL δεν αποκάλυψε μια εξάρτηση από την συγκέντρωση επικάλυψης της LDL. Στην περίπτωση της GRP78 η φαινομενική απληστία για PAT-SM6 αυξάνει με τη συγκέντρωση επίστρωσης, σύμφωνα με μια επίδραση ομαδοποίηση αντιγόνο [4]. Μία πιθανή εξήγηση για αυτή τη διαφορά είναι το μεγάλο μέγεθος της LDL και ισχυρότερη σύνδεση με την πλάκα μικροτιτλοδότησης οδηγώντας σε ομαδοποίηση, ακόμη και σε χαμηλές συγκεντρώσεις επικαλύψεως.

Ανάλυση της σύνδεσης του PAT-SM6 στην LDL και οξειδωμένης LDL υποδεικνύεται παρόμοια φαινόμενη ζωηρότητες (K

d περίπου 20 ηΜ) και τη συνολική ασθενέστερη δέσμευση σε σύγκριση με την αλληλεπίδραση με GRP78. Προηγούμενες μελέτες της αλληλεπίδρασης του PAT-SM6 με LDL και οξειδωμένης LDL, εκτελούνται χρησιμοποιώντας μια μοναδική επίστρωση αντιγόνου και συγκέντρωση PAT-SM6 έδωσε ένα χαμηλότερο σήμα ELISA (65%) για την πρόσδεση σε LDL σε σύγκριση με οξειδωμένη LDL [2], σε αντίθεση με τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στο Σχήμα 3, όπου οι καμπύλες δέσμευσης για PAT-SM6 στην LDL και οξειδωμένης LDL ήταν πολύ παρόμοιες. Οι πιθανές εξηγήσεις για αυτή την ασυμφωνία είναι παραλλαγές των μεθόδων που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή της οξειδωμένης LDL.